專利名稱：通過轉(zhuǎn)入抗病相關基因進行草魚,對蝦抗病育種的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將抗病基因如人α-干擾素基因轉(zhuǎn)入魚、蝦體內(nèi)，培育抗病的轉(zhuǎn)基因魚、蝦。本發(fā)明還涉及利用鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子與人α-干擾素基因構建成在魚、蝦體內(nèi)表達的重組基因。
草魚是我國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，年產(chǎn)量占我國淡水魚產(chǎn)量的30％。由于草魚餌料來源廣泛且廉價，而且草魚肉質(zhì)細嫩鮮美，廣受養(yǎng)殖戶和消費者歡迎。目前世界五大洲都有引種養(yǎng)殖。
草魚由于自身的生理特點，在苗種期易受病害的侵染，如草魚出血病、草魚腸炎和爛腮病等。其中草魚出血病為病毒性(草魚出血病毒GCHV)傳染疾病(毛樹堅等，1989)，危害最為嚴重，高發(fā)病期死亡率可達85％，給養(yǎng)殖業(yè)造成極大經(jīng)濟損失。我國科學家經(jīng)過十余年的研究，提出了用疫苗防治的方法，由于水生生物接種疫苗效率低，因而難以普遍推廣應用。
對蝦是我國沿海海產(chǎn)養(yǎng)殖的重要生物，每年為國家創(chuàng)造數(shù)十億元的稅利，而對蝦的皮下及造血組織壞死桿狀病毒(HHNBV)及肝胰腺細小病毒樣病毒(Hepatopancreatic Parvo-like Virus，HPV)病也是危害極嚴重的暴發(fā)性流行疾病(陳世陽，1985)。因此，采用新方法和新技術的抗病育種異常迫切。
魚類基因工程近年來發(fā)展迅速，為基因工程進行魚類抗病育種提供了技術支持。轉(zhuǎn)生長激素基因魚已經(jīng)在國內(nèi)外取得了實際成效。Hew等(HSC RES&DEV LP，et al.)利用魚抗凍蛋白基因啟動子構建成轉(zhuǎn)基因載體，用于外源基因如生長激素基因的轉(zhuǎn)移，并獲得了這一載體的專利；加拿大J.R.White等(小詹姆斯.R.懷特 比爾·波亥吉達克，1997)將人胰島素基因轉(zhuǎn)入魚體，用于人糖尿病的治療；日本山下伸(NIPPON SUISANKAISHA LTD.)則取得了電場轉(zhuǎn)移外源基因進入魚類卵細胞的方法專利。
本發(fā)明的目的在于針對魚、蝦等水生經(jīng)濟動物病毒性疾病，通過轉(zhuǎn)入外源抗病基因，獲得轉(zhuǎn)基因個體來進行魚類抗病的基因工程及育種。本發(fā)明所采用的基因啟動子為鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子，所采用的基因為抗病相關基因如人α-干擾素基因，由此構建成能在魚體中表達的重組基因。
人α-干擾素是人白細胞在病原侵染時產(chǎn)生的一種廣譜抗病毒蛋白，它通過啟動一系列抗病基因的表達，促使生物體細胞合成出多種對付病原的蛋白質(zhì)而抑制病原繁殖，從而起到抗病的作用(侯云德，1990)。本發(fā)明人采用草魚、對蝦體細胞離體培養(yǎng)并以干擾素處理及接種病毒的實驗，研究了人α-干擾素在魚、蝦細胞抗御相關病毒中的作用。結果表明用一定濃度的人α-干擾素，在病毒接種前1小時以上處理培養(yǎng)細胞，能使細胞免受接種病毒的侵噬。通過向魚體、蝦體注射一定量的人α-干擾素再接種病毒的實驗，證明在接種病毒8小時以前將人α-干擾素注入魚、蝦體內(nèi)，能顯著提高其抗性，在病毒接種前48小時注入干擾素，可使魚、蝦的成活率提高40％。這些研究證明人α-干擾素可以顯著提高魚、蝦對相應病原的抗性。
當前，通過基因工程技術構建重組分子(基因)已經(jīng)是一種常規(guī)化了的技術。同時采用通用的顯微注射法將外源分子注入受精卵細胞，在魚類轉(zhuǎn)基因操作中有明顯優(yōu)勢(Chen，T.T.et al.，1990)。將抗病基因構建成能在魚體內(nèi)表達的重組基因，轉(zhuǎn)入草魚、對蝦等水生經(jīng)濟動物受精卵中，并選育出抗病新品種(系)，可望從根本上消除諸如草魚出血病、對蝦病毒病的危害，這是本發(fā)明的基本構思。


圖1給出了人α-干擾素-鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子重組質(zhì)粒(pCI質(zhì)粒)的結構。
圖2給出了pCI質(zhì)粒的構建過程。
本發(fā)明提供了一種通過轉(zhuǎn)入抗病基因進行草魚、對蝦抗病育種的方法，該方法包括以下步驟1.重組基因構建本發(fā)明采用鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子作為外源基因在受體中表達的啟動子，人α-干擾素基因作為轉(zhuǎn)化的目的基因，通過重組構建成pCI重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中擴增，分離出擴增質(zhì)粒后，以限制性內(nèi)切酶Pvu II切下重組基因片段用于顯微注射的轉(zhuǎn)化(重組基因結構見附圖1) ；2.顯微注射轉(zhuǎn)化受體收取草魚、對蝦受精卵，在1-4胞期通過顯微操作儀將重組基因溶液注入細胞中的核區(qū)。
3.孵化注射外源基因的受精卵按常規(guī)方法進行孵化；草魚在環(huán)道流水孵化，對蝦在孵化池充氧孵化；4.轉(zhuǎn)基因個體的標記對轉(zhuǎn)基因個體進行編號標記；5.轉(zhuǎn)基因個體的檢測轉(zhuǎn)基因魚、蝦先進行病毒抗性篩選，即通過接種病毒的攻毒實驗，篩選出具有抗性的轉(zhuǎn)基因個體?？剐詡€體采血或剪取肌肉組織分離其DNA，進行分子檢測和基因表達水平測定。分子檢測的具體方法是以轉(zhuǎn)入基因內(nèi)的特異序列合成一對引物，并用這一對引物對個體DNA樣品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物凝膠電泳分離后能觀察到特定的分子帶的個體即為轉(zhuǎn)基因個體?？赏ㄟ^采用Southern雜交的方法進一步予以確證?；虮磉_水平測定則以人α-干擾素ELISA檢測試劑盒對血清進行定量分析。
6.轉(zhuǎn)基因魚、蝦形成品系轉(zhuǎn)基因個體的飼養(yǎng)按常規(guī)進行，性成熟后進行育種，形成轉(zhuǎn)基因魚、蝦品系。具體方法是轉(zhuǎn)基因魚與普通草魚雜交，從雜交后代F1中選擇轉(zhuǎn)基因的雌雄性個體作同胞間交配，從其后代中選擇出外源基因純合的個體。利用這一純合個體與普通草魚雜交，雜種一代用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。對蝦的育種過程與草魚育種一致。
實施例1.草魚的轉(zhuǎn)基因抗病育種1.重組基因的構建鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子克隆在通用的質(zhì)粒載體pUC118中，在基因下游有一多克隆位點，用限制性內(nèi)切酶SmaI和EcoRI將質(zhì)粒切開成一端為平末端而另一端為EcoRI粘端的新載體分子。人α-干擾素基因cDNA克隆在通用載體pUC18中，可用PstI和EcoRI兩限制性內(nèi)切酶切下，先用PstI切開質(zhì)粒成線性分子，再用核酸酶S1對線性分子進行有限酶解以將PstI的粘端切平，然后用EcoRI從分子上切下0.9kb的α-干擾素cDNA片段并經(jīng)低熔點膠回收。
將新載體分子和回收的cDNA 0.9kb片段按1∶2分子比例混合，加入2個單位的T4 DNA連接酶，14℃連接16小時，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在氨芐青霉素和X-gal培養(yǎng)基上篩選陽性菌落。
陽性菌落擴增培養(yǎng)后分離質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行限制性酶切、Southern雜交、順序測定分析，確證獲得正確的重組基因。
以限制性內(nèi)切酶PvuII，對大量質(zhì)粒分子酶切，并回收4kb分子，作為顯微注射的基因分子(構建過程詳見附圖2)。
2.獲得草魚受精卵親本草魚人工注射催情激素，在約16小時后出現(xiàn)交尾現(xiàn)象，用紗網(wǎng)從交配池撈起剛產(chǎn)出的受精卵，置培養(yǎng)皿中在顯微鏡下觀察，選擇1-4胞期的受精卵進行顯微注射。
3.顯微注射轉(zhuǎn)化草魚受精卵按顯微注射的常規(guī)方法，在顯微鏡下利用顯微注射儀將5nl重組基因溶液約107-108分子注入受精卵細胞核中。
4.注射后的孵化注射后受精卵按常規(guī)草魚孵化，即置于孵化池流水孵化。受精16小時后魚花孵出，三天后出孵化池置發(fā)花池常規(guī)飼養(yǎng)。
5.轉(zhuǎn)基因草魚飼養(yǎng)按普通草魚飼養(yǎng)。
6.攻毒實驗轉(zhuǎn)基因草魚長至4月齡長約15-20cm，接種3.5倍半數(shù)致死量的草魚出血病毒，篩選抗性草魚。
7.PCR檢測從抗性魚尾動脈取血1ml，離心將血細胞和血清分離，從血細胞中按常規(guī)方法分離DNA，用于PCR檢測。針對轉(zhuǎn)入基因的順序，設計一對25個堿基的特異引物，引物Tm為45℃，50ngDNA、5ppm引物、1.5mMMg+2、94℃變性5分鐘、94℃變性1分鐘→54℃復性30秒→72℃延伸45秒，30次循環(huán)擴增?？剐贼~80％有特異擴增帶。
8.ELISA檢測人α-干擾素ELISA檢測試劑盒購于邦定生物醫(yī)學公司(BiotingeBiomedicine Co.)，檢測使用按生產(chǎn)商說明進行，顯色后在酶標儀中測定吸光度并對照標準曲線，了解測定樣品中α-干擾素的濃度。
9.轉(zhuǎn)基因魚育種形成品種(系)適效表達外源基因的轉(zhuǎn)基因個體，常規(guī)飼養(yǎng)約四年至性成熟，即可進行常規(guī)育種。具體方法是轉(zhuǎn)基因魚與普通草魚雜交，從雜交后代F1中選擇轉(zhuǎn)基因的雌雄性個體作同胞間交配，從其后代中選擇出外源基因純合的個體。利用這一純合個體與普通草魚雜交，雜種一代用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。
實施例2.對蝦的轉(zhuǎn)基因抗病育種1.重組基因的構建重組基因構建同實施例1。
2.獲得對蝦受精卵對蝦親本置于暗房內(nèi)交配，用流水沖洗受精卵，在顯微鏡下挑選出1-4胞期前的受精卵用于顯微注射。
3.顯微注射轉(zhuǎn)化受精卵顯微操作同實施例1。
4.注射后的孵化顯微注射后的受精卵置孵化池，以充氧泵充氧孵化。
5.轉(zhuǎn)基因蝦的飼養(yǎng)按常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)。
6.攻毒實驗人工喂毒感染對蝦。具體方法是以感染相應病毒病致死的對蝦，去頭部、尾部甲殼及附屬物，取頭胸部切碎作為病料，在23～28℃充氣海水30L槽中飼喂體長長至2～3cm的轉(zhuǎn)基因?qū)ξr，每槽10尾，投病料1.0g。5天后仍存活的對蝦作檢測分析。
7.PCR檢測PCR檢測同實施例1，但從肌肉組織中分離DNA。具體方法是從抗性對蝦腹下剪取小團肌肉(約10mg)，按肌肉細胞DNA分離的常規(guī)方法分離DNA，以人α-干擾素基因內(nèi)特異序列的引物對其進行PCR擴增。PCR陽性抗病個體用于雜交育種。
8.轉(zhuǎn)基因抗病對蝦育種PCR陽性個體與普通對蝦雜交，從F1代中篩選抗病個體，并進行PCR檢測，抗病同時為PCR陽性的雄性個體與雌性個體交配，獲得F2代。從F2代中可選出轉(zhuǎn)基因純合的個體，用于雜交育種的親本，與普通對蝦雜交，雜種一代用于生產(chǎn)。
本發(fā)明主要參考文獻有毛樹堅等，1989，草魚出血病的病原研究，水產(chǎn)學報，13(1)1～4。
陳世陽，1985，對蝦的病毒性疾病，國外水產(chǎn)，(4)41～43。
侯云德，1990，分子病毒學，北京學苑出版社.
小詹姆斯.R.懷特比爾.波亥吉達克，1997，治療糖尿病的轉(zhuǎn)基因魚，中國專利
發(fā)明者章懷云, 張學文, 符少輝 申請人:章懷云