專利名稱：以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體及制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶生物技術(shù)，特別是涉及一種以多元共聚物為骨架、經(jīng)表面改性的多孔型微珠狀固定化酶載體及其制備方法。
六十年代初，Katchallski-Katzir等人首先將一些蛋白水解酶固定于不溶性的載體上或包裹在人工膜中，制成固定化酶，如文獻1Annu．Rev．Biochem．35，773-908，1966。1967年日本Tanake Seiyaku公司Chibata等人首次成功地將固定化酶技術(shù)用于工業(yè)生產(chǎn)，如文獻2Biotechnol．Bioeng．9，603-615，1967中描述的。他們使用固定化氨基酸?；笇⑷斯ず铣傻耐庀鼶L-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-型對映體。1970年前后，另外兩個固定化酶系統(tǒng)相繼投入中試生產(chǎn)。一個是英國用固定化青霉素酰化酶水解青霉素G或V生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸，如文獻3Proc．R．Soc．London Ser．B 179，321-334，1971所述；另一個是美國用固定化葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)果糖，如文獻4Applied Biochemistry and Bioengineering，Vol．1，pp222-327．Academic Press，1976所述。這些成功的工業(yè)應(yīng)用促進了固定化酶技術(shù)的廣泛深入研究，使以固定化酶為催化劑的工業(yè)過程的數(shù)量穩(wěn)定增加。
利用固定化酶進行工業(yè)生產(chǎn)，不僅使酶可以回收，重復(fù)使用，降低了催化劑成本，還提高了酶的穩(wěn)定性，避免了酶蛋白對產(chǎn)物造成的污染，簡化了后處理。其研究和應(yīng)用迅速發(fā)展，在工業(yè)生產(chǎn)和生化分析中獲得廣泛應(yīng)用，成為現(xiàn)代生物技術(shù)中最活躍的領(lǐng)域之一。
酶固定化方法可歸納為載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法三大類。載體結(jié)合法是將酶結(jié)合于水不溶性載體上的一類固定化方法。根據(jù)結(jié)合的形式不同，又可分為物理吸附法、離子結(jié)合法和共價結(jié)合法等。物理吸附法是指酶被物理吸附于不溶性載體上。載體有活性碳、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹脂等。此法具有酶活性中心不易被破壞、酶結(jié)構(gòu)變化小的優(yōu)點，但酶與載體相互作用力弱，酶易脫落。離子結(jié)合法將酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。此法的載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂，例如DEAE-纖維素、CM-纖維素等。此法操作簡單，條件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活收率較高的固定化酶。但是載體與酶的結(jié)合力較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響；在離子強度高的條件下反應(yīng)時，酶易從載體上脫落。共價結(jié)合法是將酶以共價鍵結(jié)合于載體上。此法或是將載體有關(guān)的基團活化，然后與酶有關(guān)的基團發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，或是在載體上接一個雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去?？膳c載體結(jié)合的酶的功能團有氨基、羧基、羥基、酚基等。共價結(jié)合法反應(yīng)條件比較苛刻，操作復(fù)雜，并且易引起酶的高級結(jié)構(gòu)變化，破壞部分活性中心，酶活收率一般為30％左右，但是酶結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好。它是載體結(jié)合法中應(yīng)用最多的一種。工業(yè)上廣泛采用共價結(jié)合法制備固定化酶。
載體結(jié)合法所用的載體有膜狀、纖維狀和顆粒狀，所用的基質(zhì)材料有天然聚合物和合成聚合物兩類。天然聚合物有瓊脂糖、明膠，如文獻5抗生素，13(3)，177-180，1988所述；又如文獻6中國醫(yī)藥上業(yè)雜志，24(3)，100-103，1993和文獻7中國抗生素雜志，15(5)，338-341，1990中所介紹的幾丁質(zhì)以及文獻8絲綢，(8)，13-15，19，1996中介紹的絲素膜等。合成聚合物有文獻9DE3515252介紹的苯乙烯——二乙烯基苯顆粒、文獻10山西大學(xué)學(xué)報，自然科學(xué)版，14(3)，273-277，1991介紹的大孔吸附樹脂、文獻11(JP5959191，JP58190399)介紹的離子交換樹脂、文獻12微生物學(xué)報，38(3)，204-207，1998介紹的聚丙烯腈纖維等。膜狀和纖維狀載體用于反應(yīng)器時，液相混合不好，不利于反應(yīng)過程中酸度的調(diào)控，而且需要人工將載體裝填入反應(yīng)器，勞動強度大，反應(yīng)過程不穩(wěn)定。另一方面，膜狀和纖維狀載體所用材質(zhì)往往不是專用于固定化酶的，影響酶活性的發(fā)揮，如聚丙烯腈纖維原用于紡織，離子交換樹脂原用于水處理和其它分離過程，幾丁質(zhì)則是經(jīng)過化學(xué)處理的天然聚合物，批次質(zhì)量難以穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的為了克服上述固定化酶載體的缺點，解決載體與酶結(jié)合弱的問題，減少酶從載體上脫落的幾率；為了提高固定化酶的活性；為了克服已有載體批次不同質(zhì)量難以相同的缺點；為了促進我國固定化酶技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提供了一種性能優(yōu)良的以多元共聚物為骨架、經(jīng)表面改性的多孔型微珠狀固定化酶載體。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體的制備方法依下列步驟進行(1)微珠制備共聚單體有四類(A、B、C、D)，其配料比例如下單體A 5-30重量份；單體B 5-30重量份；單體C 40-90重量份；單體D 0-10重量份；其中單體A包括苯乙烯、對乙烯基甲苯、間乙烯基甲苯和α-甲基苯乙烯中的一種或多種，單體B包括二乙烯基苯和異氰尿酸三烯丙酯中的一種或兩種，單體C包括乙酸乙烯酯，單體D包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和甲基丙烯酸中的一種或多種；將A、B、C、D四類單體按上述比例充分混合。按照每100g上述混合好的單體計，加入引發(fā)劑0．8-1．3g，致孔劑6-30ml和200#汽油0-20ml。其中引發(fā)劑采用本行業(yè)通用的引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈(AIBN)或過氧化苯甲酰(BPO)，致孔劑采用本行業(yè)通用的制孔劑，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯或丁酸丁酯；在單體總體積3-4倍的含有1-4wt％的明膠及1wt％Mg(OH)2的懸浮體系中進行聚合反應(yīng)。40℃開始緩慢升溫，升溫速率為0 45-0．65℃／min，65-70℃聚合5小時，70℃以上固化6-10小時，過篩，用大量的水洗滌，然后用丙酮浸泡，洗去致孔劑，得到多孔型微珠。
(2)表面改性將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含3-5wt％NaOH的甲醇溶液，18-25℃反應(yīng)24-48小時后，抽濾，用丙酮洗滌二次，即制得固定化酶用的載體。
該載體的內(nèi)外表面帶有大量羥基(-OH)，易于活化，而且硬度高，從而提高了固定化酶的活性。通過調(diào)節(jié)各單體的配比和改性條件來控制可活化羥基的數(shù)量和密度。
本發(fā)明提供的以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體，其顆粒直徑為80-400μm，濕密度為1．02-1．10g／cm3，可活化羥基數(shù)量達到9．8-11．5mmol／g(干重)。它可由下述四類單體按下述配料比例經(jīng)懸浮共聚而制得；單體A 5-30重量份；單體B 5-30重量份；單體C 40-90重量份；單體D 0-10重量份。
本發(fā)明的效果本發(fā)明制備的固定化酶載體顆粒直徑為80-400μm，濕密度為1．02-1．10g／cm3，適合于反應(yīng)器操作；不易染菌，強度優(yōu)于國外通常采用的瓊脂糖6B；活性基團多，可活化羥基數(shù)量達到9．8-11．5mmol／g干重，高于德國載體Eupergit C 2-3倍；成本低，制備方法簡單。將本發(fā)明的載體活化后結(jié)合青霉素酰化酶，制成的固定化青霉素酰化酶比用瓊脂糖6B微珠制備的固定化酶活性高5-10倍，比用Eupergit C制備的固定化酶活性高2-3倍，酶活收率平均為37％；將本發(fā)明的載體活化后結(jié)合糖化酶或葡萄糖異構(gòu)酶，制成的固定化酶的綜合性能優(yōu)于使用其它載體。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含3wt％NaOH的甲醇溶液，18℃反應(yīng)24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含5wt％NaOH的甲醇溶液，22℃反應(yīng)36小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。實施例51將苯乙烯20g、二乙烯基苯15g、乙酸乙烯酯60g、甲基丙烯酸5g充分混合，加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)1．0g，致孔劑丁酸乙酯15ml和200#汽油15ml，在400ml含有2．5wt％明膠及1wt％Mg(OH)2的懸浮體系中進行聚合反應(yīng)。40℃開始緩慢升溫，升溫速率為0．45℃／min，67℃聚合5小時，72℃固化2小時，75℃固化3．0小時，80℃繼續(xù)固化1小時后，停止反應(yīng)，過篩，用大量的水洗滌，然后用丙酮浸泡，洗去致孔劑。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含4wt％NaOH的甲醇溶液，25℃反應(yīng)24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含3wt％NaOH的甲醇溶液，18℃反應(yīng)48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含5wt％NaOH的甲醇溶液，22℃反應(yīng)36小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含4wt％NaOH的甲醇溶液，25℃反應(yīng)24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含3wt％NaOH的甲醇溶液，18℃反應(yīng)48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含5wt％NaOH的甲醇溶液，22℃反應(yīng)36小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
2將上述微珠風(fēng)干，加入過量的含4wt％NaOH的甲醇溶液，25℃反應(yīng)24小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得固定化酶用的載體。
權(quán)利要求
1．一種以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體的制法，其特征在于依下列步驟進行(1)微珠制備將單體A 5-30重量份、單體B 5-30重量份、單體C 40-90重量份、單體D 0-10重量份充分混合；每100g上述混合好的單體，加入引發(fā)劑0．8-1．3g，致孔劑6-30ml和200#汽油0-20ml；在單體總體積3-4倍的含有1-4wt％的明膠及1wt％Mg(OH)2的懸浮體系中進行聚合反應(yīng)。40℃開始緩慢升溫，升溫速率為0．45-0．65℃／min，65-70℃聚合5小時，70℃以上固化6-10小時，用通常的方法過篩及用大量的水洗滌，然后用丙酮浸泡，洗去致孔劑，得到多孔型微珠；(2)表面改性將上述得到多孔型微珠風(fēng)干，加入過量的含3-5wt％NaOH的甲醇溶液，18-25℃反應(yīng)24-48小時后，抽濾，用丙酮洗滌三次，即制得產(chǎn)品。
2．按照權(quán)利要求1所述的以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體的制法，其特征在于所述的單體A包括苯乙烯、對乙烯基甲苯、間乙烯基甲苯和α-甲基苯乙烯中的一種或多種；所述的單體B包括二乙烯基苯和異氰尿酸三烯丙酯中的一種或兩種；單體C包括乙酸乙烯酯；所述的單體D包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和甲基丙烯酸中的一種或多種。
3．以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體，其顆粒直徑為80-400μm，濕密度為1．02-1．10g／cm3，可活化羥基數(shù)量達到9．8-11．5mmol／g(干重)；它可由下述單體按照下述配料比例經(jīng)上述懸浮聚合方法而得單體A 5-30重量份；單體B 5-30重量份；單體C 40-90重量份；單體D 0-10重量份。
全文摘要
本發(fā)明涉及以多元共聚物為骨架的多孔型微珠狀固定化酶載體及其制法。制法用四類共聚單體,將單體A5—30重量份、單體B5—30重量份、單體C40—90重量份和單體D0—10重量份充分混合,在單體總體積3—4倍的含有1—4wt%的明膠及1wt%Mg(OH)
文檔編號C12N11/08GK1281038SQ9910983
公開日2001年1月24日 申請日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者叢威, 劉建國, 歐陽藩 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所