專利名稱：人神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因的制作方法
神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)高度復(fù)雜和精細(xì)的系統(tǒng)。作為生物長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，以人腦為中樞的神經(jīng)系統(tǒng)是人類的感覺、學(xué)習(xí)、記憶、思維、情感等行為的基礎(chǔ)，而且通過和內(nèi)分泌等系統(tǒng)的相互作用，對(duì)各種組織細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)都具有重要的影響。因此，人從胚胎發(fā)育到成長(zhǎng)、衰老的整個(gè)生命過程中腦組織都起到十分重要的功能。從基因水平闡明神經(jīng)系統(tǒng)的功能及其機(jī)制，不但是神經(jīng)科學(xué)的重要研究課題，而且也是分子生物學(xué)、信息科學(xué)等學(xué)科非常關(guān)注的研究領(lǐng)域。神經(jīng)分子生物學(xué)作為神經(jīng)科學(xué)研究的重要組成部分，隨著現(xiàn)代生物學(xué)的方法引入，在分子水平上回答了許多神經(jīng)發(fā)育的重要問題，如神經(jīng)元的誘導(dǎo)和分化、軸突的生長(zhǎng)和定向、神經(jīng)和肌肉的連接等。這些進(jìn)展不僅加深了我們對(duì)神經(jīng)發(fā)育的過程及其機(jī)制了解，而且使我們對(duì)某些疾病的發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)并提供了可能的治療方案。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多重大疾病的發(fā)生是由于維持神經(jīng)發(fā)育的基因發(fā)生變化而造成的?？寺∨c神經(jīng)重要生理功能及神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)基因?qū)τ谡J(rèn)識(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的生理，病理過程，尋找新的針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物有重要的意義。
本發(fā)明的內(nèi)容是應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、cDNA文庫(kù)篩選、分子克隆、DNA序列測(cè)定技術(shù)，克隆神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因BL1，并用Northern雜交及原位雜交技術(shù)進(jìn)行了組織與細(xì)胞表達(dá)分析。
該基因達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.人BLI全長(zhǎng)cDNA為2543bp，其閱讀框架為1299bp，編碼433個(gè)氨基酸，其全長(zhǎng)cDNA和編碼氨基酸見圖1與圖2。
2.人BL1基因僅在成人與胎兒神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。在小鼠中存在BLI的同源基因，也主要在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)(見圖3與圖4)。原位雜交顯示其在大腦皮層、海馬、齒狀回、小腦顆粒細(xì)胞層、腦干多個(gè)與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的核團(tuán)如面神經(jīng)核及脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)。
3.將編碼BL1蛋白胞外3個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的cDNA片段和編碼BL1胞內(nèi)區(qū)46個(gè)氨基酸的cDNA片段，分別克隆到pET-30a+原核表達(dá)載體和5’端具有編碼26kDa二氫葉酸脫氫酶cDNA序列的pET-30a+-DHFR原核表達(dá)載體中，IPTG誘導(dǎo)后獲得了高效表達(dá)。通過親和層析，得到了純化的上述蛋白。
本項(xiàng)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)一般來說，在某種組織器官特異表達(dá)的基因?qū)τ诰S持這種組織器官的功能有重要作用。我們所克隆新基因BL1編碼的神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的神經(jīng)粘附分子，對(duì)于中樞神經(jīng)發(fā)育及功能維持也應(yīng)有重要作用。該基因的克隆，表達(dá)譜分析及原核表達(dá)為進(jìn)一步的功能研究，包括今后在疾病診斷與治療上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。


圖1BLlcDNA的核苷酸序列圖2BLcDNA的全編碼區(qū)與氨基酸序列
圖3BL1cDNA的全序列分析示意4BL1基因在七種胎兒組織中表達(dá)的Northern雜交分析1.骨骼肌；2.腎；3.脾；4.肺；5肝；6心；7.腦。
圖5.BL1基因在八種成人組織中表達(dá)的Northern雜交分析1.心；2.腦；3.胎盤；4.肺；5.肝；6.骨骼?。?腎；8胰。
圖6BL1在50種組織中表達(dá)的斑點(diǎn)雜交分析A.poly A+RNAs和對(duì)照在陽性電荷尼龍膜上的組織類型和位置。
B.用BL1 cDNA探針與50種組織poly A+RNAs的雜交結(jié)果。
圖7BL1基因在八種成年小鼠組織中表達(dá)的Northern雜交分析1.心；2.腦；3.胎盤；4.肺；5.肝；6.骨骼??；7.腎；8.胰。
圖8BLIcRNA探針與成年鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織切片雜交結(jié)果A.小腦顆粒細(xì)胞層；B.面神經(jīng)核；C.脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。
實(shí)施例1:cDNA文庫(kù)的篩選與序列測(cè)定神經(jīng)發(fā)育過程中，生長(zhǎng)錐經(jīng)常伸到其它軸突的表面，形成軸突束或簇。束化的過程具有高度的選擇性，某些生長(zhǎng)錐表現(xiàn)出對(duì)特異軸突束的選擇性親和。Beaten path基因在果蠅神經(jīng)發(fā)育時(shí)控制神經(jīng)元軸突的去束化。Beaten path基因突變的果蠅胚胎中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不能去束化并繞過它的靶位置。最初，F(xiàn)ambrough和Goodman克隆果蠅Beaten path基因時(shí)在其產(chǎn)物Beat中沒有找到已知的結(jié)構(gòu)域。我們利用TBLASTN程序通過對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢，找到幾個(gè)EST(人T32071，T08949，鼠AA155245)與Beat具有一定程度的相似性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)相似的位置為一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并與許多神經(jīng)粘附分子的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域同源。
利用ESTT32071查詢Unigene發(fā)現(xiàn)了一個(gè)讓人興奮的結(jié)果，在Unigene Hs.6164中的22個(gè)EST都只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)(一般認(rèn)為在Unigene的同一記錄下的所有EST代表同一基因)。由于許多神經(jīng)特異表達(dá)的粘附分子已被證明與神經(jīng)發(fā)育和功能維持有密切關(guān)系，估計(jì)T32071等EST屬于一個(gè)有類似功能的基因，我們將這一基因命名為BL1(Beat-Like1)。
通過引物步移的方法測(cè)定克隆192716(克隆192716為Unigene Hs.6164下ESTH3850來源的克隆，我們從IMAGE公司得到)的全序列。用EcoRI和SmaI雙酶切克隆192716，得到插入序列的5′端215bp片段，用其作探針篩選用隨機(jī)引物構(gòu)建的成人腦cDNA文庫(kù)(載體為λgtll)，得到5個(gè)陽性單克隆。用λgtll的測(cè)序引物PCR擴(kuò)增得到cDNA插入片斷，通過酶切圖譜分析，選取克隆編號(hào)為DC和DD的兩個(gè)克隆測(cè)序。將PCR擴(kuò)增得到的cDNA插入片斷克隆進(jìn)pGEM-Teasy載體中，用ABI377自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。將192716和DC克隆的序列拼接得到的一條2.5kb的cDNA序列，命名為BL1(beat-like1)，對(duì)BL1的序列測(cè)定和拼接見圖3。
實(shí)施例2應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析出該基因具有權(quán)利3所述的結(jié)構(gòu)域用BL1A cDNA推測(cè)的氨基酸序列BL1A比較Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在其中部具有三個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(分別位于氨基酸殘基77-147，180-246，282-336)。用SignalP V1.1(http∥www.cbs.dtu.dk/service/signalP)分析得知1-24氨基酸為典型的信號(hào)肽。比較TMBASE發(fā)現(xiàn)有2個(gè)較明顯的穿膜區(qū)(位于氨基酸殘基7-24，366-387)，由于第一個(gè)穿膜區(qū)為信號(hào)肽位置，所以成熟的BL1在細(xì)胞膜上應(yīng)該只穿膜一次。根據(jù)分析結(jié)果，該基因編碼一新的神經(jīng)粘附分子實(shí)施例3應(yīng)用Northern雜交、RNA點(diǎn)雜交及原位雜交技術(shù)進(jìn)行了人與小鼠的組織表達(dá)譜分析通過查詢Unigene發(fā)現(xiàn)所有EST都在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，利用Northern雜交和斑點(diǎn)雜交分析BL1的組織表達(dá)。提取7月胎兒骨骼肌、腎、脾、肺、肝、心和腦等組織的總RNA。用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，每種RNA取30μg通過甲醛變性凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移、固定至尼龍膜上。用引物12772(5’-caccaactgcgatgattagg-3’，936bp-955bp)和引物12773(5’-ctctccaaatctactcttcc-3’，2161bp-2143bp)PCR擴(kuò)增192716克隆而得到1226bp的片段，以此為探針與固定有7種胎兒組織RNA的膜雜交。發(fā)現(xiàn)只在腦組織中能檢測(cè)到約2.5kb和3.5kb的兩條區(qū)帶。探針同上，與購(gòu)自Clontech公司的多組織膜(MTNTM)雜交，在檢測(cè)的8種成人組織發(fā)現(xiàn)BL1mRNA只在腦組織中表達(dá)，并且也存在2.5kb和3.5kb的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本(圖4與圖5)。
1)為了進(jìn)一步驗(yàn)證BL1中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的特異性，我們使用Clontech公司HumanRNA Master BlotTM(Cat.No.7770-1)檢測(cè)了43種成人組織，7種胎兒組織，結(jié)果顯示BL1只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織中檢測(cè)到信號(hào)(圖6)。值得注意的是，在小腦組織中BL1的表達(dá)明顯高于其它組織。為了解小鼠中是否存在BL1的同源基因，用BL1SmaI酶切片段與載有8種成年小鼠組織的多組織膜進(jìn)行Northern雜交分析，發(fā)現(xiàn)小鼠中存在BL1的同源基因，其亦為中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)為主，存在2.5kb和3.5kb兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，3.5kb的轉(zhuǎn)錄本為腦特異表達(dá)(圖7)。
2)用引物BJ033a-1P(5’-agacagtttgctttgggattg-3’，1722bp-1702bp)與12772擴(kuò)增192716克隆，而后用XbaI酶切，回收287bp片段(1435-1722)，與SmaI和XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌。提取質(zhì)粒，酶切鑒定陽性克隆，并進(jìn)一步測(cè)序鑒定。體外轉(zhuǎn)錄UTP標(biāo)記的RNA探針按Boehringer Mannheim體外轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。用該探針與成年小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片行組織原位雜交分析發(fā)現(xiàn)，BL1基因在大腦皮層、海馬、齒狀回、小腦顆粒細(xì)胞層、腦干多個(gè)與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的核團(tuán)如面神經(jīng)核及脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)(圖8)。
實(shí)施例4BL1的原核表達(dá)將編碼BL1胞外3個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的cDNA片段(212bp-1155bp，314aa)克隆到pET-30a+原核表達(dá)載體中，將編碼BL1胞內(nèi)區(qū)46個(gè)氨基酸的cDNA片段(1298bp-1720bp)克隆到本室構(gòu)建的5’端具有編碼26kDa二氫葉酸脫氫酶cDNA序列的pET-30a+-DHFR原核表達(dá)載體中，IPTG誘導(dǎo)后皆獲得了高效表達(dá)。通過親和層析，得到了純化的上述蛋白。
權(quán)利要求
1，本發(fā)明涉及一神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的基因BL1，其特征在于互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)全長(zhǎng)2543bp，含一個(gè)1299bp的完整開放閱讀框，編碼433個(gè)氨基酸，分子量為47.1kD的蛋白質(zhì)。
2，根據(jù)權(quán)利1要求所述之神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的基因BL1，其特征在于所編碼蛋白1-24氨基酸為典型的信號(hào)肽，中部具有三個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(分別位于氨基酸殘基77-147，180-246,282-336)，366-387氨基酸為穿膜區(qū)，為一新的神經(jīng)粘附分子。
3，根據(jù)權(quán)利1要求所述之神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的基因BL1，其特征在于在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)，在海馬、小腦顆粒細(xì)胞、脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元高表達(dá)。
4，根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的基因BL1，其特征在于可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因診斷、基因治療和藥物治療，也可用于篩選藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)新的人神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因(BL1),包括互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列和編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。該基因編碼一新的神經(jīng)粘附分子,神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá),在維持神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能及某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中可能具有重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1242376SQ99111018
公開日2000年1月26日 申請(qǐng)日期1999年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月27日
發(fā)明者張伯勤, 袁建剛, 周嚴(yán), 杜光偉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所