專利名稱：米曲霉菌固定化制備氨基?；傅姆椒安鸱只煨被岬难b置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種米曲霉菌固定化制備氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的裝置，它屬于酶法制備光活性氨基酸技術(shù)。
光活性氨基酸是構(gòu)成生命蛋白質(zhì)的基本組分，是與人體生命健康密切相關(guān)的基礎(chǔ)物質(zhì)。研究開發(fā)制備光活性氨基酸具有重大意義。目前生產(chǎn)光活性氨基酸的方法大體有三種發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶法。由于酶法具有反應(yīng)專一性強、制備的產(chǎn)品純度高的特點，成為目前世界上公認(rèn)的生產(chǎn)某些稀缺的光活性氨基酸和非天然氨基酸的最佳方法。采用氨基酰化酶生產(chǎn)L-氨基酸的反應(yīng)表達(dá)式如下
采用米曲霉菌提取氨基?；傅募夹g(shù)已有不少的報道，但多數(shù)是采用固相培養(yǎng)，然后破碎分離提取氨基?；?，再制備載體將酶固定其上。這種固定化酶的方法，它的不足之處是工藝路線長，酶的利用率低。
另外，目前用于固定化酶拆分氨基酸的裝置多數(shù)由于酶被污染或酶脫落等原因，造成酶反應(yīng)器運行周期短，操作運行復(fù)雜，不利于生產(chǎn)成本的降低。
本發(fā)明的目的，在于提供一種米曲霉菌的固定化制備氨基?；傅姆椒安鸱只煨被岬难b置。本發(fā)明所提出的固定化制備氨基?；傅姆椒ň哂泄に嚭唵?、酶活保留率高的特點。所提出的拆分裝置具有拆分效率高、操作簡單、生產(chǎn)周期長的特點。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的。選用米曲霉菌(如3042或No.9)作為酶源，經(jīng)在瓊脂斜面上培養(yǎng)后，用無菌水制成濃度約為108孢子/ml的菌懸液，然后將該菌懸液接種在液相培養(yǎng)基中，攪拌發(fā)酵培養(yǎng)成直徑為1-3毫米的米曲霉菌球，將米曲霉菌球與培養(yǎng)液分離后，立即放在液相固定液中進(jìn)行交聯(lián)固定，可得菌體酶活為200-1400U/g，酶活保留率達(dá)50-80％的固定化氨基?；福囵B(yǎng)液的組分重量體積比為黃豆汁8-15％、葡萄糖1.5-4.5％、酵母膏0.2-0.5％、KH2PO4 0.3-0.4％、MgSO4 0.05-0.2％、其余為無菌水；操作控制培養(yǎng)條件為溫度28-30℃、PH值6-7.5、發(fā)酵時間30-46小時；固定液的組分重量體積比為明膠0.8-1.2％、乙二胺1.8-3.0％、戊二醛0.8-1.5％、其余為無菌水；控制固定化條件為溫度20-60℃、反應(yīng)時間0.5-2小時、PH值4-7、菌體與固定液體積比為1∶10。
上述的培養(yǎng)液或者采用如下組分重量體積比為土豆汁15-25％、酵母膏0.15-0.5％、蔗糖1.5-2.5％、KH2PO4 0.2-0.4％、MgSO4 0.1-0.3％、其余均為無菌水。
采用按上述方法制備的固定化氨基?；复呋瘎?，裝在酶反應(yīng)器中，進(jìn)行氨基酸消旋體的拆分反應(yīng)所采用的裝置主要包括料液輸送器、料液貯罐、酶反應(yīng)器、產(chǎn)品貯罐，在酶反應(yīng)器的進(jìn)出口處串聯(lián)耦合切割分子量為4萬-7萬的超濾膜分離反應(yīng)器。
上述的膜分離反應(yīng)器采用的膜組件是中空纖維膜。
上述的膜分離反應(yīng)器采用的膜組件是平板膜。
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明的拆分過程加以說明。


圖1為本發(fā)明采用固定化氨基酰化酶拆分混旋氨基酸的反應(yīng)流程示意圖。
由圖1所示，將欲拆分的反應(yīng)底物配制成一定濃度的溶液后，放在料液貯罐2中，由氮氣瓶1中釋放的氮氣將貯罐2中底物溶液壓送至前置膜分離器3，分離后的溶液由下至上通入裝有固定化氨基酰化酶的酶反應(yīng)器4進(jìn)行拆分反應(yīng)，由頂部溢出的拆分反應(yīng)液流入后置膜分離反應(yīng)器5，繼續(xù)進(jìn)行拆分反應(yīng)，反應(yīng)后的產(chǎn)品經(jīng)膜分離后流入產(chǎn)品貯罐6中，酶被截留在膜反應(yīng)器中。
例1拆分N-乙酰-D、L-丙氨酸在1000毫升三角瓶中裝入100-200毫升培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液的組份重量體積比為黃豆汁10％、葡萄糖2.5％、酵母膏0.3％、KH2PO40.3％、MgSO4 0.1％、其余為無菌水。接入一定量的菌懸液后，于30℃下在旋轉(zhuǎn)半徑為1.0-3.0厘米的搖床上以100-200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速振蕩，培養(yǎng)30-45小時，可得到3.4g直徑為1-3毫米的米曲霉菌球，經(jīng)由明膠0.8％、乙二胺1.8％、戊二醛0.85％、其余為無菌水組成的固定液交聯(lián)固定后，測定固定化氨基?；傅谋让富顬?20U/g；將此酶催化劑裝入圖1所示的拆分工藝流程中，在直徑為1.2厘米的固定床酶反應(yīng)器4中裝總酶活為4600U的固定化氨基酰化酶。在料液貯罐2中裝入0.1M的N-乙酰-D、L丙氨酸(含CoCl25×10-4M)，PH7.0。將氮氣瓶1中的氮氣以0.1MPa的壓力通入料液貯罐2后，控制不同的流速將N-乙酰-D、L-丙氨酸溶液壓送至前置膜分離器3，分離后的溶液由下至上通入裝有固定化氨基?；傅拿阜磻?yīng)器4進(jìn)行拆分反應(yīng)，由頂部溢出的拆分反應(yīng)液流入后置膜分離反應(yīng)器5，繼續(xù)進(jìn)行拆分反應(yīng)。反應(yīng)后的產(chǎn)品經(jīng)膜分離后流入產(chǎn)品貯罐6中，酶被截留在膜反應(yīng)器中，當(dāng)流速低于10ml/h時，其拆分率為100％，連續(xù)操作20天后，酶反應(yīng)器—膜耦聯(lián)反應(yīng)器的拆分率仍在87％以上。
例2拆分N-乙酰-D、L-苯丙氨酸按例1中所述制備固定化氨基?；傅姆椒?，將制得一定量的固定化氨基?；阜旁诖搀w積為36.3cm3的固定床酶反應(yīng)器4中，在料液貯罐2中放入0.1M N-乙酰-D、L-苯丙氨酸；用磷酸緩沖液調(diào)整PH＝7，在室溫條件下按圖1所述的流程進(jìn)行拆分反應(yīng)，當(dāng)體積流速為12ml/h時，拆分率接近100％。用此體系連續(xù)拆分56天，體系的酶活保留率仍為64.6％。將拆分液用醋酸調(diào)PH值至5.0，減壓蒸濃，用乙醇分離，得到白色L-苯丙氨酸產(chǎn)品，拆分收率為72.8％，產(chǎn)品旋光值[α]D20＝-34.74°，符合醫(yī)用氨基酸旋光標(biāo)準(zhǔn)。
例3拆分N-乙酰-D、L-蛋氨酸在5升的機械攪拌發(fā)酵罐中裝入3升培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液的組分重量體積比為黃豆汁12％、葡萄糖2.0％、酵母膏0.4％、KH2PO4 0.3％、MgSO4 0.05％，并用流加NH3水保持發(fā)酵液PH值6.5-7.0，接入一定量的菌懸液后于30℃下以100-200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速攪拌發(fā)酵，同時按0.5-2倍V8/min氣速通入無菌空氣，經(jīng)30-45小時發(fā)酵可得到36g直徑為1-3毫米的米曲霉菌球體，經(jīng)由明膠1.1％、乙二胺2.9％、戊二醛1.0％組成的固定液交聯(lián)固定后，測定其固定化氨基?；覆鸱諲-乙酰-D、L-蛋氨酸的比酶活為450U/g，按附圖的拆分工藝流程，在固定床酶反應(yīng)器4中裝入總酶活為11400U的酶催化劑，將0.1M N-乙酰-D、L-蛋氨酸，溶液PH7.0，用氮氣以0.1MPa的壓力由貯罐2流入固定床酶反應(yīng)器4-膜分離反應(yīng)器5，當(dāng)流速低于12毫升/小時，其拆分率為100％，連續(xù)操作60天，體系的酶活保留率仍大于60％。將拆分液用醋酸調(diào)至PH5.0，減壓蒸濃，再用乙醇分離，得白色L-蛋氨酸，拆分收率為71％。測定產(chǎn)品旋光值為[α]D20＝+23.0°，表明已符合醫(yī)用蛋氨酸旋光標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的實施，其關(guān)鍵技術(shù)有兩點一是采用較便宜的黃豆汁或土豆汁為主的培養(yǎng)液將米曲霉菌培養(yǎng)成球，并用明膠-乙二胺-戊二醛三元體系作交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，實現(xiàn)氨基?；傅墓潭ɑ２捎命S豆汁或土豆汁為主的培養(yǎng)液是本發(fā)明的一個突出優(yōu)點，它比一般采用牛肉膏、蛋白胨為主的培養(yǎng)液不但經(jīng)濟(jì) 便宜、來源豐富，而且所產(chǎn)酶量高、菌體與培養(yǎng)液分離容易，采用的明膠-乙二胺-戊二醛三元體系固定液，固定化后的菌體其比酶活在200-1400U/g，酶活保留率高達(dá)50-80％。二是采用本發(fā)明的固定化氨基酰化酶進(jìn)行拆分反應(yīng)的酶反應(yīng)器串聯(lián)耦合了膜分離反應(yīng)器，前置膜分離器主要起到了分離作用，后置膜分離反應(yīng)器既起分離作用又起進(jìn)一步反應(yīng)作用，這樣不但可有效延長酶反應(yīng)器的操作周期，而且又可凈化產(chǎn)品，簡化了后續(xù)分離操作。
權(quán)利要求
1.一種米曲霉菌固定化制備氨基?；傅姆椒?，它是選用米曲霉菌作為酶源，經(jīng)在瓊脂斜面上培養(yǎng)后，用無菌水制成濃度約為108孢子/ml的菌懸液，然后將該菌懸液接種在液相培養(yǎng)基中，經(jīng)攪拌發(fā)酵培養(yǎng)成直徑為1-3毫米的米曲霉菌球，將米曲霉菌球與培養(yǎng)液分離后，立即放在液相固定液中進(jìn)行交聯(lián)固定，得到菌體酶活為200-1400U/g，酶活保留率達(dá)50-80％的固定化氨基酰化酶，其特征在于培養(yǎng)液的組分重量體積比為黃豆汁8-15％、葡萄糖1.5-4.5％、酵母膏0.2-0.5％、KH2PO40.3-0.4％、MgSO4 0.05-0.2％、其余為無菌水；操作控制培養(yǎng)條件為溫度28-30℃、PH值6-7.5、發(fā)酵時間30-46小時；固定液的組分重量體積比為明膠0.8-1.2％、乙二胺1.8-3.0％、戊二醛0.8-1.5％、其余為無菌水；控制固定化條件為溫度20-60℃、反應(yīng)時間0.5-2小時、PH值4-7、菌體與固定液體積比為1∶10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說米曲霉菌固定化制備氨基?；傅姆椒?，其特征在于培養(yǎng)液組分重量體積比為土豆汁15-25％、酵母膏0.15-0.5％、蔗糖1.5-2.5％、KH2PO4 0.2-0.4％、MgSO40.1-0.3％、其余均為無菌水。
3.一種以根據(jù)權(quán)利要求1所說的米曲霉菌固定化方法所制備的氨基?；?，拆分混旋氨基酸的裝置主要包括料液輸送器、料液貯罐、酶反應(yīng)器、產(chǎn)品貯罐，其特征在于在酶反應(yīng)器的進(jìn)出口處串聯(lián)耦合切割分子量為4萬-7萬的超濾膜分離反應(yīng)器。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所說的拆分混旋氨基酸的裝置，其特征在于膜分離反應(yīng)器采用的膜組件是中空纖維膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所說的拆分混旋氨基酸的裝置，其特征在于膜分離反應(yīng)器采用的膜組件是平板膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種米曲霉菌固定化制備氨基?；傅姆椒安鸱只煨被岬难b置。屬于酶活制備光活性氨基酸技術(shù),所述的固定化方法是以米曲霉菌為酶源,經(jīng)在黃豆汁或土豆汁為主的培養(yǎng)液中培養(yǎng)并在明膠—乙二胺—戊二醛三元體系固定液中進(jìn)行固定化制備而成。其制備工藝路線短,酶活保留率可達(dá)50—80%。所述的拆分裝置,采用了酶反應(yīng)器進(jìn)出口處串聯(lián)耦合超濾膜分離反應(yīng)器,該裝置不但具有拆分效率高,而且還具有操作簡單、生產(chǎn)周期長等特點。
文檔編號C12M1/12GK1263153SQ9912092
公開日2000年8月16日 申請日期1999年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月24日
發(fā)明者崔英波, 賈曉波, 張新法, 劉引青, 丁彩平 申請人:崔英波, 賈曉波