專利名稱：一種可用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母及其制備方法。
人體容易缺鐵，特別是兒童和孕婦，目前醫(yī)藥上用無機(jī)鐵(如硫酸亞鐵)補(bǔ)充人體需要，以減少因缺鐵而引起貧血癥，但效果很差，因無機(jī)鐵不易吸收，且口感不好，易引起惡心和降低食欲，國(guó)際上都正在以鐵蛋白補(bǔ)鐵為研究方向。我們?cè)弥参镏械蔫F氧還蛋白(Ferredoxin)基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中用于提取補(bǔ)鐵蛋白(申請(qǐng)?zhí)?8125609.0)。
本發(fā)明目的是提供一種可用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母及其生產(chǎn)方法，該方法中獲得的工程菌酵母的鐵蛋白表達(dá)量高，含鐵量多。
為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案這種可用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母，它含有鐵蛋白，每分子8.9KD的蛋白含有8個(gè)鐵原子。
用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母的方法包括以下步驟①工程菌酵母的制備，它包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建，得到pYES2-psaC表達(dá)載體；酵母的轉(zhuǎn)化，經(jīng)電擊法將表達(dá)載體進(jìn)入酵母；②轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母的生產(chǎn)，它包括轉(zhuǎn)基因酵母在高密度的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再經(jīng)破壁、干燥、粉碎得到粉末產(chǎn)品。
現(xiàn)在我們使用的鐵蛋白(PsaC)是植物中廣泛存在的一種蛋白質(zhì)，例如，聚球蘭藻中的鐵蛋白，在它的每分子中含有8個(gè)鐵原子，其分子量是8900道爾頓，也是一種非血晶質(zhì)的鐵。
以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明

圖1．重組質(zhì)粒pYES2-psaC構(gòu)建2．聚球蘭藻psaC的基因序列和蛋白序列圖3．重組質(zhì)粒pYES2-psaC的酶切鑒定圖譜圖4．轉(zhuǎn)PsaC基因酵母的Southern鑒定圖5．psaC基因在酵母中高效表達(dá)鑒定圖譜圖2中，蛋白中的氨基酸用一字英文字母表示法。圖3中，M為標(biāo)準(zhǔn)DNA(pBR322/BstNⅠ Marker)，Ⅰ為質(zhì)粒的酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)結(jié)果。證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
圖4中，1．質(zhì)粒酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)；2．pYES2-psaC質(zhì)粒；3．轉(zhuǎn)基因酵母總DNA酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)4．未轉(zhuǎn)基因酵母總DNA對(duì)照。0.45kb為含有psaC基因片段，結(jié)果證明psaC基因已轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母。
圖5中，1．標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；2．pET3a-psaC在大腸桿菌中被表達(dá)的全蛋白對(duì)照；3．含pYES2空載酵母全蛋白對(duì)照；4．含pYES2-psaC的酵母全蛋白。證明psaC基因已在酵母中高效表達(dá)。
實(shí)施例1．工程菌酵母的制備1．重組質(zhì)粒的構(gòu)建首先將載有psaC基因的載體pUC19用XbaⅠ和NdeⅠ雙酶切，獲得的psaC DNA片段被克隆在pET-3a原核表達(dá)載體上。再將pET3a-psaC表達(dá)載體用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，所得psaC片段克隆在pYES2載體上，從而獲得pYES2-psaC表達(dá)載體。構(gòu)建策略見圖1。
以重組質(zhì)粒pYES2-psaC為模板，用T7啟動(dòng)子引物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)ABI PRISMTM777DNA測(cè)序儀測(cè)定，結(jié)果表明psaC序列完全正確，其核苷酸序列和氨基酸序列見圖2，全序列由81個(gè)氨基酸殘基組成。
2．重組質(zhì)粒的酶切鑒定pYES2-psaC表達(dá)載體的酶切鑒定圖譜見圖3。經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到兩條各為5.9kb和0.45kb的預(yù)期片斷，0.45kb片段中含有psaC基因，證明構(gòu)建完全正確。
3．酵母的轉(zhuǎn)化酵母在增殖培養(yǎng)基(1％酵母提取物(市場(chǎng)有售)，2％蛋白胨和2％葡萄糖)中30℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4000×g離心收集菌體。菌體用重蒸水洗滌一次，并用預(yù)冷山梨醇溶液(1mol/L)洗滌兩次，得酵母懸液(OD值為200)。取40ul酵母懸液與5ul質(zhì)粒DNA(100ug)混合，在150V,25uF和200Ω下電擊4.2-4.9ms。電擊后加入1ml預(yù)冷山梨醇溶液(1mol/L)，在選擇性培養(yǎng)基(1mol/L山梨醇，0.17％YNB-AA/As,0.5％(NH4)2SO4，2％葡萄糖，0.01％L-His,0.01％L-Leu,0.01％L-Trp和2％瓊脂)上，30℃培養(yǎng)，2-3天后出現(xiàn)克隆斑。
4．轉(zhuǎn)化酵母的鑒定經(jīng)電擊法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母后，對(duì)酵母的PsaC進(jìn)行Southern雜交分析，分析結(jié)果如圖4。由圖4表明psaC基因已被整合到酵母中。
實(shí)施例2．轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因酵母在高密度的液體培養(yǎng)基上30℃通氣培養(yǎng)12小時(shí)內(nèi)即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高峰，每升培養(yǎng)液可獲得15克酵母干粉，產(chǎn)品含鐵量達(dá)5％。培養(yǎng)基配方為發(fā)芽黃豆10克，沸水100ml，煮30分后，溶液中加入蔗糖8克、酵母提取物1克、胰蛋白胨1克，配方中還含微量元素(銅、鈷、鈣、鋅、鉬、錳)各10-5-10-4克分子/升，6ml飽和延胡索酸鐵溶液。
上述培養(yǎng)的酵母經(jīng)高壓細(xì)胞破碎儀破璧，上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳測(cè)定，表明psaC基因被表達(dá)，電泳結(jié)果見圖5。
大量生產(chǎn)上可經(jīng)板框過濾得濕酵母，再加熱干燥粉碎即可得富鐵酵母粉。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)①首次用轉(zhuǎn)植物鐵蛋白基因到酵母中，并用于給人補(bǔ)鐵。
②工程菌酵母的產(chǎn)物表達(dá)量高，不用純化即可為人補(bǔ)鐵，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
③面包酵母中除含有大量鐵外，還有其它豐富的營(yíng)養(yǎng)有助于人體健康。
④由于使用高密度培養(yǎng)基，酵母產(chǎn)量高，每升培養(yǎng)基可產(chǎn)生15克酵母干粉，產(chǎn)品含鐵量達(dá)5％。
權(quán)利要求
1.一種可用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母，其特征在于它含有鐵蛋白，每分子8.9KD的蛋白含有8個(gè)鐵原子。
2.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母的方法，其特征在于它包括以下步驟①工程菌酵母的制備，它包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建，得到pYES2-psaC表達(dá)載體；酵母的轉(zhuǎn)化，經(jīng)電擊法將表達(dá)載體進(jìn)入酵母；②轉(zhuǎn)基固鐵蛋白酵母的生產(chǎn)，它包括轉(zhuǎn)基因酵母在高密度的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再經(jīng)破壁、干燥、粉碎得到粉末產(chǎn)品。
3.按權(quán)利要求2所述鐵蛋白酵母生產(chǎn)方法其特征在于所用的高密度培養(yǎng)基配方為發(fā)芽黃豆10克，水100ml，煮后，溶液中加入蔗糖8克、酵母提取物1克、胰蛋白胨1克，配方中還含微量元素(銅、鈷、鈣、鋅、鉬、錳)各10-5-10-4克分子/升，6ml飽和延胡索酸鐵溶液。
全文摘要
一種可用于人體補(bǔ)鐵的轉(zhuǎn)基因鐵蛋白酵母及其生產(chǎn)方法,方法包括:工程菌酵母的制備及其高密度培養(yǎng),所述的高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為發(fā)芽黃豆10克,水100ml,煮后,溶液中加入蔗糖8克、酵母提取物1克、胰蛋白胨1克,配方中還含微量元素(銅、鉆、鈣、鋅、鉬、錳)各10
文檔編號(hào)C12N15/81GK1301811SQ9912733
公開日2001年7月4日 申請(qǐng)日期1999年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月29日
發(fā)明者吳光耀, 趙進(jìn)東, 李斌 申請(qǐng)人:吳光耀