專利名稱：融合鐵蛋白在疫苗和其他方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及融合鐵蛋白，特別是在鐵蛋白內(nèi)部和外部的N端和/或C端融合其他蛋白或肽片段形成能夠自組裝的融合蛋白，以及該類融合蛋白在作為疫苗和其他方面的應(yīng)用，包括運(yùn)輸氧氣以及治療性導(dǎo)入藥物和其他治療藥劑。
背景技術(shù)：
鐵蛋白含有高度保守的24個(gè)亞基，這些亞基存在于所有的動(dòng)物、細(xì)菌和植物中。鐵蛋白的主要生理作用是控制多核Fe(III)2O3形成的速度和定位。(見(jiàn)Theil，E.C.等人在《Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.》上發(fā)表的文章，1990，63421-449；Harrison，P.M.，Lilley，T.H.等人在Loehr T.M.編著的《WeinheimVCH》中的文章，1990，33-452)該控制作用是通過(guò)生物礦化作用，將水合鐵離子和質(zhì)子運(yùn)進(jìn)和運(yùn)出含無(wú)機(jī)物的內(nèi)核實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)這一機(jī)制使鐵蛋白積累的鐵離子強(qiáng)度大于生理狀態(tài)下可溶性的游離鐵離子強(qiáng)度。生物礦化作用的速度直接與每個(gè)鐵蛋白顆粒內(nèi)的H亞基和L亞基(即所謂的輕鏈和重鏈)的比例相關(guān)，H亞基含量增加時(shí)表現(xiàn)出鐵離子儲(chǔ)存速度增加的趨勢(shì)。蛋白顆粒的組成差異具有組織特異性，并影響鐵的氧化代謝、核心形成和鐵循環(huán)的機(jī)制。比如，血清中的鐵蛋白主要由L鏈組成，來(lái)自于心臟的鐵蛋白H鏈含量較高。鐵蛋白礦化核心為不同的氧化酶提供鐵離子，而且起到還原的作用。
每個(gè)鐵蛋白由24個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含有432個(gè)對(duì)稱體，直徑125埃，顆粒厚度約為25埃，中空的內(nèi)部核心直徑約為80埃(

圖1)。典型的鐵蛋白單體含有至少兩個(gè)異構(gòu)體，由H鏈和L鏈組成，二者在氨基酸序列上不同。在許多脊椎動(dòng)物包括人中已經(jīng)確定H亞基和L亞基的長(zhǎng)度，這兩種結(jié)構(gòu)體通常存在于已經(jīng)確證的鐵蛋白中。每個(gè)鐵蛋白亞基分子量大約為17道爾頓，具有束狀螺旋的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包含4個(gè)反向平行螺旋基序和一個(gè)短螺旋(C端螺旋)，該螺旋大致與第4個(gè)束狀螺旋的長(zhǎng)軸垂直。依據(jù)慣例從N端開(kāi)始分別將螺旋標(biāo)記為“A，B，C，D和E”。N端序列與顆粒第3個(gè)折疊軸相鄰并明顯延伸到顆粒表面，而E螺旋與第4個(gè)折疊軸擠壓在一起，其C端延伸到顆粒核心。擠壓的結(jié)果是在蛋白顆粒表面形成2個(gè)孔。位于第四個(gè)折疊的孔大約有4-5埃，主要為疏水性；而位于第三個(gè)折疊的孔直徑略大，是6.0埃，主要為親水性。這兩個(gè)孔或其中一個(gè)可能是水合鐵離子擴(kuò)散出入顆粒的通道。
以前關(guān)于鐵蛋白的研究工作，如5,248,589；5,358,722和5,304,382號(hào)美國(guó)專利，通過(guò)引證被并入本文均列在參考文獻(xiàn)中，主要集中在蛋白外殼和內(nèi)核的生理作用方面，如除了含鐵水合物以外的物質(zhì)可能定位于殼內(nèi)。通過(guò)差示掃描量熱法研究顯示(見(jiàn)SP MartseV，AP Vlasov，P Arosio，等人在《Proterin Engineering》發(fā)表的文章，1998，11，377-381)重組人L和H鐵蛋白在pH2.0到2.8之間時(shí)解離成亞基單體。
其他方面的工作包括使用病毒樣顆粒作為疫苗的結(jié)構(gòu)模型，在缺少佐劑的的情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)，保護(hù)免受病毒感染和過(guò)敏反應(yīng)(見(jiàn)Lechner等人在《Intervirology》發(fā)表的文章，2002，212-217，45(4-6))，但該系統(tǒng)不包括以鐵蛋白為基礎(chǔ)的蛋白開(kāi)發(fā)系統(tǒng)。在Marchenko等人在2003年《J.Mol.Microbiol Biotechnol》5(2)97-104頁(yè)發(fā)表的文章中，已知蛋白P1-380能夠形成病毒樣顆粒(VLP)。在該研究中，P1-380蛋白的C端和/或N端融合后不影響VLP的自組裝，具有雙功能的融合蛋白顆粒顯示出誘導(dǎo)更強(qiáng)免疫反應(yīng)的能力。Douglas等人還進(jìn)行了以下研究一種形成鐵離子核的蛋白與豇豆花葉病毒(CCMV)相連，具體參考發(fā)表在《Adv.Mater.》上的文章，2002，14(6)，415-418頁(yè)。其他的融合蛋白還有包含與乳頭瘤病毒非結(jié)構(gòu)蛋白L2，一種次要結(jié)構(gòu)蛋白，融合形成的病毒樣顆粒的嵌合蛋白，具體參考Greenstone等人在《PNAS USA》上發(fā)表的文章，1998，95(4)，1800-1805頁(yè)。但是以上所有的融合蛋白中都不包括鐵蛋白。
因此，以前的文獻(xiàn)均未對(duì)鐵蛋白的使用或分別對(duì)顆粒外表面和內(nèi)表面的N端和C端的任何用途進(jìn)行過(guò)研究(如圖2A和B顯示)，而且也沒(méi)有人利用該結(jié)構(gòu)通過(guò)與鐵蛋白融合連接其他蛋白或肽以加強(qiáng)這些蛋白或肽的特性，產(chǎn)生能夠自組裝的的融合蛋白。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供包括與鐵蛋白N端和/或C端融合的蛋白或肽片段的融合鐵蛋白。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是除了提供融合鐵蛋白，還提供一種表達(dá)蛋白的方法，表達(dá)蛋白既可以與顆粒表面結(jié)合，也可以通過(guò)任一蛋白末端的延伸的內(nèi)在化表達(dá)。
本發(fā)明的又一目標(biāo)是提供融合蛋白產(chǎn)品，可應(yīng)用于疫苗、治療、圖象襯比試劑、新的金屬鰲合系統(tǒng)、膠凝劑、蛋白純化平臺(tái)、治療性受體結(jié)合蛋白和其他適當(dāng)?shù)膽?yīng)用。
本發(fā)明的再一目標(biāo)是提供可以在醫(yī)人和醫(yī)獸中應(yīng)用及其他許多非治療方面中應(yīng)用的融合鐵蛋白。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供能延長(zhǎng)動(dòng)脈停留時(shí)間的融合鐵蛋白，這樣可以促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生，使藥物和其他治療藥劑發(fā)揮更長(zhǎng)時(shí)間的治療作用。
本發(fā)明的其它目標(biāo)是提供重組融合鐵蛋白在疫苗、藥物導(dǎo)入和其他許多治療方面的應(yīng)用，重組融合鐵蛋白包括能融合到鐵蛋白上的蛋白和肽且不影響蛋白的自組裝或形成高級(jí)聚合結(jié)構(gòu)的能力如形成顆粒結(jié)構(gòu)或聚合體的片段。
本發(fā)明的這些目標(biāo)及其它目標(biāo)是提供包含外源蛋白或肽的融合鐵蛋白，并能形成聚合結(jié)構(gòu)如鐵蛋白顆粒或其他聚合體，外源蛋白或肽與鐵蛋白N或C末端連接。所融合的外源蛋白或肽不會(huì)限制融合蛋白形成具有功能的高級(jí)結(jié)構(gòu)如顆粒結(jié)構(gòu)，但也可能形成其他的聚合結(jié)構(gòu)如半球形，柱狀等。依照本發(fā)明，融合鐵蛋白提供了一種表達(dá)蛋白的方法，可以與鐵蛋白外部如顆粒表面連接，或通過(guò)蛋白末端延伸融合表達(dá)在蛋白內(nèi)部。本發(fā)明的融合蛋白有多種形式，病毒包膜和衣殼蛋白與鐵蛋白融合可以作為病毒疫苗使用。此外因?yàn)楸景l(fā)明的方法還可以融合表達(dá)多種蛋白和肽，可以構(gòu)建多價(jià)融合蛋白，如來(lái)自同一生物體的不同蛋白或來(lái)自不同生物體的相同蛋白作為多價(jià)疫苗。
此外，形成鐵蛋白顆粒結(jié)構(gòu)時(shí)，C端位于鐵蛋白內(nèi)部核心位置，N端位于蛋白外表面，因此可以構(gòu)建這樣的疫苗與鐵蛋白表面連接的第一種蛋白或肽抗原能快速誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，而第二種所需抗原與內(nèi)部C端連接，從而在開(kāi)始的免疫反應(yīng)中受到屏蔽達(dá)到延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的目的。因此該類疫苗的第一部分能誘導(dǎo)產(chǎn)生最初的抗體，疫苗的第二部分只有在經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后降解與鐵蛋白核心解離暴露第二種抗原才具有免疫原性。這種內(nèi)部屏蔽作用為導(dǎo)入非水溶性抗原提供了方法。而且，因?yàn)榕c鐵蛋白連接，還能增強(qiáng)融合蛋白或肽在降解前的有效作用時(shí)間，有利于治療性蛋白或肽發(fā)揮作用。本發(fā)明中融合蛋白的其他優(yōu)點(diǎn)還有當(dāng)不希望偶聯(lián)表達(dá)的多肽或蛋白引起免疫反應(yīng)時(shí)可以使用人源顆粒(或在獸醫(yī)中使用動(dòng)物來(lái)源的顆粒)避免產(chǎn)生免疫相關(guān)問(wèn)題。另一個(gè)應(yīng)用是使用鐵蛋白顆粒組裝人血紅蛋白聚合體作為運(yùn)輸血液中氧的替代品。最后這類融合蛋白在其他方面也有作用，如清除金屬，包裹有用的蛋白或小分子，或儲(chǔ)存與抗體相連、針對(duì)特定組織或細(xì)胞的具有放射活性的物質(zhì)。
對(duì)于讀過(guò)本說(shuō)明書(shū)和/或引入本文作為參考的此領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明的公開(kāi)范圍內(nèi)的實(shí)施方案和其選擇方案和修改是顯而易見(jiàn)的，所有這樣的方案引入本文作為參考。
圖示簡(jiǎn)介圖1是鐵蛋白顆粒的連續(xù)剖面圖，從四個(gè)折疊軸(中心)的角度觀察，亞基以醒目的顏色表示。
圖2A-2B顯示鐵蛋白顆粒下部四個(gè)折疊軸(中心)的1/3圖形立體圖.清晰標(biāo)出外部N端和內(nèi)部C端，說(shuō)明可以利用末端構(gòu)建重組融合蛋白或肽。圖2A顯示顆粒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，圖2B顯示外表面結(jié)構(gòu)。
圖3為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的人血紅蛋白α鏈與人鐵蛋白C端融合的蛋白。
圖4為在第四個(gè)折疊軸周圍組裝的亞基立體結(jié)構(gòu)圖。箭頭所示是亞基假定的旋轉(zhuǎn)方向，通過(guò)旋轉(zhuǎn)可容納較大的C端融合蛋白。
圖5為(FL.G.Hα)的正則直方圖。
圖6為馬心臟天然鐵蛋白的正則直方圖。
圖7為(FL.GG.Ag4)的正則直方圖。
圖8為(FL.GG.Ag4)特有顆粒構(gòu)像的透射電鏡圖。
圖9為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的HIV Tat蛋白(84個(gè)氨基酸)與人鐵蛋白N端連接的融合蛋白。
圖10為使用針對(duì)Tat的多克隆抗體進(jìn)行的免疫印跡分析圖，確證了本發(fā)明中鐵蛋白-Tat蛋白成功構(gòu)建。
圖11為(Tat.6G.FL)的正則直方圖。
圖12A為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的HIV Tat小肽與人鐵蛋白輕鏈N端連接的融合蛋白。
圖12B為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的HIV P24蛋白與人鐵蛋白輕鏈N端連接的融合蛋白。
本發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，融合鐵蛋白是指至少在鐵蛋白的一個(gè)鏈如H或L鏈融合有外源蛋白，這些蛋白或肽能夠與鐵蛋白的N端或C端結(jié)合且不影響融合蛋白形成聚合結(jié)構(gòu)如顆粒、聚合體或其他功能性結(jié)構(gòu)的能力。鐵蛋白含有高度保守的24個(gè)蛋白亞基，這些亞基存在于所有動(dòng)物、細(xì)菌和植物中，主要作用是通過(guò)從礦化核心運(yùn)進(jìn)和運(yùn)出水合鐵離子和質(zhì)子來(lái)控制多核Fe(III)2O3形成的速度和定位。通過(guò)這一機(jī)制，鐵蛋白積累了一定濃度的鐵離子，其濃度在生理狀態(tài)下高于可溶性游離鐵離子。生物礦物化作用的速度直接與鐵蛋白顆粒內(nèi)的H亞基和L亞基(即所謂的輕鏈和重鏈)的比例相關(guān)，隨著H鏈含量增高其儲(chǔ)存鐵的速度也隨著增高。這種顆粒組成的差異具有組織特異性，影響鐵的氧化，核心形成和鐵的運(yùn)轉(zhuǎn)。鐵蛋白的礦物化核心能夠?yàn)樵S多氧化還原酶提供具有生物活性的鐵離子，還具有解毒作用。
每個(gè)鐵蛋白由24個(gè)亞基組成顆粒，每個(gè)顆粒含432個(gè)對(duì)稱體，直徑為125埃，外殼厚度約為25埃，中空的內(nèi)部核心直徑約為80埃(圖1)。典型的鐵蛋白單體結(jié)構(gòu)至少有含有H鏈和L鏈的兩種異構(gòu)體，這兩種鏈的差異在于氨基酸序列的不同。在包括人的脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了多種長(zhǎng)度的H亞基和L亞基。每個(gè)鐵蛋白亞基的分子量約為17Kd，具有束狀螺旋的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括4個(gè)反平行螺旋基序和一個(gè)短螺旋(C端螺旋)，該短螺旋與第4個(gè)螺旋束的長(zhǎng)軸大致垂直。依據(jù)慣例從N端開(kāi)始分別將螺旋標(biāo)記為“A，B，C，D和E”。N端序列與顆粒的第3個(gè)折疊軸相鄰，延伸到蛋白表面，而E螺旋在第4個(gè)折疊軸擠壓在一起，其C端延伸到顆粒核心。螺旋擠壓在顆粒表面形成兩個(gè)小孔。位于第4折疊區(qū)的小孔約有4-5埃，主要為疏水性。位于第3折疊區(qū)的小孔稍大些，直徑約有6.0埃，主要為親水性。這兩個(gè)孔或其中一個(gè)可能是水合鐵離子擴(kuò)散出入顆粒的通道。
根據(jù)本發(fā)明，可以將適當(dāng)?shù)牡鞍谆螂娜诤系借F蛋白的N端，緊鄰蛋白顆粒的第三個(gè)折疊軸形成顆粒外產(chǎn)物；或者將蛋白或肽融合到C端，延伸到蛋白核心形成顆粒內(nèi)產(chǎn)物，或者是以上二者的集合體。這里所說(shuō)的鐵蛋白是指鐵蛋白和/或它的H鏈和/或L鏈以及鐵蛋白類似物如5,304,382號(hào)美國(guó)專利中所描述的，在此通過(guò)引證被并入本文，還包括去鐵鐵蛋白和那些具有鐵蛋白結(jié)構(gòu)的蛋白，即蛋白外表面為N端區(qū)域，內(nèi)部核心為C端區(qū)域。本發(fā)明使用的蛋白或肽包括那些氨基酸序列能與鐵蛋白連接但不影響其結(jié)構(gòu)的蛋白、多肽、抗體、片斷、酶、半抗原、肽聚糖或其他分子。融合鐵蛋白表達(dá)后自組裝成大分子或聚合結(jié)構(gòu)，與天然鐵蛋白具有相同的構(gòu)和構(gòu)像(N端在表面，C端在內(nèi)部核心)。
根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)融合產(chǎn)物時(shí)，有必要考慮在每個(gè)鐵蛋白和與鐵蛋白融合的蛋白或肽之間包括“間隔”結(jié)構(gòu)的殘基，如甘氨酸或其他適當(dāng)?shù)陌被?。一般而言間隔結(jié)構(gòu)能增加鐵蛋白中心與連接蛋白或肽之間的距離，如希望增加鐵蛋白與融合蛋白或肽之間的空間時(shí)。鐵蛋白與具有抗原性的蛋白或肽連接時(shí)該類情況較多。因?yàn)槌浞直┞犊乖欣诋a(chǎn)生抗體如在疫苗的使用中。此外，本發(fā)明的融合蛋白是抗體與鐵蛋白連接，間隔結(jié)構(gòu)能減少鐵蛋白與融合蛋白之間的空間位阻，使抗體更好的與目標(biāo)結(jié)合。通常連接的分子越大就越需要充足的間隔結(jié)構(gòu)。因此在本發(fā)明的融合產(chǎn)物中，無(wú)論是顆粒內(nèi)融合產(chǎn)物還是顆粒外融合產(chǎn)物，如果顆粒外部需要足夠的空間容納較大蛋白時(shí)，均可利用一個(gè)或更多的甘氨酸殘基(或其他適當(dāng)?shù)陌被?。通常選擇甘氨酸因?yàn)樗梢孕纬删哂袕椥缘摹版湣?，容易適應(yīng)外伸的多肽構(gòu)像。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的一樣，根據(jù)生理或物理需要，當(dāng)需要屏蔽環(huán)境中的滅活或其他造成蛋白降解或切除因素時(shí)，可以將目標(biāo)蛋白或肽融合到鐵蛋白內(nèi)部；不需要屏蔽蛋白如希望引起更加快速的免疫反應(yīng)時(shí)目標(biāo)蛋白或肽可融合到蛋白外部。此外還可以利用顆粒內(nèi)部(C端)或外部(N端)融合蛋白形成混合顆粒，如在顆粒表面或內(nèi)部表達(dá)多種抗原蛋白或肽?？梢岳眠@個(gè)方法確保發(fā)生抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外可以利用相同方法表達(dá)的多種酶為多步生化反應(yīng)產(chǎn)生高度濃縮的酶“工廠”。通過(guò)相同載體多重表達(dá)或使用已知方法使顆粒解離后再與目的產(chǎn)物重新連接形成混合物的方法構(gòu)建這類多價(jià)嵌合鐵蛋白。
本發(fā)明利用N端和C端分別在聚合結(jié)構(gòu)外部和內(nèi)部的定位(圖2A和2B)，將蛋白或肽連接到這些特定位置構(gòu)建融合蛋白。在優(yōu)選實(shí)施例中，使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浔景l(fā)明的融合鐵蛋白，其中至少有一種蛋白或肽與鐵蛋白連接，且不會(huì)影響融合蛋白形成聚合結(jié)構(gòu)，即融合鐵蛋白形成穩(wěn)定多聚體結(jié)構(gòu)時(shí)蛋白或肽仍與鐵蛋白保持連接，鐵蛋白保持基本的內(nèi)部核心和外部表面結(jié)構(gòu)，外表面的N端或內(nèi)表面的C端與蛋白或肽連接(或在兩個(gè)部位都進(jìn)行連接)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是融合蛋白具有鐵蛋白形成聚合顆粒結(jié)構(gòu)的特性?？梢岳斫獾氖?，鐵蛋白具有自組裝的趨勢(shì)是有利的，表現(xiàn)出多種不同的形式，不僅是顆粒結(jié)構(gòu)，還有其他的聚合結(jié)構(gòu)如聚合體、半球形、柱狀等結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明與鐵蛋白融合的自組裝產(chǎn)物具備多種應(yīng)用如疫苗和以下詳細(xì)描述的方面。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適當(dāng)方法構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白，如重組表達(dá)或通過(guò)物理或化學(xué)方法與單個(gè)蛋白連接構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，融合鐵蛋白具有融合到外部如與外部N端連接的蛋白或通過(guò)與C端連接表達(dá)在內(nèi)部的蛋白。正如下面詳細(xì)描述的一樣，本發(fā)明中融合蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域包括疫苗、治療、圖象襯比試劑、新的金屬鰲合系統(tǒng)、膠凝劑、蛋白純化平臺(tái)、治療性受體結(jié)合蛋白等，在人和獸醫(yī)中還有許多非治療方面的應(yīng)用。
如上所述，使用基因工程領(lǐng)域常規(guī)的重組技術(shù)就能構(gòu)建本發(fā)明中重組表達(dá)的融合鐵蛋白。如使用分子克隆的方法構(gòu)建融合蛋白，比如通過(guò)與適當(dāng)?shù)蔫F蛋白如人鐵蛋白L鏈連接，在大腸桿菌中表達(dá)制備重組人血紅蛋白α亞基。在這一過(guò)程中，使用以PCR為基礎(chǔ)的方法將血紅蛋白α亞基的全長(zhǎng)cDNA與鐵蛋白輕鏈基因的C端通過(guò)甘氨酸連接子連接(圖3)?；驑?gòu)建完成后，進(jìn)行蛋白表達(dá)和分離和/或純化。首先對(duì)融合蛋白(如鐵蛋白/血紅蛋白融合蛋白)的編碼序列測(cè)序以確保重組體具有正確的DNA序列。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。當(dāng)細(xì)菌繁殖到合適濃度如OD值為1.0(600nm)時(shí)，加入1mM IPTG激活T7啟動(dòng)子，在30℃誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后細(xì)菌重懸在B-PER緩沖液中進(jìn)行超聲破碎釋放蛋白。然后對(duì)融合蛋白進(jìn)行分離和/或純化，如采用合適的層析方法或其他方法如分子排阻、凝膠過(guò)濾、離子交換層析等從上清液中分離蛋白。使用適當(dāng)?shù)亩嗫寺『蛦慰寺】贵w通過(guò)常規(guī)的免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行蛋白確證。
本發(fā)明中的融合蛋白構(gòu)建完成后，通過(guò)下列觀察對(duì)顆粒構(gòu)像進(jìn)行確認(rèn)1)分子排阻凝膠層析純化的表達(dá)產(chǎn)物具有與比天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量，408K)稍大的蛋白復(fù)合物一致的保留效應(yīng)；2)使用光度計(jì)檢測(cè)單個(gè)蛋白的分散性，顯示蛋白直徑約是天然鐵蛋白的兩倍(圖6和表2)；
3)使用適當(dāng)?shù)亩嗫寺】贵w(如在上述實(shí)施例中，同時(shí)使用人鐵蛋白和血紅蛋白α的多克隆抗體)與融合蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，分別得到陽(yáng)性結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白中的亞基數(shù)目有可能顯著多于天然鐵蛋白中的24個(gè)亞基數(shù)目，說(shuō)明顆粒具有增加亞基與亞基之間組裝角度的能力，二聚體可能通過(guò)旋轉(zhuǎn)與平行于第二個(gè)折疊軸的“B”螺旋組裝，位于顆粒表面“B-C環(huán)”的彈性使二聚體進(jìn)一步得到穩(wěn)定，B-C環(huán)穿過(guò)第二個(gè)折疊軸形成反平行β折疊。該旋轉(zhuǎn)假說(shuō)得到空間相互作用的支持，顆粒曲率增大為較大的血紅蛋白分子提供更多空間。亞基組裝角度發(fā)生的較小變化與顆粒直徑的顯著增加相關(guān)，使顆粒內(nèi)部能容納更大的融合產(chǎn)物。同時(shí)可以更好的理解通過(guò)對(duì)表面暴露的環(huán)、B-C環(huán)進(jìn)行修飾或替換構(gòu)建“嵌合”鐵蛋白分子，用于疫苗或其他方面。
因此可以利用本發(fā)明的融合蛋白增強(qiáng)多種治療性蛋白和肽的效果。特別是通過(guò)與鐵蛋白連接極大增強(qiáng)了治療性蛋白在血漿中的半衰期，其半衰期通常為18-20個(gè)小時(shí)。因此當(dāng)血液中的非融合蛋白或肽被完全降解后，融合蛋白或肽仍能提供較長(zhǎng)時(shí)間的治療作用。此外，蛋白或肽與鐵蛋白融合后可以避免免疫相關(guān)問(wèn)題，特別是蛋白與鐵蛋白內(nèi)部C端區(qū)域連接時(shí)。同樣，融合鐵蛋白能夠?qū)σ恍┑鞍谆螂?如酶，毒素鰲合物或小分子治療劑)起保護(hù)作用，否則這些蛋白或肽在血液中很快被降解。在這類應(yīng)用中最好將這些蛋白和肽與鐵蛋白C端區(qū)域連接，使它們位于融合蛋白顆粒的內(nèi)部核心部位。
經(jīng)濟(jì)并可測(cè)量的分離純化融合鐵蛋白產(chǎn)物更進(jìn)一步，蛋白或小肽與鐵蛋白外部的酶切位點(diǎn)連接后，根據(jù)鐵蛋白顆粒大小的差異，使用簡(jiǎn)單的超濾對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分離，然后通過(guò)酶切將融合產(chǎn)物容易的分離出來(lái)。因此可以利用融合鐵蛋白平臺(tái)進(jìn)行方便經(jīng)濟(jì)的顆粒外融合產(chǎn)物的分離。
沉淀金屬?gòu)?fù)合物鐵蛋白核心具有沉淀多種金屬?gòu)?fù)合物的特性，包括某些天然狀態(tài)的陶瓷(見(jiàn)5,248,589、5,358,722和5,304,382號(hào)美國(guó)專利)。如實(shí)施例所示在融合蛋白核心表達(dá)一種新的金屬核多肽?？梢岳斫庥捎诮M成金屬或無(wú)機(jī)復(fù)合物的放射性元素具有增強(qiáng)X射線或核磁共振造影劑的作用，這類物質(zhì)可用于多種醫(yī)學(xué)方面的治療、診斷或預(yù)防。還可以理解利用顆粒結(jié)構(gòu)的蛋白核心濃縮和沉淀貴重或稀有金屬(如通常在Fe的實(shí)例中)，利用這些具有特殊功能的蛋白通過(guò)細(xì)菌、酵母等發(fā)酵過(guò)程比較容易對(duì)表達(dá)的目的或非目的無(wú)機(jī)物進(jìn)行分離。最近的研究集中在控制半導(dǎo)體材料中極小粒子生產(chǎn)的顆粒大小方面。
抗體介導(dǎo)的治療性病毒樣顆粒(VLPs)由抗體Fv片斷或更大結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的顆粒外融合產(chǎn)物能夠介導(dǎo)在顆粒內(nèi)或在表面表達(dá)的治療或診斷制劑到特定部位。在這一實(shí)施例中，針對(duì)或摧毀細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的蛋白或肽與鐵蛋白連接后再與抗體(或抗體的活性區(qū)域如活性片斷)連接，這樣形成的融合蛋白將直接針對(duì)靶組織(如腫瘤)。因此根據(jù)本發(fā)明可以將以這類方式結(jié)合的顆粒蛋白包括毒素蛋白，放射性元素或其他破壞性因子直接導(dǎo)入腫瘤組織。
以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液替代品與血紅蛋白融合的鐵蛋白可以作為新的血液替代品。這類嵌合鐵蛋白的潛在優(yōu)點(diǎn)包括1)增加血管內(nèi)殘留時(shí)間；2)降低與內(nèi)皮的相互作用，限制或消除與氧化氮結(jié)合引起的副作用；3)組裝方式可以保護(hù)血紅蛋白的Fe免受不必要的氧化；4)聚合體形式能防止血紅蛋白α鏈與β鏈解離。
疫苗以上描述的本發(fā)明的融合蛋白可以在疫苗開(kāi)發(fā)中加以應(yīng)用，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)感染的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫。
在實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明抗體與鐵蛋白連接形成融合蛋白可以作為被動(dòng)免疫的疫苗，為治療或預(yù)防感染提供適當(dāng)抗體。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的一樣，根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的疫苗可以有多種免疫方式，如注射方式(肌肉注射，皮內(nèi)注射或皮下注射)或鼻咽方式(鼻內(nèi)免疫)。其中一種情況是疫苗進(jìn)行肌肉注射如注射到三角肌，但具體免疫途徑還應(yīng)該根據(jù)感染的性質(zhì)和病人的狀況。疫苗最好溶于制藥行業(yè)認(rèn)同的溶劑中以方便使用。這類溶劑通常是含有或不含防腐劑的水或生理鹽水。疫苗可以凍干或以溶液形式保存，凍干疫苗在免疫時(shí)重懸。
本發(fā)明中融合蛋白的優(yōu)選的免疫劑量是免疫病人后的有效劑量，如使病人產(chǎn)生特異性和非特異性抗體。該劑量通常指“具有免疫原性的量”，使用劑量根據(jù)抗原性質(zhì)和病人免疫系統(tǒng)及身體狀況變化很大。因此本發(fā)明中作為有效疫苗使用的融合蛋白的“免疫原性量”即指沒(méi)有毒性，但有足夠的抗原量以產(chǎn)生預(yù)防或治療性抗體。同時(shí)免疫原用量隨著病人不同而不同，與人種、年齡和病人的狀況，需要治療的嚴(yán)重程度，疫苗使用的特殊載體或佐劑及免疫方式等方面有關(guān)。同時(shí)任何一個(gè)特定融合蛋白成分中的“免疫原性量”根據(jù)特定的情況而不同，在每種疫苗的具體使用中，由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)試驗(yàn)決定免疫原的適當(dāng)用量。根據(jù)個(gè)體需要調(diào)整使用劑量和疫苗組成，并根據(jù)個(gè)體的年齡、體重和代謝情況有所不同。疫苗組份還包括穩(wěn)定劑或制藥行業(yè)認(rèn)可的防腐劑，如硫柳汞(乙基(2-巰基乙醇)汞鈉鹽)(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)。
因此，根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的有效疫苗，由上述單個(gè)蛋白的免疫原性量決定有效疫苗的使用量，用來(lái)免疫需要這類疫苗的病人或患病動(dòng)物。疫苗還可能包括適當(dāng)?shù)?、制藥行業(yè)認(rèn)可的媒介物、賦形劑或載體。根據(jù)本發(fā)明，鐵蛋白可以與具有高度致病性病毒的蛋白，如AIDS、SARS等病毒的包膜蛋白或其他蛋白連接，使用融合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)AIDS和/或SARS病毒的抗體。除了能用于保護(hù)免受致命性病毒感染的疫苗外，融合蛋白還可以用于對(duì)該類疾病的研究，同時(shí)還可能用于開(kāi)發(fā)針對(duì)該類疾病的有效的治療方法或藥物。
本發(fā)明的融合蛋白與抗體連接可以作為被動(dòng)疫苗進(jìn)行免疫。在這種情況中，以能有效預(yù)防和治療感染的用量作為根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的被動(dòng)疫苗的適宜劑量。這一用量隨著感染性質(zhì)和病人狀態(tài)的不同而有很大變化。根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的融合抗體的“有效用量”指沒(méi)有毒性但有足夠量的抗體以能達(dá)到預(yù)期的預(yù)防或治療作用。同時(shí)抗體或治療藥物得到用量隨著病人不同而不同，與人種、年齡和病人的狀況，需要治療的嚴(yán)重程度，疫苗使用的特殊載體或佐劑及免疫方式等方面有關(guān)。同時(shí)任何一個(gè)特定抗體組份的“有效用量”根據(jù)特定的情況而變化，在每種疫苗的具體使用中，由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)試驗(yàn)決定適當(dāng)?shù)挠行в昧?。根?jù)個(gè)體需要調(diào)整使用劑量和疫苗組成，并根據(jù)個(gè)體的年齡、體重和代謝情況有所不同。疫苗組份還包括穩(wěn)定劑或制藥行業(yè)認(rèn)可的防腐劑，如硫柳汞(乙基(2-巰基乙醇)汞鈉鹽)(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)。
此外，以上描述的本發(fā)明中的抗體和疫苗可以與適當(dāng)佐劑共同免疫，增強(qiáng)針對(duì)融合體的免疫反應(yīng)。比如，常用的佐劑包括在人體中廣泛使用的鋁制劑(磷酸鋁或氫氧化鋁)，其他佐劑如皂角苷和它的純化成份Quil A，完全弗氏佐劑及在研究和獸醫(yī)中使用的其他佐劑。其他化學(xué)組成明確的制備包括胞壁酰二肽、單磷酰脂質(zhì)A、由Goodman-Snitkoff等人在《J.Immunol.》1991，147410-415頁(yè)描述的磷脂化合物，文獻(xiàn)在此通過(guò)引證被并入本文及由Miller等人在《J.Exp.Med.》1992，1761739-1744頁(yè)中描述的蛋白脂質(zhì)體包裹的融合體，文獻(xiàn)在此通過(guò)引證被并入本文，脂質(zhì)體包裹的蛋白如NovasomeTM脂質(zhì)體(Micro VescularSystems，Inc.，Nashua，NH)比較有用。
與其他病毒顆粒疫苗相比，鐵蛋白不像病毒顆粒一樣可以被免疫系統(tǒng)迅速識(shí)別，使用根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的顆粒內(nèi)融合蛋白產(chǎn)物時(shí)，顆粒不會(huì)被認(rèn)為是外源蛋白。只有在融合產(chǎn)物開(kāi)始降解，暴露出抗原后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以可以創(chuàng)造緩釋抗原效應(yīng)，因?yàn)榭乖梢员３窒喈?dāng)長(zhǎng)的暴露時(shí)間從而誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。融合鐵蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，比病毒樣顆粒特別是那些包含多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)組份的顆粒更容易制備。
藥物組合物正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的，根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白還可以作為用于治療或預(yù)防人或動(dòng)物感染的藥物組合物，或作為治療疾病的藥劑。上述融合蛋白的藥物組合物可以與其他合適的藥物溶劑、賦形劑或載體聯(lián)合使用，這些聯(lián)合制劑在本行業(yè)中經(jīng)常使用，包括鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其他治療性組合物。正如專業(yè)人士所認(rèn)識(shí)的，這些特殊的溶劑、賦形劑或載體隨著病人和病人狀態(tài)的不同而不同，根據(jù)藥物組合物采用適當(dāng)?shù)慕o藥方式，包括但不局限于以下方式局部給藥、口腔給藥、肛門(mén)給藥、陰道給藥、靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔和皮內(nèi)給藥。
局部給藥的制劑中，藥劑形式有膏劑、霜?jiǎng)?、凝膠體、滴劑(如滴眼劑和滴耳劑)或溶液(如漱口液)。還包括由特定制劑浸泡的傷口或外科敷料、縫合用的線、氣霧劑等。這些制劑還包括常規(guī)的添加劑，如防腐劑、促進(jìn)滲透的溶劑和緩和劑。局部用藥制劑還可能包括常規(guī)的吸收劑如霜或膏基質(zhì)，乙醇或油醇。
其他方面的應(yīng)用如上所述，根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的融合鐵蛋白在疫苗領(lǐng)域、制藥、治療藥物組合物及其它能夠提供有益作用的許多方面均有應(yīng)用價(jià)值。比如可以利用本發(fā)明中的融合鐵蛋白儲(chǔ)存濃縮的具有放射性的金屬，這些金屬與抗體連接作為治療藥劑直接高濃度導(dǎo)入腫瘤組織。此外，由于鐵蛋白具有潛在的結(jié)合鐵離子和其他稀有金屬的能力，可以通過(guò)本發(fā)明中的融合鐵蛋白提取所需金屬。因?yàn)樵摲椒梢员苊猱a(chǎn)生有毒的化學(xué)物質(zhì)，因此提供了一種環(huán)保的采礦方法。另外在一些組織中L和H鏈的構(gòu)成比例不同，具有特定L鏈和H鏈比例的融合鐵蛋白或主要由一種類型的鏈構(gòu)成的融合鐵蛋白(如60-100％)可以將顆粒即治療劑(DNA等)導(dǎo)入組織中，比如在心肌組織中鐵蛋白主要由H鏈構(gòu)成，而血液中的鐵蛋白主要有L鏈構(gòu)成。
其他方面的應(yīng)用包括用于更加復(fù)雜的系統(tǒng)大結(jié)構(gòu)組裝平臺(tái)(Macro structure assembly platform)-納米技術(shù)。另外，鐵蛋白、包裹在內(nèi)部的治療劑或其他藥劑通過(guò)與抗體連接或其它方法到達(dá)體內(nèi)需要進(jìn)行治療或其它的目標(biāo)。就抗體而言，可以將完整的抗體或只具有抗原識(shí)別部位的Fv片斷通過(guò)化學(xué)或重組的方法與鐵蛋白連接。還可以插入鐵蛋白顆粒的不同成分進(jìn)行修飾，構(gòu)建作為疫苗或治療藥物的混合分子。如替代位于蛋白表面的BC環(huán)。還可以使那些難以形成晶體的多肽或蛋白表達(dá)形成顆粒進(jìn)而形成晶體，特別是在顆粒內(nèi)部表達(dá)時(shí)，從而可以保留晶體外部組裝的相互作用。顆粒內(nèi)表達(dá)還可以解決某些疏水性蛋白的溶解性問(wèn)題。融合鐵蛋白還可以有以下方面的應(yīng)用在識(shí)別過(guò)程如NMR，圖象襯比或X射線成像中使用的顆粒由于連接旋轉(zhuǎn)速度減慢，因此本發(fā)明的融合蛋白可應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域。
總之，上述根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的融合鐵蛋白在疫苗、其他藥物和治療藥劑的組成中非常有用，將在給藥、運(yùn)輸氧氣和提高藥物在血液中殘留時(shí)間的應(yīng)用中發(fā)揮特殊的作用。
實(shí)施例下面的實(shí)施例體現(xiàn)了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。此領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)理解后面實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了本發(fā)明發(fā)明人所發(fā)明的技術(shù)，其很好地實(shí)施了本發(fā)明，因而可以作為操作方法的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可認(rèn)識(shí)到對(duì)本文公開(kāi)的具體實(shí)施方案所做的各沒(méi)有背離本發(fā)明范圍和精神的并仍然獲得相同或相似結(jié)果的修改。
例1顆粒內(nèi)表達(dá)的融合蛋白人血紅蛋白蛋白α鏈通過(guò)單甘氨酸連接子與人鐵蛋白C端連接構(gòu)成重組融合蛋白顆?？s寫(xiě)(FL.G.Hα)。
分子克隆在大腸桿菌中表達(dá)人血紅蛋白α亞基與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將血紅蛋白α鏈的全長(zhǎng)cDNA與鐵蛋白輕鏈基因C端通過(guò)由一個(gè)甘氨酸組成的連接子連接(圖3)。
蛋白表達(dá)和純化通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證鐵蛋白/血紅蛋白的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長(zhǎng)到OD值為1.0(600nm)時(shí)，加入1mMIPTG激活T7啟動(dòng)子，在30度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過(guò)濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。使用多克隆和單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)確證表達(dá)蛋白。
通過(guò)以下觀察顯示顆粒或自組裝顆粒(SAP)具有正確構(gòu)像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與大于天然重組鐵蛋白一致的保留效應(yīng)(鐵蛋白分子量408K)。
2)圖5和表1中的蛋白光掃描試驗(yàn)顯示單個(gè)分散蛋白的直徑約是天然鐵蛋白2.5倍，這一數(shù)據(jù)是根據(jù)圖6和表2中的數(shù)值(這些數(shù)值一般不十分準(zhǔn)確，但重要的是為單個(gè)分散蛋白提供了分子大小一致和有序SAP的依據(jù))進(jìn)行估計(jì)的。分別使用針對(duì)人鐵蛋白和血紅蛋白α的多克隆抗體與融合產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，應(yīng)得到陽(yáng)性結(jié)果。
對(duì)本復(fù)合物使用光散射分析得到的亞基數(shù)目要高于天然鐵蛋白中的24個(gè)。盡管該復(fù)合物的確切結(jié)構(gòu)還不清楚，SAP與單個(gè)分子在性質(zhì)上是一致的。說(shuō)明亞基與亞基之間的結(jié)合具有增加組裝角度的內(nèi)在能力。假設(shè)二聚體(見(jiàn)圖4)越過(guò)顆粒第二個(gè)折疊軸旋轉(zhuǎn)后與B螺旋組裝，顆粒表面越過(guò)第二個(gè)折疊軸與β折疊反平行的B-C環(huán)的彈性進(jìn)一步穩(wěn)定了這種相互作用。這一旋轉(zhuǎn)假設(shè)得到血紅蛋白α鏈之間的空間相互作用的支持，如彎曲率大的顆粒能容納較大的血紅蛋白分子。這些亞基組裝角度中小的變化與顆粒直徑的增加有關(guān)，使得顆粒核心能容納更大的融合蛋白。
表1(FL.G.Hα)的數(shù)據(jù)表。在溫度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)得到的結(jié)果。
表2(天然馬的心臟的鐵蛋白)的數(shù)據(jù)表。在溫度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)得到的結(jié)果。
例2顆粒內(nèi)表達(dá)的融合蛋白銀濃縮多肽通過(guò)包含2個(gè)甘氨酸的連接子與人鐵蛋白L鏈C端連接構(gòu)成重組融合蛋白顆?？s寫(xiě)(FL.GG.Ag4)，AG4是指NPSSLFRYLPSD(序列號(hào)1)。
作為與鐵蛋白連接的金屬提取多肽，通過(guò)下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像
1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)一致的保留效應(yīng)。
2)圖7和表3中的蛋白光散射試驗(yàn)顯示單個(gè)分散蛋白的直徑約為180埃；3)silver condensing peptide的顆粒特點(diǎn)已經(jīng)明確；4)透射電子顯微鏡成像顯示具有適當(dāng)外部尺寸的多面體顆粒與鐵蛋白X射線結(jié)構(gòu)完全一致(圖8)。
表3(FL.GG.Ag4)的數(shù)據(jù)表。在溫度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)得到的結(jié)果。
例3顆粒外融合蛋白HIV Tat蛋白(84個(gè)氨基酸)通過(guò)包含6個(gè)甘氨酸的連接子與N端連接構(gòu)成重組蛋白。
顆?？s寫(xiě)(Tat.6G.FL)其中HIV Tat蛋白序列MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGDPTGPKE-(序列號(hào)2)甘氨酸連接子序列GGGGGG(序列號(hào)3)人鐵蛋白L鏈序列MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSHFFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAAMALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLTNLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列號(hào)4)分子克隆在大腸桿菌中表達(dá)野生型HIV-1 Tat與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將Tat蛋白的全長(zhǎng)cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過(guò)包含6個(gè)甘氨酸的連接子連接(圖9)。
蛋白表達(dá)和純化通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證鐵蛋白/Tat的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長(zhǎng)到OD值為1.0(600nm)時(shí)，加入1mMIPTG激活T7啟動(dòng)子，在30度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過(guò)濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。使用多克隆和單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)確證表達(dá)蛋白(圖10)。
通過(guò)下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與同樣大小或大于天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)特點(diǎn)一致的保留效應(yīng)，；2)圖11和表4中的蛋白光散射試驗(yàn)顯示，單個(gè)分散蛋白的直徑約是天然鐵蛋白2倍；3)使用針對(duì)Tat的多克隆抗體與融合蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果(圖10)。
表4(Tat.6G.FL)的數(shù)據(jù)表。在溫度為22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)得到的結(jié)果。
例4顆粒外融合蛋白HIV Tat小肽通過(guò)包含6個(gè)甘氨酸的連接子與人鐵蛋白L鏈N端連接構(gòu)成重組蛋白。
顆?？s寫(xiě)(TatP.6G.FL)，其中TatP的序列為QPKTACTNC(序列號(hào)5)分子克隆在大腸桿菌中表達(dá)野生型HIV-1 Tat多肽與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將Tat蛋白的全長(zhǎng)cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過(guò)包含包含6個(gè)甘氨酸的連接子連接(圖9)。
蛋白表達(dá)和純化通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證鐵蛋白/Tat的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長(zhǎng)到OD值為1.0(600nm)時(shí)，加入1mMIPTG激活T7啟動(dòng)子，在30度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過(guò)濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。由于融合多肽的分子較小，在本例中使用多克隆和單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)不能得到陽(yáng)性結(jié)果。
通過(guò)下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)相一致的保留效應(yīng)。
例5顆粒外融合蛋白HIV P24蛋白通過(guò)包含6個(gè)甘氨酸的連接子與N端連接構(gòu)成重組蛋白。
顆?？s寫(xiě)(P24.6G.FL)分子克隆在大腸桿菌中表達(dá)野生型HIV-1 P24與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使用PCR方法將Tat的全長(zhǎng)cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過(guò)包含6個(gè)甘氨酸的連接子連接(圖9)。
蛋白表達(dá)和純化通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證鐵蛋白/P24的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長(zhǎng)到OD值為1.0(600nm)時(shí)，加入1mMIPTG激活T7啟動(dòng)子，在30度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和離子交換凝膠過(guò)濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。所表達(dá)的蛋白可能包含截短的P24蛋白(未對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行確證)。但是使用多克隆抗體與融合顆粒蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果。
通過(guò)下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與天然重組鐵蛋白(鐵蛋白分子量408K)相一致的保留效應(yīng)；2)融合蛋白與P24多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果。
實(shí)施例附錄1.GenBank序列號(hào)人鐵蛋白L鏈GenBank序列號(hào)M11147人鐵蛋白H鏈GenBank序列號(hào)AA075690人血紅蛋白α鏈GenBank序列號(hào)V00493HIV-1GenBank序列號(hào)K034552.氨基酸序列HIV-1 P24PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL(列號(hào)6)Tat-多肽QPKTACTNC(序列編號(hào)5)
α球蛋白MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR(序列號(hào)7)HIV Tat序列MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRKKRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGDPTGPKE(序列號(hào)2)人鐵蛋白L鏈序列MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSHFFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAAMALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLTNLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列號(hào)4)人鐵蛋白H鏈序列MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALKNFAKYFLHQSH EEREHAEKLM KLQNQRGGRIFL QDIKKPDCDDWESGLNAMEC ALHLEKNVNQ SLLELHKLAT DKNDPHLCDF IETHYLNEQVKAIKELGDH VTNLRKMGAP ESGLAEYLFD KHTVVETVIMK AKPRANFP(序列號(hào)8)
序列表<110>丹尼爾·C·卡特<120>融合鐵蛋白在疫苗和其他方面的應(yīng)用<130>P07624WO00/BAS<150>60/379,145<151>2002-05-10<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asn Pro Ser Ser Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Ser Asp1 5 10<210>2<211>86<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu85<210>3<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gly Gly Gly Gly Gly Gly1 5<210>4<211>175<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala1 5 10 15Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu20 25 30Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu50 55 60Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln65 70 75 80Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala85 90 95Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu100 105 110Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp115 120 125Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys130 135 140Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala145 150 155 160Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp165 170 175<210>5<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys1 5
<210>6<211>231<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser15 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140
Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu225 230<210>7<211>142<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly1 5 10 15Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg20 25 30Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp35 40 45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala50 55 60Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala65 70 75 80Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro85 90 95Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala100 105 110His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys115 120 125Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg130 135 140<210>8<211>190<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp1 5 10 15Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser20 25 30Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg50 55 60Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg65 70 75 80Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser85 90 95Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn100 105 110Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro115 120 125His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys130 135 140Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly145 150 155 160Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Trp165 170 175Glu Thr Val Ile Met Lys Ala Lys Pro Arg Ala Asn Phe Pro180 185 190
權(quán)利要求
1.一種融合鐵蛋白，是從包括下列融合蛋白的組中選取的在C端與能與鐵蛋白融合且不會(huì)影響產(chǎn)物融合蛋白聚合組裝的蛋白或肽融合的鐵蛋白，或在N端與能與鐵蛋白融合且不會(huì)影響產(chǎn)物融合蛋白聚合組裝的蛋白或肽融合的鐵蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中融合蛋白形成聚合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中融合蛋白形成顆粒結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白連接的蛋白通過(guò)至少由1個(gè)氨基酸組成的連接子進(jìn)行連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的融合鐵蛋白，其中氨基酸是甘氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的融合鐵蛋白，其中甘氨酸連接子包括1到6個(gè)甘氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白融合的蛋白從下列蛋白中選擇血紅蛋白，銀濃縮多肽，HIV Tat蛋白，HIV Tat小肽，HIV-1 P24蛋白和SARS病毒的病毒蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白融合的蛋白從下列蛋白序列編號(hào)中選擇序列編號(hào)1，序列編號(hào)2，序列編號(hào)5，序列編號(hào)6和序列編號(hào)7。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中鐵蛋白從包括鐵蛋白L鏈和H鏈的組中選擇。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中鐵蛋白主要由鐵蛋白L鏈組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中鐵蛋白主要由鐵蛋白H鏈組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的融合鐵蛋白，其中與鐵蛋白融合的蛋白是抗體。
13.一種包括免疫原性量的權(quán)利要求1的融合蛋白的疫苗。根據(jù)權(quán)利要求1，疫苗由免疫原性融合蛋白組成。
14.一種包括權(quán)利要求1的融合蛋白和藥用可接受的媒介物、賦形劑或載體的藥物組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其可適合對(duì)人或動(dòng)物進(jìn)行注射，口服，鼻內(nèi)，皮下，氣霧或靜脈給藥。
16.一種制備病毒疫苗的方法，包括融合鐵蛋白，至少一種具有免疫原性的病毒蛋白或肽序列能與鐵蛋白的一個(gè)鏈連接且不影響鐵蛋白形成融合蛋白的自組裝能力。
17.一種增強(qiáng)有用蛋白或肽治療作用的方法，包括將所述蛋白或肽與鐵蛋白融合形成融合蛋白，其中融合蛋白保持與鐵蛋白相同的聚合體結(jié)構(gòu)。
18.一種在人體或動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，包括給人或動(dòng)物服用免疫原性量的權(quán)利要求1分離的融合蛋白。
19.一種編碼權(quán)利要求1的融合蛋白的核酸序列或其簡(jiǎn)并序列。
20.一種增加人或動(dòng)物內(nèi)服的蛋白或肽的半衰期的方法，包括所述蛋白或肽與鐵蛋白形成融合蛋白，其中融合蛋白保持與鐵蛋白相同的自組裝能力。
21.一種融合鐵蛋白，包括至少與鐵蛋白C端融合的一種蛋白或肽和至少與鐵蛋白N端融合的一種蛋白或肽，其中所述蛋白或多肽能與鐵蛋白融合且不影響產(chǎn)物融合蛋白形成聚合體結(jié)構(gòu)。
22.一種通過(guò)重組方法制備如權(quán)利要求1中的融合鐵蛋白。
23.一種通過(guò)重組方法制備如權(quán)利要求21中的融合鐵蛋白。
24.一種提取金屬的方法，包括將含有與鐵蛋白融合的金屬提取肽的權(quán)利要求1的融合蛋白置于含有要提取金屬的液體中充分長(zhǎng)的時(shí)間以使金屬與融合蛋白的金屬提取肽結(jié)合，然后回收結(jié)合金屬的融合蛋白。
全文摘要
本文涉及分離的融合鐵蛋白，即蛋白或肽與鐵蛋白連接不影響融合蛋白自組裝形成聚合結(jié)構(gòu)，蛋白與鐵蛋白C端融合形成顆粒內(nèi)表達(dá)，或與N端融合形成顆粒外表達(dá)。融合蛋白能自組裝形成多種有用的高級(jí)聚合形式，如顆粒或其它聚合體；融合蛋白有多方面應(yīng)用，包括作為人或獸用疫苗、治療、血液替代品、圖象襯比試劑、金屬螯合系統(tǒng)、膠凝劑、蛋白純化平臺(tái)、治療性受體結(jié)合蛋白。
文檔編號(hào)A61K39/385GK1659187SQ03813504
公開(kāi)日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月10日
發(fā)明者丹尼爾·C·卡特, 切斯特·Q·李 申請(qǐng)人:新世紀(jì)藥品有限公司