專利名稱：：使用包含glp－1的運鐵蛋白融合蛋白的組合治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含促胰島肽(insulinotropicpeptide)的運鐵蛋白融合蛋白，其有效治療活性的體內(nèi)半衰期延長。本發(fā)明還涉及使用DPP-IV抑制劑和/或神經(jīng)內(nèi)肽酶抑制劑(NEP)以及促胰島肽的組合治療。
背景技術(shù)：
：蛋白酶蛋白水解酶通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和加工，在調(diào)控生理過程中起重要作用，這些生理過程如細胞增殖、分化，以及信號處理。蛋白水解酶通過蛋白水解降解，控制重要的結(jié)構(gòu)蛋白、酶和調(diào)節(jié)蛋白的水平。失控的蛋白水解酶活性，無論是升高還是降低，都與多種疾病狀態(tài)相關(guān)，包括炎癥、癌癥、動脈硬化和退行性疾病。國際生物化學會分子生物學聯(lián)合會(IUBMB)推薦使用術(shù)語“肽酶”來指肽鍵水解酶子集(亞類E.C3.4.)。廣為使用的術(shù)語蛋白酶與肽酶具有相同的含義。肽酶包括兩組酶內(nèi)肽酶和外肽酶，其裂解蛋白質(zhì)中的肽鍵，以及順序地分別從N-末端或者C-末端去除氨基酸。術(shù)語蛋白酶與內(nèi)肽酶具有相同含義。蛋白水解酶是按照其催化機制分類的。IUBMB已經(jīng)認可了四種機制類型絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是蛋白水解酶的一個大家族，在蛋白質(zhì)裂解的活性酶促位點上含有絲氨酸殘基。它們普遍存在于病毒、細菌和真核生物中。絲氨酸蛋白酶具有廣泛的底物特異性，基于這些特異性可以再細分為亞家族。有20多個絲氨酸蛋白酶亞家族，被劃分為6個分支(SA、SB、SC、SE、SF和SG)。脯氨酰寡肽酶是劃分在SC分支的一種絲氨酸蛋白酶。其在脯氨酸殘基的羧基側(cè)水解含脯氨酸的肽。其可能與肽激素和神經(jīng)肽的成熟和降解相關(guān)(Wilk等人，1983LifeSci.33，2149-2157)。脯氨酰寡肽酶的例子包括二肽基肽酶IV(DPP-IV)、二肽基肽酶II(DPP-II)、成纖維細胞活化蛋白以及脯氨酰寡肽酶。這些酶具有截然不同的特異性。脯氨酸存在于大量肽激素中。其決定了這些肽的某些結(jié)構(gòu)特性，例如這些肽的構(gòu)象和穩(wěn)定性，防止被非特異性蛋白酶降解。存在大量攻擊脯氨酸肽鍵的肽酶。這些肽酶不僅與X-Pro或Pro-X鍵的斷裂相關(guān)，而且參與相應(yīng)的丙氨酰鍵的降解，但具有下降的活性。由于一些對含有脯氨酸的序列具有高度特異活性的肽酶已經(jīng)與調(diào)節(jié)天然的肽底物的生物學活性相關(guān)，這些肽酶成為了醫(yī)學化學領(lǐng)域具有吸引力的研究對象。例如，DPP-IV與通過調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的水平與治療糖尿病聯(lián)系起來。在多種疾病中，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、格雷夫斯病(Grave’sdisease)以及Hashimoto氏甲狀腺炎、肉狀瘤病(sarcoidosis)以及癌癥，DPP-IV活性升高。在AIDS、唐氏綜合癥(Down’ssyndrome)、厭食/易餓病(anorexia/bulimia)、懷孕和低丙種球蛋白血癥中，DPP-IV活性也升高。包括DPP-IV的二肽基肽酶二肽基氨基肽酶活性是催化從肽、多肽或和蛋白質(zhì)的N-末端去除二肽的肽酶活性。通常，二肽基氨基肽酶能夠從肽、多肽和蛋白質(zhì)的未被取代的N-末端氨基上裂解二肽XY，其中X和Y代表任何氨基酸殘基。二肽基肽酶(DPPs)的例子包括二肽基肽酶I(DPP-I)、二肽基肽酶II(DPP-II)、二肽基肽酶III(DPP-III)和二肽基肽酶(DPP-IV)。DPP-I也被稱作為組織蛋白酶C，是一種在大多數(shù)組織中表達的溶酶體半胱氨酸蛋白酶。DPP-I與粒酶的加工相關(guān)，粒酶是在被活化的細胞毒淋巴細胞顆粒中專門表達的中性絲氨酸蛋白酶。DPP-II是一種存在于溶酶體中的絲氨酸蛋白酶。與DPP-IV相同，DPP-II裂解含有脯氨酸的肽鍵。事實上，DPP-II具有與DPP-IV相似的底物特異性，但僅在酸性pH下起作用。二肽基肽酶III(DPP-III)是一種金屬蛋白酶。DPP-IV是一種絲氨酸蛋白酶，包含絲氨酸蛋白酶基序GWSYG，并且具有廣泛的底物特異性。其從氨基末端順序水解肽，釋放氨基酸。然而，當?shù)竭_脯氨酸之前的氨基酸殘基時，水解終止。結(jié)果，具有鍵X-Pro-Y-(X和Y是任選的氨基酸)的肽被裂解，獲得X-Pro和Y-。DPP-IV還會斷裂在倒數(shù)第二個位置上具有丙氨酸的二肽，雖然其效率低于具有脯氨酸的二肽(Yaron等人，1993Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.2831-81)。該酶還能夠裂解其它序列，但是效率仍然較低。已經(jīng)證明，在從生物活性肽的N-末端釋放二肽時，DPP-IV具有高特異性，所述活性肽在肽底物的N-末端的倒數(shù)第二個位置上具有脯氨酸或丙氨酸。DPP-IV的大量可能的肽底物已經(jīng)被鑒定。DPP-IV底物包括肽激素和細胞因子。某些肽激素的例子為內(nèi)啡素-2(endomorphin-2)、GLP-1、GLP-2、腸抑胃肽(GIP)、神經(jīng)肽Y、生長激素釋放激素(GHRH)和P物質(zhì)，某些細胞因子的例子是RANTES、GCP-2、SDF-1α、SDF-2β、MDC、MCP-1、MCP-2和MCP-3。DPP-II具有與DPP-IV幾乎相同的底物特異性。DPP-IV與糖尿病胰島素依賴的糖尿病(IDDM或者I型糖尿病)目前是通過給患者施用胰島素來治療。非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM或者II型糖尿病)是通過飲食、施用磺酰脲類藥物(sulphonylureas)刺激胰島素分泌或者施用雙胍增加葡萄糖攝取來治療。具有抗性的個體需要胰島素治療。標準治療要求需要每日靜脈注射胰島素，這可以治療急性癥狀，但是治療期延長會引起血管疾病和神經(jīng)損害。現(xiàn)代的方法十分昂貴，如移植，并且需要進行具有風險的手術(shù)干涉。因此，需要開發(fā)一種高效、低成本的糖尿病治療替代方案。近些年來，人們對將DPP-IV作為降低血糖水平的靶點日益感興趣。使用抑制劑來阻斷患者血液中的DPP-IV酶或者DPP-IV樣酶的活性會導(dǎo)致降低對內(nèi)源性的或者體外施用的促胰島肽的降解，這些促胰島肽如GIP、GLP-1或其類似物。GIP和GLP-1是刺激胰腺葡萄糖誘導(dǎo)式地分泌胰島素的激素，是DPP-IV的底物。特別地，由于DPP-IV去除GLP-1的氨基末端的His-Ala二肽，生成GLP-1-(9-36)-酰胺，GLP-1-(9-36)-酰胺不能引起胰島的葡萄糖依賴式地分泌胰島素，這種DPP-IV或DPP-IV樣酶的體內(nèi)活性的抑制將有效地在哺乳動物生物體內(nèi)抑制病理狀況下的不期望的酶活性。PCT/DE97/00820公開了DPP-IV或DPP-IV樣酶活性的抑制劑，丙氨酰吡咯烷鹽(alanylpyrrolidide)和異亮氨酰噻唑啉鹽(isoleucylthiazolidide)。DD296075公開了吡咯烷鹽(pyrrolidide)和異亮氨酰噻唑啉鹽酸鹽。美國專利US6,548,481公開了與二肽化合物類似的由氨基酸和噻唑啉鹽或者吡咯烷鹽基團形成的抑制劑，及其鹽。雖然這些化合物是DPP-IV活性的功能性抑制劑，但是在某些患者或者特定類型疾病中，使用這些抑制劑是有問題的，這是由于這些酶負責激活或者滅活如此大范圍的生物活性肽，也就是說，DPP-IV抑制劑對期望靶點GIP和GLP-1不具有特異性。通過修飾保護治療性肽防止治療性蛋白質(zhì)和肽如GIP或GLP-1被蛋白水解酶裂解的一種可替代方法是對蛋白質(zhì)和肽本身進行修飾，以阻礙其暴露于蛋白水解酶。已經(jīng)證明，蛋白質(zhì)修飾會提高治療性多肽的穩(wěn)定性、循環(huán)時間和生物學活性。一些修飾氨基酸和肽的常用方法公開在ChemistryandBiochemistryofAminoAcid，PeptideandProteins--ASurveyofRecentDevelopments(Weinstein，B.編輯，MarcelDekker，Inc.出版，紐約1983)，其在此引入作為參考。此外，F(xiàn)rancis的綜述文章(1992FocusonGrowthFactors34-10，(Mediscript，倫敦))公開了蛋白質(zhì)修飾和融合蛋白，其在此引入作為參考。隨著DNA重組技術(shù)和自動化技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以容易地制備大量經(jīng)過修飾的多肽，這些肽可以是短的、中等長度或者長的。可以使用肽自動合成儀、固相樹脂技術(shù)或者重組技術(shù)，合成大量經(jīng)過修飾的小的多肽激素。例如，二肽基肽酶的大量修飾的底物可以用肽自動合成儀制備，例如，DPP-IV的底物如GLP-1、GIP、神經(jīng)肽Y以及緩激肽。發(fā)明概述本發(fā)明提供運鐵蛋白融合蛋白，其包含對蛋白酶裂解敏感的治療性肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供運鐵蛋白融合蛋白，其包含對蛋白酶裂解敏感、具有抗性或者具有部分抗性的治療性肽或蛋白質(zhì)。所述蛋白酶可以是DPP-IV或者神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)。然而，本發(fā)明提供包含運鐵蛋白融合蛋白和第二試劑的組合物，所述第二試劑例如但是不限于，DPP-IV的抑制劑和/或NEP的抑制劑。此外，該組合物可以是用于治療各種疾病的藥物組合物。本發(fā)明提供用組合治療，包括在治療各種疾病時，施用運鐵蛋白融合蛋白和至少一種第二試劑。運鐵蛋白融合蛋白可以與一種或多種第二試劑同時施用?？商娲?，在施用第二試劑之前或者之后，順序施用運鐵蛋白融合蛋白。優(yōu)選地，第二試劑是DPP-IV的抑制劑或NEP的抑制劑。修飾本發(fā)明的GLP-1肽部分來包含一個或多個突變，使得它們部分或者完全地抵抗蛋白酶的裂解，例如DPP-IV的裂解。GLP-1肽可以是GLP-1(7-37)(SEQIDNO32)或者GLP-1(7-36)(SEQIDNO2的氨基酸1-30)。例如，通過將A8突變?yōu)镚和/或K34A來修飾這些肽。附圖簡介圖1顯示pREX0094的限制性酶圖譜。圖2顯示質(zhì)粒pREX0198的限制性酶圖譜。圖3顯示pSAC35的限制性酶圖譜。圖4顯示質(zhì)粒pREX0240的限制性酶圖譜。圖5顯示pREX0052的限制性酶圖譜。圖6顯示pREX0367的限制性酶圖譜。圖7顯示pREX0368的限制性酶圖譜。圖8顯示GLP-1和H-GLP-1與DPP-IV溫育的時程。該圖表顯示活性的全長肽的剩余含量，通過特異于活性GLP-1的ELISA檢測。發(fā)明詳述1.一般描述本發(fā)明部分基于需要開發(fā)一種更加有效的、低成本的糖尿病治療的替代方案。促胰島肽，如GLP-1，是十分有前景的用于治療非胰島素依賴性2型糖尿病以及相關(guān)的代謝異常如前驅(qū)糖尿病(pre-diabetes)、代謝綜合癥和肥胖的治療劑。其它有用的促胰島肽(insulinotropicpeptide)包括毒蜥激動肽(exendin)3和毒蜥激動肽4。然而，這些促胰島肽的體內(nèi)血漿半衰期短，主要是由于被快速地從血清中清除以及被蛋白質(zhì)水解降解。還進行了大量工作來抑制負責降解GLP-1的酶DPP-IV，或者修飾GLP-1來減緩其降解速度并仍保留其生物學活性。盡管進行這些大量努力，但是還沒有制備得到持久的活性GLP-1。因此，需要對GLP-1、毒蜥激動肽3、毒蜥激動肽4和其它促胰島肽進行修飾，以產(chǎn)生更長的體內(nèi)活性持續(xù)時間，并且仍保留其低毒性和治療優(yōu)點。2.定義如在此所用，術(shù)語“衍生”是指使用或者不使用酶，借助化學手段對肽的一個或多個氨基酸殘基進行的修飾，例如，通過烷基化、酰化、形成酯或者形成酰胺。如在此所用，術(shù)語“來源于”是指從特定來源獲得一種分子，例如從親本分子獲得一種分子。如在此所用，術(shù)語“二肽基氨基肽酶活性(dipeptidylaminopeptidaseactivity)”是指從肽、多肽或者蛋白質(zhì)的N-末端裂解二肽的肽酶活性。通常，二肽基氨基肽酶能夠從肽、多肽或蛋白質(zhì)的未被取代的N-末端氨基上裂解二肽XY，其中X和Y代表選自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val組成的組的任何氨基酸殘基，但是至少為Ala、Arg、Asp和/或Gly。優(yōu)選地，Y是Pro或Ala。所有的X和Y可以是不同的或者相同的。二肽基氨基肽酶的例子包括但是不限于DPP-I、DPP-II、DPP-III和DPP-IV。如在此所用，術(shù)語“胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)”和“GLP-1衍生物”是指腸激素，其通常在高血糖過程中刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，刺激胰島素生物合成，并減緩胃排空和酸分泌。如美國專利US5,574,008中所公開，某些GLP-1和GLP-1衍生物促進細胞攝取葡萄糖，但是不刺激胰島素表達，該專利在此引入作為參考。如在此所用，術(shù)語“促胰島肽”是指具有促胰島活性的肽。促胰島肽刺激或者導(dǎo)致刺激激素胰島素的合成或者表達。這種肽包括肽的前體、類似物、片段，如胰高血糖素樣肽1、毒蜥激動肽3和毒蜥激動肽4以及其它具有促胰島活性的肽。如在此所用，“藥學上可接受的”是指生理上耐受的并且被施用給人時通常不會產(chǎn)生過敏的或者類似的不良反應(yīng)如反胃、頭昏等的材料和組合物。通常，如在此所用，術(shù)語“藥學上可接受的”是指為聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準或者列舉在美國藥典或者其它通常被認可的用于動物特別是人的藥典中的。如在此所用，術(shù)語“藥物組合物”是指包含藥物以及需要時加上藥學上可接受的載體或者稀釋劑的組合物。選擇藥學上可接受的載體和添加劑，使得藥物化合物的副作用被最小化而該化合物的性能不會被消除或者抑制到使治療無效的程度。如在此所用，“生理有效量”是被呈遞給患者來產(chǎn)生期望的減緩或者治愈效果的量。該量特異于各種藥物及其最終的被認可的劑量水平。如在此所用，“治療有效量”是指當被施用給需要的患者時足以實現(xiàn)治療的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的量。構(gòu)成“治療有效量”的經(jīng)過修飾的治療性多肽或者肽的量是變化的，其依賴于所用的治療性蛋白質(zhì)，狀況或疾病的嚴重程度，所治療的患者的年齡和體重，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員依照其自身知識和本文公開內(nèi)容常規(guī)地確定。如在此所用，“治療性蛋白質(zhì)”是指具有一種或者多種治療活性和/或生物學活性的蛋白質(zhì)、多肽、抗體，或其肽片段或變體。本發(fā)明所包括的治療性蛋白質(zhì)包括但是不限于蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體和生物產(chǎn)品(biologics)。術(shù)語肽、蛋白質(zhì)和多肽在此被互換使用?？商娲兀g(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”是指治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性的或者天然存在的相關(guān)物。具有“治療活性”的多肽或肽或者“治療活性的”蛋白質(zhì)是指這樣多肽、肽或者蛋白質(zhì)，其具有一種或多種已知的生物學活性和/或治療活性，該活性與治療性蛋白質(zhì)如一種或多種在此公開的或者本領(lǐng)域已知的其它治療性蛋白質(zhì)相關(guān)。作為一個非限制性例子，“治療性蛋白質(zhì)”是這樣蛋白質(zhì)、多肽或者肽，其可用于治療、預(yù)防或者改善疾病、狀況或者異常。這種疾病、狀況或者異常存在于人或者非人動物中，例如獸醫(yī)用途。如在此所用，術(shù)語“處理”或“治療”是指本發(fā)明的化合物的任何施用，并且包括(1)防止疾病在動物身上發(fā)生，該動物傾向于患病但是還沒患有或者沒有表現(xiàn)出該疾病的病理或者癥狀；(2)抑制動物體內(nèi)的疾病，該動物正患有或者表現(xiàn)出患病的病理學或者癥狀(即，使病理學和/或癥狀的進一步發(fā)展停止)；或者(3)改善動物體內(nèi)的疾病，該動物正患有或者表現(xiàn)出患病的病理學或者癥狀(即，使病理學和/或癥狀逆轉(zhuǎn))。如在此所用，術(shù)語“生物學活性”是指調(diào)節(jié)生物學功能的能力?！吧飳W活性”包括功能活性以及結(jié)構(gòu)活性。如在此所用，術(shù)語“減緩的”是指減輕或者緩和疾病或者異常的癥狀而沒有實現(xiàn)治愈的能力。例如，減輕疼痛而沒有治愈該狀況或疾病的制劑是一種減緩制劑。如在此所用，術(shù)語“預(yù)防的”是指具有保護作用，例如起作用來抵御或者阻止某事，特別是疾病或者狀況。如在此所用，“被純化的”蛋白質(zhì)或者核酸是指從細胞成分中分離得到的蛋白質(zhì)或者核酸?！氨患兓摹钡鞍踪|(zhì)或者核酸已經(jīng)被純化到在自然界中不存在的純度水平。如在此所用，術(shù)語“基本上純的(substantiallypure)”蛋白質(zhì)或者核酸是指一種蛋白質(zhì)或核酸，其不具有所有其它的細胞成分。如在此所用，術(shù)語“治療性的”是指具有治愈、恢復(fù)或者補救作用。例如，“治療性制劑”或者“治療性組合物”具有治愈作用。3.具體實施方式二肽基肽酶二肽基肽酶是水解酶，其從肽、多肽或者蛋白質(zhì)的未被取代的N-末端氨基基團上去除二肽。二肽基肽酶(DPP)的例子包括但是不限于DPP-I、DPP-II、DPP-III、DPP-IV、誘蛋白(attractin)和成纖維細胞活化蛋白質(zhì)(FAP)。該家族或者具有類似功能而結(jié)構(gòu)不同的新酶正被逐漸發(fā)現(xiàn)。二肽基肽酶I(DPP-I)也被稱作為組織蛋白酶C，是一種屬于木瓜蛋白酶家族的溶酶體半胱氨酸蛋白酶。DPP-I能夠依次從各種肽和蛋白質(zhì)底物的游離氨基末端去除二肽，因而以外肽酶(特別是二肽基肽酶)的模式起作用。如果被切斷的鍵位于脯氨酸殘基的任一側(cè)，或者N-末端殘基是賴氨酸或者精氨酸，裂解不能有效地發(fā)生。DPP-II是一種存在于溶酶體中、功能未知的絲氨酸蛋白酶。與DPP-IV相同，其主要裂解含有脯氨酸的肽鍵。事實上，DPP-II具有與DPP-IV類似的底物特異性，但是其僅在酸性pH起作用。哺乳動物的DPP-II和DPP-IV可以用抑制劑嘌呤霉素和桿菌肽(bacitracin)區(qū)分開；嘌呤霉素僅抑制DPP-II，而桿菌肽僅抑制DPP-IV(1988J.Biol.Chem.263，6613-6618)。二肽基肽酶III(DPP-III)是一種金屬蛋白酶。DPP-V釋放N-末端的X-Ala、His-Ser和Ser-Tyr二肽。DPP-VII也被稱作為休眠細胞脯氨酸二肽酶，是一種脯氨酸特異的二肽酶?；谌薉PP-VII和大鼠DPP-II的序列比較(78％同一性)(Araki等人，2001J.Biochem.129，279-288)，一般認為DPP-VII和DPP-II是相同的蛋白酶。DPP-VIII是人的后脯氨酸(postproline)二肽基氨基肽酶，與DPP-IV和FAP同源(Abbott，CA.等人，2000EuropeanJournalofBiochemistry267，6140)。與DPP-IV類似，DPP-VIII是普遍存在的。全長的DPP-VIIIcDNA編碼882個氨基酸的蛋白質(zhì)，其與DPP-IV具有約27％的同一性，與FAP具有約51％的相似性，但是沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，也未發(fā)生N-連接的糖基化和O-連接的糖基化。被純化的重組DPP-VIII水解DPP-IV底物Ala-Pro、Arg-Pro和Gly-Pro。因此，重組DPP-VIII與DPP-IV和FAP都具有后脯氨酸二肽基氨基肽酶活性。DPP-VIII酶活性具有與非溶酶體相一致的中性pH最佳活性。DPP-VIII和DPP-IV之間在組織表達模式和底物上的相似性表明DPP-VIII在T細胞活化和免疫功能上的潛在作用與DPP-IV類似。OlsenC.等人(2002Gene299，185-93)報道他們鑒定并表征了新的DPP-IV樣分子，該分子稱為二肽基肽酶樣蛋白質(zhì)DPP-IX。與DPP-IV類似，DPP-IX包含絲氨酸蛋白酶基序GWSYG(SEQIDNO110)。在DPP-IX中存在該基序以及構(gòu)成DPP-IV中的催化三組合(triad)氨基酸Ser、Asp和His殘基的保守順序和間隔，使得DPP-IX應(yīng)歸于DPP-IV基因家族。誘蛋白(DPPT-L)是一種175kDa的可溶糖蛋白，其被報道能夠水解Gly-Pro。誘蛋白含有kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域，與DPP-IV或任何其它肽酶不具有顯著的序列同一性。成纖維細胞活化蛋白(FAP)是在組織重建部位表達的脯氨酰寡肽酶基因家族的細胞表面結(jié)合蛋白酶。脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)也被稱作為脯氨酸寡肽酶(PO)，首先被Walter及其同事發(fā)現(xiàn)，是人子宮中的一種降解催產(chǎn)素的酶(Walter等人，Science173，827-829(1971))。該酶斷裂含有X-Pro-Y序列的肽中的脯氨酸的羧基側(cè)的肽鍵，其中X是一種肽或者N-末端的被取代的氨基酸，而Y是一種肽、氨基酸、酰胺或者醇(Yoshimoto等人，J.Biol.Chem.253，3708-3716(1979))。該酶對脯氨酸的亞氨基側(cè)的肽鍵的構(gòu)象轉(zhuǎn)化(trans-conformation)具有高度特異性(Lin&Brandts，Biochemistry22，4480-4485(1983))。脯氨酰寡肽酶水解血管緊張素I和血管緊張素II，這引起血管緊張素(1-7)釋放。血管緊張素(1-7)具有血管擴張活性，并調(diào)節(jié)抗利尿激素釋放，影響記憶過程，這已通過給大鼠注射特定的PEP-抑制劑所證實。該注射能夠逆轉(zhuǎn)由東莨菪堿引起的健忘癥。該實驗不僅是一個證明該酶的可能具有生理功能的例子，而且其引起一種假設(shè)，即PEP的抑制劑會影響記憶過程并且能夠抗癡呆(Yoshimoto等人，1987J.Pharmacobio-Dyn.10，730-735)。二肽基肽酶(DPP-IV)和底物DPP-IV是一種被廣泛表達的分子，其與多種肽和激素的降解相關(guān)。已經(jīng)純化了各種類型的DPP-IV，并且已經(jīng)揭示其酶學特性。例如，已經(jīng)從大鼠肝臟(Hopsu-HavuV.K.等人，1966Histochem.，7197-201)、豬腎臟(BarthA.等人，1974Biol.Med.Chem.，32157-174)、豬小腸(SvenssonB.1978Eur.J.Biochem.，90489-498)、豬肝臟(FukasawaK.M.等人1981Biochim.Biophys.Acta，657179-189)、人頜下腺(OyaH.等人，1972Biochim.Biophys.Acta，258591-599)、綿羊腎臟(YoshimotoT.等人，1977Biochim.Biophys.Acta，485391-401；YoshimotoT.等人，1978J.Biol.Chem.，2533708-3716)或者微生物(FukusawaK.M.1981Biochem.Biophys.，210230-237；YoshimotoT.1982J.Biochem.，911899-1906(1982))中分離得到DPP-IV。在人免疫系統(tǒng)中，DPP-IV與T細胞表面抗原CD26是相同的，CD26由被活化的淋巴細胞(T淋巴細胞、B淋巴細胞和天然殺傷細胞)所表達。CD26/DPP-IV是II型糖蛋白，具有內(nèi)在的二肽基肽酶IV活性，并能夠結(jié)合I型腺苷脫氨酶(ADA-1)。它在上皮細胞中組成型地表達，但是在T淋巴細胞中，其僅在嚴格細胞調(diào)控下表達，并且在細胞活化時其表達被上調(diào)。已經(jīng)證明，CD26/DPP-IV的胞外結(jié)構(gòu)域具有二肽基肽酶IV活性(Hegen等人，1990J.Immunol1442908-2914；Ulmer等人，1990Scand.J.Immunol.31429-435)，并且共刺激活性似乎部分地依賴于該酶的活性(Tanaka等人，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA904586-4590)。DPP-IV與細胞因子功能調(diào)控相關(guān)，可能在HIV感染中起重要作用。美國專利US6,265,551公開了一種循環(huán)的、可溶形式的DPP-IV/CD26，其分離自人血清。該血清形式的DPP-IV/CD26與普遍存在的膜形式的DPP-IV/CD26具有相似的酶學特性和抗原特性；但是在多個生物化學方面截然不同。特別地，循環(huán)血清形式的DPP-IV/CD26的分子量為175kDa，不同于膜形式的105kDa的分子量，其不結(jié)合ADA-1。然而，循環(huán)形式的DPP-IV/CD26顯示功能性的二肽基肽酶IV活性，并且保留共刺激T淋巴細胞反應(yīng)回憶抗原(recallantigen)的能力。DPP-IV的蛋白水解活性位于該蛋白C-末端的約200個氨基酸的片段上。催化殘基(Ser-629、Asp-708、His-740)以不同于傳統(tǒng)絲氨酸蛋白酶如胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的獨特順序排列。脯氨酸特異的二肽基肽酶活性改變大量生物活性蛋白質(zhì)和多肽的生物學活性，其中，這些蛋白質(zhì)和多肽包括GLP-1、神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)、人生長激素釋放因子、促紅細胞生成素、白介素2等等。可能的DPP-IV底物列舉在表1、表2和表3中。調(diào)節(jié)這些肽來影響DPP-IV裂解可用于治療臨床病癥，包括但是不限于糖尿病、炎癥、血管病、自體免疫性疾病、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)病以及與良性和惡性細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的疾病表1具有倒數(shù)第二位脯氨酸的人細胞因子、生長因子、神經(jīng)肽和血管活性肽，它們是DPP-IV的推定底物。表2具有倒數(shù)第二位丙氨酸的人類肽和蛋白質(zhì)，它們是DPP-IV的推定底物。本發(fā)明可利用經(jīng)過修飾的DPP底物，在底物的N-末端包含一個或多個附加的氨基酸，以保護底物免受DPP活性的作用。用于按照本發(fā)明的修飾的優(yōu)選底物被公開在表3中。表3DPP-IV(CD26)裂解的底物用于修飾的底物包括氨基末端的X-Pro-Y、X-Ala-Y、X-Ser-Y或者X-Gly-Y。優(yōu)選地，用于修飾的底物是GLP-1。免受DPP活性作用的被修飾多肽本發(fā)明提供經(jīng)過修飾的多肽，例如DPP的經(jīng)過修飾的多肽底物，在底物的N-末端包含一個或多個附加的氨基酸，以保護該多肽底物免受DPP活性的作用。在一個實施方案中，與野生型多肽相比，經(jīng)過修飾的多肽在其N-末端具有一個附加的氨基酸。在另一個實施方案中，經(jīng)過修飾的多肽在其N-末端具有5個附加的氨基酸?？商娲?，經(jīng)過修飾的多肽在其N-末端具有1-5個附加的氨基酸。20種氨基酸的任何一種可被添加到多肽底物的N-末端，或者添加非天然的氨基酸?？梢灶A(yù)期，由于本發(fā)明提供了免受DPP裂解的保護，在施用之后會在體循環(huán)或者在體內(nèi)的任何部位被裂解的任何具有肽鍵的藥物多肽都會從按照本發(fā)明的修飾中獲益。按照本發(fā)明的這個方面，有可能去除至少約30％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約70％、甚至更優(yōu)選至少約90％、和最優(yōu)選至少約99％二肽基肽酶活性。采用本發(fā)明的方法，還可能完全去除二肽基氨基肽酶活性。同樣，可能降低至少約30％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約70％、甚至更優(yōu)選至少約90％、和最優(yōu)選至少約99％的底物的二肽基肽酶敏感性。采用本發(fā)明的方法，還可能完全去除二肽基氨基肽酶敏感性。盡管本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或者肽底物部分地或基本上免受DPP活性的作用，但是經(jīng)過修飾的多肽底物仍保留至少約10％、優(yōu)選至少約30％、更優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約70％，甚至更優(yōu)選至少約90％，和最優(yōu)選至少約99％的功能活性和功效。在某些情形下，功能活性和功效下降的經(jīng)過修飾的多肽或肽底物是有用的。例如，當經(jīng)過修飾的多肽或肽與其它多肽如運鐵蛋白融合，形成血清穩(wěn)定性提高和體內(nèi)循環(huán)半衰期延長的融合蛋白時，功能活性或功效下降的經(jīng)過修飾的多肽或肽底物是有用的。在其它情形下，與未經(jīng)過修飾的多肽或肽相比，經(jīng)過修飾的多肽或肽的功效升高。與未被修飾形式的相同多肽比較，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽分子基本上免受二肽基肽酶裂解的作用。對這種實質(zhì)的保護作用進行的鑒定會因用于比較經(jīng)過修飾的多肽與未經(jīng)過修飾的多肽的分析而不同。然而，為了展示實質(zhì)的保護作用，在該分析中，經(jīng)過修飾的多肽對二肽基肽酶裂解具有可檢測的抗性水平。這種分析包括但是不限于在Doyle等人(2002Endocrinology142，4462-4468)，O′Harte等人(1999Diabetes48，758-765)和Siegel等人(1999RegulatoryPeptide79，93-102)中公開的那些方法。與未被穩(wěn)定的多肽底物相比，本發(fā)明的DPP穩(wěn)定多肽底物在體內(nèi)存在DPP時更加穩(wěn)定。與序列相同的未被穩(wěn)定的多肽相比，DPP穩(wěn)定的治療性多肽底物通常具有更長的活性半衰期。通過將未經(jīng)過修飾的多肽底物在血清或者血液中的半衰期與經(jīng)過修飾的對應(yīng)治療性肽在血清或血液中的半衰期比較，確定肽酶的穩(wěn)定性。通過在施用經(jīng)過修飾的肽和未經(jīng)過修飾的肽后采集血清或血液樣本，并確定該肽的活性，來確定半衰期。除了確定活性，還通過HPLC或者質(zhì)譜分析來測定多肽底物的長度。本發(fā)明還提供經(jīng)過修飾的多肽或肽，其具有按照本發(fā)明的被改變的氨基末端以免受DPP裂解的作用，并且具有不影響多肽的功能活性或功效的內(nèi)部和/或C-末端的氨基酸改變。這些經(jīng)過修飾的多肽具有較少的氨基酸改變，雖然這些氨基酸改變也包括非保守的取代，但通常是保持的氨基酸取代。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽還具有改變的功能活性。例如，功能活性升高的經(jīng)過修飾的多肽或肽是有用的?？商娲?，可以使用功能活性下降的經(jīng)過修飾的多肽或肽。因此，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽還含有不影響功能活性或功效的氨基酸改變。例如，對功能活性改變的GLP-1類似物的氨基末端進行修飾，使其免受DPP裂解的作用。保守氨基酸取代的例子是在相同組中進行的取代，例如在堿性氨基酸組(例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，酸性氨基酸組(例如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸組(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸組(例如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，芳香氨基酸組(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸組(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)。非保守性取代包括一個組中的氨基酸被另一個組的氨基酸取代。例如，非保守性取代包括用極性氨基酸取代疏水性氨基酸。對核苷酸取代的一般性描述參見例如Ford等人(1991)，Prot.Exp.Pur.295-107。本發(fā)明提供經(jīng)過修飾的多肽和肽的氨基酸序列的顯然變體，例如天然存在的成熟形式的多肽或肽、多肽的等位基因變體/序列變體、肽的非天然存在的重組來源的變體，以及多肽或肽的直向同源物和種內(nèi)同源物。使用核酸重組技術(shù)和蛋白質(zhì)生物化學領(lǐng)域的已知技術(shù)，可以很容易地制備這種變體。使用分子技術(shù)和序列信息，能夠容易地鑒定/制備這種變體。此外，根據(jù)其與本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽的序列和/或結(jié)構(gòu)的同源性，很容易將這種變體與其它肽區(qū)分開。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的肽是在N-末端包含一個或多個附加的氨基酸的GLP-1及其類似物。在某些情形下，DPP例如DPP-IV可以激活肽，而不是通過裂解滅活該肽。在這種情形下，對肽的修飾能夠基本上減少、延緩或者阻止肽活化。編碼經(jīng)過修飾的多肽的核酸本發(fā)明提供編碼經(jīng)過修飾的多肽和肽的核酸分子，這些多肽和肽部分地或者基本上免受DPP裂解的作用并具有功能活性和功效。在一個實施方案中，本發(fā)明所提供的核酸分子編碼經(jīng)過修飾的多肽和肽，與其野生型的未經(jīng)過修飾的多肽相比，經(jīng)過修飾的多肽和肽在其N-末端具有至少一個附加的氨基酸。在另一個實施方案中，核酸分子編碼在其N-末端具有5個附加的氨基酸的經(jīng)過修飾的多肽和肽?？商娲?，核酸分子編碼在其N-末端具有1-5個的附加的氨基酸的經(jīng)過修飾的多肽和肽。優(yōu)選地，編碼修飾的GLP-1的核酸分子包含編碼在其N-末端具有一個或多個附加氨基酸的序列。本發(fā)明的核酸分子包括脫氧核糖核酸(DNAs)，單鏈的和雙鏈的脫氧核糖核酸。然而，還可以是核糖核酸(RNAs)，以及雜合的RNADNA雙鏈分子。被包括的核酸分子還包括基因組DNA、cDNA、mRNA，以及反義分子。本發(fā)明的核酸分子還包括編碼經(jīng)過修飾的多肽的天然的或合成的RNA、DNA或cDNA，或其互補鏈。為了構(gòu)建經(jīng)過修飾的多肽，其與野生型的未經(jīng)過修飾的多肽相比部分地或基本上免受DPP活性的作用并且具有功能活性和/或功效，編碼野生型的未經(jīng)過修飾的多肽的核酸可被用作起始點，并被修飾來編碼期望的經(jīng)過修飾的多肽。已知有許多方法用于添加序列或者用于突變編碼多肽的核酸序列，并確定由這些經(jīng)過修飾的序列所編碼的多肽的功能。本發(fā)明還提供編碼多肽和肽的核酸，該多肽具有免受DPP裂解作用的經(jīng)過修飾的氨基末端以及基本上不影響多肽的功能活性或功效的內(nèi)部的和C-末端的氨基酸改變。這些經(jīng)過修飾的多肽具有較少的氨基酸改變，雖然這些氨基酸改變也可以是非保守取代，但是它們通常是保守氨基酸取代。用于實現(xiàn)位點特異性誘變的技術(shù)的核苷酸取代在本領(lǐng)域是熟知的。優(yōu)選地，核酸編碼在N-末端具有一個或多個附加氨基酸的GLP-1類似物。如本領(lǐng)域所知，兩條多核苷酸或多肽之間的“相似性”，是通過將一條多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物與第二條多核苷酸或多肽的序列比較來確定。如本領(lǐng)域所知，“同一性”是指兩條多肽或兩條多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，通過鑒定這種序列兩條鏈之間的匹配程度來確定。同一性和相似性都很容易計算(ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.編輯，OxfordUniversityPress，NewYork，1988；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects，Smith，D.W.編輯，AcademicPress，NewYork，1993；ComputerAnalysisofSequenceData，PartI，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，HumanaPress，NewJersey，1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987和SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，MStocktonPress，NewYork，1991)。在存在大量測定兩條多核苷酸或多肽序列之間的同一性和相似性的方法同時，術(shù)語“同一性”和“相似性”也是技術(shù)人員所熟知的(SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987；SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.以及Devereux，J.編輯，MStocktonPress，NewYork，1991；以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAMJ.AppliedMath.，481073(1988)。通常用于測定兩條序列之間的同一性或相似性的方法包括，但是不限于在GuidetoHugeComputers，MartinJ.Bishop編輯，AcademicPress，SanDiego，1994，以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAMJ.AppliedMath.481073(1988)中公開的那些方法。設(shè)計確定同一性的優(yōu)選方法，以在所檢測的兩條序列之間產(chǎn)生最大匹配。確定同一性和相似性的方法被編寫成計算機程序。確定兩條序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括，但是不限于GCG程序包(Devereux等人，NucleicacidResearch12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molec.Biol.215403(1990))。上面所提及的相似性或同一性的大小被確定為兩條序列之間的相同程度，表示第一條序列衍生于第二條序列。兩條核酸序列之間的相同程度可以通過本領(lǐng)域知曉的計算機程序來確定，例如在GCG程序軟件包中提供的GAP(Needleman和Wunsch(1970)JournalofMolecularBiology48443-453)。為了確定本發(fā)明的兩條核酸序列之間的相同程度，使用GAP，具有如下設(shè)定5.0的GAP產(chǎn)生(creation)罰分和0.3的GAP延長(extension)罰分。密碼子優(yōu)化遺傳密碼的簡并性使得可以改變多肽的核苷酸序列，而仍然生成包含與第一DNA序列所編碼的多肽相同的氨基酸序列的修飾多肽。該操作稱作“密碼子優(yōu)化”(描述在美國專利US5,547,871中，其在此全文引入作為參考)，提供設(shè)計這種被改變的DNA序列的方法。密碼子優(yōu)化的基因的設(shè)計應(yīng)當考慮各種因素，包括生物體中密碼子利用的頻率、最接近的鄰近者頻率、RNA穩(wěn)定性、二級結(jié)構(gòu)形成的可能性、合成路徑以及意欲對該基因進行的本來DNA操作。特別地，當采用酵母表達系統(tǒng)時，采用可獲得的方法來用那些最容易被酵母識別的密碼子改變編碼特定融合蛋白的密碼子。遺傳密碼的簡并性使得相同的氨基酸序列可以用多種不同方式來編碼和翻譯。例如，亮氨酸、絲氨酸和精氨酸分別由六種不同的密碼子編碼，而纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和甘氨酸分別由四種不同密碼子編碼。但是，在真核細胞和原核細胞中，這種同義密碼子的使用頻率在基因組之間是不同的。例如，同義密碼子的選擇模式在哺乳動物之間十分類似，而在進化距離遠的生物體例如酵母(例如釀酒酵母)、細菌(例如大腸桿菌)和昆蟲(例如D.Melanogaster)中，則表現(xiàn)出明顯不同的基因組密碼利用頻率模式(Grantham，R.等人，Nucl.AcidRes.，8，49-62(1980)；Grantham，R.等人，Nucl.AcidRes.，9，43-74(1981)；Maroyama，T.等人，Nucl.AcidRes.，14，151-197(1986)；Aota，S.等，Nucl.AcidRes.，16，315-402(1988)；Wada，K.等人，Nucl.AcidRes.，19Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，F(xiàn)EBSLetters，285，165-169(1991))。密碼子選擇模式的這些差別似乎通過調(diào)節(jié)肽伸長比例來影響各個基因的整體表達水平。(Kurland，C.G.，F(xiàn)EBSLetters，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBOJ.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L.等人，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.和Yarus，M.，J.Mol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S.等人，J.Mol.Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S.等人，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P.，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。合成基因的優(yōu)選密碼子利用頻率應(yīng)當反映來源于精確的(或者盡可能密切相關(guān))細胞/生物體的基因組的核基因的密碼子利用，該細胞/生物體將被用于重組蛋白的表達，特別是酵母屬的細胞/生物體。如上所討論，在一個優(yōu)選實施方案中，在在此所描述的修飾之前或之后，經(jīng)過修飾的多肽已經(jīng)過密碼子優(yōu)化以用于酵母表達。載體用于本發(fā)明的表達單位通常包含如下元件，以5′到3′方向被可操作地連接轉(zhuǎn)錄啟動子、分泌信號序列、編碼經(jīng)過修飾的多肽的DNA序列，以及轉(zhuǎn)錄終止子。如上所討論，經(jīng)過修飾的多肽和肽的任何排列可以被用于本發(fā)明的載體中。對合適的啟動子、信號序列和終止子的選擇將通過所選擇的宿主細胞來確定，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯然的，將在下文中更加具體地討論。用于本發(fā)明中的合適酵母載體描述在美國專利US6,291,212中，包括YRp7(Struhl等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA761035-1039，1978)、YEpl3(Broach等人，Gene8121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature275104-108，1978)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4及其衍生物。有用的酵母質(zhì)粒載體還包括pRS403-406、pRS413-416和得自StratageneCloningSystems，LaJolla，CA92037，USA的畢赤氏酵母(Pichia)載體。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406都是酵母整合型質(zhì)粒(YIps)并且納入了酵母可選擇標記HIS3、TUPI、LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413-41.6是酵母著絲粒質(zhì)粒(YCps)。這種載體通常包括可選擇的標記，可以是任意大量具有顯性表型的基因之一，由此，可以進行表型分析來選擇轉(zhuǎn)化體。優(yōu)選的可選擇標記是那些彌補宿主細胞營養(yǎng)缺陷的標記，產(chǎn)生抗生素抗性或使細胞能夠利用特定的碳源的標志，包括LEU2(Broach等人，同前)、URA3(Botstein等人，Gene817，1979)、HIS3(Struhl等人，同前)或POT1(Kawasaki和Bell，EP171，142)。其它合適的選擇性標記包括CAT基因，其賦予酵母細胞氯霉素抗性。用于酵母中的優(yōu)選啟動子包括來自酵母糖酵解基因的啟動子(Hitzeman等人，JBiol.Chem.22512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，美國專利US4,599,311)或醇脫氫酶基因的啟動子(Young等人，載于GeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals，Hollaender等人(編輯)，355，Plenum，紐約，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)。從這一點看，特別優(yōu)選的啟動子是TPI1啟動子(Kawasaki，美國專利US4,599,311)和ADH2-4C(參見美國專利US6,291,212)啟動子(Russell等人，Nature304652-654，1983)。表達單位可能還包括轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子為TPI1終止子(Alber和Kawasaki，同前)。更優(yōu)選地，啟動子是EP431880中公開的PRB1啟動子，而終止子是EP60057中公開的ADH1終止子，這兩份專利在此完全引入作為參考。除了酵母，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽和肽可以在絲狀真菌中表達，例如，在曲霉菌屬各菌種中。有用的啟動子的例子包括那些來源于構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)糖酵解基因的啟動子，例如ADH3啟動子(McKnight等人，EMBOJ.42093-2099，1985)和tpiA啟動子。合適的終止子的例子為ADH3終止子(McKnight等人，同前)。利用這些元件的表達單位可以克隆到能夠插入到例如曲霉菌屬的染色體DNA中的載體中。用于實現(xiàn)本發(fā)明的哺乳動物表達載體將包括能夠引導(dǎo)經(jīng)過修飾的多肽和肽轉(zhuǎn)錄的啟動子。優(yōu)選啟動子包括病毒啟動子和細胞啟動子。優(yōu)選的病毒啟動子包括來自腺病毒2的主要晚期啟動子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.21304-13199，1982)和SV40啟動子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1854-864，1981)。優(yōu)選的細胞啟動子包括小鼠金屬硫蛋白-1啟動子(Palmiter等人，Science222809-814，1983)和小鼠Vκ(參見美國專利US6,291,212)啟動子(Grant等人，Nuc.AcidsRes.155496，1987)。特別優(yōu)選的啟動子是小鼠VH(參見美國專利US6,291,212)啟動子。這些表達載體還可以含有位于啟動子下游和編碼經(jīng)過修飾的多肽或肽的DNA序列上游的一套RNA剪切位點。優(yōu)選的RNA剪切位點可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因中獲得。在表達載體中還含有位于感興趣的編碼序列下游的聚腺苷酸化信號。聚腺苷酸化信號包括來自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信號(Kaufman和Sharp，同前)，來自腺病毒5E1B區(qū)以及人生長激素基因終止子的聚腺苷酸化信號(DeNoto等人，Nucl.AcidRes.93719-3730，1981)。特別優(yōu)選的聚腺苷酸化信號為VH(參見美國專利US6,291,212)基因終止子。表達載體可以包括非編碼的病毒前導(dǎo)序列，例如腺病毒2的三聯(lián)前導(dǎo)序列，位于啟動子和RNA剪切位點之間。優(yōu)選的載體還可以包括增強子序列，例如SV40增強子和小鼠μ(參見美國專利US6,291,212)增強子(Gillies，Cell33717-728，1983)。表達載體還可以包括編碼腺病毒VARNA的序列。如下文所述，表達載體還用于表達融合蛋白，該融合蛋白包括被融合到第二種多肽或肽例如運鐵蛋白上的本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽，用于延長經(jīng)過修飾的多肽或肽的半衰期。此外，將經(jīng)過修飾的多肽或肽融合到用于表達和釋放經(jīng)過修飾的多肽或肽的標記(tag)和/或裂解位點上。轉(zhuǎn)化用于轉(zhuǎn)化真菌的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，被描述在例如Beggs(同前)、Hinnen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929-1933，1978)、Yelton等人，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA811740-1747，1984)和Russell(Nature301167-169，1983)中。宿主細胞的基因型通常具有遺傳缺陷，該缺陷由存在表達載體上的選擇標記來彌補。選擇特定宿主和可選擇的標記在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)?？梢酝ㄟ^例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，將包含本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽和肽的克隆的DNA序列導(dǎo)入到被培養(yǎng)的哺乳動物細胞中(Wigler等人，Cell14725，1978；Corsaro和Pearson，SomaticCellGenetics7603，1981；Graham和VanderEb，Virology52456，1973)。還可以采用將克隆DNA序列導(dǎo)入哺乳動物細胞中的其它技術(shù)，例如電穿孔(Neumann等人，EMBOJ.1841-845，1982)或脂轉(zhuǎn)染。為了鑒定已經(jīng)整合了克隆的DNA的細胞，通常將可選擇標記以及感興趣的基因或cDNA插入到細胞中。用于培養(yǎng)哺乳動物細胞中的優(yōu)選可選擇標記包括賦予對藥物的抗性的基因，這些藥物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤?？蛇x擇標記可以是可擴增的選擇標記。優(yōu)選的可擴增的選擇標記為DHFR基因。特別優(yōu)選的可擴增標記為DHFRr(參見美國專利US6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA802495-2499，1983)?？蛇x擇標記在Thilly(MammalianCellTechnology，ButterworthPublishers，Stoneham，Mass.)中評述，并且選擇可選擇的標記在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。宿主細胞本發(fā)明還包括被轉(zhuǎn)化來表達本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽的細胞，優(yōu)選為酵母細胞。除了被轉(zhuǎn)化的宿主細胞本身，本發(fā)明還包括這些細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(克隆均一的)培養(yǎng)物或者來源于單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。如果多肽被分泌，則培養(yǎng)液中含有該多肽和細胞，或者如果細胞被過濾或離心掉，則不含細胞。用于實現(xiàn)本發(fā)明的宿主細胞包括真核細胞，有時為原核細胞，能夠用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并在培養(yǎng)液中生長，例如培養(yǎng)的哺乳動物、昆蟲、真菌、植物和細菌細胞。將包含本發(fā)明的核酸序列的載體導(dǎo)入到宿主細胞中，使得該載體被保持為一種染色體整合體或者自我復(fù)制的染色體外載體。由于核酸序列更可能被穩(wěn)定地維持在細胞中，整合通常被認為是一種優(yōu)點。通過同源重組或非同源重組來將載體整合到宿主染色體中。對宿主細胞的選擇在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是單細胞的微生物，例如原核細胞，或者非單細胞的微生物，例如真核細胞。原核細胞或者真核細胞都是可使用的。當為原核宿主細胞時，可以使用通常被使用的細胞如大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌。當用原核細胞作為宿主細胞時，使用在宿主細胞中可復(fù)制的載體。優(yōu)選使用表達質(zhì)粒，其在本發(fā)明的基因上游的載體中提供起始蛋白質(zhì)合成所需的啟動子、SD序列(Shine-Dalgarno序列)和起始密碼子(例如ATG)，以促使基因的表達。上述載體的例子包括來源于大腸桿菌的通常被使用的質(zhì)粒如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等。然而，可應(yīng)用的載體不限于這些例子和還可以使用各種已知載體。可用于使用大腸桿菌的表達系統(tǒng)中的商業(yè)上可獲得到載體的例子包括pGEX-4T(AmershamPharmaciaBiotech)、pMAL-C2、pMAl-P2(NewEnglandBiolabs)、pET21/lacq(Invitrogen)、pBAD/His(Invitrogen)等。真核宿主細胞的例子包括酵母細胞等。優(yōu)選使用的有頭類動物細胞的例子包括COS細胞(來自猴子的細胞)(1981Cell，23，175)，中國倉鼠卵巢細胞及其來源的二氫葉酸還原酶缺陷細胞株(1980Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，77，4216)等等，優(yōu)選使用的酵母細胞的例子包括釀酒酵母等。然而，所用的細胞不限于這些例子。優(yōu)選地，酵母細胞被用于表達經(jīng)過修飾的多肽或肽。真菌細胞包括酵母種類(例如酵母屬，裂殖酵母屬，畢赤氏酵母屬)，可以被用作本發(fā)明中的宿主細胞。包括被期望用于實現(xiàn)本發(fā)明、在本發(fā)明中作為表達本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽的宿主的包括酵母的真菌的例子是畢氏酵母屬(包括以前被分類為漢遜酵母屬(Hansenula)的種類)、酵母屬、克魯維酵母菌屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬、念珠菌屬、球擬酵母屬(Torulopsis)、孢圓酵母屬(Torulaspora)、裂殖酵母屬、固囊酵母屬(Citeromyces)、Pachysolen、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、木霉屬(Trichoderma)、頭孢霉屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉菌屬、脈孢菌屬、耶氏酵母屬(Yarrowia)、Metschunikowia、Rhodosporidium、擔子菌白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、Botryoascus、鎖擲孢酵母屬(Sporidiobolus)、擬內(nèi)孢霉(Endomycopsis)等。酵母菌屬的例子為釀酒酵母、S.italicus和魯氏酵母(S.Rouxii)。克魯維酵母菌屬的例子為K..fragilis、K..lactis和K..marxianus。合適的孢圓酵母屬種類為T.delbrueckii。畢赤氏酵母菌屬的例子為P.angusta(以前稱作H.polymorpha)、P.anomala(以前稱作H.anomala)和巴氏畢赤酵母(P.pastoris)。用于制備本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽的特別有用的宿主細胞為甲醇營養(yǎng)型(methanoltrophic)巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)(Steinlein等人(1995)ProteinExpress.Purif6619-624)。自從巴氏畢赤酵母的醇氧化酶啟動子被分離和克隆以來，巴氏畢赤酵母已經(jīng)被開發(fā)作為制備外源蛋白的重要宿主；其轉(zhuǎn)化首次在1985年被報導(dǎo)。在缺乏葡萄糖時，巴氏畢赤酵母能夠利用甲醇作為碳源。巴氏畢赤酵母表達系統(tǒng)能夠利用甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶(alcoholoxidase)(AOX1)啟動子，該啟動子控制編碼用于醇氧化酶的表達的基因，醇氧化酶催化甲醇代謝的第一個步驟。該啟動子已被表征，并且插入到一系列巴氏畢赤酵母表達載體中。由于在巴氏畢赤酵母中生成的蛋白質(zhì)通常能夠正確地折疊，并被分泌到培養(yǎng)液中，遺傳工程化的巴氏畢赤酵母的發(fā)酵提供了一種作為大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)良替代。釀酒酵母菌株是另一種優(yōu)選宿主。在一個優(yōu)選實施方案中，使用酵母細胞，或者更具體是在糖蛋白的天冬酰胺連接的糖基化所需的基因中具有遺傳缺陷的釀酒酵母宿主細胞。具有這種缺陷的釀酒酵母宿主細胞通過常規(guī)的突變和選擇技術(shù)來制備，盡管許多可以獲得的酵母菌株已經(jīng)被修飾來防止或減少糖基化或超甘露糖基化。為了優(yōu)化異源蛋白的制備，優(yōu)選宿主菌株具有突變，例如釀酒酵母的pep4突變(Jones，Genetics8523-33，1977)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解活性下降。特別有利地使用在編碼天冬氨酰蛋白酶酵母天冬酶1(YAP3)的基因或者編碼酵母天冬酶(yapsin)2的基因(MKC7)或者兩者(Copley等人1998Biochem.J.330，1333-1340)中具有突變的宿主，使得定向于堿性殘基的蛋白水解活性被降低或消除。在其它的蛋白酶編碼區(qū)含有突變的宿主菌株被特別地用于制備大量本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽。含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的宿主細胞在適當生長培養(yǎng)液中生長。如在此所用，術(shù)語“適當?shù)纳L培養(yǎng)液”是指含有細胞生長所需營養(yǎng)的培養(yǎng)液。細胞生長所需營養(yǎng)包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生長因子。生長培養(yǎng)液通常用于篩選含有DNA構(gòu)建體的細胞，通過例如藥物選擇或缺乏關(guān)鍵營養(yǎng)，營養(yǎng)缺乏通過DNA構(gòu)建體上的可選擇標記來彌補，或者用DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。酵母細胞，例如，優(yōu)選在化學成分確定的培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有非氨基酸的氮源、無機鹽、維生素和必需氨基酸添加劑。培養(yǎng)液的pH優(yōu)選維持在大于2并小于8的pH，優(yōu)選為pH5.5-6.5。維持穩(wěn)定的pH的方法包括進行緩沖和持續(xù)的pH控制，優(yōu)選通過添加氨水、氫氧化銨或者氫氧化鈉來實現(xiàn)pH控制。優(yōu)選的緩沖試劑包括檸檬酸、磷酸、琥珀酸和Bis-Tris(SigmaChemicalCo.，St.Louis，Mo.)。缺失天冬酰胺連接的糖基化所需基因的酵母細胞優(yōu)選在含有滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)液中生長。優(yōu)選的滲透穩(wěn)定劑是被添加到培養(yǎng)液中的山梨醇，其濃度在0.1M和1.5M之間，優(yōu)選為0.5M或1.0M。被培養(yǎng)的哺乳動物細胞一般在商業(yè)上可獲得的含血清或無血清的培養(yǎng)液中生長。選擇適合于特定細胞系的培養(yǎng)液在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。被轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞生長一段時間，通常為1-2天，開始表達感興趣的DNA序列。然后進行藥物選擇，選擇以穩(wěn)定的方式表達可選擇標記的生長細胞。對于已經(jīng)用可擴增的選擇標記轉(zhuǎn)染的細胞來說，可以逐步提高藥物濃度來選擇拷貝數(shù)增加的克隆序列，從而提高表達水平。桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)也可以用于制備本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽。BacPAKTM桿狀病毒表達表達系統(tǒng)(BDBiosciences(Clontech))在昆蟲宿主細胞中高水平地表達重組蛋白。目標基因被插入到轉(zhuǎn)化載體中，該載體與線性化的BacPAK6病毒DNA一起被共轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細胞中。BacPAK6DNA缺失桿狀病毒基因組的關(guān)鍵部分。當DNA與載體重組時，該關(guān)鍵元件被恢復(fù)，而目標基因被轉(zhuǎn)移到桿狀病毒的基因組中。重組后，少數(shù)病毒斑被挑取和純化，驗證重組表型。然后，擴增新分離的重組病毒，并用于感染昆蟲細胞培養(yǎng)物來制備大量的期望蛋白質(zhì)。分泌信號序列術(shù)語“分泌信號序列”或者“信號序列”或者“分泌前導(dǎo)序列”可以相互交換使用，被描述在例如美國專利US6,291,212和美國專利US5,547,871中，這兩份專利在此完全引入作為參考。分泌信號序列或信號序列或分泌前導(dǎo)序列編碼分泌肽。分泌肽是引導(dǎo)成熟多肽或蛋白質(zhì)從細胞中分泌出來的氨基酸序列。通常，分泌肽的特征在于具有疏水氨基酸核心，并且典型地(但是不是絕對地)存在于新合成的蛋白質(zhì)的氨基末端。在分泌過程中，分泌肽通常從成熟蛋白質(zhì)上被裂解下來。分泌肽可能含有加工位點，使得在經(jīng)過分泌路徑時，信號肽從成熟蛋白質(zhì)上裂解下來。加工位點被編碼在信號肽中，或者例如通過體外誘變被添加到信號肽中。分泌肽可以用于引導(dǎo)本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽和肽的分泌?？捎糜谂c其它分泌肽結(jié)合的一種這樣的分泌肽是酵母屏障蛋白(Barrierprotein)的第三個結(jié)構(gòu)域。分泌信號序列或信號序列或分泌前導(dǎo)序列是一系列復(fù)雜的翻譯后加工步驟所需的，這些步驟引起蛋白質(zhì)的分泌。如果存在完整的信號序列，被表達的蛋白質(zhì)進入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔，然后通過高爾基體轉(zhuǎn)運到分泌小泡中，最后被轉(zhuǎn)運到細胞外。通常，信號序列緊跟在起始密碼子后面，并且編碼被分泌的蛋白質(zhì)的氨基末端的信號肽。在大多數(shù)情況下，信號序列被稱作信號肽酶的特定蛋白酶裂解掉。優(yōu)選的信號序列提高由病毒、哺乳動物或酵母病毒載體所表達的重組蛋白質(zhì)的加工和外排效率。優(yōu)選的信號序列是哺乳動物或人的運鐵蛋白信號序列。在有些情況下，天然的底物信號序列可用于表達和分泌本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽。為了確保有效地去除信號序列，在某些情形下，優(yōu)選在信號序列和成熟蛋白之間包括短的前肽(pro-peptide)序列，其中前肽的C-末端部分包括蛋白酶識別位點，例如酵母kex2p蛋白酶。優(yōu)選地，前肽序列長約2-12個氨基酸，更優(yōu)選長約4-8個氨基酸。這種前肽的例子為Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg、Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg、Arg-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg和Arg-Ser-Leu-Glu-Arg-Arg(分別為SEQIDNO111-114)。免受DPP裂解作用的經(jīng)過修飾的多肽底物的制備通過標準的合成方法、DNA重組技術(shù)或者任何其它制備肽和融合蛋白的方法制備本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽，其部分地或者基本上抵抗DPP活性。在如下參考文獻中一般性地描述固相肽合成方法Merrifield，J.Am.Chem.Soc，8882149，1963；Barany和Merrifield，InthePeptides，E.Gross和J.Meinenhofer編輯，AcademicPress，NewYork，3285(1980)；S.B.H.Kent.Annu.Rev.Biochem.，57957(1988)。采用固相肽合成方法，可以通過逐步將氨基酸添加到共價連接到固體樹脂顆粒上的逐漸伸長的肽鏈上，制備具有期望長度和序列的肽。自動合成可被用于該方法中。如上所述，也可以用分子生物學技術(shù)，使用編碼這些多肽的核酸序列，來獲得本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽。這些序列可以是RNA或DNA，并與控制序列相連和/或插入到載體中。然后將載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞如細菌中。該載體的制備及其在宿主中生產(chǎn)或表達通過常規(guī)的分子生物學和遺傳工程技術(shù)來實現(xiàn)。此外，可以使用容易合成的DNA序列，在商業(yè)上可獲得的表達系統(tǒng)中通過重組技術(shù)制備本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽。通過重組方法獲得本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽，該重組方法包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收該多肽。使用本領(lǐng)域已知的方法，在適合生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)宿主細胞。例如，通過在實驗室或工業(yè)的發(fā)酵罐中搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、補料分批的或固相的發(fā)酵)培養(yǎng)細胞，在合適的培養(yǎng)液中和允許多肽表達和/或分離的條件下進行。采用本領(lǐng)域知曉的程序，在包含碳源和氮源以及無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)(參見例如，細菌和酵母的參考文獻；Bennett，J.W.和LaSure，L.編輯，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，加利福尼亞，1991)。合適的培養(yǎng)液可以從供應(yīng)商獲得或者按照公布的組成制備(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏目錄)。如果經(jīng)過修飾的多肽被分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)液中，可以從培養(yǎng)液中直接回收多肽。如果經(jīng)過修飾的多肽未被分泌，從細胞裂解產(chǎn)物中回收多肽。作為一個例子，包括經(jīng)過修飾的多肽或肽融合蛋白的本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽通過在WO0044772中公開的發(fā)酵方法來制備，該專利在此完全引入作為參考。經(jīng)過修飾的多肽用本領(lǐng)域知曉的方法來檢測，該方法特異于該多肽。這些檢測方法包括特異性抗體的使用，酶產(chǎn)物的形成或者酶底物的消失，結(jié)合特異的受體，或者通過在細胞分析中檢測特異受體的活化。例如，用酶分析來確定經(jīng)過修飾的多肽的活性。通過常規(guī)程序，包括但是不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或者沉淀，從營養(yǎng)培養(yǎng)液中回收所生成的經(jīng)過修飾的多肽。本發(fā)明的多肽通過多種本領(lǐng)域知曉的方法來純化，包括但是不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦、大小排阻層析)，電泳方法(例如，制備等電子聚焦、示差溶解性(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見例如，ProteinPurification，J.C.Janson和LarsRyden編輯，VCHPublishers，NewYork，1989)。融合蛋白和蛋白偶聯(lián)物本發(fā)明提供經(jīng)過修飾的多肽或肽，其通過重組方法或者共價連接附著到異源分子上。連接到異源分子如血漿蛋白上，會使得經(jīng)過修飾的多肽或肽的活性延長數(shù)天到數(shù)周。在某些情形下，在該時期僅需要施用一次這種經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽。由于活性化合物將主要結(jié)合大分子，而該大分子被攝入細胞內(nèi)干擾其它生理過程的可能性較小，因而可以獲得較大的特異性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽通過重組方式附著到異源序列上，形成嵌合蛋白或融合蛋白。這種嵌合蛋白或融合蛋白包含可操作地連接到異源蛋白質(zhì)上的經(jīng)過修飾的多肽或肽，經(jīng)過修飾的多肽或肽部分地或者基本上免受DPP裂解的作用，而所述異源蛋白質(zhì)具有基本上不與經(jīng)過修飾的多肽或肽同源的氨基酸序列?！翱刹僮鞯剡B接”是指經(jīng)過修飾的多肽或肽與異源蛋白質(zhì)在讀框內(nèi)融合。異源蛋白質(zhì)融合到經(jīng)過修飾的多肽或肽的N-末端或C-末端。在一個實施方案中，融合蛋白不影響本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽本身的活性。例如，融合蛋白包括，但不限于，酶促的融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合物、酵母雙雜合GAL融合物、多聚His融合物、MYC-標記融合物、HI-標記融合物以及Ig融合物。這種融合蛋白，特別是多聚-His融合物，便于重組的經(jīng)過修飾的多肽的純化。在另一個例子中，融合蛋白包含本發(fā)明的被修飾肽和其它部分(moiety)之間的氨基酸序列，所述氨基酸序列提供識別序列，使得在化學或者酶促裂解后能夠釋放本發(fā)明的經(jīng)過修飾的肽。在某些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中，蛋白的表達和/或分泌可以通過使用異源信號序列來增加。在另一個實施方案中，將經(jīng)過修飾的多肽或肽融合到將能夠延長其血清穩(wěn)定性或血清半衰期的分子上，例如血漿蛋白上。優(yōu)選地，將經(jīng)過修飾的多肽或蛋白融合到血清白蛋白、免疫球蛋白或其部分如Fc結(jié)構(gòu)域上。更優(yōu)選地，將經(jīng)過修飾的多肽或肽融合到運鐵蛋白、乳運鐵蛋白、黑素運鐵蛋白或其雜合物上。美國專利申請10/231,494和US10/378,094以及國際專利申請PCT/US03/26818中提供了制備這種融合蛋白的方法，這些專利申請在此完全引入作為參考。如這些專利申請中所討論，可以修飾與經(jīng)過修飾的多肽或肽連接的運鐵蛋白。其可呈現(xiàn)糖基化程度降低。經(jīng)過修飾的運鐵蛋白多肽可選自如下的一種或多種單個運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域、單個運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域、運鐵蛋白N和C結(jié)構(gòu)域、兩種運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域以及兩種運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域。當Tf的C結(jié)構(gòu)域作為融合蛋白的一部分時，對應(yīng)于N413和N611的氨基酸殘基(PCT/US03/26818的SEQIDNO3，其在此完全引入作為參考)的兩個N-連接的糖基化位點被突變，以在酵母系統(tǒng)中進行表達，避免發(fā)生糖基化或者超甘露糖基化，并延長融合蛋白和/或治療性蛋白的血清半衰期(制備唾液酰(asialo)Tf，或某些情形下，單唾液酰(monosialo)-Tf或雙唾液酰(disialo)-Tf)。除了對應(yīng)于N413和N611的Tf氨基酸之外，還可以對N-X-S/T糖基化位點內(nèi)的鄰近殘基進行突變，以防止或者基本上減少糖基化。參見Funk等人的美國專利US5,986,067。已經(jīng)報道，在巴氏畢赤酵母中表達的Tf的N結(jié)構(gòu)域在S32處被單個己糖O-連接的糖基化，位點S32也可以被突變或者修飾來防止這種糖基化。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)過修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白的糖基化程度降低，包括但是不限于唾液酰、單唾液酰和雙唾液酰形式的Tf。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組的運鐵蛋白突變體，其被突變以防止糖基化。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括被完全糖基化的重組運鐵蛋白突變體。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組的人血清運鐵蛋白突變體，其被突變以防止糖基化，其中至少Asn413和Asn611(PCT/US03/26818的SEQIDNO3，其在此完全引入作為參考)之一被突變?yōu)椴荒苓M行糖基化的氨基酸。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組的人血清運鐵蛋白突變體，其被突變來防止或者基本上減少糖基化，其中可以對N-X-S/T糖基化位點內(nèi)的鄰近殘基進行突變。而且，通過突變絲氨酸或蘇氨酸殘基來減少或者防止糖基化。此外，已知將X變?yōu)楦彼崮軌蛞种铺腔?。可以通過標準的DNA重組技術(shù)來制備嵌合蛋白或融合蛋白。例如，編碼不同蛋白質(zhì)的DNA片段按照常規(guī)方法在讀框內(nèi)連接在一起。在另一個實施方案中，融合基因通過常規(guī)技術(shù)合成，包括DNA自動合成儀。可替代地，用錨定引物來進行基因片段的PCR擴增，該錨定引物使得生成兩個連續(xù)的基因片段之間的互補突出端，接著退火和再擴增，生成嵌合的基因序列(參見Ausubel1992CurrentProtocolsinMolecularBiology)。而且，許多表達載體是商業(yè)上可獲得的，這些載體已經(jīng)編碼一種融合部分(fusionmoiety)(例如，GST蛋白)。將編碼經(jīng)過修飾的多肽或肽的核酸克隆到這種表達載體中，使得融合部分以讀框內(nèi)的方式被連接到經(jīng)過修飾的多肽或肽上。在另一個實施方案中，經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽通過共價鍵偶聯(lián)到異源分子上，提高其穩(wěn)定性并免受DPP活性的作用。作為一個例子，經(jīng)過修飾的多肽或肽通過經(jīng)過修飾的肽的反應(yīng)基團與血液成分之間形成的共價鍵偶聯(lián)到血液成分上，所述血液成分可有可無連接基團。血液成分可以是固定的或者可移動的。固定的血液成分的例子為不可移動的血液成分，包括組織、膜受體、間質(zhì)蛋白(interstitialprotein)、纖維蛋白、膠原蛋白、血小板、內(nèi)皮細胞、上皮細胞及其相關(guān)的膜和膜受體、體細胞、骨骼肌細胞和平滑肌細胞、神經(jīng)元成分、骨細胞和破骨細胞，以及所有機體組織，特別是那些與循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)相關(guān)的組織?？梢苿拥难撼煞值睦邮窃谌魏窝娱L的時間段內(nèi)不具有固定位置的血液成分，所述延長時間段通常不超過5分鐘，更通常不超過1分鐘。這些血液成分不是膜相關(guān)的，并且在血液中存在延長的時間，并且以至少0.1μg/ml的最小濃度存在?？梢苿拥难撼煞职ㄑ灏椎鞍?、運鐵蛋白、免疫球蛋白如IgM和IgG、α1蛋白酶抑制劑、抗凝血酶III和α2-抗纖溶酶?？梢苿拥难撼煞值陌胨テ谕ǔＶ辽偌s12小時。在血液成分與經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽之間的共價鍵可能在體內(nèi)(invivo)或離體(exvivo)形成。對于離體形成共價鍵，將經(jīng)過修飾的多肽或肽添加到血液、血清或者含有如人血清白蛋白或者IgG的血液成分的生理鹽水溶液中，以在經(jīng)過修飾的多肽或肽和血液成分之間形成共價鍵。此外，經(jīng)過修飾的多肽或肽用馬來酰亞胺或者類似的反應(yīng)化學基團修飾，并在生理鹽水溶液中與血液成分反應(yīng)。一旦經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽與血液成分反應(yīng)，形成經(jīng)過修飾的多肽或肽偶聯(lián)物時，將該偶聯(lián)物施用給患者?？商娲兀梢詫⒔?jīng)過修飾的治療性多肽或肽直接施用給患者，使得在體內(nèi)形成經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽和血液成分之間的共價鍵。此外，可以用重組蛋白例如白蛋白來進行相同的反應(yīng)。非特異性的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的化學反應(yīng)基團會在體內(nèi)與之反應(yīng)的各種部位包括細胞，特別是紅細胞(紅血球)和血小板，以及蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白，包括IgG和IgM，血清白蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、運鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2-巨球蛋白等。經(jīng)過修飾的多肽或肽可以含有或可被化學修飾以含有結(jié)合硫醇(thiol)的反應(yīng)基團。在本發(fā)明的一個實施方案中，經(jīng)過修飾的多肽或肽可與聚乙二醇偶聯(lián)?？商娲?，經(jīng)過修飾的多肽或肽可與用聚乙二醇修飾的糖脂或者用聚乙二醇修飾的脂肪酸偶聯(lián)。一個方面，可將修飾的多肽或肽偶聯(lián)到脂肪酸或脂肪酸衍生物上，提高其穩(wěn)定性。脂肪酸的例子包括但是不限于，月桂酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸。脂肪酸衍生物的例子包括乙酯、丙酯、膽甾醇酯、輔酶A酯、硝基苯基酯、萘基酯、甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯、脂肪醇、脂肪醇乙酸酯等。另一個方面，可將修飾的多肽或肽工程制備到藥物親和復(fù)合物(drugaffinitycomplex)(DACTM)上。藥物親和復(fù)合物具有三個部分負責生物學活性的藥物成分；將藥物成分附著到反應(yīng)化學基團上的連接體；以及位于連接體另一端的反應(yīng)化學基團，負責將該構(gòu)建物永久地結(jié)合到機體中的特定目標蛋白質(zhì)上。例如，Kim等人(2003，Diabetes52(3)751)公開了一種GLP-1-白蛋白藥物親和復(fù)合物。Kim等人證明，白蛋白偶聯(lián)的DACGLP-1結(jié)合到GLP-1受體(GLP-1R)上，并激活在表達該受體的異源成纖維細胞中形成cAMP。該結(jié)果表明，白蛋白偶聯(lián)的DACGLP-1模擬天然的GLP-1。Kim等人提供一種用于延長GLP-1R信號活化的新方法。設(shè)計修飾的多肽或肽藥物親和復(fù)合物以通過皮下注射施用，并且在體內(nèi)快速而選擇性地結(jié)合白蛋白。所形成的生物偶聯(lián)物具有與內(nèi)源性多肽或肽相同的治療活性和類似功效，而且在動物體內(nèi)具有更為接近于白蛋白的藥物動力學模式。藥物組合物本發(fā)明提供藥物組合物，其包含經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽，該多肽和肽部分地或者基本上免受DPP裂解的作用，但是仍保留其功能活性和功效。這種藥物組合物可以口服、胃腸外施用，如血管內(nèi)(IV)、動脈內(nèi)(IA)、肌肉內(nèi)(IM)、皮下(SC)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮等途徑施用?？梢栽谶m當情況下通過灌注進行施用。在某些情形下，可以進行口腔的、鼻內(nèi)的、直腸的、經(jīng)皮的、通過氣霧施用，而經(jīng)過修飾的多肽可以被轉(zhuǎn)移到血管系統(tǒng)。例如，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽與運鐵蛋白部分構(gòu)成的融合物或偶聯(lián)物可以將經(jīng)過修飾的多肽轉(zhuǎn)移到血管系統(tǒng)，或者通過結(jié)合運鐵蛋白受體跨過血腦屏障，如國際專利申請PCT/US03/26778中所述，該申請在此完全引入作為參考。雖然如果需要可以進行多次注射，但是通常進行一次注射。可以通過任何便利的工具來施用經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽，包括注射器、套管針、導(dǎo)尿管等。特定的施用方式將根據(jù)要施用的量而變化，無論是單次藥丸(asinglebolus)或者連續(xù)施用等等方式。優(yōu)選地，可以進行血管內(nèi)施用，其中導(dǎo)入的部位對本發(fā)明來說不是關(guān)鍵的，優(yōu)選在存在快速血流的部位，例如靜脈內(nèi)施用時為外周靜脈或者中央靜脈。更優(yōu)選地，可以皮下施用藥物組合物。當施用與緩釋技術(shù)或者保護性基質(zhì)相結(jié)合時，其它途徑也是有用的。目的在于使經(jīng)過修飾的治療性肽或多肽如在血液中被有效地分布，以便能夠與血液成分或者組織成分反應(yīng)。一般地，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽以及藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。這種組合物包括具有各種緩沖組分(例如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑如去污劑(detergent)和增溶劑(例如，聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，硫柳汞、苯甲醇)以及膨脹物(例如，乳糖、甘露醇)；將所述材料納入到聚合化合物如多聚乳酸、多聚乙醇酸等的顆粒制備物中，或者納入到脂質(zhì)體中。還可以使用透明質(zhì)酸，這具有延長在循環(huán)中的持續(xù)時間的作用。這種組合物可能會影響當前的蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度以及體內(nèi)清除速度。參見例如，Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版(1990，MackPublishingCo.，Easton，Pa.18042)第1435-1712頁，在此引入作為參考。例如，可在生理學上可接受的溶液中施用經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽，所述溶液例如，去離子水、磷酸緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水、含水乙醇或者其它醇溶液、血漿、蛋白質(zhì)溶液、甘露醇、含水葡萄糖、醇、植物油等。其它添加劑包括緩沖劑、鹽、生理學上可接受的穩(wěn)定劑等等，其中所述溶液通常緩沖到約5-10的pH范圍內(nèi)，而緩沖劑的濃度范圍通常在約50-250mM，鹽的濃度范圍通常在約5-500mM。生理緩沖液的例子，特別是用于注射的，包括Hank’s液和Ringer’s液。經(jīng)皮制劑可含有滲透劑，如膽汁鹽或梭鏈孢酸鹽(fusidates)。藥物組合物可制備成片劑或者錠劑、舌下片(sublingualtablets)、香囊(sachets)、paquets、軟明膠膠囊、栓劑、乳劑(cream)、軟膏劑(ointment)、皮膚凝膠劑、經(jīng)皮裝置、氣霧劑、可飲用的和可注射的針劑。組合物還可以制備成液體形式，或者制備成干燥的粉末，例如便于儲存和運輸?shù)膬龈尚问?。還包括可植入的緩釋制劑。口服劑量形式在一個實施方案中，本發(fā)明提供口服固體劑量形式的藥物組合物，其包含經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽，所述劑量形式在Remington′sPharmaceuticalSciences(1990)，第18版，MackPublishingCo.EastonPa.18042中有一般性的描述，其在此引入作為參考。固體劑量形式包括片劑、膠囊、藥丸、錠劑(troche)或菱形片(lozenge)、扁膠劑(cachet)或小丸(pellet)。此外，脂質(zhì)體的或者類蛋白的包裝可用于配制本發(fā)明的組合物(例如美國專利US4,925,673中報道的類蛋白微球)?？梢允褂弥|(zhì)體包裝，該脂質(zhì)體可用各種聚合物衍生化(例如美國專利US5,013,556)。對于治療用的可能固體劑量形式的描述在由G.S.Banker和C.T.Rhodes編輯，Marshall，K.，ModernPharmaceutics(1979)的第10章中給出，其在此引入作為參考?？傊鲋苿ń?jīng)過修飾的治療性多肽或肽和惰性成分，惰性成分使得免受胃環(huán)境的作用，并在腸道中釋放生物活性材料。如果需要，對經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽進行化學修飾，使得進行口腔呈遞是有效的。通常，所包括的化學修飾是將至少一個部分(onemoiety)附著到經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽本身上，其中所述部分使得可以從胃或者腸道攝取到血流中。還期望的是全面提高化合物的穩(wěn)定性，并增加在機體的循環(huán)時間。在本發(fā)明中可用作共價附著載體的部分也可用于該目的。這種部分的例子包括PEG、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。參見，例如，Abuchowski和Davis，SolublePolymer-EnzymeAdducts，EnzymesasDrugs(1981)，Hocenberg和Roberts編輯，Wiley-Interscience，紐約，N.Y.，367-83；Newmark等人(1982)，J.Appl.Biochem.4185-9?？墒褂玫钠渌酆衔餅榫?1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-三氧戊環(huán)(tioxocane)。如上指出，用于藥物用途優(yōu)選為PEG部分。同樣，可將經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽重組融合到另一種多肽上，提高其總體穩(wěn)定性或者改善其口腔呈遞。例如，將經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽融合到運鐵蛋白、黑素運鐵蛋白或乳運鐵蛋白上。用于制備融合蛋白的方法在美國專利申請US10/378,094中描述，該申請在此完全引入作為參考。對于口腔呈遞的劑量形式，還可能使用經(jīng)過修飾的脂族氨基酸的鹽，如N-(8-[2-羥基苯甲?；鵠氨基)辛酸鈉(SNAC)作為載體來增強本發(fā)明的治療性化合物的吸收。使用SNAC的肝素制劑的臨床功效已經(jīng)被EmisphereTechnologies實施的2期臨床實驗所證實。參見，美國專利US5,792,451，“口腔藥物呈遞組合物和方法”(Oraldrugdeliverycompositionandmethods)，其在此完全引入作為參考。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽可以做為顆粒大小約1mm的顆?；蛘咝∏蛐问降臉O細微粒包含在制劑中。以膠囊施用的材料的制劑也可以是粉末形式、輕度壓縮的栓劑或者甚至是片劑。治療性制劑可以通過壓縮來制備。還可以包括著色劑和調(diào)味劑。例如，配制經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽(如通過脂質(zhì)體或微球包裝)，然后進一步包含在可食用的產(chǎn)品中，例如含有著色劑和調(diào)味劑的冷凍飲料?？梢杂靡环N惰性材料來稀釋本發(fā)明的藥物組合物或者增加其體積。這些稀釋劑包括碳水化合物，特別是甘露醇、cc-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。某些無機鹽也被用作填充物，包括磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些商業(yè)上可獲得的稀釋劑為Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。在固體劑量形式的治療性制劑中包括崩解劑。用作崩解劑的材料包括但是不限于淀粉，包括以淀粉為基礎(chǔ)的商業(yè)崩解劑，Explotab。淀粉羥乙酸鈉、安伯來特(Amberlite)、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、藻酸鈉、明膠、橙皮(orangepeel)、酸性羧甲基纖維素、天然海綿(naturalsponge)和膨潤土(bentonite)都可以使用。另一種形式的崩解劑是不溶的陽離子交換樹脂。粉末化的膠可以用作崩解劑和作為粘合劑，可以包括的粉末狀的膠，例如瓊脂、刺梧桐樹膠(karaya)或者黃芪膠。褐藻酸及其鈉鹽也可以用作崩解劑。可用粘合劑來將經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽固定在一起，形成堅硬的片劑，并包括來自天然產(chǎn)物的材料，例如阿拉伯樹膠、黃芪膠、淀粉和白明膠。其它的包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可以用在醇溶液中，使治療性組合物變成顆粒狀。在本發(fā)明的藥物組合物制劑中包括抗摩擦劑，以防止在制劑加工過程中變得粘稠?；瑵檮┛捎米鹘?jīng)過修飾的治療性多肽或肽和模壁之間的隔離層，這些滑潤劑包括但是不限于硬脂酸，包括其鎂鹽和鈣鹽，聚四氟乙烯(PTFE)，液體石蠟，植物油和蠟?？扇艿幕瑵檮┮部梢允褂茫缭鹿鸹蛩徕c，月桂基硫酸鎂，各種分子量的聚乙二醇，Carbowax4000和6000。添加助流劑可能改善經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽在配制過程中的流動性能，并有助于在壓縮過程中重新排列。助流劑包括淀粉、滑石粉、熱解硅膠和水合硅鋁化物。為了幫助本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽溶解到水環(huán)境中，添加表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑包括陰離子去污劑，如月桂基硫酸鈉、十六烷基磺基琥珀酸鈉和十六烷基磺酸鈉。可以使用陽離子去污劑，包括苯扎氯銨(benzalkoniumchloride)或者芐索氯銨(benzethoniumchloride)。被包括在制劑中作為表面活性劑的可能非離子去污劑為聚桂醇(lauromacrogol)400、多聚氧基40硬脂酸鹽、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60，甘油單硬脂酸酯，聚山梨醇酯40、60、65和80，脂肪酸糖酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑存在于蛋白或衍生物的制劑中，該蛋白或衍生物單獨使用或者以不同比例構(gòu)成混合物。制劑中還包括添加劑，來提高經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽的攝取?？赡芫哂羞@種特性的添加劑為例如脂肪酸、油酸、亞油酸和亞麻酸?？刂漆尫胖苿┮彩瞧谕摹？蓪⒈景l(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽納入到惰性基質(zhì)中，例如樹膠中，該基質(zhì)使得可以通過擴散或者浸析機制來釋放。也可將緩慢降解基質(zhì)納入到制劑中，所述基質(zhì)例如藻酸鹽、多糖。本發(fā)明的化合物的控制釋放的另一種形式是通過基于Orostherapeuticsystem(AlzaCorp.)的方法制備，即藥物被封裝在半透膜中，該膜使得水可以進入，并由于滲透作用將藥物從單個小孔推出。某些糖衣也具有延遲釋放的作用。其它包被方式也可用于制劑中。這些包被包括各種糖，其可用于包被盤(coatingpan)中。經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽也可以在膜包被的片劑中給予，在這種情形下使用的材料分為兩組。第一組是非腸道的材料，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基-乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、羧基-甲基纖維素鈉、providone和聚乙二醇。由腸道材料構(gòu)成的第二組通常是鄰苯二甲酸酯。多種材料的混合物也可用于提供最佳的膜包被。可以在平板包被或流化床或者通過壓縮包被來進行膜包被。肺部呈遞形式在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供用于肺部呈遞的包含經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的藥物組合物。當吸入時，藥物組合物被呈遞到哺乳動物的肺部，并經(jīng)過肺上皮內(nèi)層進入血流。本發(fā)明提供設(shè)計用于肺部呈遞治療性產(chǎn)品的大量機械裝置的用途，包括但是不限于霧化器、計量吸入器和粉末吸入器，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說全部是熟悉的。適合用于實施本發(fā)明的商業(yè)上可獲得的裝置的某些特別例子是Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Mo.制造的Ultravent霧化器；MarquestMedicalProducts，Englewood，Colo.制造的AcornII霧化器；GlaxoInc.，ResearchTrianglePark，N.C.制造的Ventolin計量吸入器；FisonsCorp.，Bedford，Mass制造的Spinhaler粉末吸入器。所有這些裝置需要使用適合分散經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽的制劑。典型地，各種制劑特異于所用裝置的類型，并且除了用于治療的稀釋劑、佐劑和/或載體之外，包括使用適當?shù)耐七M材料。經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽最有利地制備成顆粒形式，用于最有效地呈遞到肺的深部(distallung)，平均顆粒尺寸小于10μm，最優(yōu)選為0.5-5μm。藥學上可接受的載體包括碳水化合物例如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制劑中的其它成分包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC?？梢允褂锰烊坏幕蚝铣傻谋砻婊钚詣Ｊ褂肞EG(甚至除了其用于衍生蛋白質(zhì)或類似物之外)。也可使用葡聚糖，例如環(huán)葡聚糖?？墒褂媚懼}和其它相關(guān)增強劑?？墒褂美w維素和纖維素衍生物。也可使用氨基酸，如用于緩沖制劑中。此外，還包括使用脂質(zhì)體、微囊或者微球，包合絡(luò)合物(inclusioncomplex)或者其它類型的載體。適合與噴氣式霧化器或者超聲波霧化器一起使用的制劑通常包括該具有創(chuàng)造性的化合物，該化合物以每毫升溶液約0.1-25mg生物活性蛋白的濃度溶解在水中。所述制劑還包括緩沖劑和單糖(例如，用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)滲透壓)。霧化器制劑還含有表面活性劑，降低或者防止由于形成氣霧時的溶液的霧化引起的表面誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚合。與計量吸入器一起使用的制劑通常包含含有借助表面活性劑懸浮在推進劑中的該創(chuàng)造性的化合物的磨碎粉末。推進劑可以是可用于該目的的任何常規(guī)材料，例如氯氟碳、含氫氯氟碳、含氫氟碳或烴，包括三氯氟甲烷、二氯氟甲烷、二氯四氟乙醇以及1，1，1，2-四氟乙烷，或者它們的組合。合適的表面活性劑包括山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。用于從粉末吸入器裝置中分散的制劑包括含有該創(chuàng)造性的化合物的磨碎干燥粉末，并且還包含便于粉末從該裝置中分散量的填充劑，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或者木糖醇，其含量例如約占所述制劑重量的50-90％。鼻呈遞形式還包括鼻呈遞本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽的藥物組合物。鼻呈遞使得在將經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽施用到鼻子之后，可以將該蛋白直接轉(zhuǎn)移到血流中，而不需要在肺部沉積該產(chǎn)品。用于鼻呈遞的制劑包括那些具有葡聚糖或環(huán)葡聚糖的制劑。還公開了通過跨越其它粘膜運輸?shù)某蔬f。劑量與治療上述狀況的方法相關(guān)的劑量方案可由主治醫(yī)生，考慮改變藥物作用的各種因素，例如，患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食，任何感染的嚴重程度，給藥時間和其它臨床因素來確定。通常，日劑量方案在每公斤體重0.01-1000微克該創(chuàng)造性化合物的范圍內(nèi)，優(yōu)選為每公斤體重0.1-150微克。用經(jīng)過修飾的治療性蛋白質(zhì)治療疾病本發(fā)明提供各種運鐵蛋白融合蛋白，其可用于治療多種疾病。例如，包含本發(fā)明的融合多肽或肽的藥物組合物用于治療疾病，例如但是不限于，胰島素抗性(insulinresistance)、高血糖癥(hyperglycemia)、高胰島素血癥(hyperinsulinemia)、或者游離脂肪酸或甘油的血液水平升高、高脂血癥(hyperlipidemia)、肥胖癥(obesity)、X綜合癥、代謝異常綜合癥、炎癥、糖尿病并發(fā)癥、受損的葡萄糖動態(tài)平衡、受損的葡萄糖耐受、II型糖尿病、前驅(qū)糖尿病(prediabetes)、高甘油三酯血癥性動脈硬化癥(hypertriglyceridemiaatherosclerosis)、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、充血性心力衰竭、消化不良(dyspepsia)和過敏性腸道綜合癥(irritablebowelsyndrome)。經(jīng)過修飾的多肽和肽還可用于誘導(dǎo)對CNS的抗焦慮作用，用于激活CNS或者用于術(shù)后治療。由于本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽融合到運鐵蛋白或經(jīng)修飾的運鐵蛋白上，或者部分地或基本上得到保護而不受DPP活性的作用，所以該治療性多肽和肽在體內(nèi)比未經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽更穩(wěn)定。因此，施用較少量分子即可實現(xiàn)有效治療。在某些情形下，較低劑量會減少副作用。在一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽可用作一種鎮(zhèn)定劑。因此，本發(fā)明提供一種使用本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽使哺乳動物患者鎮(zhèn)定的方法，該患者具有導(dǎo)致中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)活動增加的異常。該方法包括給患者施用足以對該患者產(chǎn)生鎮(zhèn)定或抗焦慮作用量的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽?？梢阅X室內(nèi)(intracerebroventriculary)、口腔、皮下、肌肉內(nèi)或者靜脈內(nèi)施用經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽。這樣的方法可用于治療或者改善神經(jīng)系統(tǒng)狀況，例如焦慮、運動失調(diào)、攻擊(aggression)、精神錯亂、癲癇(seizure)、恐慌性攻擊(panicattack)、癔病和睡眠失調(diào)(sleepdisorder)。而且，本發(fā)明包括增強哺乳動物患者的活動性的方法，包括給患者施用足以對患者產(chǎn)生激活作用的量的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽。所述患者患有會導(dǎo)致中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的活動性下降的狀況。經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽可用于治療或者改善抑郁癥(depression)、情感分裂性精神障礙、睡眠性呼吸暫停(sleepapnea)、專心程度差的注意力缺乏綜合癥、失憶(memoryloss)、健忘和發(fā)作性睡眠(narcolepsy)等等以喚醒中樞神經(jīng)系統(tǒng)為有益的狀況。同樣，特定類型的手術(shù)、選擇性腹部手術(shù)后的胰島素抗性對術(shù)后第一天影響最大，持續(xù)至少5天，并可能需要3周才恢復(fù)正常。因此，術(shù)后的患者需要在手術(shù)損傷后施用本發(fā)明的經(jīng)過修飾的促胰島肽一段時間。因此，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽可用于術(shù)后治療?；颊咝枰谑中g(shù)之前施用本發(fā)明的經(jīng)過修飾的促胰島肽約1-16小時，在對患者實施手術(shù)過程中施用，和在患者手術(shù)后施用不超過5天的一段時期。而且，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽，例如促胰島肽，用于治療胰島素抗性，獨立于其用于手術(shù)后治療。胰島素抗性可能是由于胰島素與細胞表面受體結(jié)合減少，或者由于細胞內(nèi)代謝發(fā)生改變。特征在于胰島素敏感性下降的第一種類型通?？梢酝ㄟ^提高胰島素濃度來克服。特征在于胰島素響應(yīng)降低的第二種類型不能通過大量施用胰島素來克服。創(chuàng)傷(trauma)后的胰島素抗性能夠通過給予與胰島素抗性程度成正比的胰島素量來克服，其顯然是由胰島素敏感性降低所引起。優(yōu)選地，本發(fā)明提供經(jīng)過修飾的促胰島肽使高血糖正常化，這是通過葡萄糖依賴的、胰島素依賴的和不依賴于胰島素的機制來實現(xiàn)的。同樣，經(jīng)過修飾的促胰島肽用作治療糖尿病的主要制劑，特別是II型糖尿病。本發(fā)明特別適合用于治療患有糖尿病的患者，包括I型糖尿病和II型糖尿病，因為所述肽的作用依賴于血液的葡萄糖濃度，因此，在使用當前的治療方法時，低血糖的副作用的風險被極大地降低。有效使患者的血糖水平正?；慕?jīng)過修飾的促胰島肽的劑量將依賴于多種因素，其中包括，但不是限于，患者的性別、體重和年齡，不能調(diào)節(jié)血糖的嚴重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的潛在原因，無論是葡萄糖或者其它碳水化合物來源被同時施用，施用的路徑和生物利用度，在體內(nèi)的持續(xù)性，制劑和功效。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性肽如促胰島肽用于治療受損的(impaired)葡萄糖耐受、糖尿、高脂血癥、代謝性酸中毒、糖尿病、糖尿病性神經(jīng)病和腎病。更優(yōu)選地，用于治療II型糖尿病的經(jīng)過修飾的肽是經(jīng)過修飾的GLP-1及其類似物。監(jiān)控經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽的存在使用用于測定功能活性的分析方法、HPLC-MS或針對所述多肽或肽的抗體，可以監(jiān)測經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽。例如，監(jiān)測哺乳動物宿主的血液中的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的活性和/或經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的存在與否。在不同時間點采集宿主血液的部分或樣本，可以確定經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽是否已經(jīng)以足夠產(chǎn)生治療活性的量結(jié)合到持久的血液成分上，隨后確定血液中的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的水平。如果需要，還確定經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽，如經(jīng)過修飾的促胰島肽結(jié)合到哪種血液成分上。作為一個例子，用了分析促胰島活性的方法可以監(jiān)測本發(fā)明的經(jīng)過修飾的促胰島肽。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的促胰島肽具有促胰島活性，其活性至少與未經(jīng)過修飾的促胰島肽的促胰島活性相同。將經(jīng)過修飾的肽提供給動物細胞，或者將該肽注射給動物，并分別監(jiān)測免疫反應(yīng)活性的胰島素釋放到溶液或者動物的循環(huán)系統(tǒng)中，確定經(jīng)過修飾的促胰島肽的促胰島特性。使用可特異性檢測胰島素的放射性免疫測定，檢測免疫反應(yīng)活性的胰島素的存在。雖然可以采用能夠檢測IRI存在的任何放射性免疫測定，但優(yōu)選使用Albano，J.D.M.等人(1972ActaEndocrinol.70487-509)的分析方法的改進形式，其完全在此引入作為參考。通過胰腺灌注來確定經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽的促胰島特性(Penhos，J.C，等人1969Diabetes18733-738，其在此引入作為參考)。其中實施、改進和分析灌注的方式優(yōu)選采用Weir，G.C等人(J.Clin.Investigat.541403-1412(1974))的方法，在此引入作為參考。用結(jié)合了質(zhì)譜分析(MS)的HPLC分析經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽的存在，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。典型地，使用兩個流動相，如0.1％TFA/水和0.1％TFA/乙腈。柱溫度以及梯度條件可以是變化的。用于監(jiān)測經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽的存在的另一種方法使用特異于經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽的抗體。使用對特定的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽具有特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，有助于解決任何的這樣的問題?？梢詮乃拗髦猩苫蜓苌贵w，所述宿主用特定的經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽免疫，或用該治療性多肽或肽的免疫原性片段免疫，或者用對應(yīng)于所述治療性多肽或肽的抗原決定簇的合成的免疫原免疫。優(yōu)選的抗體對經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽具有高特異性和親和力。這樣的抗體還可以用酶、熒光染料或放射性標記進行標記?？梢杂每贵w監(jiān)測血流中是否存在經(jīng)過修飾的治療性多肽和肽?？梢酝ㄟ^SDS-PAGE和western印跡分析血液和/或血清樣本。這種技術(shù)使得可以分析血液或血清，確定經(jīng)過修飾的治療性多肽或肽是否結(jié)合到血液成分上。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)已經(jīng)可以用DNA重組技術(shù)生成穩(wěn)定性和生物學活性增強的新分子。這些分子是融合到穩(wěn)定蛋白上的生物活性蛋白和肽的組合，該穩(wěn)定蛋白具有天然的長半衰期，例如免疫球蛋白Fc部分、白蛋白和運鐵蛋白。這些融合分子保留活性部分的生物學活性，具有比天然的未被融合的蛋白或肽對應(yīng)物更長的藥物動力學。藥物動力學增強還會改善生物學活性，減少不期望的副作用，并給患者提供更多便利。有許多這種融合蛋白的例子，如干擾素-白蛋白、干擾素-Fc、BNP-白蛋白、GLP-1-白蛋白、GLP-1-運鐵蛋白。雖然融合蛋白對降解是穩(wěn)定的并對降解具有抗性，但降解活性部分的可能蛋白酶機制會導(dǎo)致該分子被緩慢滅活。特別地，許多肽如GLP-1、強啡肽(dynorphin)(BermanYL，JulianoL，DeviLAJBiolChem.1995年10月6日；27023845-50)、腦啡肽(GuZF，MenozziD，OkamotoA，MatonPN，BunnettNWExpPhysiol.1993年1月；7835-48)、BNP、ANP、血管緊張素、緩激肽和PYY對蛋白酶如二肽基肽酶IV、神經(jīng)內(nèi)肽酶非常敏感。這些蛋白酶單獨地或者組合地引起循環(huán)中的肽快速滅活。肽與大蛋白如白蛋白、Fc和運鐵蛋白融合賦予對蛋白酶的顯著抗性。然而，這不能完全消除由蛋白酶引起的滅活作用。因此，融合蛋白和蛋白酶抑制劑的組合具有比融合蛋白本身更高的PK和PD。本發(fā)明提供運鐵蛋白融合蛋白，其包含對蛋白酶具有抗性的治療性肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的治療性肽是經(jīng)過修飾的促胰島肽，其部分地或者基本上得到保護而免受DPP活性作用。更優(yōu)選地，經(jīng)過修飾的促胰島肽是經(jīng)過修飾的GLP-1肽及其類似物和片段。經(jīng)過修飾的GLP-1肽及其類似物和片段可用于治療糖尿病，特別是II型糖尿病。野生型GLP-1的N-末端序列是His-Ala-Glu；本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1多肽包含選自如下組成的組的N-末端序列His-His-Ala-Glu(SEQIDNO115)、Gly-His-Ala-Glu(SEQIDNO116)、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-Ala-Glu、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-His-Ala-Glu(SEQIDNO82)、His-His-Gly-Glu(SEQIDNO83)、His-His-Ser-Glu(SEQIDNO84)、Gly-His-Ala-Glu(SEQIDNO85)、Gly-His-Gly-Glu(SEQIDNO86)、Gly-His-Ser-Glu(SEQIDNO87)、His-X-Ala-Glu、His-X-Gly-Glu和His-X-Ser-Glu，其中X是任何氨基酸。如下所述，可以進行其它修飾來降低和防止蛋白酶降解，這些分子可用于本發(fā)明的方法和組合物中。此外，任何的GLP-1部分或GLP-1類似物、衍生物，或模擬物可(作為一種融合蛋白)用于本發(fā)明的方法和組合物中。將氨基酸添加到GLP-1的N-末端，由于空間位阻，可以防止二肽基肽酶裂解GLP-1的第二位氨基酸。因此，GLP-1將保留功能活性。將20種氨基酸的任何一種或非天然的氨基酸添加到GLP-1的N-末端。組氨酸也是一種優(yōu)選的氨基酸。在某些情形下，使用無電荷的或正電荷的氨基酸。優(yōu)選地，添加較小的氨基酸，如甘氨酸。然后將具有額外氨基酸的經(jīng)過修飾的GLP-1融合到運鐵蛋白上，制備融合蛋白。在一個實施方案中，GLP-1肽被修飾，以在其氨基末端含有至少一個附加的氨基酸。在另一個實施方案中，GLP-1肽被修飾，以在其氨基末端含有至少5個附加的氨基酸?？商娲?，GLP-1肽被修飾，以在其氨基末端含有1-5個附加的氨基酸。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種調(diào)控胰島素分泌的胃腸激素，屬于所謂的腸-胰島軸。腸-胰島軸指定一組從胃腸粘膜釋放的激素，它們對消化道中營養(yǎng)成分的存在和吸收響應(yīng)，促進胰島素早期釋放和增強釋放。腸降血糖素(incretin)作用是對胰島素分泌的增強作用，這對于正常的葡萄糖耐受來說可能是重要的。GLP-1因為負責腸降血糖素作用，因此是一種生理學上很重要的促胰島激素。GLP-1是胰高血糖素原(proglucagon)基因的產(chǎn)物(Bell等人，Nature，1983，304368-371)。其以兩種主要的大分子形式在腸道內(nèi)分泌細胞中合成，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。該肽于20世紀80年代早期在胰高血糖素原的cDNAs和基因被克隆之后被首次鑒定。對全長肽GLP-1(1-37和1-36酰胺)進行的最初研究表明，較大的GLP-1分子缺乏生物學活性。1987，三個獨立的研究小組證明，去除前6個氨基酸會提高GLP-1分子的生物學活性。Schmidt等人(1985Diabetologia28704-707)公開了GLP-1的氨基酸序列。人GLP-1是一種37個氨基酸殘基的肽，來源于胰高血糖素原，在回腸遠端、胰腺和大腦的L細胞中合成。胰高血糖素原加工成GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2主要是在L細胞中發(fā)生。GLP-1(7-37)的氨基酸序列是SEQIDNO32(X＝Gly)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。在GLP-1(7-36)酰胺中，末端的Gly被NH2替代。在患有II型糖尿病(非胰島素依賴的糖尿病(NIDDM))的人類患者中，有時甚至在患有I型糖尿病的患者中，GLP-1樣分子具有抗糖尿病活性。用GLP-1治療僅在葡萄糖水平升高時產(chǎn)生活性，例如增加胰島素分泌和生物合成，減少胰高血糖素分泌，延緩胃排空，因此提供一種可能比胰島素或磺酰脲更為安全的治療方法。使用適當?shù)腉LP-1治療，患者體內(nèi)的餐后葡萄糖水平會回到正常水平。還有報道表明，GLP-1樣分子能夠保護和甚至恢復(fù)II型糖尿病患者中的胰腺β細胞功能。任何GLP-1序列都可以通過在其氨基末端添加一個或多個氨基酸來修飾，包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。GLP-1對胃腸道具有強大的作用。以生理學量灌注GLP-1能有效地抑制五肽胃泌素誘導(dǎo)的以及食物誘導(dǎo)的胃酸分泌(Schjoldager等人，Dig.Dis.Sci.1989，35703-708；Wettergren等人，DigDisSci1993；38665-673)。它還抑制胃排空速度和胰腺的酶分泌(Wettergren等人，DigDisSci1993；38665-673)。在用碳水化合物或者含脂溶液灌注人的回腸時，會對胃和胰腺的分泌和運動產(chǎn)生類似的抑制作用(Layer等人，DigDisSci1995，401074-1082；Layer等人，Digestion1993，54385-38)。伴隨地，GLP-1分泌被極大地刺激，已經(jīng)推測GLP-1可能至少部分地負責這種所謂的“回腸閘(ileal-brake)”作用(Layer等人，Digestion1993；54385-38)。事實上，最近研究表明，在生理學上GLP-1的回腸閘作用比其對胰島的作用更重要。因此，在劑量響應(yīng)研究中，GLP-1在至少與影響胰島分泌所需的速度一樣慢的灌注速度下影響胃排空的速度(Nauck等人，Gut1995；37(副刊2)A124)。GLP-1似乎影響食物攝取。心室內(nèi)施用GLP-1顯著地抑制大鼠的食物攝取(Schick等人.inDitschuneit等人(編輯)，ObesityinEurope，JohnLibbey&Companyltd，1994；363-367；Turton等人，Nature1996，37969-72)。這種作用似乎是高度特異性的。因此，N-末端延伸的GLP-1(1-36酰胺)是無活性的，并且適當劑量的GLP-1拮抗劑，毒蜥激動肽9-39，完全消除GLP-1的作用(Tang-Christensen等人，Am.J.Physiol.，1996，271(4Pt2)R848-56)。在大鼠中，急劇外周施用GLP-1不會劇烈地抑制食物攝取(Tang-Christensen等人，Am.J.Physiol.，1996，271(4Pt2)R848-56；Turton等人，Nature1996，37969-72)。然而，從腸道L細胞分泌的GLP-1還可作為一個過飽信號起作用也是可能的。在糖尿病患者中，GLP-1的促胰島作用以及GLP-1對胃腸道的作用被保存(Willms等人，Diabetologia1994；37，副刊1A118)，這有助于減少食物誘導(dǎo)的葡萄糖偏移，但是更重要的是也可影響食物攝取。已經(jīng)證明，以4ng/kg/min的速度持續(xù)靜脈內(nèi)施用GLP-1一周會顯著地提高對NIDDM患者體內(nèi)的甘油血癥(glycaemic)的控制，而無明顯的副作用(Larsen等人，Diabetes1996；45，副刊2233A.)。經(jīng)過修飾的GLP-1部分地或基本上得到保護而免受DPP活性的作用，并且經(jīng)過修飾的GLP-1類似物可用于治療I型和II型糖尿病以及肥胖癥。如在此所用，術(shù)語“GLP-1分子”是指GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物。如在此所用，術(shù)語“GLP-1類似物”被定義為與GLP-1相比具有一個或多個氨基酸取代、缺失、倒置或添加的分子。許多GLP-1類似物在本領(lǐng)域是已知的，包括，例如，GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)(SEQIDNO72)美國專利US5,118,666公開了GLP-1類似物的例子，例如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)。術(shù)語“GLP-1衍生物”被定義為一種分子，其具有GLP-1或GLP-1類似物的氨基酸序列，但是其氨基酸側(cè)鏈基因，α-碳原子，末端氨基基團，或末端羧酸基團中的一個或多個還具有化學修飾。化學修飾包括，但不限于，添加化學部分、產(chǎn)生新鍵和去除化學部分。如在此所用，術(shù)語“GLP-1相關(guān)化合物”是指落入GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物的定義中的任何化合物。WO91/11457公開了活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的類似物，其作為GLP-1部分是有用的。EP0708179-A2(EliLilly&Co.)公開了GLP-1類似物和衍生物，其包括N-末端咪唑基團和任選地連接到位置34的賴氨酸殘基上的無支鏈的C6-C10?；鶊F。EP0699686-A2(EliLilly&Co.)公開了某些GLP-1N-末端截短片段，據(jù)報道它們具有生物學活性。美國專利US5,545,618公開了基本上由GLP-1(7-34)、GLP1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，或其酰胺形式，及其藥學上可接受的鹽組成的GLP-1分子，具有至少一種選自如下的修飾(a)甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-賴氨酸取代位置26和/或位置34上的賴氨酸；或用甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸或D-精氨酸取代位置36上的精氨酸(SEQIDNO73)；(b)抗氧化的氨基酸取代位置31上的色氨酸(SEQIDNO74)；(c)如下取代中的至少一種取代酪氨酸取代位置16上的纈氨酸；賴氨酸取代位置18上的絲氨酸；天冬氨酸取代位置21上的谷氨酸；絲氨酸取代位置22上的甘氨酸；精氨酸取代位置23上的谷氨酰胺；精氨酸取代位置24上的丙氨酸；以及谷氨酰胺取代位置26上的賴氨酸(SEQIDNO75)；和(d)如下取代中至少一種取代甘氨酸、絲氨酸或半胱氨酸取代位置8上的丙氨酸；天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸取代上位置9的谷氨酸；絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸取代位置10上的甘氨酸；以及谷氨酸取代位置15上的天冬氨酸(SEQIDNO76)；和(e)用甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸，或D-或N-酰化或烷基化形式的組氨酸取代位置7上的組氨酸(SEQIDNO77)；其中，在取代(a)、(b)、(d)和(e)中，被取代的氨基酸可任選是D型的，取代位置7的氨基酸可選擇地是N-?；騈-烷基化形式的。美國專利US5,118,666公開一種具有促胰島活性的GLP-1分子。這種分子選自具有如下氨基酸序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(GLP-1，7-34，見SEQIDNO32)或His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(GLP-1，7-35，見SEQIDNO32)；以及所述肽的衍生物，其中所述肽選自所述肽的藥學上可接受的酸加成鹽；所述肽的藥學上可接受的羧酸鹽；所述肽的藥學上可接受的低級烷基酯；和選自酰胺、低級烷基酰胺和低級二烷基酰胺的所述肽的藥學上可接受的酰胺。美國專利US6,277,819教導(dǎo)了降低心肌梗塞形成后的死亡率和發(fā)病率的方法，包括給患者施用GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1衍生物。GLP-1類似物用如下結(jié)構(gòu)式表示(SEQIDNO**)R1-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-X2-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X3-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2(SEQIDNO78)及其藥學上可接受的鹽，其中R1選自L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-組氨酸和α-甲基-組氨酸；X1選自Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala；X2選自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；X3選自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；R2選自NH2和Gly-OH；只要GLP-1類似物的等電點的范圍在約6.0至約9.0，并且如果R1為His，X1是Ala，X2是Glu，和X3是Glu時，R2必須是NH2。Ritzel等人(JournalofEndocrinology，1998，15993-102)公開了一種GLP-1類似物，[Ser8]GLP-1，其中第二個N-末端的丙氨酸用絲氨酸替代。該修飾不影響該肽的促胰島活性，但是產(chǎn)生一種血漿穩(wěn)定性比GLP-1高的類似物。美國專利US6,429,197教導(dǎo)在急性卒中(stroke)或出血后用GLP-1治療是一種理想的治療方法，優(yōu)選進行靜脈內(nèi)施用，這是因為這種處理提供一種手段，用于優(yōu)化胰島素分泌、增強腦合成代謝、通過抑制胰高血糖素增強胰島素效力，并維持血糖正?；蛘咻p微的低血糖，而不會有嚴重的低血糖或其它副作用的風險。本發(fā)明提供一種在急性卒中或出血后用GLP-1或其生物學活性類似物治療缺血或者再灌注大腦的方法，優(yōu)化胰島素分泌，通過抑制胰高血糖素對抗性來增強胰島素效力，以及維持血糖正?；蛘咻p微的低血糖，而不會有嚴重的低血糖的風險。美國專利US6,277,819提供一種降低心肌梗塞后死亡率和發(fā)病率的方法，包括以使血糖正?；挠行┝拷o需要的患者施用一種選自GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物及其藥學上可接受的鹽的化合物。美國專利US6,191,102公開一種降低需要降低體重的患者的體重的方法，通過以足以引起體重下降的劑量給患者施用一種組合物一段有效引起體重下降的時間，所述時間至少為4周，該組合物包含胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽類似物(GLP-1類似物)、胰高血糖素樣肽衍生物(GLP-1衍生物)或其藥學上可接受的鹽。皮下施用后，GLP-1是完全具有活性的(Ritzel等人，Diabetologia1995；38720-725)，但是主要由于二肽基肽酶IV樣酶降解而被快速降解(Deacon等人，JClinEndocrinolMetab1995，80952-957；Deacon等人，JClinEndocrinolMetab1995，80952-957；Deacon等人，1995，Diabetes441126-1131)。因此，不幸的是，GLP-1和許多其類似物在人體中具有短的血漿半衰期(Orskov等人，Diabetes1993；42658-661)。因此，本發(fā)明的目的是提供經(jīng)過修飾的GLP-1或其類似物，它們相對于GLP-1(7-37)具有延長的作用模式。本發(fā)明的還有一個目的是提供GLP-1的衍生物及其類似物，它們的清除速度低于GLP-1(7-37)。而且，本發(fā)明的一個目的是提供藥物組合物，該組合物包含穩(wěn)定性增強的經(jīng)過修飾的GLP-1或GLP-1類似物。因此，本發(fā)明包括經(jīng)過修飾的GLP-1或GLP-1類似物用于治療與GLP-1相關(guān)的疾病的用途，這些疾病例如，但是不限于上述的那些。本發(fā)明的一個方面涉及包含經(jīng)過修飾的GLP-1和GLP-1類似物的藥物組合物的制備，所述包含經(jīng)過修飾的GLP-1和GLP-1類似物的藥物組合物可通過已經(jīng)建立的配制藥物組合物的方法的任何一種來制備，例如，如Remington′sPharmaceuticalSciences，1985中所描述。該組合物可以是適合全身注射或灌注的形式，并同樣可以用合適的液體載體配制，例如無菌水或者等滲鹽水或者葡萄糖溶液。該組合物通過本領(lǐng)域熟知的常規(guī)滅菌方法進行滅菌。所得到的液體溶液可以包裝起來使用或者在無菌條件下過濾和凍干，在施用之前凍干制備物與無菌水溶液組合。所述組合物含有相似的生理狀況所需的藥學上可接受的輔助物質(zhì)，例如緩沖試劑，張力調(diào)節(jié)試劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1和GLP-1類似物還適合用于鼻、經(jīng)皮、肺或直腸施用。用于組合物中的藥學上可接受的載體或稀釋劑可以是任何常規(guī)固體載體。所述固體載體的例子為乳糖、石膏粉(terraalba)蔗糖、滑石粉、白明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸鎂和硬脂酸。類似地，載體或稀釋劑可包括本領(lǐng)域知曉的任何緩釋材料，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，單獨使用或與蠟(wax)混合。以持續(xù)釋放制劑形式提供本發(fā)明的組合物是特別有利的。同樣，組合物配制成含有經(jīng)過修飾的GLP-1或GLP-1類似物的微膠囊或微粒，用適當?shù)乃帉W上可接受的生物可降解聚合物包裝或分散，這種聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸或者乳酸/乙醇酸共聚物。用于鼻施用，制備物可含有溶解或懸浮在液體載體特別是水性載體中的經(jīng)過修飾的GLP-1或GLP-1類似物，用于氣霧應(yīng)用。所述載體含有添加劑，例如增溶劑，例如丙二醇、表面活性劑，吸收增強劑，例如卵磷脂(縮醛磷脂酰膽堿)或環(huán)式糊精，或者防腐劑如對羥基苯甲酸酯。一般地，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的多肽或肽以每單位劑量與藥學上可接受的載體一起分散在單位劑量形式中。而且，本發(fā)明包括經(jīng)過修飾的GLP-1和GLP-1類似物用于制備醫(yī)學產(chǎn)品的用途，該醫(yī)學產(chǎn)品可用于治療與血糖水平升高相關(guān)的疾病(代謝病)，例如但是不限于上述那些疾病。特別地，本發(fā)明包括經(jīng)過修飾的GLP-1和GLP-1類似物用于治療糖尿病的用途，包括II型糖尿病、肥胖癥、嚴重燒傷(severeburn)和心力衰竭，包括充血性心力衰竭和急性冠狀動脈綜合癥。本發(fā)明還提供部分或基本上受到保護而免受DPP活性作用的經(jīng)過修飾的毒蜥激動肽-3和毒蜥激動肽-4。毒蜥激動肽-3和毒蜥激動肽-4是促胰島肽，包含39個氨基酸(殘基2和殘基3不同)，與GLP-1具有約53％的同源性。毒蜥激動肽-3序列為HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO79)，而毒蜥激動肽-4的序列為HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO80)。本發(fā)明還包括經(jīng)過修飾的毒蜥激動肽-4片段，其包含氨基酸序列例如毒蜥激動肽-4(1-31)HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY(SEQIDNO81)。此外，本發(fā)明還包括毒蜥激動肽-3和毒蜥激動肽-4肽的經(jīng)過修飾的類似物。用于治療糖尿病、前驅(qū)糖尿病或肥胖癥的經(jīng)過修飾的GLP-1融合蛋白或偶聯(lián)物可以將經(jīng)過修飾的GLP-1與異源分子融合，提高體內(nèi)總穩(wěn)定性。通過本領(lǐng)域知曉的方法重組或者共價連接到異源分子上，將經(jīng)過修飾的GLP-1與異源分子融合?？蓪⒔?jīng)過修飾的GLP-1融合或共價連接到如血漿蛋白如血清白蛋白或運鐵蛋白，免疫球蛋白或其部分如Fc結(jié)構(gòu)域上。更優(yōu)選地，經(jīng)過修飾的多肽或肽融合到運鐵蛋白、乳運鐵蛋白或黑素運鐵蛋白上。用于制備這種融合蛋白的方法描述在美國專利申請US10/378,094中，其在此完全引入作為參考。GLP-1分子可通過不同長度的接頭連接到異源蛋白上，以在所融合的蛋白之間提供更好的物理分離和更多的空間靈活性，從而使治療性蛋白可達性最大化，例如使其可達其相關(guān)受體。接頭肽可由柔性的或更具剛性的氨基酸組成。例如，可以使用的接頭如多聚甘氨酸鏈。所述接頭可以少于約50個、40個、30個、20個、10個或5個氨基酸殘基。接頭可被共價連接到或在異源蛋白和GLP-1之間。優(yōu)選地，接頭可以是一個Ser殘基、兩個Ser殘基、肽Ser-Ser-Gly、肽PEAPTD、肽(PEAPTD)2、與IgG鉸鏈連接子組合的肽PEAPTD，以及與IgG鉸鏈連接子組合的肽(PEAPTD)2。這些接頭可用于將GLP-1連接到運鐵蛋白上?？蓪B接到經(jīng)過修飾的多肽或肽上的運鐵蛋白進行修飾。其可呈現(xiàn)糖基化程度下降。經(jīng)過修飾的運鐵蛋白多肽可選自單個運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域、單個運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域、運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域、兩個運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域以及兩個運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域。如上討論，GLP-1激活和調(diào)控機體內(nèi)的重要內(nèi)分泌激素系統(tǒng)，并且在葡萄糖代謝中起關(guān)鍵的控制作用。與市場上所有其它糖尿病治療劑不同，GLP-1作為β細胞的生長因子起作用，具有恢復(fù)潛能，從而改善胰腺分泌胰島素的能力，并且通過提高敏感性和更好地穩(wěn)定葡萄糖水平使得已有的胰島素水平更加有效地起作用。這減少了每日監(jiān)控葡萄糖水平的負擔，并可能延緩由糖尿病導(dǎo)致的血糖波動引起的嚴重的長期副作用。此外，GLP-1能夠降低食欲并降低體重。肥胖癥是對葡萄糖代謝控制差的固有結(jié)果，并且只會使糖尿病狀況惡化。由于天然GLP-1在循環(huán)中被迅速降解(半衰期只有數(shù)分鐘)，所以天然GLP-1的臨床應(yīng)用受到限制。為了維持循環(huán)中的治療劑水平，需要使用泵或者膜片裝置(patchdevice)持續(xù)施用高劑量，這增加了治療成本。這對于長期使用是不方便的，特別是與所有其它藥物治療協(xié)同使用來治療糖尿病和監(jiān)控葡萄糖水平時。經(jīng)過修飾的GLP-1融合蛋白保留了GLP-1的活性，但是具有運鐵蛋白的長半衰期(14-17天)、穩(wěn)定性和生物分布特性。這些特性能提供一種低成本、小體積的每月s.c.(皮下)注射，而且這類產(chǎn)品完全是長期使用所需的。還可經(jīng)過修飾的GLP-1共價連接到血液成分上，提高其穩(wěn)定性。例如經(jīng)過修飾的GLP-1共價連接到血清白蛋白、運鐵蛋白、免疫球蛋白或免疫球蛋白的Fc部分上。在一個實施方案中，可將經(jīng)過修飾的GLP-1連接到脂肪酸或者脂肪酸衍生物上。在另一個實施方案中，經(jīng)過修飾的GLP-1被工程化到藥物親和復(fù)合物(DAC)中。如先前所討論的，Kim等人(2003，Diabetes52(3)751)公開了GLP-1-白蛋白藥物親和復(fù)合物。Kim等人證明，白蛋白偶聯(lián)的DACGLP-1模擬天然的GLP-1。Kim等人提供了一種用于長期活化GLP-1R信號的新方法。在進行皮下施用時，DAC經(jīng)過修飾的GLP-1在體內(nèi)快速地并且選擇地結(jié)合白蛋白。所形成的生物偶聯(lián)物具有與內(nèi)源性GLP-1相同的治療活性和相似的功效，并具有更接近于白蛋白的藥物動力學模式。經(jīng)過修飾的GLP-1及其融合蛋白與其它治療劑組合在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1肽及其融合蛋白，例如，GLP-1-Tf融合蛋白，與至少一種第二治療性分子組合使用來治療II型糖尿病、肥胖癥和其它與異常的葡萄糖水平相關(guān)的疾病或狀況，所述第二治療性分子如Glucophage(鹽酸二甲雙胍(metformin)片劑)或GlucophageXR(鹽酸二甲雙胍長釋片劑)。Glucophage和GlucophageXR是用于控制II型糖尿病的口服抗高血糖藥。GlucophageXR是Glucophage的長釋制劑。因此，由于藥物從GlucophageXR中緩慢釋放，每天只需服用一次GlucophageXR。Glucophage幫助機體從肝臟中生成較少葡萄糖。因此，Glucophage有效控制患者體內(nèi)的血糖水平。Glucophage不會使機體產(chǎn)生更多的胰島素，因此，其極少引起低血糖(低血糖癥)。Glucophage還有助于降低血液的脂成分、甘油三酯和膽固醇，這些物質(zhì)在患有II型糖尿病的人體中通常是高水平的。二甲雙胍已經(jīng)被證明能夠降低食欲，當人們開始服用該藥物時有助于其降低一些體重。二甲雙胍已經(jīng)被批準與磺酰脲或者胰島素一起用于治療，或者作為單一治療劑治療(單獨地)。二甲雙胍已經(jīng)被建議用于治療各種心血管疾病，例如胰島素抗性患者中的高血壓(WO9112003-Upjohn)，用于溶解血液凝塊(與t-PA-衍生物組合)(WO9108763、WO9108766、WO9108767和WO9108765-BoehringerMannheim)，缺血性缺氧和組織缺氧(EP283369-Lipha)，動脈硬化(DE1936274-Brunnengraber&Co.，DE2357875-Hurka，和美國專利US4,205,087-ICI)。此外，已經(jīng)建議使用二甲雙胍組合前列腺素類似物環(huán)戊烷衍生物作為冠狀動脈擴張物以及用于降低血壓(美國專利US4,182,772-Hoechst)。二甲雙胍還被建議與2-羥基-3，3，3-三氟丙酸衍生物(美國專利US4,107,329-ICI)、1，2-二芳基乙烯衍生物(美國專利US4,061,772-Hoechst)、取代的芳基氧基-3，3，3-三氟-2-丙酸、酯和鹽(美國專利US4,055,595-ICI)、取代的羥苯基-哌啶酮(美國專利US4,024,267-Hoechst)以及部分氫化的1H-茚并-[1，2B]-吡啶衍生物(美國專利US3,980,656-Hoechst)組合，用于降低膽固醇。Montanari等人(PharmacologicalResearch，25(1)，1992)公開以每天兩次500mg的劑量(b.i.d.)使用二甲雙胍以與每天三次850mg二甲雙胍(t.i.d.)相似的方式增加缺血后的血流。Sirtori等人(J.Cardiovas.Pharm.，6914-923，1984)公開，每天三次850mg劑量(t.i.d)的二甲雙胍增加患有外周血管疾病患者的動脈血流。本發(fā)明提供各種疾病的治療方法，包括本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1或其融合蛋白與一種或多種治療試劑例如二甲雙胍聯(lián)合。在一個實施方案中，用經(jīng)過修飾的GLP-1或其融合蛋白組合二甲雙胍來治療疾病以及與異常血糖水平相關(guān)的狀況，例如糖尿病。優(yōu)選地，用GLP-1/mTf融合蛋白組合二甲雙胍來治療II型糖尿病或肥胖癥?？膳c本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1及其融合蛋白組合的其它治療劑包括，但是不限于磺酰脲和磺酰脲樣制劑、噻唑二酮(thiazolidinedione)、過氧物酶體增殖物激活受體(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptor)(PPAR)γ調(diào)節(jié)物、PPARα調(diào)節(jié)物、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B抑制劑、胰島素受體酪氨酸激酶活化劑、11β-羥基類固醇脫氫酶抑制劑、糖原磷酸化酶抑制劑、葡萄糖激酶活化劑、β-3腎上腺素能激動劑以及胰高血糖素受體激動劑。DPP-IV抑制劑已經(jīng)證明DPP-IV的抑制劑在治療各種由DPP-IV介導(dǎo)的狀況中是很有前景的。例如，在葡萄糖耐受和與高血糖相關(guān)的狀況如II型糖尿病或肥胖癥的治療中，DPP-IV的抑制劑是非常有前景的方案。而且已經(jīng)證明，DPP-IV與免疫反應(yīng)有關(guān)，例如移植排斥(Transplantation1997，63(10)1495-1500)。因此，DPP-IV可用于防止移植排斥。此外，由于肺的內(nèi)皮細胞DPP-IV結(jié)合癌細胞的纖連蛋白會促進癌細胞轉(zhuǎn)移，因此DPP-IV的抑制劑可用于治療癌癥，用于預(yù)防癌細胞轉(zhuǎn)移(J.Biol.Chem.1998，273(3724207-24215)。同樣認為DPP-IV在牙周炎的發(fā)病機理中起重要作用(Infect.Immun.2000，68(2)，716-724)，并且負責滅活GLP-2，GLP-2是促進腸道在大切除術(shù)后的恢復(fù)的因子(J.Surg.Res.1999，87(1)，130-133)。因此，DPP-IV抑制劑還可用于腸道的恢復(fù)。WO95/15309公開了某些肽衍生物，它們是DPP-IV的抑制劑，從而可用于處理大量由DPP-IV介導(dǎo)的過程。WO95/13069公開某些環(huán)胺化合物，其可用于刺激釋放天然的或內(nèi)源的生長激素。歐洲專利555,824公開某些苯并咪唑基化合物，其延長凝血酶時間并抑制凝血酶和絲氨酸相關(guān)蛋白酶。ArchivesofBiochemistryandBiophysics，第323卷，第1期，148-154(1995)公開某些氨基酰基吡咯烷-2-腈，可用作DPP-IV抑制劑。JournalofNeurochemistry，第66卷，2105-2112(1996)公開了某些Fmoc-氨基?；量┩?2-腈，可用于抑制脯氨酰寡肽酶。BulletinoftheChemicalSocietyofJapan，第50卷，第7期，1827-1830(1977)公開氨基六肽，即Z-Val-Val-lmPro-Gly-Phe-Phe-OMe，及其相關(guān)氨肽的合成。此外，還檢測了所述化合物的抗菌特性。WO90/12005公開某些氨基酸化合物，其抑制脯氨酰內(nèi)肽酶活性，因此可用于治療癡呆或健忘癥。DerwentAbstract95302548公開某些N-(芳基(烴基)羰基)取代的雜環(huán)化合物，其是膽堿脂酶的活化劑，外周選擇性增強，可用于治療由于膽堿脂酶活性下降引起的狀況。ChemicalAbstracts84177689公開某些1-?；?吡咯烷-2-腈化合物，可用作具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性的脯氨酸化合物的中間物。ChemicalAbstracts96116353公開某些3-氨基-2-巰基-丙基-脯氨酸化合物，它們是Ras法尼基-轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可用于治療各種癌癥或髓樣白血病。WO95/34538公開抑制DPP-IV的某些吡咯烷(pyrrolidide)、磷酸鹽、吖丁啶(azetidine)、肽和氮雜脯氨酸，用于治療可通過DPP-IV抑制改善的狀況。WO95/29190公開某些化合物，特征在于具有許多KPR型重復(fù)模式，由肽基質(zhì)所攜帶，使得它們多次呈現(xiàn)在酶DPP-IV前，并對DPP-IV具有親和性，該化合物能夠抑制HIV進入細胞。WO91/16339公開某些四肽硼酸，它們是DPP-IV的抑制劑，可用于治療自體免疫性疾病以及通過IL-2抑制所介導(dǎo)的狀況。WO93/08259公開某些多肽硼酸，它們是DPP-IV的抑制劑，可用于治療自體免疫性疾病以及通過IL-2抑制所介導(dǎo)的狀況。WO95/11689公開某些四肽硼酸，它們是DPP-IV的抑制劑，可用于阻止HIV進入細胞。東德專利158109公開某些N-保護的肽基-氧肟酸和硝基苯甲酰草酰胺，其可用作DPP-IV的抑制劑。WO95/29691中公開了某些二肽脯氨酸磷酸鹽(酯)，它們是DPP-IV的抑制劑，可用于治療免疫系統(tǒng)異常。德國專利DD296075公開了某些氨基酸酰胺化合物，其抑制DPP-IV。BiochimicaetBiophysicaActa，第1293卷，147-153公開了某些二肽和三肽p-硝基苯胺(nitroanilide)的制備，以研究側(cè)鏈的修飾對它們的DPP-IV和PEP催化水解的影響。BioorganicandMedicinalChemistryLetters，第6卷，第10期，1163-1166(1996)公開了某些2-氰基吡咯烷，它們是DPP-IV的抑制劑。J.Med.Chem.，第39卷，2087-2094(1996)公開了某些含有脯氨酸硼酸的二肽，它們是DPP-IV的抑制劑。Diabetes，第44卷，126-1131(96年9月)涉及這些的研究，該研究證明當GLP-1酰胺通過皮下或者靜脈內(nèi)路徑施用給糖尿病患者或者非糖尿病患者時被迅速降解。美國專利US6,727,261提供新的DPP-IV抑制劑吡哆[2，1-a]異喹啉衍生物，可用于治療和/或預(yù)防與DPP-IV相關(guān)的疾病和受損的葡萄糖耐受。與DPP-IV相關(guān)的疾病例如糖尿病，特別是非胰島素依賴的糖尿病，這些化合物還可用于治療和/或預(yù)防Bowl病、潰瘍性結(jié)腸炎、MorbusCrohn、肥胖癥(obesity)和/或代謝綜合征。美國專利US6,716,843提供α-氨基酸磺?；衔铮捎米鱀PP-IV的抑制劑。美國專利US6,645,995公開了2-取代的不飽和雜環(huán)化合物，其中雜環(huán)中的氮原子通過酰胺鍵或者肽鍵連接到氨基酸或氨基酸衍生物上。這些化合物是有效的和選擇性的DPP-IV的抑制劑，可有效用于治療可通過抑制DPP-IV來調(diào)控或正?；臓顩r。美國專利US6,617,340公開了N-(取代的甘氨酰)-吡咯烷，以及所述化合物在抑制二肽基肽酶-IV的用途。美國專利US6124,305公開了N-(取代的甘氨酰)-2-氰基吡咯烷，其抑制DPP-IV。這些化合物可用于治療由DPP-IV所介導(dǎo)的狀況。給患有II型糖尿病的93位患者(平均HbA1c為7.4％)施用Novartis化合物1-[[[2-[(5-氰基嘧啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-2-氰基-(S)-吡咯烷(NVPDPP728)4周，在該4周的研究期間，血漿葡萄糖、胰島素和HbA1c的水平下降(參見DiabetesCare2002，25(5)869-875)。使用DPP-IV抑制劑的組合治療一個方面，本發(fā)明提供包含治療性蛋白、多肽或肽的運鐵蛋白融合蛋白與一種或多種DPP-IV抑制劑組合用于治療各種狀況的用途。本發(fā)明提供藥物組合物，其包含運鐵蛋白融合蛋白和一種或多種DPP-IV抑制劑。如美國專利申請US10/378,094所公開，其在此完全引入作為參考，可以修飾與治療性蛋白、多肽或肽連接的運鐵蛋白。其可呈現(xiàn)糖基化程度下降。經(jīng)過修飾的運鐵蛋白多肽可選自單個運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域、單個運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域、運鐵蛋白N和C結(jié)構(gòu)域、兩個運鐵蛋白N結(jié)構(gòu)域以及兩個運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域。與運鐵蛋白連接的治療性多肽或肽可以是其天然形式或經(jīng)過修飾的形式。優(yōu)選地，運鐵蛋白融合蛋白包含作為治療性肽的GLP-1，該GLP-1被連接到經(jīng)過修飾的運鐵蛋白分子上，如美國專利申請US10/378,094中所公開。而且，本發(fā)明的組合治療包含GLP-1/mTf融合蛋白，一種或多種DPP-IV抑制劑，以及另一種治療性分子。這種分子可以是Glucophage或GlucophageXR。另一個方面，本發(fā)明提供對二肽基蛋白酶裂解具有抗性的經(jīng)過修飾的蛋白或肽或其融合蛋白與一種或多種DPP-IV抑制劑組合的用途。本發(fā)明公開了藥物組合物，其包含經(jīng)過修飾的蛋白或肽或其融合蛋白與一種或多種DPP-IV抑制劑組合。優(yōu)選地，經(jīng)過修飾的肽是經(jīng)過修飾的GLP-1，而融合蛋白是經(jīng)過修飾的GLP-1/mTf蛋白。此外，本發(fā)明的組合治療包含經(jīng)過修飾的GLP-1或者經(jīng)過修飾的GLP-1/mTf蛋白、一種或多種DPP-IV抑制劑以及其它治療性分子例如Glucophage或GlucophageXR。DPP-IV抑制劑可用于本發(fā)明的方法中，以治療任何相關(guān)疾病。例如，在此公開的GLP-1-運鐵蛋白融合蛋白可與DPP-IV抑制劑組合用于治療前驅(qū)糖尿病(prediabetes)、糖尿病、肥胖癥或者糖尿病的癥狀，所述DPP-IV抑制劑如1-[[[2-[(5-氰基嘧啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-2-氰基-(S)-吡咯烷(NVPDPP728)。所述治療劑可以順序施用或者同時施用。運鐵蛋白融合蛋白可包含GLP-1(7-37)肽(SEQIDNO32)或者GLP-1(7-36)肽(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。更優(yōu)選地，GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽包含將A8突變?yōu)镚和將K34突變?yōu)锳。運鐵蛋白蛋白還可在GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽和運鐵蛋白分子之間包含接頭。優(yōu)選地，該接頭為(PEAPTD)2肽。使用內(nèi)肽酶抑制劑的組合治療來增強融合蛋白的藥物動力學和藥效學本發(fā)明還提供使用神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)抑制劑和運鐵蛋白融合蛋白的組合治療。而且，本發(fā)明包括使用NEP和DPP-IV抑制劑以及運鐵蛋白融合蛋白的組合治療。NEP和DPPIV的抑制劑可以同時或順序施用。而且，所述抑制劑和運鐵蛋白融合蛋白可以同時或順序施用?？梢栽谑┯眠\鐵蛋白融合蛋白之前或之后，施用抑制劑。運鐵蛋白融合蛋白包含GLP-1(7-37)肽(SEQIDNO32)或GLP-1(7-36)肽(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。更優(yōu)選地，GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽包含將A8突變?yōu)镚和將K34突變?yōu)锳。運鐵蛋白蛋白在GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽和運鐵蛋白分子之間還可以包含接頭。優(yōu)選地，該接頭為(PEAPTD)2肽。神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)也被稱作為腦啡肽、中性溶酶(neprilysin)和心房肽酶，是存在于許多組織中的膜結(jié)合鋅指金屬內(nèi)肽酶，這些組織包括大腦、腎臟、肺、胃腸道、心臟和外周血管系統(tǒng)。NEP通過降解循環(huán)的利鈉肽(natriureticpeptide)，在利鈉肽的清除中起主要作用，從而阻礙利鈉肽對血管舒張、血壓和血量的作用。NEP通過降解和滅活利鈉肽，從而與高血壓、心力衰竭和腎衰竭相關(guān)。除了降解循環(huán)的利鈉肽，NEP還降解其它引起血管舒張的物質(zhì)，包括循環(huán)的緩激肽；腎上腺髓質(zhì)素、腎血管舒張肽和促尿鈉排泄-利尿肽(natriuretic-diureticpeptide)；和/或腎臟形式的ANP尿舒張素(urodilatin)。NEP還參與血管收縮物內(nèi)皮素同種型ET-1的降解，并且也可能與ET-1的形成相關(guān)(Brunner-LaRocca等人，CardiovascularResearch51(2001)510-520)。NEP還降解血管緊張素II，一種有效的血管收縮物，內(nèi)啡肽，以及大量與代謝相關(guān)的肽例如緩激肽，GLP-1(Hupe-Sodmann，K.，McGregor，GP.，Brideribaugh，R等人RegulatoryPeptide1995；58149-56，Hupe-Sodmann，K，Goeke，R.，Goeke，B等人Peptide1997；18625-32)，PYY(MedeirosMD，TurnerAJ.，Endocrinology.1994年5月；134(5)2088-94)和胰高血糖素(TrebbienR等人AmJPhysiolEndocrinolMetab.2004年9月；287(3)E431-8)。文獻中已經(jīng)公開了大量NEP抑制劑例如磷酸阿米酮(phosphoramidon)或NEP/ACE抑制劑(包括美國專利US5,508,272中公開的omapatrilat、美國專利US5,552,397中公開的gempatrilat、美國專利US5,430,145中公開的sampatrilat和MDL100240)，用于單獨治療(monotherapeutictreatment)如高血壓和心力衰竭。Nathisuwan等人，“AReviewofVasopeptidaseInhibitorANewModalityintheTreatmentofHypertensionandChronicHeartFailure”，Pharmacotherapy，22(1)，27-42(2002)。Candoxatril和ecadotril是兩種高度特異的NEP抑制劑，目前正進行臨床實驗，是心力衰竭的未來藥物。這兩種藥物是可在體內(nèi)被代謝為活性同源物的藥物前體。Candoxatril在肝臟中被活化為candoxatrilat，而ecadotril被轉(zhuǎn)化為其活性同源物S-四氫噻吩(S-thiorphan)。一些ACE/NEP抑制劑的例子被公開在美國專利US5,508,272、US5,362,727、US5,366,973、US5,225,401、US4,722,810、US5,223,516、US5,552,397、US4,749,688、US5,504,080、US5,612,359和US5,525,723，以及歐洲專利申請EP0481,522、EP0534363A2、EP534,396和EP534,492。本發(fā)明提供包含運鐵蛋白融合蛋白和DPP-IV抑制劑以及ACE/NEP抑制劑的組合(聯(lián)合)治療，用于治療各種疾病或狀況。這種疾病或狀況包括但是不限于糖尿病，優(yōu)選為II型糖尿病，充血性心力衰竭，肥胖癥，高血壓以及過敏性腸綜合癥(irritablebowelsyndrome)。轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明的一個實施方案包含轉(zhuǎn)基因的非人動物的生產(chǎn)，該動物表達受到保護而免受DPP活性的作用的經(jīng)過修飾的多肽或肽。在某些實施方案中，包含表達融合蛋白的轉(zhuǎn)基因的非人動物，該融合蛋白包含經(jīng)過修飾的多肽或肽并且穩(wěn)定性提高。在大量專利和專利申請中已經(jīng)描述了成功生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非人動物，例如美國專利US6,291,740(2001年9月18日授權(quán))；美國專利US6,281,408(2001年8月28日授權(quán))；以及美國專利US6,271,436(2001年8月7日授權(quán))，其內(nèi)容在此完全引入作為參考。改變動物的遺傳組成的能力使得它們可以進行大量商業(yè)應(yīng)用，所述動物例如被訓(xùn)養(yǎng)的動物包括母牛、豬、山羊、馬、牛和綿羊。這些應(yīng)用包括動物的生產(chǎn)，該動物表達大量容易收集的形式(例如，表達到乳汁或血液中)的外源性蛋白，體重增加、飼料轉(zhuǎn)化率高、肉質(zhì)組成(carcasscomposition)改善、奶產(chǎn)量或奶成分高、抗病和對特定微生物感染具有抗性的動物，生產(chǎn)生長速度快或者繁殖性能強的動物。在基因組中含有外源DNA序列的動物被稱作為轉(zhuǎn)基因動物。最為廣泛用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法是將DNA顯微注射到受精胚胎的原核中(Wall等人，J.Cell.Biochem.49113)。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的其它方法包括用逆轉(zhuǎn)錄病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染胚胎。已經(jīng)報道用野生型或者重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染植入前或植入后的小鼠胚胎(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA731260；Janenich等人，Cell24519；Stuhlmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA817151；Jahner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826927；VanderPutten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826148-6152；Stewart等人，EMBOJ.6383-388)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎的可替代方法是將病毒或者生產(chǎn)病毒的細胞注射到小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等人，Nature298623)。已經(jīng)報道，采用子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染妊娠中期小鼠胚胎，將轉(zhuǎn)基因?qū)氲叫∈蟮纳臣毎?Jahner等人，同上文)。已經(jīng)報道用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染牛和羊的胚胎來生成轉(zhuǎn)基因動物。這些方案包括微注射逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒或生長停止(即用絲裂菌素C處理)的細胞，該細胞將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒排到受精卵或早期胚胎的卵黃周空間(PCT國際專利申請WO90/08832；以及Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40386。PCT國際專利申請WO90/08832描述將野生型貓白血病病毒B注射到2-8個細胞階段的羊胚胎的卵黃周空間。從經(jīng)過注射的胚胎獲得的胎兒被證實含有多個整合位點。美國專利US6,291,740(2001年9月18日授權(quán))描述使用轉(zhuǎn)導(dǎo)分化細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如來源于鼠白血病病毒[MLV]的載體)，將外源DNA導(dǎo)入到未成熟的卵母細胞和成熟的未受精的卵母細胞(即受精前的卵母細胞)中來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。該專利還描述了用于細胞巨化病毒啟動子起始以及小鼠乳腺腫瘤LTR表達各種重組蛋白的方法和組合物。美國專利US6,281,408(2001年8月28日授權(quán))描述了用胚胎干細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法。簡而言之，胚胎干細胞和桑椹胚用于混合細胞共培養(yǎng)，生成轉(zhuǎn)基因動物。共培養(yǎng)前，通過例如電穿孔、微注射或者逆轉(zhuǎn)錄病毒呈遞，將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到胚胎干細胞中。通過選擇標記如新霉素，對以這種方式轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞進行選擇，選擇發(fā)生基因整合的細胞。美國專利US6,271,436(2001年8月7日授權(quán))描述轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)，該方法包括分離原始的生殖細胞，培養(yǎng)這些細胞來產(chǎn)生原始的生殖細胞來源的細胞系，轉(zhuǎn)化原始的生殖細胞和所培養(yǎng)的細胞系，用這些被轉(zhuǎn)化的細胞和細胞系來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。生成轉(zhuǎn)基因動物的效率被極大地提高，從而使得在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因非嚙齒類動物種屬時可以采用同源重組?；蛑委煴景l(fā)明的一個實施方案包括本發(fā)明的多肽或肽構(gòu)建物用于基因治療的用途。通過在N-末端添加一個或多個附加的氨基酸來修飾多肽或肽，使其免受DPP活性的作用。例如，提供編碼在其N-末端包含附加His殘基的GLP-1的核酸構(gòu)建體，用于基因治療。此外，提供編碼經(jīng)過修飾的GLP-1/運鐵蛋白融合蛋白的核酸構(gòu)建體，用于基因治療。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1構(gòu)建體受到保護而不受DPP活性的作用，并且更為穩(wěn)定；因此，它們理想地適合用于基因治療。簡而言之，最近在Ijima等人(2001年6月10日)HumanGeneTherapy(美國)12/91063-77中證實了可以通過注射腺病毒載體來進行基因治療，該載體含有編碼可溶的融合蛋白的基因，該融合蛋白由細胞毒性淋巴細胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分組成。在該基因治療申請中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射該載體來成功治療II型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的鼠科模型。在許多美國專利中也描述了基因治療，包括美國專利US6,225,290(2001年5月1日授權(quán))；美國專利US6,187,305(2001年2月13日授權(quán))；和美國專利US6,140,111(2000年10月31日授權(quán))。美國專利US6,225,290提供方法和構(gòu)建物，從而使哺乳動物個體的腸上皮細胞被遺傳改變以可操作地插入表達具有期望治療作用的蛋白的基因。通過施用主要由裸DNA組成的制劑來轉(zhuǎn)化腸道細胞，并口服施用該DNA完成了所述轉(zhuǎn)化?？谇换蚱渌奈改c內(nèi)施用路徑提供簡單的施用方法，而裸核酸的使用避免與使用病毒載體相關(guān)的并發(fā)癥，并實現(xiàn)基因治療。所表達的蛋白質(zhì)直接分泌到胃腸道和/或血流中，獲得治療性的血液水平的蛋白質(zhì)，從而治療需要該蛋白的患者。被轉(zhuǎn)化的上皮細胞提供短期或長期的疾病治療方案，所述疾病與特定蛋白的缺陷相關(guān)，或者適合通過該蛋白的過度表達來治療。美國專利US6,187,305提供在脊椎動物來源特別是哺乳動物的細胞中進行基因或DNA打靶的方法。簡而言之，通過DNA的同源重組或打靶，將DNA導(dǎo)入到脊椎動物來源的原代細胞和后代細胞中，所述DNA被導(dǎo)入到脊椎動物來源的原代細胞和后代細胞的基因組DNA中的預(yù)先選擇的位點上。美國專利US6,140,111(2000年10月31日授權(quán))描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體。所公開的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括感興趣基因的插入位點，并且其能夠在大量各種被轉(zhuǎn)化的細胞類型中高水平表達來源于該感興趣的基因的蛋白。還公開了缺乏可選擇標記的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，從而使得它們適合在多種疾病狀態(tài)的治療中進行人類基因治療，而不共表達標記產(chǎn)物，例如抗生素。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特別適合用于某些包裝細胞系中。逆轉(zhuǎn)錄載體插入哺乳動物細胞的基因組的能力使得它們成為治療人和動物的遺傳病的基因治療中的特別有前景的候選物?；蛑委熗ǔ０?1)將遺傳物質(zhì)添加到患者體內(nèi)細胞中，或(2)從機體中取出患者細胞，將新的遺傳物質(zhì)添加到細胞中，并將它們再引入機體中，即體外基因治療。對如何在多種細胞中用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行基因治療的討論可見于，例如1989年9月19日授權(quán)的美國專利US4,868,116，和1990年12月25日授權(quán)的US4,980,286(上皮細胞)，1989年8月10公開的WO89/07136(肝細胞)，1990年7月25日公開的EP378,576(成纖維細胞)，以及1989年6月15日公開的WO89/05345和1990年6月28日公開的WO/90/06997(內(nèi)皮細胞)，其公開內(nèi)容在此引入作為參考?？梢韵嘈牛瑹o需進一步描述，利用先前的描述和下面的說明性實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)嵤┖屠靡蟊Ｗo的本發(fā)明。因此，如下的工作實施例特別地指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而不解釋為以任何方式限制所公開的其它部分。本申請全文所有提及的文章、出版物、專利和文件在此完全引入作為參考。實施例實施例1具有二肽基肽酶IV保護的經(jīng)過修飾的GLP-1該實施例描述免受DPP-IV活性作用的經(jīng)過修飾的GLP-1肽。采用標準的固相Fmoc化學合成如下肽，并用C18柱通過反相HPLC進行純化，并通過220nm的吸光度來量化。通過質(zhì)譜分析法(MALDI-TOF)分析純化的肽GLP-1NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO32的氨基酸1-30)GLP-1(A8G)NH2-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO90)H-GLP-1NH2-His-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO91)H-GLP-1(A8G)NH2-His-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO92)HH-GLP-1NH2-His-His-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO93)G-GLP-1NH2-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO94)H-毒蜥激動肽-4NH2-His-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-COOH(SEQIDNO95)二肽基肽酶-IV處理等克分子數(shù)濃度的各種肽(6μM)用溶于25mMTris-Cl(pH8.0)中的2μg重組人DPP-IV(1μg/μL，R&DSystems，Minneapolis，MN)處理。同時對各種肽平行進行除了DPP-IV外的對照反應(yīng)。室溫溫育消化物2小時，在該時間內(nèi)，反應(yīng)用添加了1mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，Calbiochem，SanDiego，CA)的Krebs-Ringer緩沖液(BiosourceInternational，Camarillo，CA)稀釋10倍。如下討論，對肽進行分析，以確定剩余GLP-1受體的活化活性。環(huán)AMP刺激分析處理的前一天，以2×104細胞/孔的密度，在四個96-孔組織培養(yǎng)平板的RPMI/10％FBS培養(yǎng)液中植入CHO-GLPlR細胞(Montrose-Rafizadeh等人1997J.Biol.Chem.272，21201-21206)。第二天，細胞以約60-80％的匯合度均勻分布。在植入培養(yǎng)平板的第二天，用Krebs-Ringer緩沖液(KRB)洗滌細胞兩次，接著37℃在KRB中培養(yǎng)1小時，來降低細胞內(nèi)的cAMP水平。接著在KRB/IBMX中培養(yǎng)10分鐘以抑制細胞內(nèi)的分解cAMP的酶。在KRB/IBMX中制備各種測試化合物的稀釋液，37℃，三孔CHO-GLPlR細胞用每孔50μl測試化合物處理整20分鐘。用冰冷的磷酸緩沖鹽水洗滌培養(yǎng)物兩次來終止處理。室溫添加0.1ml溶解緩沖液1B(AmershamBiosciencescAMPBiotrakEIA試劑盒)10分鐘，制備裂解產(chǎn)物。使用cAMPBiotrakEnzymeImmunoassaySystem(AmershamBiosciencesCorporation，Piscataway，NJ，產(chǎn)品號RPN225)，按照試劑盒說明，對全體積的各種細胞提取物進行分析，確定cAMP濃度。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的肽對DPP-IV的抗性高于未經(jīng)過修飾的形式?；钚訥LP-1的特異ELISA可替代地，用ELISA系統(tǒng)(胰高血糖素樣肽-1[Active]ELISA試劑盒[LincoResearch，Inc.，St.Charles，MO])分析DPP-IV對本發(fā)明的GLP-1和GLP-1衍生物的降解，該系統(tǒng)特異于完整的活性GLP-1，但是不識別N-末端的兩個氨基酸由于DPP-IV的作用而被去除的GLP-1，即GLP-1(9-36或9-37)。等克分子數(shù)濃度的GLP-1和H-GLP-1(1200pM)用溶于25mMTris-Cl(pH8.0)的重組人DPP-IV(200ng/μL，R&DSystems，Minneapolis，MN)處理，用試劑盒中提供的分析緩沖液稀釋來終止反應(yīng)，該試劑盒含有蛋白酶抑制劑。該試劑盒包含包被了抗GLP-1的單克隆抗體的96-孔微量滴定平板。洗滌平板(在平板清洗機，ThermoLabsystemsUltrawashPlus中，用25mM硼酸緩沖鹽水x4洗滌)，然后室溫用肽樣本溫育3小時(300pM和10倍連續(xù)稀釋液放入平板)。在如上所述洗滌后，室溫用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗GLP抗體(試劑盒中的即用成分)溫育平板2小時。洗滌后，將4-甲基傘形基磷酸鹽(4-MethyllumbelliferylPhosphate)(MUP)底物(在50mM硼酸鹽pH9.5以1∶200稀釋)添加到所有孔中，室溫在黑暗中溫育30分鐘。在355nm激發(fā)波長和460nm發(fā)射波長，在SpectraMaxGeminiEM熒光平板讀數(shù)器中對平板進行讀數(shù)。因為H-GLP-1比GLP-1不容易結(jié)合單克隆抗體，因此在DPP-IV處理后剩余的活性H-GLP-1的濃度用H-GLP-1標準曲線確定。圖8顯示H-GLP-1對DPP-IV作用的抗性實質(zhì)上比GLP-1更高。實施例2經(jīng)過修飾的GLP-1融合蛋白該實施例描述包含融合到經(jīng)過修飾的運鐵蛋白分子上的經(jīng)過修飾的GLP-1的融合蛋白，經(jīng)過修飾的GLP-1受到保護而免受DPP-IV活性的作用。為了構(gòu)建編碼運鐵蛋白分泌前導(dǎo)序列的序列，設(shè)計如下重疊引物，所述前導(dǎo)序列后面為GLP-1和運鐵蛋白的N-末端部分P0236-TTCCCATACAAACTTAAGAGTCCAATTAGCTTCATCGCCA(SEQIDNO96)P0237-GGTTTAGCTTGTTTTTTTATTGGCGATGAAGCTAATTGGACTCTTAAGTTTGTATGGGAA(SEQIDNO97)P0244-ATAAAAAAACAAGCTAAACCTAATTCTAACAAGCAAAGATGAGGCTCGCCGTGGGAGCCC(SEQIDNO98)P0245-CAGGACGGCGCAGACCAGCAGGGCTCCCACGGCGAGCCTCATCTTTGCTTGTTAGAATTA(SEQIDNO99)P0248-TGCTGGTCTGCGCCGTCCTGGGGCTGTGTCTGGCGCATGCTGAAGGTACTTTTACTTCTGATGTTTCTTC(SEQIDNO100)P0249-AATTCTTTAGCAGCTTGACCTTCCAAATAAGAAGAAACATCAGAAGTAAAAGTACCTTCAGCATGCGCCAGACACAGCCC(SEQIDNO101)P0250-TTATTTGGAAGGTCAAGCTGCTAAAGAATTTATTGCTTGGTTGGTTAAAGGTAGGGTACCTGATAAAACT(SEQIDNO102)P0251-AGTTTTATCAGGTACCCTACCTTTAACCAACCAAGCAATA(SEQIDNO103)這些引物的位置顯示如下。AflII-+---->>...........P0236............>>721ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaacttaagagtccaattagcggttacaatgcagggcaatataacctcaagaagggtatgtttgaattctcaggttaatcg<<...........P0237............<<>>P0236.>>>>.....................P0244........................>>781ttcatcgccaataaaaaaacaagctaaacctaattctaacaagcaaagatgaggctcgccaagtagcggttatttttttgttcgatttggattaagattgttcgtttctactccgagcgg<<...........P0237............<<<<...........P0245............<<>>...nL.....>mrla>>P0244.>>>>.....................P0248........................>>841gtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcgcatgctgaaggtactcaccctcgggacgaccagacgcggcaggaccccgacacagaccgcgtacgacttccatga<<...........P0245............<<<<...........P0249............<<>......................nL......................>>vgallvcavl.glcla>>...GLP-1.....>haegt>>.....P0248.......>>>>...............P0250...................>>901tttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggaaatgaagactacaaagaagaataaaccttccagttcgacgatttcttaaataacgaacc<<...................P0249..........................<<<<.P0251<<>.............................GLP-1.............................>ftsdvssylegqaakefiawKpnI-----+>>.........P0250..............>>961ttggttaaaggtagggtacctgataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgagaaccaatttccatcccatggactattttgacactctaccacacgtcacagcctcgtactc<<...........P0251............<<>....GLP-1....>>lvkgr>>.....................mTf......................>vpdktvrwcavsehe(SEQIDNO104是編碼鏈；SEQIDNO105是所編碼的蛋白質(zhì)。)加入引物(8μL20pmolconc.)并加熱到65℃5分鐘，然后進行退火反應(yīng)將溫度緩慢降低到室溫。在將T4DNA連接酶添加到退火反應(yīng)中，并在室溫接著溫育2小時，取出1μl反應(yīng)物，用于PCR反應(yīng)中來擴增具有外引物(outerprimers)P0236和P0251的完整插入物。PCR反應(yīng)條件如下94℃5分鐘25個循環(huán)94℃30秒50℃30秒72℃1分鐘72℃7分鐘4℃放置用AflII和KpnI消化所生成的PCR產(chǎn)物，并連接到先用AflII和KpnI消化的pREX0094上(圖1)。用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對來自所生成的克隆的DNA進行測序，選擇符合AflII/KpnI插入物長度的克隆，并命名為pREX0198(圖2)。接著，pREX0198用NotI和PvuI消化并插入到pSAC35(圖3)中，生成pREX0240(圖4)。為了生成編碼天然運鐵蛋白分泌前導(dǎo)序列、之后是融合到經(jīng)過修飾的運鐵蛋白(mTf)上的H-GLP-1(7-36)的質(zhì)粒，設(shè)計重疊引物P0424和P0425，將額外的N-末端組氨酸添加到pREX0198所編碼的序列。P04245’到3’CTGTGTCTGGCGCATCATGCTGAAG(SEQIDNO106)P04255’到3’CTTCAGCATGATGCGCCAGACACAG(SEQIDNO107)pREX0198用作模板用于起始PCR反應(yīng)，在各個反應(yīng)中使用兩條重疊突變引物和兩條外引物，即P0424加上P0012，以及P0425加上P0025。然后，為了將它們連接在一起，在第二輪PCR中，這些反應(yīng)的產(chǎn)物用作模板，并僅使用外引物，即P0012加上P0025。兩輪PCR的反應(yīng)條件為1×94℃1分鐘，20×94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘和1×72℃7分鐘，到結(jié)束。來自最后反應(yīng)的PCR產(chǎn)物用AflII和KpnI消化，并連接到用AflII/KpnI消化的pREX0052(圖5)中，生成pREX0367(圖6)。對構(gòu)建體進行DNA測序，證實插入了編碼額外組氨酸的密碼子。然后用NotI和PvuI(后者破壞氨芐青霉素抗性基因)消化pREX0367，并連接到預(yù)先用NotI消化的pSAC35上，生成pREX0368(圖7)。通過電穿孔將pREX0368轉(zhuǎn)化到宿主釀酒酵母菌株中，根據(jù)亮氨酸原養(yǎng)型(leucineprototrophy)在緩沖的最低培養(yǎng)液(minimalmedium)平板上選擇被轉(zhuǎn)化的克隆。在選擇單個克隆后，酵母轉(zhuǎn)化子存放在40％海藻糖中，并在-70℃儲存。通過在調(diào)整到pH6.5的液體最低培養(yǎng)液中生長來確定表達，并通過SDS-PAGE、western印跡和ELISA分析上清液。如2003年3月4日提交的美國專利申請10/378,094中所述，構(gòu)建編碼GLP-1/mTf(pREX0100)和H-GLP-1/mTf的質(zhì)粒，該專利申請在此完全引入作為參考。為了制備GLP-1/mTf融合蛋白，可使用GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列。haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr(SEQIDNO32的氨基酸1-30)haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg(SEQIDNO32)例如，再將GLP-1(7-36)的肽序列可反譯成DNA，并優(yōu)化密碼子用于酵母表達catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaahaegtftsdvssylegqaaketttattgcttggttggttaaaggtaga(SEQIDNO117)fiawlvkgr(SEQIDNO32的氨基酸1-30)特異地設(shè)計引物，以在退火后形成5′XbaI和3′KpnI粘性末端，并且使得能夠直接連接到XbaI/KpnI切割的pREX0052上，正好位于前導(dǎo)序列的5′末端和mTf的N-末端?？商娲?，工程化制備其它粘性末端以連接到其它載體上。XbaI-+-----1aggtctctagagaaaaggcatgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttgtccagagatctcttttccgtacgacttccatgaaaatgaagactacaaagaagaataaac>>......FL.......>>rslekr>>..................GLP-1....................>haegtftsdvssylKpnI------+61gaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggttggttaaaggtagggtacctgatacttccagttcgacgatttcttaaataacgaaccaaccaatttccatcccatggactat>......................GLP-1......................>>egqaakefiawlvkgr>>..mTf..>>vpdSEQIDNOs118和119在退火和連接后，對克隆進行測序，以驗證正確插入。該載體被命名為pREX0094。用NotI從pREX0094中切出表達盒，并亞克隆到NotI酶切的酵母載體pSAC35中，制備pREX0100。然后將質(zhì)粒電穿孔到宿主釀酒酵母菌株中，在最低培養(yǎng)液平板上選擇亮氨酸原養(yǎng)型的轉(zhuǎn)化子。通過在液體最低培養(yǎng)液中生長來確定表達，并且通過SDS-PAGE、western印跡和ELISA分析上清液。GLP-1/mTf和H-GLP-1/mTf被表達，并通過陽離子交換和陰離子交換層析從發(fā)酵培養(yǎng)物(所述培養(yǎng)物在標準條件下生長)中純化。二肽基肽酶-IV處理等克分子數(shù)濃度的GLP-1/mTf和H-GLP/1-mTF(2μM)用25mMTris-Cl(pH8.0)中的重組人DPP-IV(1μg/μL，R&DSystems)處理。同時對各種融合蛋白平行進行除了DPP-IV外的對照反應(yīng)。室溫下溫育消化物2小時，在該時間內(nèi)，反應(yīng)用添加了1mMIBMX(Calbiochem)的Krebs-Ringer緩沖液(BiosourceInternational)稀釋20倍。環(huán)AMP刺激分析處理的前一天，以1×105細胞/孔的密度，在組織培養(yǎng)平板(24-孔)的RPMI/10％FBS培養(yǎng)液中植入CHO-GLPlR細胞。第二天，細胞以約60-80％的匯合度均勻分布。在細胞植入培養(yǎng)平板后的第二天，用Krebs-Ringer緩沖液(KRB)洗滌細胞兩次，接著37℃在KRB中溫育1小時，來降低細胞內(nèi)的cAMP水平。接著在KRB/IBMX中溫育10分鐘以抑制細胞內(nèi)的分解cAMP的酶。在KRB/IBMX中制備各種測試化合物的稀釋液，并在37℃，三孔CHO-GLPlR細胞用每孔0.15ml測試化合物處理整50分鐘。用冰冷的磷酸緩沖鹽水洗滌培養(yǎng)物兩次來終止處理。室溫添加0.2ml溶解緩沖液1B(AmershamBiosciencescAMPBiotrakEIA試劑盒)10分鐘，制備裂解產(chǎn)物，然后使用cAMPBiotrakEnzymeImmunoassaySystem(AmershamBiosciences)，按照試劑盒說明，分析100μl各細胞提取物，確定cAMP濃度。實施例3用于治療糖尿病的經(jīng)過修飾的GLP-1/mTf在該實施例中，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的GLP-1/mTf用作治療劑來治療糖尿病。將經(jīng)過修飾的GLP-1/mTf施用給Zucker大鼠，Zucker大鼠是II型糖尿病的標準動物模型。Zucker大鼠的血糖水平異常高。已經(jīng)證明，用GLP-1處理這些動物誘導(dǎo)胰島素分泌，并降低血糖。Zucker大鼠禁食過夜，然后用H-GLP-1或融合到運鐵蛋白上的H-GLP-1(H-GLP-1/mTf)處理。在皮下注射H-GLP-1或H-GLP-1/mTf30分鐘后，動物進行葡萄糖耐受測試(GTT)。對于該測試來說，給禁食動物飼喂葡萄糖溶液(1.5mg/g體重)，并以適當?shù)臅r間間隔測量血糖。在施用葡萄糖后不久，未被處理的動物的血糖水平升高，并緩慢下降到基線，而注射了H-GLP-1或H-GLP-1/mTf的動物由于GLP-1的促胰島作用顯示更快恢復(fù)到正常的血糖水平。在另一個實驗中，經(jīng)過修飾的H-GLP-1或H-GLP-1/mTf用于使Zucker大鼠的高水平的禁食葡萄糖恢復(fù)到正常水平，該Zucker大鼠未施用葡萄糖。而在未被處理的動物中，血糖水平仍然很高，而在用H-GLP-1或經(jīng)過修飾的H-GLP-1/mTf處理的動物中，血糖顯著下降。實施例4具有二肽基肽酶IV保護作用的經(jīng)過修飾的胰高血糖素該實施例描述了經(jīng)保護而免受DPP-IV活性作用的經(jīng)過修飾的胰高血糖素分子。用標準的固相Fmoc化學合成如下肽，并用C18柱通過反相HPLC純化，并通過220nm的吸光度進行量化。通過質(zhì)譜分析(MALDI-TOF)分析經(jīng)過純化的肽胰高血糖素NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQIDNO35)H-胰高血糖素NH2-His-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQIDNO108)如上所述，該肽用DPP-IV預(yù)處理，然后用表達所克隆的胰高血糖素受體的重組細胞系分析其激活胰高血糖素受體的能力。實施例5具有二肽基肽酶IV保護作用的經(jīng)過修飾的GIP該實施例提供了受到保護而免受DPP-IV活性作用的經(jīng)過修飾的GIP分子。用標準的固相Fmoc化學合成如下肽，并用C18柱通過反相HPLC純化，并通過220nm的吸光度進行量化。通過質(zhì)譜分析(MALDI-TOF)分析經(jīng)過純化的肽GIPNH2-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-COOH(SEQIDNO31)Y-GIPNH2-Tyr-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-COOH(SEQIDNO109)如上所述，該肽用DPP-IV預(yù)處理，然后用表達所克隆的GIP受體的重組細胞系分析其激活GIP受體的能力。應(yīng)當理解，先前的討論和實施例僅提供對某些優(yōu)選實施方案的詳細描述。因此，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然可以進行各種改進和進行等同替代，而不脫離本發(fā)明的精神和保護范圍。在本專利申請中提及的所有雜志、其它參考文獻、專利和專利申請全文引入作為參考。序列表<110>比奧雷克西斯藥物公司(BIOREXISPHARMACEUTICALCORPORATION)Sadeghi，HomayounPrior，ChristopherP.Ballance，DavidJ.<120>使用包含GLP-1的運鐵蛋白融合蛋白的組合治療<130>054710-5012-WO<150>US60/598,031<151>2004-08-03<160>119<170>PatentInversion3.2<210>1<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>1AlaProValArgSer15<210>2<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2AlaProThrSerSer15<210>3<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>3IleProThrGluIle15<210>4<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4ValProProGlyGlu15<210>5<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>5SerProGlyGlnGly15<210>6<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>6SerProGlyProVal15<210>7<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>7LysProArgLeuLeu15<210>8<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>8GlyProValSerAla15<210>9<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>9AlaProAlaArgSer15<210>10<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>10ThrProLeuGlyPro15<210>11<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>11AlaProProArgLeu15<210>12<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>12PheProThrIlePro15<210>13<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>13ValProLeuSerArg15<210>14<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>14MetProIleThrArg15<210>15<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>15MetProValGluArg15<210>16<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>16GlyProGluThrLeu15<210>17<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>17AlaProLeuAlaThr15<210>18<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>18MetProMetPheIle15<210>19<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>19GluProAspAlaIle15<210>20<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>20TyrProSerLysPro15<210>21<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>21AlaProLeuGluPro15<210>22<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>22TyrProIleLysPro15<210>23<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>23LeuProIleCysPro15<210>24<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>24SerProTyrSerSer15<210>25<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>25ArgProLysProGln15<210>26<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>26SerProAlaProPro15<210>27<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>27MetProGlyMetIle15<210>28<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>28MetProSerCysSer15<210>29<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>29LeuProGlyValLeu15<210>30<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>30AlaProMetAlaGlu15<210>31<211>42<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>31TyrAlaGluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMetAspLys151015IleHisGlnGlnAspPheValAsnTrpLeuLeuAlaGlnLysGlyLys202530LysAsnAspTrpLysHisAsnIleThrGln3540<210>32<211>31<212>PRT<213>人(Homosapiens)<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第31位的X＝G或-NH2。<400>32HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgXaa202530<210>33<211>33<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>33HisAlaAspGlySerPheSerAspGluMetAsnThrIleLeuAspAsn151015LeuAlaAlaArgAspPheIleAsnTrpLeuIleGlnThrLysIleThr202530Asp<210>34<211>44<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>34TyrAlaAspAlaIlePheThrA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70PheProThrIleProLeuSerArg15<210>71<211>8<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>71HisSerAspGlyThrPheThrSer15<210>72<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第2位的X＝V或S；第3位的X＝Gln，D-Gln或Asp；第10位的X＝T或G；第12位的X＝K或A。<400>72HisXaaXaaGlyThrPheThrSerAspXaaSerXaaTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>73<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第20位的X＝G，S，C，T，N，Q，Y，A，V，I，L，M，F(xiàn)，A，d-Lys或K；第28位的X＝G，S，C，T，N，Q，Y，A，V，I，L，M，F(xiàn)，A，d-Lys或K；第30位的X＝G，S，C，T，N，Q，Y，A，V，I，L，M，F(xiàn)，K，R，d-Arg或OH。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第29位的X＝G或OH；第31位的X＝G或OH。<400>73HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaXaaGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>74<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第25位的X＝抗氧化的氨基酸；第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>74HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaXaaLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>75<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第10位的X＝Y(jié)或V；第12位的X＝K或S；第15位的X＝D或E；第16位的X＝S或G；第17位的X＝R或Q；第18位的X＝R或A；第20位的X＝Q或K。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>75HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspXaaSerXaaTyrLeuXaaXaa151015XaaXaaAlaXaaGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>76<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第2位的X＝G或S或C或A；第3位的X＝D或G或S或C或T或N或Q或Y或A或V或I或L或M或F或E；第4位的X＝S或C或T或N或Q或Y或A或V或I或L或M或F或G；第9位的X＝E或D。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>76HisXaaXaaXaaThrPheThrSerXaaValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>77<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第1位的X＝G或S或C或T或N或Q或Y或A或V或I或L或M或F或d-His或烷基化His或酰化His；第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>77XaaAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>78<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第1位的X＝1-或d-His，脫氨基-His，2-氨基-His，β-羥基-His，同組氨酸(homohistidine)，α-氟甲基-His，和α-甲基-His；第2位的X＝A，G，V，T，I或α-甲基-Ala；第15位和第21位的X＝E，Q，A，T，S或G。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第31位的X＝Gly或NH2。<400>78XaaXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuXaaGly151015GlnAlaAlaLysXaaPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgXaa202530<210>79<211>39<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>79HisSerAspGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGlu151015GluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSer202530SerGlyAlaProProProSer35<210>80<211>39<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>80HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGlu151015GluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSer202530SerGlyAlaProProProSer35<210>81<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的毒蜥激動肽(exendin)-4<400>81HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGlu151015AlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProTyr202530<210>82<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1N-末端<400>82HisHisAlaGlu1<210>83<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1N-末端<400>83HisHisGlyGlu1<210>84<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1N-末端<400>84HisHisSerGlu1<210>85<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1N-末端<400>85GlyHisAlaGlu1<210>86<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1N-末端<400>86GlyHisGlyGlu1<210>87<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1N-末端<400>87GlyHisSerGlu1<210>88<211>32<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1<400>88HisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>89<211>32<212>PRT<213>人工的<220><223>修飾的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>X＝除1-或d-Lys外的氨基酸<400>89HisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValXaaGlyArgGly202530<210>90<211>30<212>PRT<213>人工的<220><223>A8G修飾的GLP-1<400>90HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>91<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>用額外的N-末端His修飾的GLP-1<400>91HisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>92<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>用額外的N-末端His和A8G修飾的GLP-1<400>92HisHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>93<211>32<212>PRT<213>人工的<220><223>用2個額外的N-末端His殘基修飾的GLP-1<400>93HisHisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeu151015GluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>94<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>用額外的N-末端Gly修飾的GLP-1<400>94GlyHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>95<211>40<212>PRT<213>人工的<220><223>用額外的N-末端His修飾的毒蜥激動肽-4<400>95HisHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGlu151015G1uGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyPro202530SerSerGlyAlaProProProSer3540<210>96<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>96ttcccatacaaacttaagagtccaattagcttcatcgcca40<210>97<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>97ggtttagcttgtttttttattggcgatgaagctaattggactcttaagtttgtatgggaa60<210>98<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>98ataaaaaaacaagctaaacctaattctaacaagcaaagatgaggctcgccgtgggagccc60<210>99<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>99caggacggcgcagaccagcagggctcccacggcgagcctcatctttgcttgttagaatta60<210>100<211>70<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>100tgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcgcatgctgaaggtacttttacttctg60atgtttcttc70<210>101<211>80<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>101aattctttagcagcttgaccttccaaataagaagaaacatcagaagtaaaagtaccttca60gcatgcgccagacacagccc80<210>102<211>70<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>102ttatttggaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggttggttaaaggtagggtacc60tgataaaact70<210>103<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的引物<400>103agttttatcaggtaccctacctttaaccaaccaagcaata40<210>104<211>300<212>DNA<213>人工的<220><223>編碼修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的序列<220><221>CDS<222>(109)..(300)<400>104ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaacttaagagtccaattagc60ttcatcgccaataaaaaaacaagctaaacctaattctaacaagcaaagatgaggctc117MetArgLeu1gccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcg165AlaValGlyAlaLeuLeuValCysAlaValLeuGlyLeuCysLeuAla51015catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggt213HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly20253035caagctgctaaagaatttattgcttggttggttaaaggtagggtacct261GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgValPro404550gataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgag300AspLysThrValArgTrpCysAlaValSerGluHisGlu5560<210>105<211>64<212>PRT<213>人工的<220><223>編碼修飾的GLP-1-修飾的Tf融合蛋白的序列<400>105MetArgLeuAlaValGlyAlaLeuLeuValCysAlaValLeuGlyLeu151015CysLeuAlaHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyr202530LeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGly354045ArgValProAspLysThrValArgTrpCysAlaValSerGluHisGlu505560<210>106<211>25<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建具有天然Tf分泌信號的質(zhì)粒的引物<400>106ctgtgtctggcgcatcatgctgaag25<210>107<211>25<212>DNA<213>人工的<220><223>用于構(gòu)建具有天然Tf分泌信號的質(zhì)粒的引物<400>107cttcagcatgatgcgccagacacag25<210>108<211>30<212>PRT<213>人工的<220><223>用額外的N-末端His修飾的胰高血糖素<400>108HisHisSerGlnGlyThrPheThrSerAspTyrSerLysValLeuAsp151015SerArgArgAlaGlnAspPheValGlnTrpLeuMetAsnThr202530<210>109<211>43<212>PRT<213>人工的<220><223>用額外的N-末端Tyr修飾的GIP<400>109TyrTyrAlaGluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMetAsp151015LysIleHisGlnGlnAspPheValAsnTrpLeuLeuAlaGlnLysGly202530LysLysAsnAspTrpLysHisAsnIleThrGln3540<210>110<211>5<212>PRT<213>人工的<220><223>二肽基肽酶絲氨酸蛋白酶基序<400>110GlyTrpSerTyrGly15<210>111<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>運鐵蛋白分泌信號序列<400>111ArgSerLeuAspLysArg15<210>112<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>運鐵蛋白分泌信號序列<400>112ArgSerLeuAspArgArg15<210>113<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>運鐵蛋白分泌信號序列<400>113ArgSerLeuGluLysArg15<210>114<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>運鐵蛋白分泌信號序列<400>114ArgSerLeuGluArgArg15<210>115<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>DPP-抗性的N-末端<400>115HisHisAlaGlu1<210>116<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>DPP-抗性的N-末端<400>116GlyHisAlaGlu1<210>117<211>90<212>DNA<213>人工的<220><223>編碼GLP-1(7-36)的DNA序列<400>117catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaa60gaatttattgcttggttggttaaaggtaga90<210>118<211>118<212>DNA<213>人工的<220><223>具有GLP-1插入的pREX0052位點<220><221>CDS<222>(1)..(117)<400>118aggtctctagagaaaaggcatgctgaaggtacttttacttctgatgtt48ArgSerLeuGluLysArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspVal151015tcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggttg96SerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeu202530gttaaaggtagggtacctgata118ValLysGlyArgValProAsp35<210>119<211>39<212>PRT<213>人工的<220><223>具有GLP-1插入的pREX0052位點<400>119ArgSerLeuGluLysArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspVal151015SerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeu202530ValLysGlyArgValProAsp3權(quán)利要求1.治療患者中的疾病或狀況的方法，包括施用有效量的運鐵蛋白(Tf)融合蛋白和至少一種第二試劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中第二試劑選自DPP-IV抑制劑和神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)抑制劑。3.權(quán)利要求1的方法，其中Tf融合蛋白易受DPP-IV清除。4.權(quán)利要求1的方法，其中Tf融合蛋白對DPP-IV清除敏感、具有抗性或具有部分抗性。5.權(quán)利要求1的方法，其中Tf融合蛋白包含一個或多個融合到Tf分子上的GLP-1肽。6.權(quán)利要求5的方法，其中Tf融合蛋白還包含接頭。7.權(quán)利要求6的方法，其中接頭為PEAPTD或(PEAPTD)2。8.權(quán)利要求5的方法，其中GLP-1肽位于融合蛋白的N-末端。9.權(quán)利要求5的方法，其中GLP-1肽是具有SEQIDNO32的GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。10.權(quán)利要求9的方法，其中GLP-1肽已經(jīng)通過將A8突變?yōu)镚進行修飾。11.權(quán)利要求9的方法，其中GLP-1肽已經(jīng)通過將K34突變?yōu)锳進行修飾。12.權(quán)利要求9的方法，其中GLP-1肽已經(jīng)通過將A8突變?yōu)镚和將K34突變?yōu)锳進行修飾。13.權(quán)利要求12的方法，其中GLP-1肽通過接頭(PEAPTD)2連接到Tf分子上。14.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾，以與完全糖基化的Tf分子相比其糖基化程度下降。15.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾以不顯示糖基化。16.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾以包含至少一個防止糖基化的突變。17.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾，以與野生型Tf分子相比其對運鐵蛋白受體(TfR)的親和力降低。18.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾以不結(jié)合TfR。19.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾，以與野生型Tf分子相比其對鐵的親和力下降。20.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子被修飾以不結(jié)合鐵。21.權(quán)利要求5的方法，其中Tf分子是乳運鐵蛋白或黑素運鐵蛋白。22.權(quán)利要求1的方法，其中該疾病是代謝疾病。23.權(quán)利要求22的方法，其中代謝疾病是前驅(qū)糖尿病、糖尿病或肥胖癥。24.權(quán)利要求23的方法，其中糖尿病是II型糖尿病。25.權(quán)利要求1的方法，其中疾病是充血性心力衰竭。26.權(quán)利要求1的方法，其中疾病是過敏性腸綜合癥或消化不良。27.權(quán)利要求1的方法，其中有兩種第二試劑。28.權(quán)利要求27的方法，其中兩種第二試劑是DPP-IV抑制劑和NEP抑制劑。29.權(quán)利要求29的方法，其中兩種第二試劑同時施用。30.權(quán)利要求1或29的方法，其中運鐵蛋白融合蛋白和一種或多種第二試劑順序施用。31.權(quán)利要求1或29的方法，其中運鐵蛋白融合蛋白和一種或多種第二試劑同時施用。32.一種組合物，其包含運鐵蛋白(Tf)融合蛋白和至少一種第二試劑。33.權(quán)利要求32的組合物，其中第二試劑選自DPP-IV抑制劑和神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)抑制劑。34.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf融合蛋白易受DPP-IV清除。35.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf融合蛋白對DPP-IV清除敏感、具有抗性或具有部分抗性。36.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf融合蛋白包含一個或多個融合到Tf分子上的GLP-1肽。37.權(quán)利要求36的組合物，其中Tf融合蛋白還包含接頭。38.權(quán)利要求37的組合物，其中接頭為PEAPTD或(PEAPTD)2。39.權(quán)利要求36的組合物，其中GLP-1肽位于融合蛋白的N-末端。40.權(quán)利要求36的組合物，其中GLP-1肽是具有SEQIDNO32的GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。41.權(quán)利要求40的組合物，其中GLP-1肽已經(jīng)通過將A8突變?yōu)镚進行修飾。42.權(quán)利要求40的組合物，其中GLP-1肽已經(jīng)通過將K34突變?yōu)锳進行修飾。43.權(quán)利要求40的組合物，其中GLP-1肽已經(jīng)通過將A8突變?yōu)镚和將K34突變?yōu)锳進行修飾。44.權(quán)利要求43的組合物，其中GLP-1肽通過接頭(PEAPTD)2連接到Tf分子上。45.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾，以與完全糖基化的Tf分子相比其糖基化程度下降。46.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾以不顯示糖基化。47.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾以包含至少一個防止糖基化的突變。48.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾，以與野生型Tf分子相比其對運鐵蛋白受體(TfR)的親和力降低。49.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾以不結(jié)合TfR。50.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾，以與野生型Tf分子相比其對鐵的親和力下降。51.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子被修飾以不結(jié)合鐵。52.權(quán)利要求32的組合物，其中Tf分子是乳運鐵蛋白或黑素運鐵蛋白。全文摘要本發(fā)明提供包含運鐵蛋白融合蛋白和DPP－IV抑制劑和/或神經(jīng)內(nèi)肽酶(NEP)抑制劑的組合治療。運鐵蛋白融合蛋白包含可用于疾病如糖尿病等疾病治療中的治療性的多肽或肽。文檔編號A61K51/08GK101035568SQ200580033674公開日2007年9月12日申請日期2005年8月3日優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日發(fā)明者霍馬揚·薩德吉,克里斯托弗·普賴爾,戴維·J·巴蘭斯申請人:比奧雷克西斯技術(shù)股份有限公司