專利名稱：葡糖淀粉酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親本AMG的葡糖淀粉酶變體(突變體)，尤其其具有改善的熱穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)的特異性活性，以適于如淀粉轉(zhuǎn)化，如由淀粉生成葡萄糖。更具體地，本發(fā)明涉及葡糖淀粉酶變體及這類變體酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3.)是催化D-葡萄糖從淀粉或相關(guān)的寡糖和多糖分子釋放的酶。葡糖淀粉酶由多種絲狀真菌和酵母產(chǎn)生，其中包括具有極重要商業(yè)價(jià)值的曲霉屬真菌。
葡糖淀粉酶在商業(yè)上用于將已由α淀粉酶部分水解的玉米淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。然后葡萄糖經(jīng)葡糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為等量葡萄糖和果糖的混合物。這種混合物，或另外還富含果糖的混合物是全球市場(chǎng)上常用的高果糖玉米糖漿。這種糖漿是全球通過酶加工生產(chǎn)的產(chǎn)量最大的產(chǎn)品。淀粉到果糖的轉(zhuǎn)化過程涉及的三種酶是所生產(chǎn)的最重要的工業(yè)用酶。
在高果糖玉米糖漿的商業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用葡糖淀粉酶的主要問題之一是葡糖淀粉酶的相對(duì)較低的熱穩(wěn)定性。葡糖淀粉酶不如α淀粉酶或葡糖異構(gòu)酶耐熱，其具有最大活性和穩(wěn)定性的相應(yīng)pH低于α淀粉酶或葡糖異構(gòu)酶。因此，它需在具有較低溫度和pH的隔離容器內(nèi)使用。
黑曲霉的葡糖淀粉酶具有由一段長(zhǎng)而高度O-糖基化的接頭所分隔催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-440)和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(氨基酸509-616)(Svensson等，1983,Carlsberg Res.Commun.48,529-544,1983和1986，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)154,497-502)。泡盛曲霉之X100變種的葡糖淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-471)采用一種(α/α)6折疊，其中六個(gè)保守的α→α環(huán)連接著外柱和內(nèi)柱(Aleshin等，1992，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267,19291-19298)。葡糖淀粉酶的結(jié)晶結(jié)構(gòu)與1-脫氧野尻霉素(Harris等，1993，生物化學(xué)(Biochemistry),32,1618-1626)及假四糖抑制物阿卡波糖和D-葡萄糖-二氫阿卡波糖(Aleshin等，1996，生物化學(xué)，35,8319-8328)的組合還分別與作為通用酸或堿起作用的谷氨酸179和400相容。已用蛋白質(zhì)工程研究了這些殘基在催化中的關(guān)鍵作用(Sierks等，1990，蛋白質(zhì)工程(Protein α Engng.)3,193-198；Frandsen等，1994，生物化學(xué)，33,13808-13816)。在四個(gè)糖基結(jié)合亞位點(diǎn)-1、+1、+2和+3處葡糖淀粉酶與糖類的相互作用均主要突出在葡糖淀粉酶-復(fù)合體結(jié)構(gòu)中(Aleshin等，1996，生物化學(xué)，35,8319-8328)，利用定點(diǎn)突變體結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析深入研究了對(duì)于結(jié)合和催化均很重要的殘基(Sierks等，1989，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)2,621-625；Sierks等，1990，蛋白質(zhì)工程3,193-198；Berland等，1995，生物化學(xué)，34,10153-10161；Frandsen等，1995，生物化學(xué)，34,10162-10169)。
為增強(qiáng)黑曲霉葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性而進(jìn)行的各種置換已得到描述ⅰ)置換α螺旋甘氨酸G137A和G139A(Chen等，1996，蛋白質(zhì)工程9,499-505)；ⅱ)消除Asp-X弱肽鍵D257E和D293E/Q(Chen等，1995，蛋白質(zhì)工程8,575-582)；阻止N182位的脫氨基作用(Chen等，1994，生物化學(xué)雜志301,275-281)；ⅳ)通過遺傳工程添加二硫鍵，A246C(Fierobe等，1996，生物化學(xué)，35,8698-8704)；ⅴ)在A435和S436位導(dǎo)入Pro殘基(Li等，1997，蛋白質(zhì)工程10,1199-1204)。此外ClarkFord于1997年10月17日提交了一份報(bào)告酶工程，14，北京/中國(guó)，10月刊12-17,1997年，摘要編號(hào)摘要集第0-61頁。該摘要提到了在(未公開的)泡盛曲霉葡糖淀粉酶中G137A、N20C/A27C、及S30P位置的突變以增強(qiáng)熱穩(wěn)定性。
其它有關(guān)葡糖淀粉酶的資料可在互聯(lián)網(wǎng)主頁http://www.public.iastate.edu/～pedro/glase/glase.html。由Pedro M.Coutinho公開的“葡糖淀粉酶WWW主頁”(97年10月8日更新)公開了有關(guān)葡糖淀粉酶的資料，其中包括曲霉菌株衍生的葡糖淀粉酶。在黑曲霉葡糖淀粉酶中進(jìn)行的化學(xué)修飾和定點(diǎn)修飾業(yè)已列出。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供改良的葡糖淀粉酶變體，其熱穩(wěn)定性增強(qiáng)且/或適于在如淀粉轉(zhuǎn)化過程的糖化步驟中應(yīng)用的特異性活性增強(qiáng)。
術(shù)語“一種增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性的葡糖淀粉酶變體”在本發(fā)明中指一種葡糖淀粉酶變體，其T1/2()高于比相應(yīng)親本葡糖淀粉酶。T1/2測(cè)定法(方法Ⅰ和方法Ⅱ)見下文“材料和方法”部分。
術(shù)語“一種增強(qiáng)了特異性活性的葡糖淀粉酶變體”在本發(fā)明中指一種葡糖淀粉酶變體，其針對(duì)目的糖分子中α-1,4鍵的特異性活性增強(qiáng)。所述特異性活性測(cè)定為Kcat或AGU/mg(如“材料和方法”部分所述進(jìn)行測(cè)量)。增強(qiáng)了的特異性活性指當(dāng)與相應(yīng)親本葡糖淀粉酶比較時(shí)，Kcat或AGU/mg值分別提高。
本發(fā)明的發(fā)明人已針對(duì)一種親本葡糖淀粉酶提供了一定數(shù)量的改良變體，它們的熱穩(wěn)定性和/或特異性活性均比相應(yīng)親本酶有了改善。熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)通過置換親本葡糖淀粉酶中的特定位點(diǎn)而獲得。詳見下述。
命名在本說明書和權(quán)利要求書中，使用了氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母和三字母密碼。為便于參考，本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體用以下命名法描述來源氨基酸位置已置換的氨基酸根據(jù)該命名法，例如第30位的丙氨酸置換為天冬酰氨可表示為Ala30Asn或A30N在同一位點(diǎn)刪除丙氨酸表示為Ala30*或A30*插入另一種氨基酸殘基，如賴氨酸，表示為Ala30AlaLys或A30AK一連串氨基酸殘基如氨基酸殘基30-33的刪除表示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當(dāng)一種特定葡糖淀粉酶與另一種葡糖淀粉酶相比包含一處“刪除”并在這樣一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了插入，這類情況下，將第36位插入一個(gè)天冬氨酸可表示為*36Asp或*36D多個(gè)突變用符號(hào)+分隔，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S表示分別將第30和34位的丙氨酸和谷氨酸置換為天冬酰氨和絲氨酸。多個(gè)突變還可按如下分隔，意思與符號(hào)+一樣，即Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S當(dāng)在指定位置插入一或多種可替換的氨基酸殘基時(shí)，表示為A30N,E或A30N/E，或A30N或A30E
此外，當(dāng)在本文中，一個(gè)適于修飾的位點(diǎn)得到鑒定而未提出任何特定修飾時(shí)，應(yīng)理解為可用任何氨基酸殘基置換該位點(diǎn)的氨基酸殘基。因此，如當(dāng)提到第30位丙氨酸的修飾，但未具體說明時(shí)，應(yīng)理解為該丙氨酸可刪除或置換成任何其它氨基酸，即R,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V中的任何一個(gè)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶基因的質(zhì)粒pCAMG91。
發(fā)明詳述本發(fā)明的工作旨在改善特定葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性和/或特異性活性，所述特定葡糖淀粉酶可得自真菌，尤其曲霉屬的特定菌株，而且它們自身是根據(jù)它們適于淀粉轉(zhuǎn)化或乙醇發(fā)酵的特性被篩選出來的。
鑒定可通過突變獲得改善的熱穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)的特異性活性的位點(diǎn)和/或區(qū)域分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氨基酸的易變性(見McCammon,JA和Harvey,SC.,1987，蛋白質(zhì)和核酸的動(dòng)力學(xué)，Cambridge UniversityPress.)。通常將這類蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)與結(jié)晶的B因子進(jìn)行比較(見Stout,GH和Jensen,LH,1989,X-線結(jié)構(gòu)測(cè)定，Wiley)。通過在可滴定的殘基的不同質(zhì)子化狀態(tài)下實(shí)施MD模擬，可對(duì)與pH相關(guān)的殘基變化進(jìn)行模擬。選擇具有高度易變性或靈活性(此處為各向同性波動(dòng))的區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變。在此應(yīng)理解，蛋白質(zhì)特定區(qū)域中所發(fā)現(xiàn)的高度易變性可通過置換這其中的殘基而在更高溫條件下得到改善。所述置換直接針對(duì)殘基，可改變殘基的動(dòng)力學(xué)特性，使其如具有更大側(cè)鏈和/或成為能使殘基在鄰近環(huán)境中形成更穩(wěn)定接觸的殘基。黑曲霉的AMG可用于MD模擬。如何實(shí)施MD模擬已在下文“材料和方法”部分描述。
通過分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬發(fā)現(xiàn)的適于在希望獲得改善的熱穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)的特異性活性時(shí)進(jìn)行突變的區(qū)域如下區(qū)域1-18，區(qū)域19-35，區(qū)域73-80，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，
區(qū)域334-341，區(qū)域353-374，區(qū)域407-411，區(qū)域445-470，可用于增強(qiáng)特異性活性和/或改善熱穩(wěn)定性的區(qū)域是活性位點(diǎn)鄰近的區(qū)域。位于底物結(jié)合位點(diǎn)的α螺旋之間，且可能包含這些α螺旋的N末端側(cè)和C末端側(cè)區(qū)域的區(qū)域?qū)τ谠撁傅幕钚院苤匾?。這些區(qū)域包括區(qū)域40-62，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域388-414。
根霉屬、踝節(jié)菌屬如Talaromyces emersonii(公開在WO 99/28448中)、和草根霉屬對(duì)麥芽糖糊精包括麥芽糖和麥芽糖庚糖(maltohepatose)具有高度特異性。因此，在增強(qiáng)特異性活性方面有重要意義的區(qū)域是區(qū)域200-212，區(qū)域287-300，區(qū)域305-319。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，確實(shí)有可能通過修飾親本葡糖淀粉酶氨基酸序列中的一或多個(gè)氨基酸殘基，而改善親本葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)其特異性活性。本發(fā)明是基于這一發(fā)現(xiàn)。
相應(yīng)地，本發(fā)明第一方面涉及一種親本葡糖淀粉酶的改良變體，其在下述區(qū)域和位點(diǎn)中包含一或多個(gè)突變。
親本葡糖淀粉酶本發(fā)明所考慮的親本葡糖淀粉酶包括真菌葡糖淀粉酶，尤其獲自曲霉屬菌株如黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶以及它們的變體或突變體、同源葡糖淀粉酶、還包括結(jié)構(gòu)和/或功能類似于SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶。具體實(shí)例有黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2，公開于Boel等，1984，“黑曲霉的葡糖淀粉酶G1和G2已自兩種不同但密切相關(guān)的mRNA合成”，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBOJ),3(5)，第1097-1102頁。G2葡糖淀粉酶公開于SEQID NO:2。G1葡糖淀粉酶公開于SEQ ID NO:13。另一可考慮的AMG骨架為Talaromyces emersonii，尤其公開于WO 99/28448(Novo Nordisk)的Talaromyces emersonii DSM。
市售親本葡糖淀粉酶市售親本葡糖淀粉酶包括Novo Nordisk的AMG，還包括Genencor,Inc.USA、Gist-Brocades,Delft，荷蘭這兩家公司的葡糖淀粉酶。
葡糖淀粉酶變體本發(fā)明第一方面涉及一種親本葡糖淀粉酶的變體，其在示于NO:2的氨基酸序列中的以下位點(diǎn)或區(qū)域內(nèi)包含一或多個(gè)突變區(qū)域1-18，區(qū)域19-35，區(qū)域40-62，區(qū)域73-80，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域334-341，區(qū)域353-374，區(qū)域388-414，區(qū)域445-470，和/或一種同源葡糖淀粉酶的相應(yīng)位點(diǎn)或區(qū)域，所述同源葡糖淀粉酶顯示與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性，不同之處在于以下置換N20C,A27C,S30P,Y48W,Y50F,W52F,R54K/L,D55G/V,G57A,K108R,D112Y,Y116A/W,S119C/W/E/G/Y/P,W120H/L/F/Y,G121T/A,R122Y,P123G,Q124H,R125K,W170F,N171S,Q172N,T173G,G174C,Y175F,D176N/E,L177H/D,W178R/D,E179Q/D,E180D/Q,V181D/A/T,N182A/D/Q/Y/S,G183K,S184H,W212F,R241K,A246C,D293E/Q,A302V,R305K,Y306F,D309N/E,Y312W,W317F,E389D/Q,H391W,A392D,A393P,N395Q,G396S,E400Q/C,Q401E,G407D,E408P,L410F,S411A/G/C/H/D,S460P在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為1-18。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。
特異性突變包括以下之一或更多A1V,T2P/Q/R/H/M/E/K,L3N,N9A,A11E/P,I18V。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G,T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,T2E+T379A+S386K+A393R,T2Q+A11P+S394R,T2R+L66V+S394P+Y402F,T2M+N9A+T390R+D406N+L410R,T2R+S386R+A393R,A11P+T2Q+S394R,A11E+E408R,I18V+T51S+S56A+V59T+L60A。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為19-35。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多21-26,31-35。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多19,21,22,23,24,25,26,28,29,31,32,33,34,35。特異性突變包括以下之一或更多L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為40-62。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多40-47,58-62。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多40,41,42,43,44,45,46,47,49,51,53,56,58,59,60,61,62。
特異性突變包括以下之一或更多S40C/A/G,T43R,T51S/D,T53D,S56A/C,V59T/A,
L60A。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多T51S+S56A+V59T+L60A+I18VV59A+A393R+T490A+PLASD(N末端延伸)。
一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為73-80。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多73,74,75,76,77,78,79,80。
特異性突變包括以下之一或更多S73P/D/T/N/Q/E,L74I/D,L75MR/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V，優(yōu)選為I/N/D,S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選T/A,T77V/T,I78V,E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V，優(yōu)選為Q/R/K,N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選為H/D/E/R/K/T/S/Y在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為93-127。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞區(qū)為93-124。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多93-107,109-111,113-115。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,109,110,111,113,114,115,117,118,126,127。
特異性突變包括以下之一或更多N93T,P94V,S95N,D97S,L98S/P,S100T/D,A102S/*,P107M/L/A/G/S/T/V/I,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/A,Y116F,
S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V,優(yōu)選為A,R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,G127A.
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多S119P+G447S,S119P+Y402F,S119P+A393R,S119P+I189T+223F+F227Y+Y402FS119P+T416H+Y402F+Y312Q.
在一個(gè)實(shí)施方案中,突變區(qū)為170-184。特異性突變包括以下之一或更多N171R/K/Q/E/W/F/Y,Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,T173K/R/S/N/Q,G174A,S,Y175N/Q/D/E,D176LL177IE180N/MV181I/TN182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.G183AS184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為200-212。優(yōu)選的亞區(qū)包括200-211。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211。特異性突變包括以下之一或更多A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為234-246。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多234-240,242-245。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多234,235,236,237,238,239,240,242,243,244,245。特異性突變包括以下之一或更多L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.
A235SF237Y/H/N/D.
D238T/S.
S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.
S240GS242S/P/T/A/Y/H/N/D.
G243S/P/T/A/Y/H/N/D.
K244R,A246T.
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多A246T+T72I。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為287-319。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多287-292,294-301,313-316。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319.
特異性突變包括以下之一或更多S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,I288L/N/Q,Y289F,T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,L291I/D/N,N292D,D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V,V301T/I,A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V/,優(yōu)選為S,V303T/I,G304A,R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.
E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,優(yōu)選為Q,D309L,
T310V/S,Y311N,Y312Q/N,N313T/S/GN315Q/E/R,F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選為Y。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多Y312Q+S119P+T416H+Y402F,Y312Q+S119P+Y402F+T416H+S411V,Y312Q+T416HN313G+F318Y.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為334-341。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多334,335,336,337,338,339,340,341。
特異性突變包括以下之一或更多D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.
K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.
Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.
G339S/P/T/A.
S340I/T/N/V/A/D/G.
L341F/L/I/V.
優(yōu)選突變組合包括以下之一或更多S340G+D357S+T360V+S386P。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)包括353-374。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374。
特異性突變包括以下之一或更多A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,
S366T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G.
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多S356P+S366T,D357S+T360V+S371H.
D357S+T360V+S386P+S340G.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)包括388-414。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多397-399,402-406,412-414。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414.
特異性突變包括以下之一或更多T390R,A393R,S394P/R,M398L,S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,優(yōu)選為T/Q//C,Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V,優(yōu)選為F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,A4Q9R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,優(yōu)選為P,L410R/I,S411R/N/Q/E/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,優(yōu)選為V,A412C,R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V.
D414A.
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸)S394R+T2Q+A11P,
Y402F+S411V,Y402F+S411V+S119PY402F+S411V+S119p+A393R,Y402F+Y312Q+S119P+T416H,E408R+S386N,E408R+A425T+S465P+T494A,L410R+A393R,Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為445-470。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多445-459,461-470。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,461,462,463,464,465,466,467,467,468,469,470.
特異性突變包括以下之一或更多G447S,G456C/P,S465P。
特異性變體包括具有一或多個(gè)以下置換的變體A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/E,I18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53D,S56A/C,V59T/A,L60A,N93T,P94V,S95N,D97S,L98P/S,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246T Y312Q,N313T/S/G,A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S366T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,L410I/R,S411V,A412C,D414A,G447S,S465P.
改善的熱穩(wěn)定性本發(fā)明第二方面涉及一種親本葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性(尤其在40-80℃，優(yōu)選60-80℃，且優(yōu)選在pH4-5時(shí))改善了的變體，所述變體在示于NO:2的氨基酸序列中以下位點(diǎn)或區(qū)域包含一或更多突變區(qū)域1-18，區(qū)域19-35，
區(qū)域73-80，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域334-341，區(qū)域353-374，區(qū)域388-414，區(qū)域445-470，和/或一種同源葡糖淀粉酶的相應(yīng)位點(diǎn)或區(qū)域，所述同源葡糖淀粉酶顯示與示于SEQID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性，不同之處在于以下置換N20C,A27C,S30P,A246C。
正如底物結(jié)合可能改善穩(wěn)定性區(qū)域93-127，根據(jù)本發(fā)明改善熱穩(wěn)定性時(shí)還可考慮區(qū)域170-184，區(qū)域305-319。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為1-18。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。
特異性突變包括以下之一或更多A1V,T2P/Q/R/H/M/E,N9A,A11E/P。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G,T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,T2E+T379A+S386K+A393R,T2R+S386R+A393R,A11P+T2Q+S394R,T2Q+A11P+S394R,T2R+L66V+S394P+Y402F,T2M+N9A+T390R+D406N+L410R,T2R+S386R+A393R,A11E+E408R。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為19-35。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多21-26,31-35。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多19,21,22,23,24,25,26,28,29,31,32,33,34,35。特異性突變包括以下之一或更多L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N。
一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為73-80。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多73,74,75,76,77,78,79,80。
特異性突變包括以下之一或更多S73P/D/T/N/Q/E,L74I/D,L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V，優(yōu)選為I/N/ID，S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選T/A,T77V/T,I78V,E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V，優(yōu)選為Q/R/K,N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選為H/D/E/R/K/T/S/Y在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為93-127。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞區(qū)為93-124。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多93-107,109-111,113-115。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,109,110,111,113,114,115,117,118,126,127。
優(yōu)選的突變包括以下之一或更多P107M/L/A/G/S/T/V/I,S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V，優(yōu)選為A,R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多S119P+G447S。
S119P+A393R。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為170-184。特異性突變包括以下之一或更多N171R/K/Q/E/W/F/Y,Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,T173K/R/S/N/Q,G174A,S,
Y175N/Q/D/E,D176LL177IE180N/MV181I/TN182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.
G183AS184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為200-212。優(yōu)選的亞區(qū)包括200-211。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211。特異性突變包括以下之一或更多A203L,S211P。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為234-246。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多234-240,242-245。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多234,235,236,237,238,239,240,242,243,244,245。特異性突變包括以下之一或更多L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,A235S,F237Y/H/N/D,D238T/S,S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,8240G,S242S/P/T/A/Y/H/N/D,G243S/P/T/A/Y/H/N/D,K244R,A246T.
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多A246T+T72I。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為287-319。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多287-292,294-301,313-316。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中亞區(qū)包括305-319。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319.
特異性突變包括以下之一或更多Y312Q,
F318A/R/N D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選為Y。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多N313G+F318Y,Y302Q+S119P+T416H+Y402F。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為334-341。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多334,335,336,337,338,339,340,341。
特異性突變包括以下之一或更多D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.
K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.
Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.
G339S/P/T/A.
S340I/T/N/V/A/D/G.
L341F/L/I/V.
優(yōu)選突變組合包括以下之一或更多S340G+D357S+T360V+S386P。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)包括353-374。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374。
特異性突變包括以下之一或更多A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S366T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G.
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多S356P+S366T,
D357S+T360V+S371H,D357S+T360V+S386P+S340G。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)包括388-414。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多397-399,402-406,412-414。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中亞區(qū)為407-411。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414.
特異性突變包括以下之一或更多T390R,A393R,A394P/R,S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V，優(yōu)選為T/Q/C,Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V，優(yōu)選為F，D403S,S405T,D406N,E408C/R,Q409A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優(yōu)選為P,L410I/R,S411V,A412C,R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,D414A。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多A393R+T2R+S386R,A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸)S394R+T2Q+A11P,Y402F+T2R+L66V+S394P,Y402F+S411V+S119PY402F+S411V,Y402F+312Q+S119P+T416H,S411V+A393R,E408R+S386N,
E408R+A425T+S465P+T494A,L410R+A393R,S411V+S119P+402F+A393R,S411V+S119P+402F+A393R+T416H.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為445-470。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多445-459,461-470。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,461,462,463,464,465,466,467,467,468,469,470.
特異性突變包括以下之一或更多G447S,G456C/P,S465P。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多G447S+S119P,S465P+E408R+A425T+T494A。
增強(qiáng)了的特異性活性本發(fā)明第三方面涉及一種親本葡糖淀粉酶的具有增強(qiáng)之特異性活性的變體，其在示于NO:2的氨基酸序列中的以下位點(diǎn)或區(qū)域包含一或多個(gè)突變區(qū)域1-18，區(qū)域40-62，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域388-414，和/或一種同源葡糖淀粉酶的相應(yīng)位點(diǎn)或區(qū)域，所述同源葡糖淀粉酶顯示與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性，不同之處在于以下置換S411G。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為1-18。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。
特異性突變?yōu)長(zhǎng)3N,I18V。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多
I18V+T51S+S56A+V59T+L60A。
在一個(gè)實(shí)施方案中,突變區(qū)為40-62。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多40-47,58-62。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多40,41,42,43,44,45,46,47,49,51,53,56,58,59,60,61,62。特異性突變包括以下之一或更多S40C,T43R,T51S/C,T53D,S56A/C,V59T,L60A。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多T51S+S56A+V59T+L60A+I18V。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為93-127。在一個(gè)附加實(shí)施方案中亞區(qū)為93-124。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多93-107,109-111,113-115。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,109,110,111,113,114,115,117,118,126,127。
優(yōu)選的突變包括以下之一或更多N93T,P94V,S95N,D97S,L98S/P,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多S119P+Y402F。
S119P+Y402F+1189T+Y223F+F227Y。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突變區(qū)為170-184。特異性突變包括以下之一或更多N171R/K/Q/E/W/F/Y,Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,T173K/R/S/N/Q,G174A,S,Y175N/Q/D/E,D176LL177IE180N/MV181I/TN182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V,優(yōu)選為E,G183AS184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為200-212。優(yōu)選的亞區(qū)包括200-211。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211。特異性突變包括以下之一或更多A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,W212N/A/T。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為234-246。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多234-240,242-245。特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多234,235,236,237,238,239,240,242,243,244,245。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)為287-319。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多287-292,294-301,313-316。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,307,308,310,311,313,314,315,316, 318,319.
特異性突變包括以下之一或更多S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,I288L/N/Q,Y289F,T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,L291I/D/N,N292D,D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.
V301T/I,A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V/，優(yōu)選為S,V303T/I,G304A,R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.
E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V，優(yōu)選為Q,D309L,T310V/S,Y311N,Y312Q/N，優(yōu)選為Q,N313T/S/G，優(yōu)選為S,
N315Q/E/R。
在一個(gè)實(shí)施方案中突變區(qū)包括388-414。優(yōu)選的亞區(qū)包括以下之一或更多397-399,402-406,412-414。
特別優(yōu)選的位點(diǎn)包括以下之一或更多388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414。
特異性突變包括以下之一或更多M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,E408C/R,S411V,A412C,D414A。
優(yōu)選的突變組合包括以下之一或更多Y402F+S119P,Y402F+S119P+I189T+Y223F+F227Y。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中突變區(qū)為區(qū)域287-300，區(qū)域305-319，和/或一種同源葡糖淀粉酶的相應(yīng)位點(diǎn)或區(qū)域，所述同源葡糖淀粉酶顯示與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少60％的同源性。
同源性(同一性)上文所述的親代葡糖淀粉酶的同源性被測(cè)定為兩個(gè)蛋白質(zhì)序列之間的同一性程度，其顯示出第一個(gè)序列與第二個(gè)序列的差異。利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，例如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Package程序手冊(cè)，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)可適當(dāng)?shù)販y(cè)定同源性(Needleman,S.B和Wunsch,C.D.,1970，分子生物學(xué)雜志，48,p443-453)。為了進(jìn)行多肽序列對(duì)比，使用了具有下列設(shè)置的Gap:Gap產(chǎn)生罰分為3.0,Gap延伸罰分為0.1，由本發(fā)明的類似DNA序列編碼的成熟多肽部分顯示出與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的成熟部分的同一性優(yōu)選至少為60％，如70％，至少80％，至少90％，更優(yōu)選至少為95％，更優(yōu)選至少為97％，最優(yōu)選至少為99％。
優(yōu)選親代葡糖淀粉酶含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或其等位基因變體；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。
SEQ ID NO:2的片段是在此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。例如，AMG G2(SEQ ID NO:2)是具有葡糖淀粉酶活性的黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等，1984,EMBOJ,3(5),p1097-1102)的片段。等位基因變體表示占據(jù)相同染色體基因座的任何兩個(gè)或多個(gè)可替代的基因形式。等位基因變異是通過突變天然產(chǎn)生的，它可導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?所編碼的多肽沒有改變)，或者可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
由于插入或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或用不同的氨基酸殘基取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，同源的親代葡糖淀粉酶的氨基酸序列與SEQID NO:2的氨基酸序列有所不同。優(yōu)選氨基酸的改變對(duì)酶特性的影響很小，即為不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守的氨基酸取代；小的缺失，一般為1至約30個(gè)氨基酸缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端的甲硫氨酸殘基；約為20至25個(gè)殘基的小連接肽；或便于通過改變凈電荷或另一個(gè)功能進(jìn)行純化的小的延伸，所述功能如多-組氨酸通道，抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的親代葡糖淀粉酶由核酸序列編碼，該序列在嚴(yán)緊度很低的條件下，優(yōu)選在低嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選在中度嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選在中-高度嚴(yán)緊條件下，甚至更優(yōu)選在高度嚴(yán)緊條件下，最優(yōu)選在嚴(yán)緊度很高的條件下能與核酸探針雜交，所述探針能在相同的條件下與以下序列雜交(ⅰ)SEQ ID NO:1的核酸序列，(ⅱ)SEQ ID NO:1的cDNA序列，(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的亞序列，或(ⅳ)互補(bǔ)于(ⅰ),(ⅱ)或(ⅲ)的鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，紐約)。SEQID NO:1的亞序列至少為100個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選至少為200個(gè)核苷酸。此外，該亞序列可編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。親代多肽也可以是具有葡糖淀粉酶活性的多肽的等位基因變體或片段。
可使用SEQ ID NO:1的核酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段設(shè)計(jì)核酸探針，從而根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法從不同的屬或種的菌株中鑒定和克隆編碼具有葡糖淀粉酶活性之多肽的DNA。特別是，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，使用這種探針與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和分離其中的相應(yīng)基因。這種探針可以比完整序列短很多，但其長(zhǎng)度應(yīng)該至少為15，優(yōu)選至少為25，更優(yōu)選至少為35個(gè)核苷酸。也可使用較長(zhǎng)的探針。DNA和RNA探針都可以使用。一般需標(biāo)記探針以檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如用32P,3H,35S，生物素或親和素)。本發(fā)明包括這種探針。
因此，可從由其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交，且編碼具有葡糖淀粉酶活性之多肽的DNA。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)可分離得自其它生物體的基因組或其它DNA。將文庫(kù)中的DNA或經(jīng)分離的DNA轉(zhuǎn)移至并固定于硝酸纖維素或其它適當(dāng)?shù)妮d體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。本發(fā)明意義上的雜交指的是在嚴(yán)緊度很低至很高的條件下，核酸序列與核酸探針雜交，所述探針對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1所示的核酸序列，其互補(bǔ)鏈或其亞序列。使用X-射線膠片檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。
對(duì)于長(zhǎng)度至少為100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針而言，最終使用2×SSC,0.2％SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘，洗滌溫度優(yōu)選至少為45℃(很低的嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少為50℃(低嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少為55℃(中度嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少為60℃(中-高度嚴(yán)緊度)，甚至更優(yōu)選至少為65℃(高嚴(yán)緊度)，最優(yōu)選至少為70℃(很高的嚴(yán)緊度)。
對(duì)于長(zhǎng)度約為15個(gè)核苷酸至70個(gè)核苷酸的短探針而言，嚴(yán)緊條件的定義是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，在比根據(jù)Bolton和McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)的算式計(jì)算出的Tm低5℃至10℃的溫度下，在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl,pH7.6,6mM EDTA,0.5％NP-40,1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中進(jìn)行預(yù)雜交，雜交和雜交后的洗滌。
對(duì)于長(zhǎng)度約為15個(gè)核苷酸至70個(gè)核苷酸的短探針而言，在比計(jì)算出的Tm低5℃至10℃的溫度下，用6×SSC+0.1％SDS將載體材料洗滌1次，共15分鐘，再用6×SSC洗滌2次，每次15分鐘。
本發(fā)明還涉及通過下列方法產(chǎn)生的分離的核酸序列(a)在很低，低，中度，中-高度，高度或很高的嚴(yán)緊條件下使DNA與SEQ ID NO:1的序列，或其互補(bǔ)鏈，或其亞序列雜交；和(b)分離核酸序列。優(yōu)選亞序列是至少為100個(gè)核苷酸的序列，例如編碼具有葡糖淀粉酶活性之多肽片段的序列。
期望親代葡糖淀粉酶具有的活性至少為SEQ ID NO:2所示成熟多肽的葡糖淀粉酶活性的20％，優(yōu)選為至少40％，更優(yōu)選至少為60％，甚至更優(yōu)選至少為80％，甚至更優(yōu)選至少為90％，最優(yōu)選至少為100％。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體使用麥芽糖糊精作為底物，優(yōu)選在約60-80℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為63-75℃，優(yōu)選在pH4-5，特別是4.2-4.7時(shí)具有改良的熱穩(wěn)定性和/或提高的比活性。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體被用于例如乙醇發(fā)酵。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶(Boel等，1984,EMBO J,3(5),p1097-1102)。親代葡糖淀粉酶可以是截短的葡糖淀粉酶，例如AMGG2葡糖淀粉酶。
克隆編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列可使用本領(lǐng)域已知的多種方法，從能夠產(chǎn)生葡糖淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中分離編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)使用得自能夠產(chǎn)生待研究的葡糖淀粉酶的生物體的染色體DNA或信使RNA來構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成標(biāo)記的寡核苷酸探針，以用于從所述生物體制備的基因組文庫(kù)中鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆?；蛘撸蓪⒑信c另一個(gè)已知葡糖淀粉酶基因同源之序列的標(biāo)記寡核苷酸探針用作探針，使用很低至很高嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件來鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。
另一種鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達(dá)載體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化葡糖淀粉酶-陰性細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪于含有葡糖淀粉酶底物(即麥芽糖)的瓊脂上，從而鑒定出表達(dá)葡糖淀粉酶的克隆。
或者，可通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)合成而制備編碼酶的DNA序列，所述方法包括例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)，四面體通訊，22,p.1859-1869所述的膦酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，1984,EMBOJ,3,p.801-805所述的方法。在膦酰胺法中，寡核苷酸在如DNA自動(dòng)合成儀中合成，純化，退火，連接并克隆至適當(dāng)載體中。
最后，DNA序列可以是基因組和合成物質(zhì)的混合，合成物質(zhì)和cDNA的混合或基因組和cDNA物質(zhì)的混合，它們是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接合成性，基因組性或cDNA來源性片段(適當(dāng)時(shí)，片段對(duì)應(yīng)于完整DNA序列的多個(gè)部分)而制備的。也可使用特異性引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備DNA序列，例見US4,683,202或R.K.Saiki等，1988，科學(xué)，239,1988,p487-491。
定點(diǎn)誘變一旦分離出編碼葡糖淀粉酶的DNA序列,鑒定出理想的突變位點(diǎn)，可使用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)翼于所需突變位點(diǎn)的核苷酸序列。在特定的方法中，在攜有葡糖淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生DNA(即葡糖淀粉酶編碼序列)的單鏈缺口。然后使攜有所需突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)補(bǔ)平殘留的缺口，使用T4連接酶連接構(gòu)建體。此方法的具體例子描述于Morinaga等，1984，生物技術(shù)，2,p646-639。US4,760,025公開了通過對(duì)表達(dá)盒進(jìn)行微小的改變來導(dǎo)入編碼多個(gè)突變的寡核苷酸。另外，通過Morinaga的方法可導(dǎo)入大批不同長(zhǎng)度的寡核苷酸，因此可同時(shí)導(dǎo)入差異更大的突變。
另一種將突變導(dǎo)入編碼葡糖淀粉酶的DNA序列的方法描述于Nelson和Long,1989，分析生物化學(xué)，180,p147-151。該方法包括3步產(chǎn)生PCR片段，所述片段含有通過使用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)中的一個(gè)引物而導(dǎo)入的所需突變。通過用限制性內(nèi)切核酸酶裂解，從PCR-產(chǎn)生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，重新插入表達(dá)質(zhì)粒中。
另外，Sierks等，1989，蛋白質(zhì)工程，2,621-625；Sierks等，1990，蛋白質(zhì)工程，卷3,193-198也描述了曲霉屬葡糖淀粉酶中的定點(diǎn)誘變。
隨機(jī)誘變適當(dāng)?shù)碾S機(jī)誘變可以是翻譯成所需氨基酸序列之基因的至少三個(gè)部分中的定位或區(qū)域-特異性隨機(jī)誘變，也可以是整個(gè)基因中的隨機(jī)誘變。
可使用本領(lǐng)域已知的任何方法方便地對(duì)編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變。
有關(guān)上述內(nèi)容，本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生親代葡糖淀粉酶變體的方法，其中相對(duì)于親代而言，變體表現(xiàn)出改良的熱穩(wěn)定性，所述方法包括(a)對(duì)編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中所得的突變DNA序列，和(c)篩選表達(dá)葡糖淀粉酶變體的宿主細(xì)胞，相對(duì)于親代葡糖淀粉酶而言，所述變體具有改變的特性(即熱穩(wěn)定性)。
如本文工作實(shí)施例所述，優(yōu)選使用摻加(doped)引物進(jìn)行本發(fā)明之上述方法的步驟(a)(參見下文)。
例如，可通過使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑，通過使用適當(dāng)?shù)墓押塑账?，或通過對(duì)DNA序列進(jìn)行PCR-產(chǎn)生的誘變來進(jìn)行隨機(jī)誘變。另外，可通過使用這些誘變劑的任何組合進(jìn)行隨機(jī)誘變。誘變劑可以誘導(dǎo)例如堿基轉(zhuǎn)換，顛換，倒位，轉(zhuǎn)頻，缺失和/或插入。
適用于本發(fā)明的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG),O-甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲烷磺酸酯(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些誘變劑時(shí)，一般通過下述方法進(jìn)行誘變，即在適于發(fā)生誘變的條件下，在存在選定誘變劑時(shí)保溫待誘變的編碼親代酶的DNA序列，并選擇具有所需特性的突變DNA。
當(dāng)通過使用寡核苷酸進(jìn)行誘變時(shí)，在合成待改變的位置處的寡核苷酸的過程中，可在寡核苷酸中添加或摻加3個(gè)非親代核苷酸。可進(jìn)行添加或摻加以避免出現(xiàn)不必要的氨基酸密碼子。可通過任何已知技術(shù)，必要時(shí)使用例如PCR,LCR或任何DNA聚合酶和連接酶，將經(jīng)添加或摻加的寡核苷酸摻入編碼葡糖淀粉酶的DNA中。
優(yōu)選使用“恒定不變的隨機(jī)添加”進(jìn)行添加，其中各個(gè)位置處的野生型和突變的百分比是預(yù)先確定好的。另外，可優(yōu)先進(jìn)行有目的的添加以導(dǎo)入某些核苷酸，籍此優(yōu)先導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)特定的氨基酸殘基?？蛇M(jìn)行添加以在每個(gè)位置處導(dǎo)入90％野生型和10％突變。選擇添加方案的其它考慮基于基因以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的限制。通過使用DOPE程序可制訂摻加方案，所述程序可特別地確保不會(huì)導(dǎo)入終止密碼子。
當(dāng)使用PCR-產(chǎn)生的誘變時(shí)，在增加核苷酸摻入錯(cuò)誤率的條件下，對(duì)經(jīng)化學(xué)處理或未經(jīng)處理的編碼親代葡糖淀粉酶的基因進(jìn)行PCR(Deshler,1992；Leung等，技術(shù)，Vol.1,1989,p11-15)。
可使用大腸桿菌(Fowler等，普通分子遺傳學(xué)，133,1974,p179-191)，釀酒酵母或任何其它微生物的增變菌株隨機(jī)誘變編碼葡糖淀粉酶的DNA，誘變方法包括例如將含有親代糖基化酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至增變菌株，培養(yǎng)具有質(zhì)粒的增變菌株，從增變菌株中分離突變質(zhì)粒。隨后，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)生物體。
待誘變的DNA序列可方便地存在于基因組或cDNA文庫(kù)中，所述文庫(kù)制備自表達(dá)親代葡糖淀粉酶的生物體?；蛘?，DNA序列可存在于適當(dāng)載體，如質(zhì)?；蚴删w上，再將所述載體與誘變劑保溫，或?qū)⑺鲚d體暴露于誘變劑中。待誘變的DNA也可存在于宿主細(xì)胞中，或者整合于所述細(xì)胞的基因組中，或者存在于細(xì)胞所攜有的載體上。最后，待誘變的DNA可以是分離的形式。應(yīng)理解需進(jìn)行隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選為cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下，在進(jìn)行表達(dá)步驟b)或篩選步驟c)之前，可方便地?cái)U(kuò)增突變的DNA序列?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行這種擴(kuò)增，本發(fā)明優(yōu)選的方法是使用寡核苷酸引物進(jìn)行PCR-產(chǎn)生的擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)親代酶的DNA或氨基酸序列制備的。
與誘變劑保溫或暴露于其中之后，通過在允許表達(dá)發(fā)生的條件下培養(yǎng)攜有突變DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞來表達(dá)突變的DNA。用于此目的的宿主細(xì)胞可以被任選存在于載體上的突變的DNA序列轉(zhuǎn)化，或者攜有處于誘變處理過程中的編碼親代酶的DNA序列。適當(dāng)宿主細(xì)胞的例子如下革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；和革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
突變的DNA序列可進(jìn)一步含有編碼允許突變的DNA序列表達(dá)的DNA序列。
定位隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變定位于所述親代葡糖淀粉酶的一部分較為有利。當(dāng)鑒定出酶的某些區(qū)域?qū)γ傅奶囟ㄌ匦允种匾獣r(shí)，和當(dāng)經(jīng)修飾后有望產(chǎn)生具有改良特性的變體時(shí)，進(jìn)行定位隨機(jī)誘變較有利。當(dāng)已闡明親代酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)，并證實(shí)該結(jié)構(gòu)與酶功能有關(guān)時(shí)，一般即可鑒定出該區(qū)域。
通過使用上文所述的PCR-產(chǎn)生的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)技術(shù)，可方便地進(jìn)行定位的或區(qū)域特異性的隨機(jī)誘變?；蛘撸赏ㄟ^例如插入適當(dāng)?shù)妮d體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后，可使用上述誘變方法中的任一種誘變所述部分。
另一種提供本發(fā)明變體的方法包括基因改組，其描述于例如WO95/22625(Affymax Technologies N.V.)或WO 96/00343(Novo Nordisk A/S)。
葡糖淀粉酶變體的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明，使用表達(dá)載體可將通過上述方法或本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列表達(dá)成酶的形式，所述載體一般包括編碼啟動(dòng)子的調(diào)控序列，操縱基因，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號(hào)，并任選包括阻抑蛋白基因或多種激活物基因。
表達(dá)載體攜有編碼本發(fā)明葡糖淀粉酶變體之DNA序列的重組表達(dá)載體可以是便于經(jīng)受重組DNA方法的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于欲導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。當(dāng)將所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，該載體能整合至宿主細(xì)胞基因組并與整合了該載體的染色體一起復(fù)制。適當(dāng)表達(dá)載體的例子包括pMT838。
啟動(dòng)子在載體中，DNA序列應(yīng)與適當(dāng)啟動(dòng)子序列可操作相連。啟動(dòng)子可以是在選定宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，所述啟動(dòng)子可得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
用于介導(dǎo)編碼本發(fā)明葡糖淀粉酶變體的DNA序列的轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA啟動(dòng)子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)的啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動(dòng)子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用啟動(dòng)子的例子是得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶的基因的啟動(dòng)子，釀酒酵母的TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)啟動(dòng)子(Alber等，1982，應(yīng)用分子遺傳學(xué)雜志，1,p419-434),Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因的啟動(dòng)子。
表達(dá)載體本發(fā)明的表達(dá)載體也可含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明的α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列適于得自與啟動(dòng)子相同的來源。
載體還可含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列的例子是質(zhì)粒pUC19,pACYC177,pUB110,pE194,pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性包括例如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。此外，載體可含有曲霉選擇標(biāo)記，如amdS,argB,niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或按WO91/17243所述通過共轉(zhuǎn)化完成選擇。
分別連接本發(fā)明編碼葡糖淀粉酶變體的DNA構(gòu)建體，啟動(dòng)子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所必需信息的適當(dāng)載體，所用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，1989)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明的細(xì)胞含有上文所述的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體，在重組生產(chǎn)本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體時(shí)，所述細(xì)胞可有利地用作宿主細(xì)胞。可方便地通過將DNA構(gòu)建體(一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合至宿主染色體，而用編碼變體的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)榇藭r(shí)DNA序列更可能在細(xì)胞中穩(wěn)定維持?？筛鶕?jù)常規(guī)方法，如同源或異源重組將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體?；蛘撸捎蒙衔乃龅呐c不同類型的宿主細(xì)胞相關(guān)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選是微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適當(dāng)細(xì)菌的例子是革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，或青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。通過例如以本身已知的方式進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或使用感受態(tài)細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
從糖酵母或裂殖酵母，如釀酒酵母的種中選擇酵母生物體較為有利。
宿主細(xì)胞也可以是絲狀真菌，例如屬于曲霉屬的種的菌株，最優(yōu)選為米曲霉或黑曲霉，或鐮孢菌屬的菌株，例如尖孢鐮孢菌，禾谷鐮孢菌(其確切的名稱為Gribberella zeae，以前被稱為Sphaeria zeae，與Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis同義)或硫色鐮孢菌(其確切的名稱為Gibberella puricaris，與Fusarium trichothecioides，桿孢狀鐮孢菌，接骨木鐮孢(Fusarium sambucium)，玫瑰色鐮孢菌和玫瑰色鐮孢菌graminearum變種同義)，櫻桃鐮孢(Fusarium cerealis)(與Fusarium crokkwellnse同義)或Fusariumvenenatum。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是蛋白酶缺損或蛋白酶陰性菌株。
例如，蛋白酶缺損菌株米曲霉JaL 125缺損了被稱為“alp”的堿性蛋白酶基因。該菌株描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。
可通過下述方法轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞，所述方法包括形成原生質(zhì)體并進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，接著以本身已知的方法再生細(xì)胞壁。曲霉屬用作宿主微生物描述于EP 238023(Novo Nordisk A/S)，其內(nèi)容列入本文作為參考。
產(chǎn)生葡糖淀粉酶變體的方法在另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的方法，所述方法包括在有助于產(chǎn)生變體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基是適用于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和表達(dá)本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以商購(gòu)或根據(jù)已知方法(例如按美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄所述的方法)制備。
通過眾所周知的方法可從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞所分泌的葡糖淀粉酶變體，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，利用諸如硫酸銨的鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分，接著使用層析方法，如離子交換層析，親和層析等。
淀粉轉(zhuǎn)化本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體由淀粉生產(chǎn)葡萄糖等的方法。該方法一般包括以下步驟，即在α-淀粉酶的存在下部分水解前體淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下，通過裂解α-(1→4)和α-(1→6)葡糖苷鍵，從淀粉或相關(guān)寡-和多糖分子的非-還原末端進(jìn)一步水解釋放D-葡萄糖。
利用α-淀粉酶部分水解前體淀粉可通過水解內(nèi)部的α-(1→4)連鍵而初步裂解淀粉分子。在商業(yè)應(yīng)用中，使用α-淀粉酶初步水解在約105℃的溫度下進(jìn)行。處理了很高濃度的淀粉，通常為30％至40％固體。通常在此高溫下將初步水解進(jìn)行5分鐘。然后將部分水解的淀粉轉(zhuǎn)移至第二個(gè)罐中，在85℃至98℃的溫度下保溫約1至2小時(shí)以使葡萄糖當(dāng)量(D.E.)為10至15。
通常在降低的溫度，即30℃至62℃下，在獨(dú)立的罐中，在葡糖淀粉酶的存在下，從淀粉或相關(guān)寡-和多糖分子的非-還原末端進(jìn)一步水解釋放D-葡萄糖。優(yōu)選將底物液體的溫度降至55℃至60℃，溶液的pH從約5.5至6.5降至約3至5.5。優(yōu)選溶液的pH為4至4.5。在溶液中加入葡糖淀粉酶，將反應(yīng)進(jìn)行24至72小時(shí)，優(yōu)選36至48小時(shí)。
在比傳統(tǒng)的分批糖化法高的溫度下，使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶變體進(jìn)行糖化。根據(jù)本發(fā)明，可在60至80℃，優(yōu)選在63至75℃的溫度下進(jìn)行糖化。該溫度適用于傳統(tǒng)的分批法(上文所述)和連續(xù)糖化法。
實(shí)際上，必須在超過60℃的溫度下進(jìn)行連續(xù)糖化法，所用溫度應(yīng)能維持合理高的流量穿過膜，或者能使微生物污染最小化，所述糖化法包括一個(gè)或多個(gè)膜分離步驟，即過濾步驟。因此，本發(fā)明的熱穩(wěn)定性變體提供了以較合理的成本和/或使用較低酶蛋白質(zhì)劑量，在工業(yè)糖化法可接受的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模連續(xù)糖化法的可能性。根據(jù)本發(fā)明，糖化時(shí)間甚至可以縮短。
在60℃至80℃的溫度下，本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體(如AMG變體)的活性基本上高于傳統(tǒng)使用的30至60℃的溫度下的活性。因此，通過升高葡糖淀粉酶的工作溫度，可在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行糖化過程。
另外，通過改善熱穩(wěn)定性，T1/2(“材料和方法”一節(jié)所定義的半壽期)也得以改善。由于本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的熱穩(wěn)定性得以改善，只需加入很少量的葡糖淀粉酶以替代在糖化過程中失活的葡糖淀粉酶。在本發(fā)明的糖化過程中，更多的葡糖淀粉酶能維持活性。此外，當(dāng)在高于63℃的溫度下進(jìn)行糖化過程時(shí)，微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)也有所降低。
用葡糖淀粉酶，酸性淀粉酶和支鏈淀粉酶進(jìn)行的典型糖化試驗(yàn)的葡萄糖產(chǎn)率為95.5至96.5％。其余的糖類一般由1％麥芽糖，1.5-2％異麥芽糖和1-1.5％高級(jí)寡糖組成。由于在高濃度的葡萄糖和高的干-固體水平存在下，葡糖淀粉酶趨向于形成回復(fù)突變產(chǎn)物，因此也產(chǎn)生了二糖。
對(duì)液化之后溶液中存在的糖類和糖化過程中形成的糖類具有提高的比活性的葡糖淀粉酶可能是有利的，因?yàn)殡S后可使用降低的酶蛋白質(zhì)劑量或縮短的反應(yīng)時(shí)間。通常，相對(duì)于短鏈糖類而言，葡糖淀粉酶偏好由長(zhǎng)鏈糖類組成的底物，因此，針對(duì)麥芽糖庚糖的比活性約比針對(duì)麥芽糖的比活性高6倍。因此，針對(duì)短鏈糖類，如麥芽糖的比活性提高(不降低針對(duì)寡糖的活性)也允許使用較低酶劑量和/或較短反應(yīng)時(shí)間。
此外，用具有增加的α-1,4-水解活性(如果α-1,6活性未改變或甚至降低)的葡糖淀粉酶變體可得到較高的葡萄糖產(chǎn)量，由于使用了量有所降低的酶蛋白質(zhì)，減少了α-1,6回復(fù)突變產(chǎn)物的形成(較少的異麥芽糖)。
可使用“材料和方法”一節(jié)中所述的方法，在37℃或60℃下測(cè)定比活性。
其中使用了本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體的糖化方法的例子包括JP 3-224493；JP 1-191693；JP 62-272987；EP 452,238和WO 99/27124中所述的方法(所有參考文獻(xiàn)皆列入本文作為參考)。
另一方面，本發(fā)明涉及糖化液化淀粉溶液的方法，所述方法包括步驟(ⅰ)糖化步驟，在該步驟中，發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)酶促糖化過程，隨后的步驟是(ⅱ)一個(gè)或多個(gè)高溫膜分離步驟，其中使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶變體進(jìn)行酶促糖化。
在本發(fā)明的方法中，可聯(lián)合使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體和僅水解具有至少4個(gè)葡糖殘基的分子中的α-(1→6)葡糖苷鍵的酶。優(yōu)選聯(lián)合使用本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體和支鏈淀粉酶或異淀粉酶。異淀粉酶和支鏈淀粉酶的脫支用途，酶的分子特性和具有葡糖淀粉酶活性的酶的潛在用途示于G.M.A.van Beynum等，淀粉轉(zhuǎn)化技術(shù)，Marcel Dekker，紐約，1985,101-142。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉(zhuǎn)變過程中的用途。
另外，本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體可用于包括連續(xù)糖化步驟的淀粉連續(xù)轉(zhuǎn)變過程。
本發(fā)明的葡糖淀粉酶變體也可以固定化的形式被使用。這種固定化酶是合適的，經(jīng)常用于產(chǎn)生特制的漿液，如麥芽糖漿液，并進(jìn)一步用于與果糖漿液的生產(chǎn)有關(guān)的寡糖殘液流。
本發(fā)明的葡糖淀粉酶也可用于生產(chǎn)燃料或飲料用乙醇的方法，或者用于生產(chǎn)有機(jī)化合物的發(fā)酵方法，如檸檬酸，抗壞血酸，賴氨酸，谷氨酸。
材料和方法材料酶AMG G1黑曲霉葡糖淀粉酶G1，公開于Boel等，1984,EMBOJ,3(5),p1097-1102和SEQ ID NO:13，可得自Novo Nordisk。
AMG G2截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G1，示于SEQ ID NO:2，可得自Novo Nordisk。
溶液緩沖液0.05M醋酸鈉(6.8g溶于11milli-Q-水中)，pH4.5終止溶液0.4M NaOHGOD-perid,124036,Boehringer Mannheim底物麥芽糖29mM(1g麥芽糖溶于100ml 50mM醋酸鈉，pH4.5)(Sigma)麥芽糖庚糖10mM,115m/10ml(Sigma)宿主細(xì)胞米曲霉JaL 125米曲霉IFO4177得自O(shè)saka發(fā)酵研究所；17-25 JusoHammachi 2-Chome Yodogawa-ku,Osaka，日本，其具有被稱為“alp”的堿性蛋白酶基因(描述于Murakami K等，1991，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，55,p2807-2811)缺失，所述缺失是通過使用米曲霉pyrG基因?yàn)闃?biāo)記，經(jīng)一步基因取代法(描述于G.May，“絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)”，1992,p1-25,J.R.Kinghom和G.Turner編；Blackie Academic and Professional)完成的。菌株JaL 125進(jìn)一步描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。
微生物菌株釀酒酵母YNG318:MATαleu2-Δ2 ura3-52his4-539pep4-Δ1[cir+]質(zhì)粒pCAMG91見圖1，該質(zhì)粒含有黑曲霉G1葡糖淀粉酶(AMG G1),pCAMG91的構(gòu)建描述于Boel等，1984,EMBOJ,3(7),p1581-1585。
pMT838該質(zhì)粒編碼截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G2(SEQ ID NO:2)。
pJSO026(釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒)(J.S.Okkels,1996,“pYES載體中的URA3啟動(dòng)子缺失增加釀酒酵母中的真菌脂肪酶表達(dá)水平”，重組DNA生物技術(shù)Ⅲ生物學(xué)和工程學(xué)的結(jié)合，紐約科學(xué)院年刊Vol.782)。更具體地，通過用得自釀酒酵母的組成型表達(dá)的TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)啟動(dòng)子(Albert和Karwasaki,1982，應(yīng)用分子遺傳學(xué)雜志，1,419-434)替代pYES2.0中的誘導(dǎo)型GAL1-啟動(dòng)子，并缺失URA3啟動(dòng)子的一部分，由pYES2.0衍生得到表達(dá)質(zhì)粒pJSO37。
方法釀酒酵母YNG318的轉(zhuǎn)化混合DNA片段和開環(huán)載體，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化至酵母釀酒酵母YNG318中。
測(cè)定以Kcat(sec.-1)表示的比活性在選定的溫度下，如37℃或60℃，將750μl底物(1％麥芽糖，50mM醋酸鈉，pH4.3)保溫5分鐘。
加入50μl用醋酸鈉稀釋的酶。在0,3,6,9和12分鐘之后取出100μl等分試樣，并轉(zhuǎn)移至100μl 0.4M氫氧化鈉中以終止反應(yīng)。也包括空白對(duì)照。
將20μl轉(zhuǎn)移至微滴板中，加入200μl GOD-Perid溶液，室溫下保溫30分鐘之后，在650nm下測(cè)定光吸收值。
葡萄糖被用作標(biāo)準(zhǔn)，比活性被計(jì)算為Kcat(sec.-1)。
測(cè)定AGU活性并表示為AGU/mg一個(gè)Novo淀粉葡糖苷酶單位(AGU)被定義為于37℃和pH4.3，每分鐘水解1μM麥芽糖的酶量。分析方法(AEL-SM-0131)的詳細(xì)描述可由NovoNordisk提供。
使用Boehringer Mannheim的Glucose GOD-Perid試劑盒，124036，通過(AEL-SM-0131)的改良方法將活性測(cè)定為AGU/ml。標(biāo)準(zhǔn)AMG-標(biāo)準(zhǔn)，批號(hào)7-1195,195AGU/ml。
于37℃，將375μl底物(1％麥芽糖，50mM醋酸鈉，pH4.3)保溫5分鐘。加入25μl用醋酸鈉稀釋的酶。10分鐘之后通過加入100μl 0.25M氫氧化鈉以終止反應(yīng)。將20μl轉(zhuǎn)移至96孔微滴板中，加入200μl GOD-Perid溶液，室溫下保溫30分鐘之后，在650nm下測(cè)定光吸收值，根據(jù)AMG-標(biāo)準(zhǔn)將活性計(jì)算為AGU/ml。
然后用活性(AGU/ml)除以蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)，計(jì)算出比活性(AGU/mg)。
米曲霉的轉(zhuǎn)化(一般方法)用米曲霉的孢子接種100ml YPD(Sherman等，1981，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，振蕩培養(yǎng)約24小時(shí)。通過流經(jīng)miracloth過濾以收集菌絲體，并用200ml 0.6M MgSO4洗滌。將菌絲體懸浮于15ml 1.2M MgSO4,10mMNaH2PO4,pH5.8中。在冰上冷卻懸浮液，加入1ml含有120mg NovozymTM234的緩沖液。5分鐘之后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma H25型)，于37℃持續(xù)緩慢攪拌保溫達(dá)1.5至2.5小時(shí)，直至在顯微鏡下檢查出樣品中可見大量原生質(zhì)體。
流經(jīng)miracloth過濾懸浮液，將濾液轉(zhuǎn)移至無菌的試管中，鋪一層5ml0.6M山梨糖醇，100mM Tris-HCl,pH7.0。1000g離心15分鐘，從MgSO4墊層的上部收集原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體懸浮液中加入2倍體積的STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl,pH7.5,10mM CaCl2)，以1000g將混合物離心5分鐘。將原生質(zhì)體沉淀物重新懸浮于3ml STC中，并重新沉淀。重復(fù)該步驟，最終，將原生質(zhì)體重新懸浮于0.2-1ml STC中。
將100μl原生質(zhì)體懸浮液與溶于10μl STC中的5-25μg p3SR2(攜有構(gòu)巢曲霉amdS基因的質(zhì)粒，其描述于Hynes等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，Vol.3,No.8,1430-1439,Aug.1983)混合。將混合物置于室溫放25分鐘，加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576),10mM CaCl2和10mM Tris-HCl,pH7.5，小心混合(兩次)，最終加入0.85ml相同的溶液并小心混合。將混合物置于室溫放25分鐘，以2500g離心15分鐘，將沉淀物重新懸浮于2ml 1.2M山梨糖醇中。再進(jìn)行一次沉降之后，將原生質(zhì)體鋪于基本平板(Cove,1966,Biochem.Biophys.Acta 113,51-56)，所述平板含有1.0M蔗糖，pH7.0，以10mM乙酰胺為氮源，并含20mM CsCl以抑制背景生長(zhǎng)。于37℃保溫4至7天之后，挑選孢子，懸浮于無菌水中，鋪平板以得到單菌落。重復(fù)該方法，儲(chǔ)存第二次重分離之后的單菌落孢子，將其作為確定的轉(zhuǎn)化子。
補(bǔ)料分批發(fā)酵在含有麥芽糖糊精作為碳源，尿素作為氮源，并含有酵母提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。通過將所述米曲霉宿主細(xì)胞的搖瓶培養(yǎng)物接種于含有3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中來進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。在pH5.0和34℃下培養(yǎng)24小時(shí)之后，開始持續(xù)補(bǔ)加碳源和氮源。碳源被當(dāng)成限速因子，它可以確保存在過量的氧。補(bǔ)料分批培養(yǎng)持續(xù)4天，然后通過離心，超濾，清洗過濾和除菌過濾回收酶。
純化過濾培養(yǎng)物肉湯，加入硫酸銨(AMS)至濃度為1.7M AMS，將pH調(diào)節(jié)為pH5。離心除去沉淀的物質(zhì)，將含有葡糖淀粉酶活性的溶液上樣于預(yù)先用1.7M AMS,20mM醋酸鈉，pH5平衡過的Toyo Pearl Butyl柱。使用1.7至0M AMS的線性梯度，用超過10倍柱體積的10mM醋酸鈉，pH4.5洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集含葡糖淀粉酶的級(jí)分，對(duì)著20mM醋酸鈉，pH4.5進(jìn)行透析。然后將溶液上樣于預(yù)先用10mM Piperazin,Sigma,pH5.5平衡過的QSepharose柱。用平衡緩沖液洗下未結(jié)合的物質(zhì)。用超過10倍柱體積的含10mM Piperazin,pH5.5的0-0.3M氯化鈉線性梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集含葡糖淀粉酶的級(jí)分，通過SDS-PAGE證實(shí)純度。
T1/2(半壽期)方法Ⅰ使用下列方法將變體的熱穩(wěn)定性測(cè)定為T1/2于68℃或70℃，將950μl50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.3)(NaOAc)保溫5分鐘。加入50μl溶于緩沖液中的酶(4AGU/ml)。在0,5,10,20,30和40分鐘之后取出2×40μl樣品，并在冰上冷卻。將保溫(0分鐘)之前測(cè)定的活性(AGU/ml)用作對(duì)照(100％)。穩(wěn)定性的降低(百分比)被計(jì)算為保溫時(shí)間的函數(shù)。在不同的時(shí)間測(cè)定殘留的葡糖淀粉酶活性所占的百分比。T1/2是直至相對(duì)活性的百分比降低為50％所花的時(shí)間。
T1/2(半壽期)(方法Ⅱ)通過在所述溫度(如70℃)下，在pH4.5的30％葡萄糖，50mM醋酸鈉中保溫所述酶(ca0.2AGU/ml)來測(cè)定T1/2。以給定的時(shí)間間隔取出樣品，置于冰上冷卻，通過pNPG法(如下文所述)測(cè)定殘留的酶活性。
在不同的時(shí)間測(cè)定殘留的葡糖淀粉酶活性所占的百分比。T1/2是直至相對(duì)活性的百分比降低為50％所花的時(shí)間。
殘留的酶活性(pNPG法)pNPG試劑將0.2gpNPG(對(duì)-硝基苯基葡糖吡喃糖苷)溶解于0.1M醋酸鹽緩沖液(pH4.3)，并將體積調(diào)節(jié)至100ml。
硼酸鹽溶液將3.8g Na2B4O7·10H2O溶解于Milli-Q水中，并將體積調(diào)節(jié)為100ml。在25μl樣品中加入50μl底物，于50℃保溫2小時(shí)。通過加入150μl硼酸鹽溶液以終止反應(yīng)。測(cè)定405nm處的光密度，計(jì)算殘留的活性。
構(gòu)建pAMGY按下述構(gòu)建pAMGY載體用AMG基因取代pJSO026中的脂肪酶基因，AMG基因是使用含有AMG基因的模板質(zhì)粒pLAC103，用正向引物FG2:5’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3’和反向引物RG2:5’-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3’經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。于37℃，用XbaⅠ和SmaⅠ將pJSO026質(zhì)粒消化2小時(shí)，使用Klenow片段使PCR擴(kuò)增子成為平端，然后用XbaⅠ消化。連接載體片段和PCR擴(kuò)增子，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。所得載體被稱為pAMGY。
構(gòu)建pLaC103黑曲霉AMGⅡcDNA克隆(Boel等，1984，文獻(xiàn)同上)被用作來源以構(gòu)建pLaC103，從而在釀酒酵母中表達(dá)GⅡ型AMG。
按下述幾個(gè)步驟進(jìn)行構(gòu)建。
用XbaⅠ裂解pT7-212(EP37856/US5162498)，用Klenow DNA聚合酶和dNTP使其成為平端。用EcoRⅠ裂解之后，從瓊脂糖凝膠電泳中純化所得的載體片段，并與pBoe153的2.05kb EcoRⅠ-EcoRⅤ片段連接，籍此在所得質(zhì)粒pG2x中重新產(chǎn)生位于AMG編碼片段之EcoRⅤ末端的XbaⅠ位點(diǎn)。
為了除去AMG編碼序列上游的DNA，并在編碼AMG的DNA中安插適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，需制備下列構(gòu)建體分離p53的930bp EcoRⅠ-PstⅠ片段，用AluⅠ裂解，將所得771bp Alu-PstⅠ片段連接至具有平端EcoRⅠ位點(diǎn)的pBR322(見上文)，并用PstⅠ裂解。在所得質(zhì)粒pBR-AMG’中，在離AMG編碼序列起始密碼子僅34bp的位置處重新產(chǎn)生了EcoRⅠ位點(diǎn)。
從pBR-AMG’中分離775bp EcoRⅠ-PstⅠ片段，并在包括pT7-212的XbaⅠ-EcoRⅠ載體片段的連接反應(yīng)中與pG2x的1151bp PstⅠ-XbaⅠ片段連接。
在堿性磷酸酶的存在下，用BamHⅠ裂解所得質(zhì)粒pT7GⅡ，滅活磷酸酶之后用SphⅠ進(jìn)行部分消化。由此反應(yīng)得到2489bp SphⅠ-BamHⅠ片段，其含有與AMGⅡ編碼序列相連的釀酒酵母TPⅠ啟動(dòng)子。
上述片段和pT7GⅡ的1052bp BamHⅠ片段與經(jīng)堿性磷酸酶處理的，由SphⅠ-BamHⅠ消化所得的pMT743(EP37856/US5162498)載體片段相連接，所得質(zhì)粒是pLaC103。
篩選熱穩(wěn)定性AMG變體在下文所述的熱穩(wěn)定性濾膜分析試驗(yàn)中篩選文庫(kù)。
濾膜試驗(yàn)分析熱穩(wěn)定性于30℃，將酵母文庫(kù)鋪于含100μg/ml氨芐青霉素的SCFura瓊脂平板上的醋酸纖維素(OE67,Schleicher & Schuell,Dassel，德國(guó))-和硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85,Schleicher＆Schuell,Dassel，德國(guó))的夾層中放置至少72小時(shí)。將菌落影印鋪板于用甲醇激活1分鐘的PVDF濾膜(Immobilon-P,Millipore,Bedford)，或者Protran濾膜(未激活)，隨后用0.1M NaAc洗滌，置于室溫下保溫2小時(shí)。用自來水洗滌PVDF/Protran濾膜上的菌落，在保溫之前用針頭特異性標(biāo)記各個(gè)濾膜夾層和PVDF/Protran濾膜，從而能在篩選之后將陽性變體定位于濾膜上。將具有結(jié)合變體的PVDF濾膜轉(zhuǎn)移至含0.1MNaAc,pH4.5的容器中，于47℃保溫(如果是Protran濾膜，則在67-69℃保溫)15分鐘。室溫下儲(chǔ)存SC ura-瓊脂平板上的醋酸纖維素和硝酸纖維素濾膜夾層直至使用。保溫之后，在含有5％麥芽糖，1％瓊脂糖，50mM NaAc,pH4.5的平板上檢測(cè)殘留的活性。按與濾膜夾層相同的方式標(biāo)記具PVDF濾膜的檢測(cè)平板，50℃保溫2小時(shí)。取出PVDF濾膜之后，用Glucose GODperid(Boehringer Mannheim GmbH，德國(guó))染色檢測(cè)平板。在白色背景上，檢測(cè)平板上具有殘留活性的變體被檢測(cè)為暗綠色的點(diǎn)。改良變體位于儲(chǔ)存平板上。在與第一次篩選相同的條件下再將改良變體篩選2次。
使用摻加方案進(jìn)行隨機(jī)誘變的一般方法通過下列步驟進(jìn)行隨機(jī)誘變1．在親代酶中選擇需修飾的區(qū)域，2．確定選定區(qū)域中的突變位點(diǎn)和無需突變的位點(diǎn)，3．確定應(yīng)進(jìn)行何種類型的突變，例如與所構(gòu)建的變體的所需穩(wěn)定性和/或特性相關(guān)的突變，4．選擇結(jié)構(gòu)合理的突變，5．考慮到步驟4，調(diào)整步驟3所選擇的殘基，6．利用適當(dāng)?shù)膿郊铀惴ㄒ?guī)則分析核苷酸分布，7．必要時(shí)，將需要的殘基調(diào)整為實(shí)實(shí)在在的遺傳密碼，例如考慮到遺傳密碼的局限性，例如為了避免導(dǎo)入終止密碼子；本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到在實(shí)踐中不能使用一些密碼子的組合，而需改動(dòng)這些組合，8．制備引物，9．使用引物進(jìn)行隨機(jī)誘變，10．通過篩選所需的改良特性來選擇所得的葡糖淀粉酶變體。
摻加算法規(guī)則用于步驟6的適當(dāng)?shù)膿郊铀惴ㄒ?guī)則是本領(lǐng)域眾所周知的。一個(gè)這種算法規(guī)則描述于Tomandl,D等，1997，計(jì)算機(jī)輔助的分子設(shè)計(jì)雜志，11:29-38。另一個(gè)算法規(guī)則是DOPE(Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A和Kretzschmar,T,1998，核酸研究，26:697-702)。
使用分子模擬推斷出溫度活性重要區(qū)的方法對(duì)目的酶(本文是AMG)的X-射線結(jié)構(gòu)和/或模型-制作結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。使用CHARMM(得自分子模擬(MSI))程序或其它適當(dāng)程序，如DISCOVER(得自MSI)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。所述動(dòng)力學(xué)模擬在真空，或包括結(jié)晶水，或與包埋于適當(dāng)水體如球體或盒中的目的酶一起進(jìn)行。模擬進(jìn)行300皮秒(ps)，或更長(zhǎng)時(shí)間，如300至1200ps。推斷出結(jié)構(gòu)中CA碳的各向同性波動(dòng)，并且進(jìn)行結(jié)構(gòu)之間的比較。有關(guān)如何獲得各向同性波動(dòng)的詳細(xì)描述見于CHARMM手冊(cè)(得自MSI)(列入本文作為參考)。
可使用可帶電氨基酸上的標(biāo)準(zhǔn)電荷進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。例如，Asp和Glu帶負(fù)電，Lys和Arg帶正電。此狀況類似于約7.0的中性pH。為了分析較低的pH，可以滴定分子以便得到正?？傻味埢趐H2-10的pKa變化；所述殘基為L(zhǎng)ys,Arg,Asp,Glu,Tyr和His。Ser,Thr和Cys也是可滴定的，但是不在考慮之列。此處，因pH所致的電荷改變被描述為在高pH時(shí)Arg,Lys都帶負(fù)電，Asp,Glu都不帶電。這模仿了4至5的pH，此時(shí)一般會(huì)發(fā)生Asp和Glu的滴定。
通過使用MSI程序包中的HOMOLOGY模型可進(jìn)行目的酶的模型制作。泡盛曲霉變體X100的晶體結(jié)構(gòu)見于例如Brookhaven數(shù)據(jù)庫(kù)中的3GLY和1DOG。
實(shí)施例實(shí)施例1 構(gòu)建AMG G2變體定點(diǎn)誘變?yōu)榱藰?gòu)建AMG G2(SEQ ID NO:2)的變體，按說明書使用了市售的Chameleon雙鏈定點(diǎn)誘變?cè)噭┖小?br> 在含有AMG G1形式的質(zhì)粒pCAMG91(見圖1)中刪除介于G2第1362位核苷酸和G2第1530位核苷酸之間的DNA，制成pMT838，將編碼所選AMG G2酶的基因置于上述pMT838上。
按說明書用以下引物7258:5’p gaatga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’(SEQ ID NO:3)將pMT838中氨芐青霉素基因的ScaⅠ位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為MluⅠ位點(diǎn)(從而改變?cè)诎逼S青霉素抗性基因中發(fā)現(xiàn)的ScaⅠ位點(diǎn)，并用于切割MluⅠ位點(diǎn))。然后以含有所選AMG基因的pMT838載體為DNA聚合酶、寡聚核苷酸7258(SEQID NO:3)和21401(SEQ ID NO:4)的模板。
引物編號(hào)21401(SEQ ID NO:4)作為篩選引物使用。
21401:5’pgg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg ccttgg acctgc gtt ata gcc 3’(改變了在AMG基因中發(fā)現(xiàn)的ScaⅠ位點(diǎn)但未改變氨基酸序列)通過添加含所需突變的相應(yīng)寡聚核苷酸將所需突變(如半胱氨酸殘基的引入)引入所選AMG基因中。
用引物107581引導(dǎo)T12P107581:5’pgc aacgaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3’(SEQ ID NO:5)通過對(duì)整個(gè)基因測(cè)序而對(duì)突變進(jìn)行檢驗(yàn)。用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化米曲霉，方法如上文“材料與方法”部分所述。發(fā)酵變體并如上文“材料與方法”部分所述純化。
實(shí)施例2 通過局部隨機(jī)摻加誘變來構(gòu)建比親代酶熱穩(wěn)定性增強(qiáng)了的黑曲霉AMG變體在黑曲霉AMG的預(yù)選區(qū)實(shí)施隨機(jī)誘變以增強(qiáng)熱穩(wěn)定性。
殘基區(qū)域L19-G35區(qū)域A353-V374用DOPE軟件(見材料與方法)測(cè)定上述區(qū)域中每一改變的插入(spiked)密碼子以使終止密碼子的量減至最少(見表1)。計(jì)算密碼子的三個(gè)位置中核苷酸的真實(shí)分布，從而得出所選的氨基酸改變?nèi)后w。在指定位置對(duì)摻加區(qū)域進(jìn)行特異性摻加，從而能有較多機(jī)會(huì)獲得所需殘基，但仍允許有其它可能性。
第一柱為待突變的氨基酸，第二柱為野生型的百分率，第三柱為新的氨基酸。
表1 在L19-G35中的摻加L1990％NN2095％TN21恒定不變的
I22恒定不變的G2395％AA2490％S,TD2593％S,T,RG2695％AA2790％S,TW28＜80％R,YV29恒定不變的S3093％T,NG3195％AA3295％VD3380％R,K,HS3490％NG35恒定不變的所得摻加寡核苷酸鏈?zhǔn)居诒?，為有義鏈包含引物序列、野生型核苷酸序列、親代氨基酸序列及每一摻加位置的核苷酸分布。
表2位置19 20 21 22 23 24 25 26 27氨 基 酸 序 列L N N I G A D G A引物12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT野生型核苷酸序列CTG AAT AAC ATC GGG GCG GAC GGT GCT位置(續(xù))28 29 30 31 32 33 34 35氨基酸序列(續(xù)) WVSGADSG引 物91010 GTG 1112C G4C G13G 14151 61718T GGC野生型核苷酸序列TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCTGGC每一摻加位置的核苷酸分布1:A10,C902:A6,T943:A95,C54:G95,C55:G91,A3,T3,C36:G95,A3,C27:G3,A95,C28:G92,A4,T49:A3,T9710:G95,T511:G3,A97
12:G95,A2,C313:T5,C9514:G88,A8, C415:G7,A9316:G4,C9617:G4,A9618:G95,A2,C3正向引物(SEQ ID NO:6):FAMGII｀5-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC 12T A3T AAC ATCG4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATTGTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3′反向引物(SEQ ID NO:7):RAMG1:5′-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3′表3 在A353-V374區(qū)中的摻加A353＜80％ D,E,Q,N,YL35490％Q,EY35590％N,QS35690％T,D,NG35780％P,A,S,TA35893％SA35990％S,T,NT36090％R,KG36185％A,S,TT36290％SY363恒定不變的S36493％DS36593％N,Q,KS36693％P,DS367恒定不變的S36893％D,N,TT36993％Q,EY370恒定不變的S37193％NS37293％N,TI373恒定不變的V37493％N,Y,H
所得摻加寡核苷酸鏈?zhǔn)居诒?，為有義鏈包含引物序列、野生型核苷酸序列、親代氨基酸序列及每一摻加位置的核苷酸分布。
表4位置353 354 355 356 357 358 359 360 361 362氨 基 酸 序 列ALY S DAA T GT引物123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC野生型核苷酸序列GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACTGGC ACC位置(續(xù))363 364 365 366 367 368 369 370氨基 酸 序列(續(xù))YS S S SSTY引物TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T野生型核苷酸序列TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT位置(續(xù))371 372 373 374氨基 酸 序列(續(xù))SS I V引物A16T 2930T ATT 313233野生型核苷酸序列AGT AGC ATT GTA每一摻加位置的核苷酸分布。
1:G91,A3,T3,C32:A13,C873:A40,T604:G3,A3,C945:A6,T946:G4,A4,T927:G2,A96,C28:G93,A3.5,C3.59:G87,A8,C510:A84,C1611:G93,T712:G92,A5,T313:A3,C9714:G3,A9715:G2,A2,T4,C9216:G93,A717:G93,C718:A90,T10
19:G4,A9620:G95,A521:G96,A422:G3,C9723:G2,A1,T95,C224:A3,C9725:G95,A3,C226:G2,A96,C227:A5,C9528:A95,T529:G2,A9830:G94,A4,C231:G94,A3,T1,C232:A4,T9633:A20,C80引物FAMGIV(SEQ ID NO:8)5′-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 12131415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A162930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3＇引物RAMGⅥ(SEQ ID NO:9)5’-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3’隨機(jī)誘變使用表2和3中顯而易見的插入的寡核苷酸(均稱為FAMG)、L19-G35的反向引物RAMG，以及特異性SEQ ID NO:2引物的跨N末端(FG2:5’-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATC-3’(SEQ ID NO:10)和C末端(RG2:5’-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT(SEQ IDNO:11)序列，以通過重疊延伸法(Horton等，基因(Gene),77(1989)，第61-68頁)產(chǎn)生帶有21個(gè)堿基對(duì)的一段重疊的PCR-文庫(kù)-片段。質(zhì)粒pAMGY是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。經(jīng)同源重組在大腸桿菌/酵母穿梭質(zhì)粒pAMGY中克隆PCR片段(見材料和方法)。
篩選如“材料和方法”部分所述，在熱穩(wěn)定性過濾試驗(yàn)中用Protran濾膜，并在67-69℃溫育，以篩選文庫(kù)。
實(shí)施例3通過有DNA寡聚核苷酸插入的PCR改組來構(gòu)建比親代酶熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的黑曲霉AMG變體用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法裝備攜帶AMG基因及側(cè)翼區(qū)的DNA片段。約10μg DNA用DNA酶消化，并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。50-150bp的片段從凝膠上純化。約1μg純化片段與5-15倍摩爾過量的含所需突變之寡聚核苷酸混合。寡聚核苷酸如下(分別用于構(gòu)建Hklib1,Hklib2,Hklib3等)Hklib1:
Hk1- T2X:
5′-ATGTGATTTCCAAGCGCGCGVNNTTGGATTCATGGTTGAGCAAHk1-N9X:
5′-CCTTGGATTCATGGTTGAGCVNNGAAGCGACCGTGGCTCGTACHk1-A11X:
5′-ATTCATGGTTGAGCAACGAAVNNACCGTGGCTCGTACTGCCATHk1-L66X:
5′-TCCTCAAGACCCTCGTCGATVNNTTCCGAAATGGAGATACCAGHk1-S386X:
5′-CTTTCGCCGATGGCTTCGTCVNNATTGTGGAAACTCACGCCGCHk1-E389X:
5′-ATGGCTTCGTCTCTATTGTGVNNACTCACGCCGCAAGCAACGGHk1-T390X:
5′-GCTTCGTCTCTATTGTGGAAVNNCACGCCGCAAGCAACGGCTCHk1-A393X:
5′-CTATTGTGGAAACTCACGCCVNNAGCAACGGCTCCATGTCCGAHk1- S394X:
5′-TTGTGGAAACTCACGCCGCAVNNAACGGCTCCATGTCCGAGCAHk1-N395X:
5′-TGGAAACTCACGCCGCAAGCVNNGGCTCCATGTCCGAGCAATAHk1-G396X:
5′-AAACTCACGCCGCAAGCAACVNNTCCATGTCCGAGCAATACGAHk1-K404X:5′-CCATGTCCGAGCAATACGACVNNTCTGATGGCGAGCAGCTTTCHk1-D406X:5′-CCGAGCAATACGACAAGTCTVNNGGCGAGCAGCTTTCCGCTCGHk1-E408X:5′-AATACGACAAGTCTGATGGCVNNCAGCTTTCCGCTCGCGACCTHk1-L410X:5′-ACAAGTCTGATGGCGAGCAGVNNTCCGCTCGCGACCTGACCTHk1-L423X:5′-CCTGGTCTTATGCTGCTCTGVNNACCGCCAACAACCGTCGTAAHk1 -N426X:5′-ATGCTGCTCTGCTGACCGCCVNNAACCGTCGTAACTCCGTCGTGHk1-N427X:5′-CTGCTCTGCTGACCGCCAACVNNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCTHk1-Y402X:5′-ACGGCTCCATGTCCGAGCAANNCGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCTHklib2:Hk2-L234X- SENSE:5′-CTGGACCGGCAGCTTCATTNNKGCCAACTTCGATAGCAGCCHk2-A235S -ANTISENSE:5′-GAACGGCTGCTATCGAAGTTAGACAGAATGAAGCTGCCGGTCHk2-F237X- SENSE:5-CAGCTTCATTCTGGCCAACNATGATAGCAGCCGTTCCGGCAHk2-D238T-ANTISENSE:5′-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGTGAAGTTGGCCAGAATGAAGCHk2-D238S-ANTISENSE:5′-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGAGAAGTTGGCCAGAATGAAGCHk2-S239X- SENSE:5′-TCATTCTGGCCAACTTCGATNNCAGCCGTTCCGGCAAGGACGHk2-S240G-ANTISENSE:5′-TTGCGTCCTTGCCGGAACGACCGCTATCGAAGTTGGCCAGAAHk2-S242X-ANTISENSE:5′-GGGTGTTTGCGTCCTTGCCAKNACGGCTGCTATCGAAGTTGHk2-G243X-ANTISENSE:5′-GGAGGGTGTTTGCGTCCTTAKNGGAACGGCTGCTATCGAAGHk2-K244R-SENSE:5′-CGATAGCAGCCGTTCCGGCAGAGACGCAAACACCCTCCTGGHk2-T310V-ANTISENSE:5′-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAACGTCCTCAGGGTACCGACCCHk2-T310S-ANTISENSE:5′-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAGAGTCCTCAGGGTACCGACCCHk2-Y311N-SENSE:5′-TCGGTACCCTGAGGACACGAATTACAACGGCAACCCGTGGTHk2-Y312Q-ANTISENSE:5′-GGAACCACGGGTTGCCGTTTTGGTACGTGTCCTCAGGGTACHk2-Y312N-ANTISENSE:5′-GGAACCACGGGTTGCCGTTATTGTACGTGTCCTCAGGGTACHk2-N313T-SENSE:5′-CCCTGAGGACACGTACTACACTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N313S-SENSE:5′-CCCTGAGGACACGTACTACTCTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N313G-SENSE:5′-CCCTGAGGACACGTACTACGGTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N315Q-ANTISENSE:5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTTGGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-N315E-ANTISENSE:5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTTCGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-N315R-ANTISENSE:5′-AGGTGCACAGGAACCACGGTCTGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-F318Y-ANTISENSE:5′-CGGCAGCCAAGGTGCACAGATACCACGGGTTGCCGTTGTAGHk2- Q409P-SENSE:5′-CGACAAGTCTGATGGCGAGCCACTTTCCGCTCGCGACCTGAHklib3:Hk3-D336X-SENSE:5′-CGATGCTCTATACCAGTGGNNKAAGCAGGGGTCGTTGGAGGHk3-K337X-SENSE:5′-TGCTCTATACCAGTGGGACNNKCAGGGGTCGTTGGAGGTCAHk3- Q338X-ANTISENSE:5′-CTGTGACCTCCAACGACCCGNNCTTGTCCCACTGGTATAGAHk3-G339X-SENSE:5′-ATACCAGTGGGACAAGCAGNCUTCGTTGGAGGTCACAGATGHk3-S340X′-ANTISENSE:5′-ACACATCTGTGACCTCCAAANTCCCCTGCTTGTCCCACTGGHk3-S340X″-ANTISENSE:5′-ACACATCTGTGACCTCCAAANCCCCCTGCTTGTCCCACTGGHk3-L341X-SENSE:5′-GTGGGACAAGCAGGGGTCGNUUGAGGTCACAGATGTGTCGCHk3-K352Q-SENSE:5′-TGTGTCGCTGGACTTCTTCCAAGCACTGTACAGCGATGCTGHk3-K352R-SENSE:5′- TGTGTCGCTGGACTTCTTCAGAGCACTGTACAGCGATGCTGHk3-A353D-ANTISENSE:5′-TAGCAGCATCGCTGTACAGATCCTTGAAGAAGTCCAGCGACHk3-A353S-ANTISENSE:5′-TAGCAGCATCGCTGTACAGAGACTTGAAGAAGTCCAGCGACHk3-S356P-SENSE:5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACCCAGATGCTGCTACTGGCACCTHk3-S356N-SENSE:5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACAAUGATGCTGCTACTGGCACCTAHk3-S356D-SENSE:5′-ACTTCTTCAAGGCACTGTACGAUGATGCTGCTACTGGCACCTAHk3-D357S-ANTISENSE:5′-GAGTAGGTGCCAGTAGCAGCAGAGCTGTACAGTGCCTTGAAGAHk3-A359S-SENSE:5′-GGCACTGTACAGCGATGCTTCTACTGGCACCTACTCTTCGTHk3-T360V-ANTISENSE:5′-TGGACGAAGAGTAGGTGCCAACAGCAGCATCGCTGTACAGTHk3-G361X- SENSE:5′-TGTACAGCGATGCTGCTACTNCTACCTACTCTTCGTCCAGTTCHk3-T362R-ANTISENSE:5′-GTCGAACTGGACGAAGAGTATCTGCCAGTAGCAGCATCGCTGHk3-S364X-SENSE:5′- TGCTGCTACTGGCACCTACNNKTCGTCCAGTTCGACTTATAGHk3-S365X-SENSE:5′-TGCTACTGGCACCTACTCTNNKTCCAGTTCGACTTATAGTAGHk3-S366T-ANTISENSE:5′-ATGCTACTATAAGTCGAACTAGTCGAAGAGTAGGTGCCAGTAHk3-S368X-ANTISENSE:5′-TCTACAATGCTACTATAAGTAGNACTGGACGAAGAGTAGGTGHk3-T369X-SENSE:5′-CTACTCTTCGTCCAGTTCGNNKTATAGTAGCATTGTAGATGCCHk3- S371X-ANTISENSE:5′-TTCACGGCATCTACAATGCTATNATAAGTCGAACTGGACGAAGHk3-S372X-SENSE:5′-CGTCCAGTTCGACTTATAGTNNTATTGTAGATGCCGTGAAGAC
向DNA酶處理的DNA與寡聚核苷酸的混合物中添加核苷酸、PCR緩沖液和Taq/PWo聚合酶。實(shí)施PCR裝配反應(yīng)，條件為首先94℃ 2分鐘，然后94℃30秒、45℃30秒、72℃ 60秒共進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)；再以72℃ 5分鐘結(jié)束。
以1μl裝配反應(yīng)物為模板，并加入與AMG基因側(cè)翼區(qū)退火的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。參數(shù)為首先94℃ 2分鐘，然后以94℃ 30秒、55℃30秒、72℃ 90秒進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)；再以72℃ 10分鐘結(jié)束。
所得PCR稱為在1％瓊脂糖凝膠上純化，與線性載體混合并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的酵母細(xì)胞中，如上述。
實(shí)施例4比活性如上實(shí)施例1所述構(gòu)建AMG G32變體。以Kcat表示的比活性在純化樣品上，以pH4.3,37℃的條件，用麥芽糖和麥芽糖庚糖為底物，如在“材料和方法”部分所述進(jìn)行測(cè)定。以AGU/mg表示的比活性也在pH4.3,37℃，用麥芽糖為底物，如在“材料和方法”部分所述進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)施例5在70℃時(shí)的熱穩(wěn)定性用實(shí)施例1所述方法構(gòu)建一個(gè)AMG G2 S119P變體。
按上文“材料和方法”一節(jié)中所述，使用方法Ⅰ將熱穩(wěn)定性測(cè)定為T1/2，在50mM NaOAc,pH4.5,70℃,0.2AGU/ml中保溫30分鐘之后將熱穩(wěn)定性測(cè)定為％殘留活性。試驗(yàn)結(jié)果列于下表，并將試驗(yàn)結(jié)果與野生型黑曲霉AMG G2相比。
實(shí)施例668℃時(shí)的熱穩(wěn)定性使用實(shí)施例3所述的方法構(gòu)建AMG G2變體，但下表中的第1和2號(hào)變體是通過按WO 95/22625所述進(jìn)行改組而制備的(Affymax Technologies N.V.)。
按上文“材料和方法”一節(jié)中所述，于68℃使用方法Ⅰ將熱穩(wěn)定性測(cè)定為T1/2，并與相同條件下的野生型黑曲霉AMGG2比較。過濾上清液之后對(duì)培養(yǎng)物肉湯進(jìn)行變體評(píng)價(jià)。
純化樣品在70℃的熱穩(wěn)定性
實(shí)施例7在68℃的熱穩(wěn)定性用實(shí)施例3所述方法并隨后改組陽性變體，從而構(gòu)建AMG G2變體。
如“材料和方法”部分所述以方法Ⅰ測(cè)定在68℃時(shí)的T1/2以示熱穩(wěn)定性，并與同樣條件下的野生型黑曲霉AMG G2相比較。將培養(yǎng)液上清過濾后實(shí)施對(duì)變體的評(píng)估。
i為N末端延伸實(shí)施例8在68℃的熱穩(wěn)定性用實(shí)施例3所述方法構(gòu)建AMG G2變體。如“材料和方法”部分所述以方法Ⅰ測(cè)定在68℃時(shí)的T1/2以示熱穩(wěn)定性，并與同樣條件下的野生型黑曲霉AMG G2相比較。將培養(yǎng)液上清過濾后實(shí)施對(duì)變體的評(píng)估。
實(shí)施例9在70℃的熱穩(wěn)定性用實(shí)施例1所述方法構(gòu)建AMG G2變體，并評(píng)價(jià)為半純化樣品(將培養(yǎng)液過濾，再于G-25上脫鹽)。
用方法Ⅰ在50mM NaOAc,pH 4.5,70℃，如以上“材料和方法”部分所述將熱穩(wěn)定性測(cè)定為殘留活性的百分率。檢驗(yàn)結(jié)果列于下表，并與黑曲霉AMG G2比較。
實(shí)施例10 在70℃時(shí)有30％葡萄糖存在的情況下的熱穩(wěn)定性用實(shí)施例3的方法構(gòu)建AMG G2變體。
用方法Ⅱ在70℃如“材料和方法”所述將熱穩(wěn)定性測(cè)定為T1/2，并與同樣條件下的野生型黑曲霉AMG G2比較。
實(shí)施例11 分別對(duì)AMG變體S119P+Y402F+S411V和PLASD(N末端)+V59A+A393R+T490A實(shí)施糖化AMG變體S119P+Y402F+S411V和PLASD(N末端)+V59A+A393R+T490A均具有改良的熱穩(wěn)定性，分別對(duì)它們實(shí)施糖化，在70℃時(shí)如下述進(jìn)行檢驗(yàn)。
參照酶為野生型黑曲霉AMG G2。
糖化條件如下底物 10DE麥芽糖糊精，約30％DS(w/w)溫度 70℃起始pH4.3(在70℃)酶的用量 0.24AGU/g DS糖化糖化底物通過將(從普通玉米制備的)麥芽糖糊精溶于100℃的Milli-Q水中，并將底物干重調(diào)為約30％(w/w)。pH調(diào)為4.3。將相當(dāng)于15g干物質(zhì)的底物轉(zhuǎn)移至50ml蘭帽玻璃燒瓶中，并于水浴中攪拌。加入酶，必要時(shí)重新調(diào)整pH。做平行實(shí)驗(yàn)。定期取樣，在HPLC上分析糖的組成。
序列表(1)序列資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名NOVO NORDISK A/S(B)街道Novo Alle(C)城市DK-2880 Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵編DK-2880(G)電話+45 4444 8888(H)電傳+45 4449 3256(ⅱ)發(fā)明標(biāo)題葡糖淀粉酶變體(ⅲ)序列數(shù)81(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1605個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“cDNA”(ⅵ)來源(B)菌株黑曲霉(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞信號(hào)肽(B)位置1..72(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置73..1602(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置1..1602(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC ACA GGG 48Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24 -20 -15 -10TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC CCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC 96Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-5 1 5AAC GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC CTG AAT AAC ATC GGG GCG 144Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20GAC GGT GCT TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC ATT GTC GTT GCT AGT 192Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40CCC AGC ACG GAT AAC CCG GAC TAC TTC TAC ACC TGG ACT CGC GAC TCT 240Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55GGT CTC GTC CTC AAG ACC CTC GTC GAT CTC TTC CGA AAT GGA GAT ACC 288Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70AGT CTC CTC TCC ACC ATT GAG AAC TAC ATC TCC GCC CAG GCA ATT GTC 336Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val75 80 85CAG GGT ATC AGT AAC CCC TCT GGT GAT CTG TCC AGC GGC GCT GGT CTC 384Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu90 95 100GGT GAA CCC AAG TTC AAT GTC GAT GAG ACT GCC TAC ACT GGT TCT TGG 432Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120GGA CGG CCG CAG CGA GAT GGT CCG GCT CTG AGA GCA ACT GCT ATG ATC 480Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135GGC TTC GGG CAG TGG CTG CTT GAC AAT GGC TAC ACC AGC ACC GCA ACG 528Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150GAC ATT GTT TGG CCC CTC GTT AGG AAC GAC CTG TCG TAT GTG GCT CAA 576Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165TAC TGG AAC CAG ACA GGA TAT GAT CTC TGG GAA GAA GTC AAT GGC TCG 624Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180TCT TTC TTT ACG ATT GCT GTG CAA CAC CGC GCC CTT GTC GAA GGT AGT 672Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200GCC TTC GCG ACG GCC GTC GGC TCG TCC TGC TCC TGG TGT GAT TCT CAG 720Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215GCA CCC GAA ATT CTC TGC TAC CTG CAG TCC TTC TGG ACC GGC AGC TTC 768Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230ATT CTG GCC AAC TTC GAT AGC AGC CGT TCC GGC AAG GAC GCa AAC ACC 816Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245CTC CTG GGa AGC ATC CAC ACC TTT GAT CCT GAG GCC GCA TGC GAC GAC 864Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260TCC ACC TTC CAG CCC TGC TCC CCG CGC GCG CTC GCC AAC CAC AAG GAG 912Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280GTT GTA GAC TCT TTC CGC TCA ATC TAT ACC CTC AAC GAT GGT CTC AGT 960Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser285 290 295GAC AGC GAG GCT GTT GCG GTG GGT CGG TAC CCT GAG GAC ACG TAC TAC 1008Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu ASp Thr Tyr Tyr300 305 310AAC GGC AAC CCG TGG TTC CTG TGC ACC TTG GCT GCC GCA GAG CAG TTG 1056Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu315 320 325TAC GAT GCT CTA TAC CAG TGG GAC AAG CAG GGG TCG TTG GAG GTC ACA 1104Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp ASp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340GAT GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT 1152Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360GGC ACC TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT AGT AGC ATT GTA GAT GCC 1200Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370 375GTG AAG ACT TTC GCC GAT GGC TTC GTC TCT ATT GTG GAA ACT CAC GCC 1248Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390GCA AGC AAC GGC TCC ATG TCC GAG CAA TAC GAC AAG TCT GAT GGC GAG 1296Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405CAG CTT TCC GCT CGC GAC CTG ACC TGG TCT TAT GCT GCT CTG CTG ACC 1344Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420GCC AAC AAC CGT CGT AAC TCC GTC GTG CCT GCT TCT TGG GGC GAG ACC 1392Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440TCT GCC AGC AGC GTG CCC GGC ACC TGT GCG GCC ACA TCT GCC ATT GGT 1440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450 455ACC TAC AGC AGT GTG ACT GTC ACC TCG TGG CCG AGT ATC GTG GCT ACT 1488Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470GGC GGC ACC ACT ACG ACG GCT ACC CCC ACT GGA TCC GGC AGC GTG ACC 1536Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485TCG ACC AGC AAG ACC ACC GCG ACT GCT AGC AAG ACC AGC ACC ACG ACC 1584Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 495 500CGC TCT GGT ATG TCA CTG TGA 1605Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度534個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24 -20 -15 -10Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-5 15Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val75 80 85Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu90 95 100Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser285 290 295Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr300 305 310Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu315 320 325Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370 375Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450 455Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 495 500Arg Ser Gly Met Set Leu505 510(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物7258”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac20(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物21401”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgccttggacctgcg ttatagcc 68(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物10758l”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5gcaacgaagc gcccgtggct cgtac25(2)SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度109個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/dese=“引物FAMGⅡ”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置30,33,42,44,47,48,51,53,56,57,58,62,63,66,69,71,72,73,74,75(D)其它資料/Note=
1:A10,C902:A6,T943:A95,C54:G95,C55:G91,A3,T3,C36:G95,A3,C27:G3,A95,C28:G92,A4,T49:A3,T9710:G95,T511:G3,A9712:G95,A2,C313:TS,C9514:G88,A8,C415:G7,A9316:G4,C9617:G4,A9618:G95,A2,C3(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6CGAAGCGACC GTGGCTCGTA CTGCCATC12 TA3TAACATC G4GSCG67CG4T8CT91010GT G1112CG4CG13G 1415161718TGGCA TTGTCGTTGCTAGTCCCAGC ACGGATAAC 109(2)SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物RAMG1”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7GATGGCAGTA CGAGCCACGG TCGCTTCG28(2)SEQ ID NO:8的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度110個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物FAMGIV”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征位置22,23,24,25,26,28,31,32,34,35,37,40,41,43,44,46,47,49,55,56,59,60,61,62,67,68,70,71,74,77,79,80,85,86,87(D)其它資料/Note=1:G91,A3,T3,C32:A13,C873:A40,T604:G3,A3,C945:A6,T946:G4,A4,T927:G2,A96,C28:G93,A3.5,C3.59:G87,A8,C510:A84,C1611:G93,T712:G92,A5,T313:A3,C9714:G3,A9715:G2,A2,T4,C9216:G93,A717:G93,C718:A90,T1019:G4,A9620:G95,A521:G96,A422:G3,C9723:G2,A1,T95,C224:A3,C97
25:G95,A3,C226:G2,A96,C227:A5,C9528:A95,T529:G2,A9830:G94,A4,C231:G94,A3,T1,C232:A4,T9633:A20,C80(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8GTGTCGCTGG ACTTCTTCAA G12345A6AC 78C910T11CT1213T1415A1617C18C CTAC1920TA2122 2324CAGT1425C2627GT28TA16T2930 CATT313233GAT GCCCGTGAAGA CTTTCGCCGA 110(2)SEQ ID NO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物RAMGVI”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9CTTGAAGAAG TCCAGCGACA C21(2)SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物FG2”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10CATCCCCAGG ATCCTTACTC AGCAATG 27(2)SEQ ID NO:11的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc=“引物RG2”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11CTCAAACGAC TCACCAGCCT CTAGAGT27<210>12<211>2602<212>DNA<213>黑曲霉<220>
<22l>信號(hào)肽<222>(270)…(323)<221>成熟肽<222>(342)…(2438)<221>內(nèi)含子<222>(484)…(558)<221>內(nèi)含子<222>(846)…(900)<221>內(nèi)含子<222>(998)…(1058)<221>內(nèi)含子<222>(1697)…(1754)<400>12ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa actgaagagc ttgaagtggc gagatgtctc 60tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt gatgcatgtg 120cttcttcctt cagcttcccc tcgtgcgagt gaggtttggc tataaattga agtggttggt 180cggggttccg tgaggggctg aagtgcttcc tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc 240ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg 300gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt 360tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg 420cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg 480actgtatgtt tcgagctcag atttagtatg agtgtgtcat tgattgattg atgctgactg 540gcgtgtcgtt tgttgtagac ttctacacct ggactcgcga ctctggtctc gtcctcaaga 600ccctcgtcga tctcttccga aatggagata ccagtctcct ctccaccatt gagaactaca 660tctccgccca ggcaattgtc cagggtatca gtaacccctc tggtgatctg tccagcggcg 720ctggtctcgg tgaacccaag ttcaatgtcg atgagactgc ctacactggt tcttggggac 780ggccgcagcg agatggtccg gctctgagag caactgctat gatcggcttc gggcagtggc 840tgcttgtatg ttctccaccc ccttgcgtct gatctgtgac atatgtagct gactggtcag 900gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc ccctcgttag gaacgacctg 960tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatggtg tgtttgtttt attttaaatt1020tccaaagatg cgccagcaga gctaacccgc gatcgcagat ctctgggaag aagtcaatgg1080ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt gtcgaaggta gtgccttcgc1140gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag gcacccgaaa ttctctgcta1200cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac ttcgatagca gccgttccgg1260caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt gatcctgagg ccgcatgcga1320cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc aaccacaagg aggttgtaga1380ctctttccgc tcaatctata ccctcaacga tggtctcagt gacagcgagg ctgttgcggt1440gggtcggtac cctgaggaca cgtactacaa cggcaacccg tggttcctgt gcaccttggc1500tgccgcagag cagttgtacg atgctctata ccagtgggac aagcaggggt cgttggaggt1560cacagatgtg tcgctggact tcttcaaggc actgtacagc gatgctgcta ctggcaccta1620ctcttcgtcc agttcgactt atagtagcat tgtagatgcc gtgaagactt tcgccgatgg1680cttcgtctct attgtggtaa gtctacgcta gacaagcgct catgttgaca gagggtgcgt1740actaacagaa gtaggaaact cacgccgcaa gcaacggctc catgtccgag caatacgaca1800agtctgatgg cgagcagctt tccgctcgcg acctgacctg gtcttatgct gctctgctga1860ccgccaacaa ccgtcgtaac tccgtcgtgc ctgcttcttg gggcgagacc tctgccagca1920gcgtgcccgg cacctgtgcg gccacatctg ccattggtac ctacagcagt gtgactgtca1980cctcgtggcc gagtatcgtg gctactggcg gcaccactac gacggctacc cccactggat2040ccggcagcgt gacctcgacc agcaagacca ccgcgactgc tagcaagacc agcaccagta2100cgtcatcaac ctcctgtacc actcccaccg ccgtggctgt gactttcgat ctgacagcta2160ccaccaccta cggcgagaac atctacctgg tcggatcgat ctctcagctg ggtgactggg2220aaaccagcga cggcatagct ctgagtgctg acaagtacac ttccagcgac ccgctctggt2280atgtcactgt gactctgccg gctggtgagt cgtttgagta caagtttatc cgcattgaga2340gcgatgactc cgtggagtgg gagagtgatc ccaaccgaga atacaccgtt cctcaggcgt2400gcggaacgtc gaccgcgacg gtgactgaca cctggcggtg acaatcaatc catttcgcta2460tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc atgtatgtag tgggtgtgca2520taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat cgaccgacgg aattgaggat2580atccggaaat acagacaccg gg 2602<210>SEQ ID NO:13<211>長(zhǎng)度640<212>類型PRT<213>生物體黑曲霉<400> SEQ ID NO:13Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly15 10 15Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser20 25 30Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala35 40 45Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser50 55 60Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser65 70 75 80Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr85 90 95Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val100 105 110Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu115 120 125Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp130135 140Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile145 150 155 160Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr165 170 175Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln180 185 190Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser195 200 205Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser210 215 220Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln225 230235 240Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe245 250255Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr260 265 270Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp275 280 285Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu290 295 300Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser305 310 315 320Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr325 330 335Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu340 345 350Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly SerLeu Glu Val Thr355 360 365Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr370 375 380Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala385 390 395 400Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala405 410 415Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu420 425 430Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr435 440 445Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr450 455 460Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly465 470 475 480Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr485 490 495Gly Gly Thr Thr Thr Thr A la Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr500 505 510Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr515 520 525Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp530 535 540Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser545 550 555 560Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser565 570 575Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr580 585 590Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser595 600 605Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val610 615 620Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg625 630 635640<210>SEQ ID NO:14<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列atgtgatttc caagcgcgcg vnnttggatt catggttgag caa43<220>特征<223>其它資料引物HK1-T2X<400>SEQ ID NO:14<210>SEQ ID NO:15<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-N9X<400>SEQ ID NO:15ccttggattc atggttgagc vnngaagcga ccgtggctcg tac 43<210>SEQ ID NO:16<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-A11X<400>SEQ ID NO:16attcatggtt gagcaacgaa vnnaccgtgg ctcgtactgc cat 43<210>SEQ ID NO:17<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-L66X<400>SEQ ID NO:17tcctcaagac cctcgtcgat vnnttccgaa atggagatac cag43<210>SEQ ID NO:18<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-S386X<400>SEQ ID NO:18ctttcgccga tggcttcgtc vnnattgtgg aaactcacgc cgc 43<210>SEQ ID NO:19<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-E389X<400>SEQ ID NO:19atggcttcgtctctattgtg vnnactcacg ccgcaagcaa cgg 43<210>SEQ ID NO:20<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-T390X<400>SEQ ID NO:20GCTTCGTCTC TATTGTGGAA VNNCACGCCG CAAGCAACGG CTC43<210>SEQ ID NO:21<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-A393Xctattgtgga aactcacgcc vnnagcaacg gctccatgtc cga 43<400>SEQID NO:21<210>SEQ ID NO:22<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-S394X
<400>SEQ ID NO:22ttgtggaaac tcacgccgca vnnaacggct ccatgtccga gca43<210>SEQ ID NO:23<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-N395X<400>SEQ ID NO:23tggaaactca cgccgcaagc vnnggctcca tgtccgagca ata43<210>SEQ ID NO:24<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-G296X<400>SEQ ID NO:24aaactcacgc cgcaagcaac vnntccatgt ccgagcaata cga43<210>SEQ ID NO:25<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-K404X<400>SEQ ID NO:25ccatgtccga gcaatacgac vnntctgatg gcgagcagct ttc43<210>SEQ ID NO:26<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-D406X<400>SEQ ID NO:26ccgagcaata cgacaagtct vnnggcgagc agctttccgc tcg43<210>SEQ ID NO:27<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-E408X<400>SEQ ID NO:27aatacgacaa gtctgatggc vnncagcttt ccgctcgcga cct43<210>SEQ ID NO:28<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-L410X<400>SEQ ID NO:28acaagtctga tggcgagcag vnntccgctc gcgacctgac ct 42<210>SEQ ID NO:29<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-L423X<400>SEQ ID NO:29cctggtctta tgctgctctg vnnaccgcca acaaccgtcg taa43<210>SEQ ID NO:30<211>長(zhǎng)度44<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-N426X<400>SEQ ID NO:30atgctgctct gctgaccgcc vnnaaccgtc gtaactccgt cgtg 44<210>SEQ ID NO:31<211>長(zhǎng)度44<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-N427X<400>SEQ ID NO:31CTGCTCTGCT GACCGCCAAC VNNCGTCGTA ACTCCGTCGT GCCT 44<210>SEQ ID NO:32<211>長(zhǎng)度46<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-Y402X<400>SEQ ID NO:32ACGGCTCCAT GTCCGAGCAA NNCGACAAGT CTGATGGCGA GCAGCT 46<210>SEQ ID NO:33<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-L234X-有義<400>SEQ ID NO:33ctggaccggc agcttcattn nkgccaactt cgatagcagc c41<210>SEQ ID NO:34<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-A235X-反義<400>SEQ ID NO:34gaacggctgc tatcgaagtt agacagaatg aagctgccgg tc42<210>SEQ ID NO:35<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-NF237X-有義<400>SEQ ID NO:35cagcttcatt ctggccaacn atgatagcag ccgttccggc a41<210>SEQ ID NO:36<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-D238T-反義<400>SEQ ID NO:36ccttgccgga acggctgcta gtgaagttgg ccagaatgaa gc42<210>SEQ ID NO:37<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-D238S-反義<400>SEQ ID NO:37ccttgccgga acggctgcta gagaagttgg ccagaatgaa gc 42<210>SEQ ID NO:38<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-S239X-有義<400>SEQ ID NO:38tcattctggc caacttcgat nncagccgtt ccggcaagga cg42<210>SEQ ID NO:39<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-S240G-反義<400>SEQ ID NO:39ttgcgtcctt gccggaacga ccgctatcga agttggccag aa42<210>SEQ ID NO:40<211>長(zhǎng)度41
<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-S242X-反義<400>SEQ ID NO:40gggtgtttgc gtccttgcca knacggctgc tatcgaagtt g41<210>SEQ ID NO:41<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-G243X-反義<400>SEQ ID NO:41ggaggcgtgtt tgcgtcctta knggaacggc tgctatcgaa g 41<210>SEQ ID NO:42<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-K244R-有義<400>SEQ ID NO:42cgatagcagc cgttccggca gagacgcaaa caccctcctg g41<210>SEQ ID NO:43<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-T310V-反義<400>SEQ ID NO:43acgggttgcc gttgtagtaa acgtcctcag ggtaccgacc c41<210>SEQ ID NO:44<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-T310S-反義<400>SEQ ID NO:44acgggttgcc gttgtagtaa gagtcctcag ggtaccgacc c 41<210>SEQ ID NO:45<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-Y311N-有義<400>SEQ ID NO:45tcggtaccct gaggacacga attacaacgg caacccgtgg t41<210>SEQ ID NO:46<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-Y312Q-反義<400>SEQ ID NO:46ggaaccacgg gttgccgttt tggtacgtgt cctcagggta c<210>SEQ ID NO:47<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-Y312N-反義<400>SEQ ID NO:47ggaaccacgg gttgccgtta ttgtacgtgt cctcagggta c41<210>SEQ ID NO:48<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N313T-有義<400>SEQ ID NO:48ccctgaggac acgtactaca ctggcaaccc gtggttcctg t 41<210>SEQ ID NO:49<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N313S-有義<400>SEQ ID NO:49ccctgaggac acgtactact ctggcaaccc gtggttcctg t41<210>SEQ ID NO:50<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N313G-有義<400>SEQ ID NO:50ccctgaggac acgtactacg gtggcaaccc gtggttcctg t 41<210>SEQ ID NO:51<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N315Q-反義<400>SEQ ID NO:51aggtgcacag gaaccacggt tggccgttgt agtacgtgtc c41<210>SEQ ID NO:52<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N315E-反義<400>SEQ ID NO:52aggtgcacag gaaccacggt tcgccgttgt agtacgtgtc c41<210>SEQ ID NO:53<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N315R-反義<400>SEQ ID NO:53aggtgcacag gaaccacggt ctgccgttgt agtacgtgtc c41<210>SEQ ID NO:54<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-F318Y-反義<400>SEQ ID NO:54cggcagccaa ggtgcacaga taccacgggt tgccgttgta g41<210>SEQ ID NO:55<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-Q409P-有義<400>SEQ ID NO:55cgacaagtct gatggcgagc cactttccgc tcgcgacctg a41<210>SEQ ID NO:56<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-D336X-有義<400>SEQ ID NO:56cgatgctcta taccagtggn nkaagcaggg gtcgttggag g41<210>SEQ ID NO:57<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-K336X-有義<400>SEQ ID NO:57tgctctatac cagtgggacn nkcaggggtc gttggaggtc a41<210>SEQ ID NO:58<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-Q338X-反義
<400>SEQ ID NO:58ctgtgacctc caacgacccg nncttgtccc actggtatag a41<210>SEQ ID NO:59<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-G339X-有義<400>SEQ ID NO:59ataccagtgg gacaagcagn cutcgttgga ggtcacagat g41<210>SEQ ID NO:60<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S340X-反義<400>SEQ ID NO:60acacatctgt gacctccaaa ntcccctgct tgtcccactg g41<210>SEQ ID NO:61<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S340C-反義<400>SEQ ID NO:61acacatctgt gacctccaaa nccccctgct tgtcccactg g41<210>SEQ ID NO:62<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-L341X-有義<400>SEQ ID NO:62gtgggacaag caggggtcgn uugaggtcac agatgtgtcg c 41<210>SEQ ID NO:63<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-K352Q-有義<400>SEQ ID NO:63tgtgtcgctg gacttcttcc aagcactgta cagcgatgct g41<210>SEQ ID NO:64<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-K352R-有義<400>SEQ ID NO:64tgtgtcgctg gacttcttca gagcactgta cagcgatgct g 41<210>SEQ ID NO:65<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-A352D-反義<400>SEQ ID NO:65tagcagcatc gctgtacaga tccttgaaga agtccagcga c41<210>SEQ ID NO:66<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-A353S-反義<400>SEQ ID NO:66tagcagcatc gctgtacaga gacttgaaga agtccagcga c41<210>SEQ ID NO:67<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S356P-有義<400>SEQ ID NO:67acttcttcaag gcactgtacc cagatgctgc tactggcacc t 41<210>SEQ ID NO:68<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S356N-有義<400>SEQ ID NO:68acttcttcaa ggcactgtac aaugatgctg ctactggcac cta43<210>SEQ ID NO:69<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S356X-有義<400>SEQ ID NO:69acttcttcaa ggcactgtac gaugatgctg ctactggcac cta43<210>SEQ ID NO:70<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-D357S-反義<400>SEQ ID NO:70gagtaggtgc cagtagcagc agagctgtac agtgccttga aga43<210>SEQ ID NO:71<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-A359S-有義<400>SEQ ID NO:71ggcactgtac agcgatgctt ctactggcac ctactcttcg t41<210>SEQ ID NO:72<211>長(zhǎng)度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-T360V-反義<400>SEQ ID NO:72tggacgaaga gtaggtgcca acagcagcat cgctgtacag t41<210>SEQ ID NO:73<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-G361X-有義<400>SEQ ID NO:73tgtacagcga tgctgctact nctacctact cttcgtccag ttc 43<210>SEQ ID NO:74<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-T362R-反義<400>SEQ ID NO:74gtcgaactgg acgaagagta tctgccagta gcagcatcgc tg42<210>SEQ ID NO:75<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S364X-有義<400>SEQ ID NO:75tgctgctact ggcacctacn nktcgtccag ttcgacttat ag42<210>SEQ ID NO:76<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S365X-有義<400>SEQ ID NO:76tgctactggc acctactctn nktccagttc gacttatagt ag42<210>SEQ ID NO:77<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S366T-反義<400>SEQ ID NO:77atgctactat aagtcgaact agtcgaagag taggtgccag ta42<210>SEQ ID NO:78<211>長(zhǎng)度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S368X-反義<400>SEQ ID NO:78tctacaatgc tactataagt agnactggac gaagagtagg tg 42<210>SEQ ID NO:79<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-T369X-有義<400>SEQ ID NO:79ctactcttcg tccagttcgn nktatagtag cattgtagat gcc43<210>SEQ ID NO:80<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S371X-反義<400>SEQ ID NO:80ttcacggcat ctacaatgct atnataagtc gaactggacg aag43<210>SEQ ID NO:81<211>長(zhǎng)度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S372X-有義<400>SEQ ID NO:81cgtccagttc gacttatagt nntattgtag atgccgtgaa gac 4權(quán)利要求
1．親代葡糖淀粉酶的變體，其在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的下列位置或區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變區(qū)域1-18，區(qū)域19-35，區(qū)域40-62，區(qū)域73-80，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域334-341，區(qū)域353-374，區(qū)域388-414，區(qū)域445-470，和/或在與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少60％同源的同源性葡糖淀粉酶的相應(yīng)位置或區(qū)域具有上述一個(gè)或多個(gè)突變，另外還具有下列取代N20C,A27C,S30P,Y48W,Y50F,W52F,R54K/L,D55G/V,G57A,K108R,D112Y,Y116A/W,S119C/W/E/G/Y/P,W120H/L/F/Y,G121T/A,R122Y,P123G,Q124H,R125K,W170F,N171S,Q172N,T173G,G174C,Y175F,D176N/E,L177H/D,W178R/D,E179Q/D,E180D/Q,V181D/A/T,N182A/D/Q/Y/S,G183K,S184H,W212F,R241K,A246C,D293E/Q,A302V,R305K,Y306F,D309N/E,Y312W,W317F,E389D/Q,H391W,A392D,A393P,N395Q,G396S,E400Q/C,Q401E,G407D,E408P,L410F,S411A/G/C/H/D,S460P。
2．權(quán)利要求1的變體，其中變體含有一個(gè)或多個(gè)下列突變A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/E,I18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53D,S56A/C,V59T/A,L60A,N93T,P94V,S95N,D97S,L98P/S,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246T Y312Q,N313T/S/G,A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,L410I/R,S411V,A412C,D414A,G447S,S465P.
3．具有改良的熱穩(wěn)定性的親代葡糖淀粉酶變體，其在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的下列位置或區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變區(qū)域1-18，區(qū)域19-35，區(qū)域73-80，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域334-341，區(qū)域353-374，區(qū)域388-414，區(qū)域445-470，和/或在與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少60％同源的同源性葡糖淀粉酶的相應(yīng)位置或區(qū)域具有上述一個(gè)或多個(gè)突變，另外還具有下列取代N20C,A27C,S30P,A246C。
4．具有提高的比活性的親代葡糖淀粉酶變體，其在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的下列位置或區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變區(qū)域1-18，區(qū)域40-62，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域388-414，和/或在與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少60％同源的同源性葡糖淀粉酶的相應(yīng)位置或區(qū)域具有上述一個(gè)或多個(gè)突變，另外還具有下列取代S411G。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的變體，其在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的下列區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變區(qū)域287-300區(qū)域305-319和/或在與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少60％同源的同源性葡糖淀粉酶的相應(yīng)位置或區(qū)域具有上述一個(gè)或多個(gè)突變。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)的變體，其中親代同源性葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶。
7．根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)的變體，其中葡糖淀粉酶是截短的，尤其是C末端截短的葡糖淀粉酶。
8．DNA構(gòu)建體，其含有編碼權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。
9．重組表達(dá)載體，其攜有根據(jù)權(quán)利要求8的DNA構(gòu)建體。
10．細(xì)胞，所述細(xì)胞被根據(jù)權(quán)利要求8的DNA構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)化。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞，其為微生物，如細(xì)菌或真菌。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)胞，其為蛋白酶缺損的米曲霉或黑曲霉。
13．轉(zhuǎn)化淀粉或?qū)⒌矸鄄糠炙獬珊咸烟堑臐{液的方法，所述方法包括在根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體的存在下糖化淀粉水解液的步驟。
14．權(quán)利要求14的方法，其中葡糖淀粉酶的劑量范圍為0.05至0.5AGU/g干固體。
15．權(quán)利要求13或14的方法，其包括糖化干固體重量比至少30％的淀粉水解液。
16．上述任一權(quán)利要求的方法，其中在選自支鏈淀粉酶和異淀粉酶，優(yōu)選為得自Bacillus acidopullulyticus或Bacillus deramificans的支鏈淀粉酶或得自淀粉皮假單胞菌的異淀粉酶的脫支酶存在下進(jìn)行糖化。
17．上述任一權(quán)利要求的方法，其中在pH3至5.5,60至80℃，優(yōu)選為63至75℃的溫度下糖化24至72小時(shí)，優(yōu)選在pH4至4.5中糖化36至48小時(shí)。
18．糖化液化淀粉溶液的方法，所述方法包括步驟(ⅰ)糖化步驟，在該步驟中，發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)酶促糖化過程，隨后的步驟是(ⅱ)一個(gè)或多個(gè)高溫膜分離步驟，其中使用根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體進(jìn)行酶促糖化。
19．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉(zhuǎn)化過程中的用途。
20．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在淀粉連續(xù)轉(zhuǎn)化過程中的用途。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中淀粉連續(xù)轉(zhuǎn)化過程包括根據(jù)權(quán)利要求18的連續(xù)糖化方法。
22．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)寡糖的方法中的用途。
23．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)特制漿液的方法中的用途。
24．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)燃料用乙醇的方法中的用途。
25．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在生產(chǎn)飲料的方法中的用途。
26．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的葡糖淀粉酶變體在發(fā)酵生產(chǎn)諸如檸檬酸，抗壞血酸，賴氨酸，谷氨酸等有機(jī)化合物的方法中的用途。
27．改良親代葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性和/或增加其比活性的方法，所述方法包括在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)下列位置或區(qū)域中進(jìn)行突變區(qū)域1-18，區(qū)域19-35，區(qū)域40-62，區(qū)域73-80，區(qū)域93-127，區(qū)域170-184，區(qū)域200-212，區(qū)域234-246，區(qū)域287-319，區(qū)域334-341，區(qū)域353-374，區(qū)域388-414，區(qū)域445-470，和/或在與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少60％同源的同源性葡糖淀粉酶的相應(yīng)位置或區(qū)域進(jìn)行上述突變。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的方法。其具有一個(gè)或多個(gè)下列取代A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/E,I18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53D,S56A/C,V59T/A,L60A,N93T,P94V,S95N,D97S,L98P/S,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246T Y312Q,N313T/S/G,A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,L410I/R,S411V,A412C,D414A,G447S,S465P。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種親本真菌葡糖淀粉酶的變體,其熱穩(wěn)定性已增強(qiáng)且/或?qū)μ穷惖孜锏睦玫奶禺愋曰钚砸言鰪?qiáng)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1309700SQ9980865
公開日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月15日
發(fā)明者比賈恩·R·尼爾森, 阿倫·斯文德森, 亨里克·佩德森, 杰斯珀·文德, 漢尼·V·亨德里克森, 托本·P·弗蘭德森 申請(qǐng)人:諾維信公司