專利名稱：植物中孢母細胞或性母細胞形成的控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物能育性相關(guān)的基因及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明尤其涉及參與植物性母細胞形成的基因及其編碼的蛋白質(zhì)的應用，以使植物能結(jié)無籽果實和/或無花粉花。
在擬南芥中，孢子發(fā)生和配子發(fā)生(也分別稱為大孢子發(fā)生和雌配子發(fā)生)已被詳細闡述。參見Bowman,J.,1994,Arabidopsis,An Atlasof Morphology and Development。在孢子發(fā)生中，雙珠被胚珠與薄珠心胚珠在植物子房(心皮)胎座上作為類指狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。在胚珠原基頂部單個下皮細胞比相鄰細胞更突出，這是由于其略大的大小，更密集的細胞質(zhì)及更明顯的細胞核，并在10～11朵花時期分化為孢原細胞。孢原細胞然后縱向延伸和極化其細胞成分，并分化為孢母細胞或大孢子母細胞(MMC)。MMC然后經(jīng)過減數(shù)分裂形成四個單倍體大孢子(四聯(lián)體)。在11朵花時期可見到孢原細胞稍后，在珠心基底的表皮細胞中形成內(nèi)層和外層珠被。在配子發(fā)生中，外層珠被生長超過內(nèi)層珠被，外層和內(nèi)層珠被均包被珠心，珠心中雌配子體(胚囊)在13朵花時期發(fā)育。在成熟時期，內(nèi)層珠被的內(nèi)層細胞分化為營養(yǎng)內(nèi)皮(珠被絨氈層)。
盡管已熟知以上內(nèi)容，但關(guān)于調(diào)節(jié)與控制孢子發(fā)生，尤其性母細胞形成的分子與遺傳機制還了解得很少。鑒別調(diào)節(jié)與控制性母細胞形成的基因有助于了解這些機制，及發(fā)現(xiàn)操縱植物能育性的方式。
因此本發(fā)明的一方面是提供參與植物性母細胞形成中的分離的核酸及其編碼的蛋白質(zhì)，其可用于操縱植物的能育性。
本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)一種植物，其中性母細胞形成已在生長期間被影響，以使植物能結(jié)包括無籽果實和/或無花粉花的改變的果實和/或花。
根據(jù)本發(fā)明的一實施方案，提供了編碼參與植物性母細胞形成中的蛋白質(zhì)的分離的核酸及其互補序列。這些分離的核酸包括分離自Arabidopsis thaliana生態(tài)型landsberg erecta植物及其它植物物種的SPL基因的DNA，或其一部分。本發(fā)明還提供了擬南芥和其它植物物種的SPL基因的同系物，其能與SPL基因的DNA雜交。這些同系物具有SPL類型的功能并可從整個植物界中被鑒別。
根據(jù)本發(fā)明的DNA可以各種形式存在，包括編碼調(diào)節(jié)或控制植物性母細胞形成的蛋白質(zhì)的外源DNA。
本發(fā)明的DNA可以是已通過突變或其它方式改變以影響植物中性母細胞形成的外源基因。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了遺傳因子的插入，如Ds序列(具有或不具有活性Ac序列)插入上述核酸中。
本發(fā)明還提供了負責性母細胞形成的植物內(nèi)源DNA的改變或突變，可通過直接或定向誘變，或其它也可影響性母細胞形成的技術(shù)進行。含有這種突變的基因的植物可以結(jié)無籽果實和/或無花粉花。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了參與植物中性母細胞形成的多肽或蛋白質(zhì)，這些多肽或蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)或控制性母細胞形成，其包括植物來源的SPL蛋白或其部分。本發(fā)明也包括來自大多數(shù)或全部植物物種的SPL蛋白，這些蛋白質(zhì)的具有相同或相似的SPL蛋白調(diào)節(jié)功能(即性母細胞形成)的同系物。本文中同源多肽定義為具有與圖3所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)具有至少80％或更高同源性的氨基酸序列的多肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及與本文描述的多肽和蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，這種抗體可用于定位植物中調(diào)節(jié)活性的部位。根據(jù)本發(fā)明另一實施方案，包含SPL蛋白和一種額外的肽如蛋白質(zhì)標記的融合蛋白也可用于檢測植物中SPL蛋白/蛋白相互作用的部位。
本發(fā)明進一步提供了用作雜交探針的分離的核酸和其互補序列，它們可用于檢測參與植物中性母細胞形成的同源核酸。
本發(fā)明進一步提供了含有能在植物生長過程中以多種方式影響性母細胞形成的DNA的植物和植物相關(guān)宿主，包括種子、植物組織培養(yǎng)物和植物部分，所述DNA可以是改變的或未改變的外源DNA，或改變的內(nèi)源DNA，或其部分。
本發(fā)明的另一實施方案中，提供了生產(chǎn)其中性母細胞被影響或控制的轉(zhuǎn)基因植物的方法，特別是生產(chǎn)能結(jié)無籽果實和/或無花粉花的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明還提供了SPL基因的啟動子，其可用于驅(qū)動SPL基因或外源基因在植物小孢子母細胞和大孢子母細胞中的表達。此啟動子可用于使轉(zhuǎn)基因在植物繁殖細胞中表達，從而使植物不育。此啟動子還可用于表達一定基因，從而從具有相比于親代植物改變的DNA結(jié)構(gòu)的植物產(chǎn)生下一代種子。
附圖和序列表的簡要描述

圖1A(SEQ ID NO:2)示出緊鄰Ds序列(以黑體字表示)側(cè)翼的SPL基因的基因組序列的一部分。Ds序列的插入導致在插入位點4個堿基對重復(下劃線處)。
圖1B(SEQ ID NO:3)示出如圖1A(SEQ ID NO:2)所示的Ds序列。
圖2(SEQ ID NO:1)示出SPL基因的cDNA序列。以黑體字代表的密碼子atg和taa分別表示開放讀框的起始和終止密碼子。下劃線的序列g(shù)cta表示Ds序列的插入位點。
圖3(SEQ ID NO:4)示出推導自圖2的DNA序列(SEQ ID NO:1)的SPL多肽的氨基酸序列。密碼子Val Leu(黑體字)位于Ds序列的插入位點。
圖4(SEQ ID NO:5～14)例證了一些MADS盒式轉(zhuǎn)錄因子的MADS區(qū)的前18個氨基酸與SPL蛋白64～80位氨基酸的序列對比。
圖5(SEQ ID NO:15)示出SPL基因啟動子的DNA序列及該基因的編碼區(qū)。此啟動子序列起自SPL基因起始密碼子上游的2690位核苷酸。起始密碼子ATG的第1個核苷酸標記為+1位。劃線處為起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，兩個外顯子以黑體字表示。
發(fā)明詳細描述如上所述，本發(fā)明提供了分離的核酸分子(例如DNA或RNA)，其編碼參與并可能是植物雄性及雌性器官中性母細胞形成所必需的蛋白質(zhì)。當本文所述的核酸分子摻入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)時，這種核酸可用于產(chǎn)生植物起源的無孢母細胞(SPL)蛋白質(zhì)及SPL型蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一種分離的SPL基因示于圖2(SEQ IDNO:1)。SPL基因啟動子區(qū)的序列以及基因的編碼區(qū)示于圖5(SEQID NO:15)。
“分離的”或“基本上純化的”核酸(例如RNA,DNA或混合的聚合物)是與天然伴隨著天然人類序列或蛋白質(zhì)例如核糖體，聚合酶，許多其它人類基因組序列及蛋白質(zhì)的其它細胞成分基本上分離的核酸。該術(shù)語包括已從其天然發(fā)生的環(huán)境中移出的核酸序列或蛋白質(zhì)，并包括分離的重組或克隆的DNA及化學合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。
所述“編碼”多肽的多核苷酸，如果在其自然狀態(tài)或當經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法操縱時，其可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生mRNA和/或多肽或其片段。反義鏈是這種核酸的互補序列，且從中可推導出編碼序列。
術(shù)語“SPL”指野生型形式，而“spl”指SPL基因的突變形式。“SPL”(非斜體字)指本文所述蛋白質(zhì)的野生型形式。
文中SPL基因的“一部分”或“片段”指最小大小至少大約8個或優(yōu)選至少大約15個，或更優(yōu)選至少大約25個核苷酸，且可具有至少大約40個核苷酸。此定義包括8～40個核苷酸范圍內(nèi)的所有大小以及多于40個核苷酸的大小。因此，此定義包括8,12,15,20,25,40,60,80,100,200,300,400,500個核苷酸的核酸，或具有這些數(shù)值范圍內(nèi)任何數(shù)目核苷酸(例如9,10,11,16,23,30,38,50,72,121…等個核苷酸)的核酸，或具有500個以上核苷酸的核酸。本發(fā)明包括具有衍生自圖1A(SEQ ID NO:2)或圖2(SEQ ID NO:1)的至少8個核苷酸的所有新核酸，其互補序列或功能相同的核酸序列。本發(fā)明不包括現(xiàn)有技術(shù)中存在的核酸。即本發(fā)明包括具有衍生自圖1A(SEQ ID NO:2)或圖2(SEQ ID NO:1)的至少8個核苷酸的所有核酸，而不包括現(xiàn)有技術(shù)中存在的核酸。
根據(jù)本發(fā)明實施方案的SPL基因可衍生自雙子葉Arabidopsisthaliana。由此基因編碼的多肽可調(diào)節(jié)或控制并可以為植物性母細胞形成所必需。通過SPL基因的突變，植物不能或幾乎不能產(chǎn)生孢子，胚囊及花粉粒。因而，本發(fā)明的分離的SPL基因可用于產(chǎn)生修飾的植物，包括產(chǎn)生無籽果實，無花粉花和/或具有較大生物量的植物。
本發(fā)明提供了編碼參與性母細胞形成中的蛋白質(zhì)的分離的核酸或其互補序列，其中所述核酸包括(a)編碼圖3所示氨基酸序列(SEQ IDNO:4)的DNA，或(b)天然產(chǎn)生的DNA，或天然產(chǎn)生的DNA的簡并DNA，其在中等嚴格條件下與(a)的DNA雜交，其中天然產(chǎn)生的DNA與(a)的DNA至少70％相同，且其中所述天然產(chǎn)生的DNA編碼的蛋白質(zhì)參與性母細胞形成中。
本發(fā)明還包括編碼參與植物性母細胞形成中的蛋白質(zhì)的分離的核酸或其互補序列，其中核酸包括植物天然產(chǎn)生的DNA，或天然產(chǎn)生的DNA的簡并DNA，其與(a)圖1A(SEQ ID NO:2)或其一部分，或(b)圖2(SEQ ID NO:1)或其一部分的DNA在中等嚴格條件下雜交，其中天然產(chǎn)生的DNA與(a)或(b)的DNA至少70％相同，且其中天然產(chǎn)生的DNA編碼這種蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了分離的核酸或其互補序列，其與(a)圖2(SEQ IDNO:1)的81～1024位核苷酸或其一部分，或(b)編碼由(a)編碼的相同氨基酸序列，但使用一些氨基酸的不同密碼子的(a)的變體具有至少70％的相同性，且其中此核酸編碼參與植物性母細胞形成中的蛋白質(zhì)。
雜交是指核酸的互補鏈(即有義反義鏈或探針靶DNA)之間通過氫鍵彼此結(jié)合，類似于染色體DNA中天然存在的鍵。用于所供探針與靶DNA雜交的嚴格條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地改變。
文中“中等嚴格”雜交是指一種使靶DNA與如下的互補核酸結(jié)合的條件，該互補核酸與靶DNA具有大約60％，優(yōu)選大約70％，更優(yōu)選大約75％，更優(yōu)選85％，特別優(yōu)選90％的同源性。優(yōu)選地，中等嚴格條件是在50％甲酰胺，5×Denhart’s溶液，5×SSPE,0.2％SDS中，在42℃雜交，隨后在65℃在0.2×SSPE,0.2％SDS中沖洗。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知Denhart’s溶液和SSPE(例如參見Sambrook等，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版，1989)以及其它適當?shù)碾s交緩沖液。
術(shù)語“同源性”或“同系物”，或說核酸或其片段與其它核酸“同源”是指當與其它核酸(或其互補鏈)充分對比序列(具有適當核苷酸插入或缺失)時，至少大約50％，通常大約70％，更通常大約80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95-98％的核苷酸堿基的核苷酸序列相同。
為測定兩個不同核酸間的同源性，可用BLASTN程序“BLAST2序列”測定同源性百分率。此程序可從Internet上得自國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.govf/b12.html)(Altschul等，1997)。所用參數(shù)包括以下產(chǎn)生最大計算同源性百分率的參數(shù)組合(如下用圓括號內(nèi)所示參數(shù)計算)程序-blastnMatrix-0 BLOSUM62Reward for amatch-0或1(1)Penalty for a mismatch-0,-1,-2或-3(-2)Open gap penalty-0,1,2,3,4,或5(5)Extension gap penalty-0或1(1)Gap x dropoff-0或50(50)Expect-10根據(jù)各種其它結(jié)果，BLASTN程序示出匹配的兩個核酸的完整鏈或區(qū)域間的相同性百分率。此程序示出兩個對比鏈的序列對比及相同性作為部分結(jié)果。如果鏈是等長的，根據(jù)核酸全長計算相同性。如果鏈不等長，用較短核酸鏈長計算。如果核酸間只其序列的一部分相似，BLASTN程序?qū)⑹境鲋皇沁@些相似部分的相同性，其是單獨報道的。為測定本文的同源性，同源性百分率指對比的兩個序列中較短者。如果任何一個區(qū)域示出具有不同相同性百分率的不同序列對比，使用產(chǎn)生最高同源性的序列對比。
或者，當核酸或其片段在選擇性雜交條件下與另一核酸(或其互補鏈)雜交時，存在“同源性”。當雜交基本比發(fā)生特異性全部喪失更具有選擇性時，存在雜交選擇性。典型地，當一段至少14個核苷酸的序列至少大約35％，優(yōu)選至少大約65％，更優(yōu)選至少大約75％，最優(yōu)選至少大約90％同源時，將發(fā)生選擇性雜交。參見Kanehisa,1984,核酸研究12:203-13。所述同源性對比的長度可以是較長一段序列，在某些實施方案中通常長度至少大約9個，通常至少20個，更通常至少24個，典型地至少大約28個，更典型地至少大約32個，優(yōu)選至少36個或更多個核苷酸。
除了堿基組成，互補鏈長度及雜交核酸間堿基錯配核苷酸數(shù)目之外，核酸雜交將受鹽濃度，溫度或有機溶劑等條件的影響，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易意識到這些。嚴格溫度條件通常包括30℃以上，典型地37℃以上，優(yōu)選45℃以上。嚴格鹽條件一般小于1000mM，典型地小于500mM，優(yōu)選小于200mM。但參數(shù)的組合比任一參數(shù)的測定更重要。嚴格條件依于核酸的長度及核酸的堿基組成，并可由本領(lǐng)域熟知的技術(shù)測定。例如參見Wetmur和Davidson,1968，分子生物學雜志31:349-70。
探針序列在一定條件下也可與雙螺旋DNA雜交，以形成三螺旋或其它更高級DNA復合物。本領(lǐng)域熟知這種探針的制備及雜交條件。
SPL核酸可以是圖2(SEQ ID NO:1)所示核酸，或者可以是通過添加，插入，缺失及取代所示序列的一或多個核苷酸加以改變而不同于所示序列的等位基因或變體或衍生物。核苷酸序列的改變通過遺傳密碼決定可引起或不引起蛋白質(zhì)水平的改變。
因此，本發(fā)明的核酸可包括不同于圖2(SEQ ID NO:1)所示序列的一序列，但仍編碼具有與圖3(SEQ ID NO:4)所示相同序列的多肽。即本發(fā)明的核酸包括遺傳密碼簡并結(jié)果的序列。另一方面，編碼的多肽可包括一氨基酸序列，該序列與圖3(SEQ ID NO:4)所示氨基酸序列有一或多個氨基酸殘基不同。本發(fā)明還提供了編碼是圖3(SEQ ID NO:4)所示氨基酸序列的變體，衍生物或等位體的多肽的核酸。
SPL基因也指(a)任何DNA序列，其(ⅰ)在嚴格條件下(見Ausubel等，1992，分子生物學通用方案(John Wiley和Sons，紐約))與編碼圖3所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的DNA的互補序列雜交，及(ⅱ)編碼與SPL蛋白質(zhì)功能相同的基因產(chǎn)物，或(b)任何DNA序列，其(ⅰ)在較低嚴格條件如中等嚴格條件下(Ausubel等，1992)，與編碼圖3所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的DNA序列的互補序列雜交，及(ⅱ)編碼與SPL蛋白質(zhì)功能相同的基因產(chǎn)物。本發(fā)明還包括是本文所述序列互補序列的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案，提供了一包含圖2(SEQ ID NO:1)所示相同連續(xù)核苷酸序列的分離的核酸或其互補序列，或其一部分，其編碼參與植物性母細胞形成中的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一與所述包含圖2所示連續(xù)核苷酸序列的序列雜交的分離的核酸序列或其互補序列，或其一部分，其前面為提供基因啟動子區(qū)的核酸序列。提供啟動子區(qū)的核苷酸序列示于圖5。特別地，此啟動子包括位于圖5(SEQ ID NO:15)所示序列的-2690～-1位核苷酸內(nèi)的序列，或其能調(diào)節(jié)可操縱連接的基因表達的功能片段。
在本發(fā)明的一實施方案中，分離的SPL啟動子可被可操縱地連接于外源基因并控制外源基因的表達。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案，提供了包含圖2(SEQ ID NO:1)的81～1024位核苷酸的相同連續(xù)核苷酸序列的分離的核酸或其互補序列，或它們的一部分，其編碼參與植物性母細胞形成中的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了編碼參與植物性母細胞形成中的多肽和蛋白質(zhì)的分離的核酸及其互補序列。這種參與可包括調(diào)節(jié)或控制性母細胞形成。由該分離的核酸編碼的多肽和蛋白質(zhì)包含與圖3(SEQ ID NO:4)中相關(guān)氨基酸序列至少大約80％，更優(yōu)選大約90％相同的氨基酸序列，尤其優(yōu)選95％以上相同性的氨基酸序列。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一包括編碼包含圖3(SEQ ID NO:4)所示相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸的分離的核酸及其互補序列。
這樣，本發(fā)明的SPL多肽可以是圖3(SEQ ID NO:4)所示多肽，其可以是分離的和/或純化形式，不含或基本上不含天然相關(guān)的物質(zhì)。如果通過在原核細胞中表達而產(chǎn)生或合成產(chǎn)生，此多肽可能缺失天然翻譯后加工如糖基化。或者，本發(fā)明還涉及是SPL多肽的序列變體，等位體或衍生物的多肽。這種多肽可具有不同于圖3(SEQ ID NO:4)所示序列的氨基酸序列，通過添加，取代，缺失或插入一或多個氨基酸而不同。
取代變體典型地在蛋白質(zhì)的一或多個位點由一個氨基酸置換另一個，并可設(shè)計為調(diào)節(jié)多肽的一或多種性質(zhì)，如抗蛋白酶切的穩(wěn)定性，而不喪失其它功能或性質(zhì)。氨基酸取代可基于所涉及殘基的極性，電荷，可溶性，疏水性，親水性和/或兩親性進行。優(yōu)選的取代是保守取代，即用相似形狀和電荷的氨基酸取代氨基酸。本領(lǐng)域熟知保守取代且典型地包括在以下組之內(nèi)的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；及酪氨酸，苯丙氨酸。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以被其它氨基酸取代，而不明顯喪失結(jié)構(gòu)的相互作用性結(jié)合能力，所述結(jié)構(gòu)例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上結(jié)合位點或與SPL多肽相互作用的蛋白質(zhì)上結(jié)合位點。由于其是活性容量及闡述蛋白質(zhì)生物功能活性的蛋白質(zhì)性質(zhì)，某些氨基酸取代可以在蛋白質(zhì)序列及其DNA編碼序列中進行，而獲得相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。在進行這種置換中，要考慮氨基酸的疏水指數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知氨基酸疏水指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用性生物學功能中的重要性。參見Kyte和Doolittle,1982，分子生物學雜志57:105-32?；蛘撸愃瓢被崛〈稍谟H水性的基礎(chǔ)上有效進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知親水性在賦予蛋白質(zhì)相互作用性生物性功能中的重要性(美國專利4,554,101)。關(guān)于使用疏水指數(shù)或親水性在設(shè)計多肽中的進一步闡述見于美國專利5,691,198。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了包含至少具有圖2(SEQ IDNO:1)的81～1024位堿基的8個連續(xù)核苷酸的DNA的分離的DNA分子，或其互補序列。在一優(yōu)選的實施方案中，分離的核苷酸具有圖2(SEQ ID NO:1)的81～1024位堿基的至少15個連續(xù)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了分離的核酸或其互補序列，其含有編碼阻斷，降低或提高植物中性母細胞形成的SPL多肽突變體的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了通過在適當宿主細胞中表達上述核酸序列，重組產(chǎn)生SPL和SPL型蛋白質(zhì)的方法。該蛋白質(zhì)可在SPL基因啟動子的控制下被表達。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該植物能結(jié)無籽果實和/或無花粉花，或基本上無核或無花粉的果實和花。這些方法包括用適當表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物以阻斷，降低或提高植物性母細胞形成，該表達系統(tǒng)含有改變形式(例如突變)的上述核酸序列。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很容易確定適當?shù)谋磉_系統(tǒng)。例如，通過農(nóng)桿菌介導的和/或biolistic方法，在適當啟動子控制下的基因可以很容易地轉(zhuǎn)化入大多數(shù)種植植物中，參見Christou，植物科學動向1:423-431。
其它實施方案的生產(chǎn)能結(jié)無籽果實和/或無花粉花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用上述核酸序列轉(zhuǎn)化植物以通過反義及相關(guān)技術(shù)阻斷，降低或提高性母細胞形成。有義及反義技術(shù)是常用的改變植物發(fā)育和代謝的方法。例如參見Jorgensen,R.A.等，植物分子生物學31(5):957-73(1996)。有義和反義構(gòu)建體通過農(nóng)桿菌介導的和/或biolistic方法可很容易地導入植物細胞中，參見P.Christou，植物科學動向1:423-431。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)結(jié)無籽果實和/或無花粉花的植物的方法，包括在植物中以改變形式表達上述核酸序列以影響植物性母細胞形成。
在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，上述方法包括用包含參與性母細胞形成的核酸或其互補序列的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物，該表達系統(tǒng)包括(a)編碼圖3(SEQ ID NO:4)的蛋白質(zhì)的核酸，(b)如圖2(SEQIDNO:1)所示核酸或其一部分，或(c)如圖2(SEQ ID NO:1)的81～1024位核苷酸所示核酸或其一部分，其中核酸被突變以阻斷，降低或提高植物中性母細胞形成，從而使植物能結(jié)無籽果實或無花粉花。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了一種生產(chǎn)能結(jié)無籽果實或無花粉花的植物的方法，包括突變負責性母細胞形成的植物內(nèi)源DNA，其中性母細胞形成受影響且植物能結(jié)無籽果實或無花粉花，或結(jié)基本上無核或無花粉的果實或花。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，內(nèi)源DNA通過定向誘變而突變。參見Mazzucato,A等，Development125(1):107-114(1998)。
“轉(zhuǎn)基因植物”包括含有野生型(天然)植物中非天然存在的內(nèi)源或外源DNA或RNA，或已知變體，或含有如本文所述導入的額外或反向拷貝的天然存在的DNA的植物，及其從種子經(jīng)營養(yǎng)繁殖產(chǎn)生的，經(jīng)細胞、組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)等產(chǎn)生的子代。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可包含編碼參與植物性母細胞形成中的SPL蛋白或類SPL蛋白的DNA。例如，當導入和/或存在于植物細胞時，SPL DNA或SPL DNA變體形式的表達可產(chǎn)生缺少性母細胞或具有比相同種類的未轉(zhuǎn)化植物中性母細胞數(shù)多的植物。例如，具有過量性母細胞數(shù)的玉米macⅠ突變體導致完全雄性不育及部分雌性不育。過量性母細胞數(shù)導致不育性的機制還不十分清楚。參見Sheridan,W.F.,等，遺傳142:1009-1020(1966)。
本發(fā)明的DNA可以是以有義或反義方向加入的外源DNA，其編碼參與并可為植物性母細胞形成之所需的蛋白質(zhì)。參見Jorgensen,R.A.,等，植物分子生物學31(5)957-73(1996)。本發(fā)明的DNA也可以是已經(jīng)改變的(如突變的)外源DNA，從而其阻斷、降低或提高性母細胞形成。例如，遺傳因子如Ds序列(具有或不具有活性Ac序列)的插入，可影響性母細胞形成，且因此可特別用于本發(fā)明。本發(fā)明還提供了直接定向誘變負責性母細胞形成的植物內(nèi)源DNA，其也能影響性母細胞形成。
已通過直接誘變而突變的參與性母細胞形成中的外源和內(nèi)源DNA不同于相應野生型(天然存在的)DNA之處是這些序列中含有至少一個核苷酸的取代，缺失或加入，且能編碼至少一個氨基酸殘基不同于相應野生型蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。文中所用術(shù)語“核苷酸”包括DNA或RNA的殘基。
改變或未改變形式的外源DNA可通過熟知方法，如農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法，微粒轟擊，微注射或電穿孔法導入目標植物中。參見Wilkinson,J.Q.等，自然生物技術(shù)學15(5)444-447(1997)。
攜帶外源SPL或類SPL DNA，或經(jīng)直接誘變突變的內(nèi)源SPL DNA的植物細胞，可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中性母細胞形成被阻斷，降低或提高，因此是額外植物的來源，經(jīng)種子生產(chǎn)或非種子，無性繁殖方式(即切割，組織培養(yǎng)等)。
本發(fā)明還提供了用上述核酸序列轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞和植物種子。在這種轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞和植物種子中，在性母細胞形成和植物生長期間性母細胞的形成可被影響。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了分離的蛋白質(zhì)家族，其可調(diào)節(jié)或控制植物雄性和雌性器官中性母細胞形成。這種蛋白質(zhì)包括與SPL功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，因而通過干擾SPL功能使植物能結(jié)無籽果實和/或無花粉花。這種蛋白質(zhì)還包括其它植物物種的相關(guān)蛋白質(zhì)，其是那些物種中SPL的功能和結(jié)構(gòu)的等價物，并行使SPL在擬南芥中行使的相同功能。本發(fā)明蛋白質(zhì)的典型氨基酸結(jié)構(gòu)如圖3(SEQ IDNO:4)所示。本發(fā)明的蛋白質(zhì)參與植物性母細胞形成中，并含有與圖3(SEQ ID NO:4)中的參照序列至少大約80％，優(yōu)選大約90％氨基酸相同性的氨基酸序列，特別優(yōu)選具有95％以上氨基酸相同性的序列。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了包含或具有與圖3(SEQID NO:4)相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了抗上述蛋白質(zhì)的抗體。這種抗體可用于各種應用中，包括確定植物中調(diào)節(jié)活性的位點。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了一種融合蛋白，其可包含上述任一種氨基酸，且在一優(yōu)選的實施方案中包括SPL或SPL型蛋白質(zhì)。本發(fā)明的融合蛋白還可包括一附加的肽，如蛋白質(zhì)標記，其可用于檢測植物中SPL蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的位點。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，本文所述核酸分子(或其片段)可用易于檢測的取代基標記，并用作雜交探針，以分析所供植物樣本中SPL或SPL型DNA或RNA的存在與否和/或數(shù)量。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，用作雜交探針的分離的核酸包括具有圖1A(SEQ IDNO:2)所示核苷酸序列或其一部分的核酸。在本發(fā)明的一更優(yōu)選的實施方案中，雜交探針可以是包括圖2(SEQ ID NO:2)的81～1024位核苷酸所示核苷酸序列或其一部分的核酸。所述的核酸分子及其片段也可用作PCR中的引物和/或模板，以擴增編碼所述SPL蛋白質(zhì)或SPL型蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明的另一實施方案提供了SPL基因的分離的啟動子。延伸自SPL基因起始密碼子上游2690位核苷酸的DNA片段已被鑒別為SPL基因的調(diào)節(jié)表達區(qū)。此啟動子的序列示于圖5(SEQ ID NO:15)的序列中-2690～-1堿基對序列。起始ATG密碼子的第1個核苷酸在序列中被定為+1位。從-2690至-1位的序列足以提供在大孢子母細胞和小孢子母細胞中SPL特異表達。文中所用“啟動子”包括這種序列，與這種序列雜交并啟動可操縱地與其連接的編碼序列的表達的序列，這種序列的能啟動或調(diào)節(jié)可操縱地與其連接的編碼序列的表達的功能片段。如果啟動子與編碼序列的ATG起始密碼子連接，則其可與編碼序列可操縱地連接。
SPL基因的啟動子可用于驅(qū)動植物小孢子母細胞和大孢子母細胞中SPL基因或外源基因的表達。啟動子的一個用途是使轉(zhuǎn)基因在植物生殖細胞中特異表達。如果轉(zhuǎn)基因如編碼核糖核酸酶的基因在SPL啟動子的控制下表達，植物將是不育的?；蛘撸琒PL啟動子可用于在生殖細胞中(孢母細胞)特異表達編碼轉(zhuǎn)座酶或重組酶(催化DNA重排的蛋白質(zhì))的基因，如此下一代種子將具有相比于親代植物改變的DNA結(jié)構(gòu)。例如，攜帶在SPL啟動子控制下Cre重組酶的植物可用于從孢母細胞中特異地切除轉(zhuǎn)基因DNA的區(qū)段。結(jié)果，親代植物將攜帶轉(zhuǎn)基因，但子代喪失該轉(zhuǎn)基因。此結(jié)構(gòu)有助于防止轉(zhuǎn)基因從一代到下一代傳播。
以下研究是結(jié)合本發(fā)明進行的，但非限制本發(fā)明范圍。
隱性spl基因中的突變在篩選Arabidopsis thaliana生態(tài)型～landsberg erecta中基因阱品系期間被鑒別。發(fā)現(xiàn)這些突變導致植物中雄性和雌性不育性，從而推斷SPL基因在植物生殖中起樞紐作用。spl純合植物除老化延遲之外，呈現(xiàn)類似于野生型植物形態(tài)學的全部形態(tài)學。另外，發(fā)現(xiàn)SPL同源植物的花與野生植物具有同樣數(shù)目的器官，除了spl純合植物的花包括白色扁平花藥并在13-14朵花期間沒有可觀測到的花粉粒。參見D.R.Smyth,J.H.Bowan,E.M.Meyerowitz,1990,植物細胞2,755。這些spl純合植物的心皮也呈現(xiàn)相同形態(tài)學結(jié)構(gòu)，盡管當用野生型花粉粒授粉時是不育的。
用全樣載片透明和切片技術(shù)進行的細胞學研究表明在spl純合植物的花藥和心皮中性母細胞形成均受影響。spl純合植物的研究還揭示在spl突變體花中，花藥的下皮細胞在7朵花時期輕度擴大并分化成孢原細胞，如在野生型花中正常發(fā)生的一樣。然后孢原細胞分化且有時平周分裂形成PPC層和PSC層。PPC層偶爾另外分裂產(chǎn)生二個結(jié)束分裂的二級周壁細胞。但是，靠近花藥中心的細胞成為液泡狀的，且未觀測到小孢子母細胞和絨氈層的發(fā)育。另外，在13-14朵花時期，花藥由高液泡狀的薄壁組織細胞構(gòu)成，且在某些情況下也存在一些管狀細胞。
相比之下，上述研究結(jié)果不同于對野生擬南芥的研究，其中野生型發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)與雙子葉植物典型呈現(xiàn)的小孢子生成相同。特別地，在未成熟的7朵花時期，在每個花藥座中心的單個下皮細胞迅速膨脹并分化成孢原細胞，孢原細胞經(jīng)過平周分裂產(chǎn)生內(nèi)層初級孢子細胞(PSC)層和外層初級周壁細胞(PPC)層。PPC層隨后平周分裂形成二個二級周壁細胞(SPC)層，內(nèi)層SPC層分化成絨氈層。外層SPC層然后另外平周分裂形成兩層位于外側(cè)的稱之為內(nèi)皮的層及位于內(nèi)側(cè)的中層。這些層盡管對花粉粒成熟很重要，但來自PPC或稱初級周壁細胞層的這些層在孢子生成中無一起直接作用。孢子形成自直接分化成小孢子母細胞(雄性性母細胞)的PSC層(初級孢原細胞層)細胞，在晚期8花時期也稱為花粉母細胞(PMCs)。在9花時期，通過細胞壁上胼胝質(zhì)的沉積，PMCs彼此分離，并隨后減數(shù)分裂。參見Bowman,J,1994，擬南芥，形態(tài)學及發(fā)育圖譜。同時，絨氈層成為可觀測到的并由于核內(nèi)有絲分裂而呈現(xiàn)雙核。
從以上對spl突變體及野生型植物的對比研究推斷spl突變體植物中小孢子生成在PSC層過渡到小孢子母細胞期間被阻斷，導致缺少任何小孢子母細胞的表型。
在根據(jù)本發(fā)明對spl突變體的研究中還發(fā)現(xiàn)胚珠原基正常生成，頂部下皮細胞大小略增大。孢原細胞如在野生型植物中同樣生成，但不能縱向延伸以發(fā)育為大孢子母細胞或雌性性母細胞。因而，spl突變體不能生成大孢子母細胞，結(jié)果珠心被抑制。然而，內(nèi)層和外層珠被均如在野生型花中一樣分化。從內(nèi)層珠被的內(nèi)層細胞也分化出內(nèi)皮。在13花時期珠被發(fā)育稍后，被抑制的珠心的頂部表皮細胞延伸，并開始橫向及有絲分裂，之后二個相鄰表皮細胞也橫向分裂。結(jié)果，珠心沿珠孔生長，在14花時期及之后在胚珠的縱向剖面上產(chǎn)生三層類指狀結(jié)構(gòu)。
spl突變在大孢子發(fā)生期間阻止孢原細胞過渡為大孢子母細胞，這是通過對全部苯胺藍染色標本觀測在不同花期心皮上胼胝質(zhì)沉積缺乏而部分證明的。然而這不影響孢子體組織如珠被的發(fā)育，由此表明spl突變特別阻斷植物中孢原細胞過渡到大孢子母細胞。
SPL基因產(chǎn)物因此呈現(xiàn)在雌性植物大孢子母細胞和雄性植物小孢子母細胞的生成中起始樞紐作用。遺傳研究，包括用5’Ds序列作探針的Southern印跡分析，顯示spl不育表型通過插入單一Ds而產(chǎn)生。另外的反向?qū)嶒炞C實spl突變基因由Ds因子標記。通過Ac轉(zhuǎn)座酶基因切除此Ds因子恢復孢母生成及正常能育性。在這些試驗中，分離10個完全能育的獨立回復體植物。在每個實例中都確定SPL基因中的Ds因子經(jīng)過精細切除，恢復野生型序列及功能。
用熱不對稱交錯-PCR(TAIL PCR)技術(shù)，如Liu等，植物雜志8:457(1995)所述，檢測側(cè)翼于Ds因子的基因組序列。如圖1A和1B(SEQ ID NO:2和3)所示，緊鄰Ds因子3’和5’末端側(cè)翼的片段被測序，并發(fā)現(xiàn)如所預期地包括Ds序列的3’和5’部分。上述PCR片段被用作探針以篩選來自Arobidopsis thaliana Landsberg erecta花的cDNA文庫。分離SPL基因的cDNA克隆并測序。如圖2(SEQ ID NO:1)所示，發(fā)現(xiàn)全長cDNA克隆長度為1302bp，并編碼分子量為34kDa的314個氨基酸多肽，如圖3(SEQ ID NO:4)所示。
或者，對蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索揭示如圖3(SEQ ID NO:4)所示的SPL蛋白質(zhì)不與任何已知蛋白質(zhì)同源，由此證實SPL蛋白質(zhì)的新穎性。SPL蛋白質(zhì)的三個短區(qū)域與已知蛋白質(zhì)的氨基酸區(qū)部分同源。具體地，SPL蛋白質(zhì)149～181位的33個氨基酸區(qū)域發(fā)現(xiàn)與一種有絲分裂抑制物釀酒酵母SWE1的氨基酸區(qū)域同源，相同性為45％。SPL蛋白質(zhì)119～133位的另一15個氨基酸區(qū)發(fā)現(xiàn)與鼠3-羥異丁基脫氫酶前體同源，具有73％相同性。然而，上二個氨基酸區(qū)來自不相關(guān)的蛋白質(zhì)且功能未知。
另外，在SPL蛋白質(zhì)64～85位氨基酸中有一推斷的螺旋區(qū)，其與稱作MADS結(jié)構(gòu)域的與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)基序的第一個螺旋區(qū)有有限同源性。MADS結(jié)構(gòu)域是在稱作MADS盒因子的轉(zhuǎn)錄因子家族有限同源性。MADS結(jié)構(gòu)域是在稱作MADS盒因子的轉(zhuǎn)錄因子家族中發(fā)現(xiàn)的大約有57個氨基酸的高保守區(qū)(參見例如，Kramer等，遺傳，149:765-783(1998))。SPL不具備整個MADS結(jié)構(gòu)域，但示出與此結(jié)構(gòu)域前18個氨基酸的良好保守性。SPL的64～80位氨基酸與各種物種的此類已知調(diào)節(jié)蛋白的MADS結(jié)構(gòu)域的前18個氨基酸的對比示于圖4(SEQ ID NO:5～14)。
如圖4所示，所列的MADS盒轉(zhuǎn)錄因子是擬南芥的AP3,AG,AGL5,AGL11蛋白；Antirrhinum(金魚草)的DEFA和GLO蛋白；Brassica oleracea的BOAP1；矮牽牛的FBP11；芽殖酵母的MCM1,RLM1,SMP1蛋白；及SRF和MEF2D人蛋白。
SPL的核定位及其與前述MADS結(jié)構(gòu)域的部分同源性提示SPL可代表新一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
用上述cDNA克隆作探針，對擬南芥的花，根，葉，莖與長角的polyA+RNA的Northern印跡分析只在從花中提取的RNA中顯示一1.3kb條帶，由此推測SPL基因在不同植物組織中不同地表達。用合成自SPL cDNA克隆的標記的反義RNA作探針的原位雜交，也證實SPL基因在花的造孢細胞中表達，這與該基因的生物學功能一致。
如圖1A，1B(SEQ ID NO:2和3)和圖2(SEQ ID NO:1)所示，基因組序列與擬南芥的eDNA序列相對比揭示Ds因子在SPL基因的411和412堿基間插入。Ds因子的插入導致宿主序列在插入位點4bp重復。得自10個以上獨立回復突變系的序列顯示一完全切除及無足跡，由此表明包括緊鄰插入位點側(cè)翼的氨基酸的區(qū)域?qū)PL基因功能的重要性。此結(jié)論是基于觀測到spl突變的所有回復體都精確切除Ds因子而得出的。當Ds因子插入基因時，典型的回復體中有一或二個氨基酸的小缺失，取代或插入(Wessler,S.R.,科學242(4877):399-405(1988年10月21日)。從spl突變中未回收到這種回復體證明即使在插入位點氨基酸序列的細微變化也導致SPL蛋白質(zhì)功能的缺失。
Southern雜交分析示出SPL基因是單基因。使不是必需的，也在從孢原細胞過渡到植物雄性和雌性器官中性母細胞中起重要作用。如上所述，孢子發(fā)生是植物生殖的一關(guān)鍵步驟，因此植物控制孢子發(fā)生的能力也影響植物產(chǎn)生種子的能力。本文所述的對擬南芥的spl突變的遺傳學研究顯示SPL基因編碼性母細胞形成中一種重要的蛋白質(zhì)。用轉(zhuǎn)座子標記分離并定性SPL基因。另外在中等嚴格水平下的Southern分析顯示，在其它植物物種如玉米和水稻中的SPL同系物具有與SPL基因相同或相似功能。
如上所述，本發(fā)明提供的分離的DNA可用作探針以分離其它植物物種DNA序列，該序列與SPL基因同源并編碼以與SPL基因編碼的蛋白質(zhì)相同或相似方式參與性母細胞形成的調(diào)節(jié)蛋白。如上所述，本發(fā)明中術(shù)語“同源性”及“同源的”指全部序列至少50％相同。其它植物SPL型基因(即SPL基因的同系物)的鑒別與分離可根據(jù)本領(lǐng)域已知的標準方法和步驟進行。例如參見Sambrook等，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版，冷泉港，NY(1989)。
用這些及其它類似技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能輕易地不僅從擬南芥的不同細胞和組織中分離SPL基因，還能從其它植物種中分離SPL基因的同系物。例如，其它植物物種中的SPL和SPL型基因可通過制備植物的基因組和/或cDNA文庫，隨后用圖1A(SEQ ID NO:2)和圖2(SEQ ID NO:1)所示序列或其同系物的全部或一部分探查一個或兩個文庫，鑒別雜交序列，并分離雜交的DNA以獲得SPL或SPL型基因。
一旦鑒別，這些其它植物物種的SPL或SPL型基因可以限制作圖，測序并克隆。
分離的SPL基因或其同系物也可改變后導入擬南芥或其它植物物種中，以調(diào)節(jié)并控制性母細胞形成以產(chǎn)生無籽果實和/或無花粉植物。例如，遺傳工程化的SPL基因可摻入已為其它性狀而育種的植物品系中以產(chǎn)生無籽果實。
性母細胞形成通過用SPL基因的反義結(jié)構(gòu)或共抑制SPL基因降低SPL蛋白質(zhì)的表達水平可被阻斷?；蛘?，通過將有義或反義SPL基因置于不同的可誘導啟動子控制下，應用特異環(huán)境條件或應用的化合物，也可控制性母細胞形成。
“共抑制”指內(nèi)源基因或?qū)氲耐庠椿?轉(zhuǎn)基因)的過表達，其中基因的額外拷貝導致內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因均協(xié)同沉墨，由此降低或消除某一性狀的表達。參見美國專利5,034,323和5,283,184。轉(zhuǎn)基因可以有義或反義方向?qū)?，且不需要全長序列或與待阻抑的內(nèi)源序列絕對同源。
另外，SPL蛋白質(zhì)的顯性陰性突變體可通過用SPL基因截短的變體構(gòu)建，該截短的變體能與其配偶體相互作用，但不能執(zhí)行其生物學活性。參見Wilkinson,J.Q.等，自然生物技術(shù)學15(5):444-447(1997)。如果此截短的基因在強啟動子的控制下導入植物體，轉(zhuǎn)基因植物將降低或喪失其結(jié)種的能力。因而，截短的顯性陰性SPL基因可作為反義SPL基因的取代物。當工程化無核或無花粉植物時，顯性陰性的SPL基因途徑相比于反義構(gòu)建體也具有優(yōu)勢，如反義策略依賴于從每種植物中開始克隆部分或全部SPL基因，隨后反向表達基因。反義抑制也依賴于互補核苷酸序列的表達，其在各物種之間有變化。相反，顯性陰性策略只依賴于蛋白質(zhì)及其靶位點的功能保守，其整體上比核苷酸序列保守所要求的嚴格性低。Lloyd,A.M.等(1992)，科學258:1773-1775；Irish,V.F.和Yamamoto,Y.T.(1995)，植物細胞7:1635-1644描述了一些當在趨異性很大的植物物種中表達時能進行相似功能的調(diào)節(jié)蛋白的實例。這種類型的功能保守提示擬南芥SPL基因的顯性陰性變體在其它植物物種中也能相似地起作用。
以下實施例闡述了本發(fā)明的特殊方面，舉例說明及闡述了分離SPL基因的方法。實施例不以任何方式限制本發(fā)明。
本申請中所引證的文獻，包括那些物質(zhì)及方法，在此并入?yún)⒖肌?br> 實施例1.轉(zhuǎn)座子標記植物在22℃在分子生物農(nóng)業(yè)學院(1 Research Link,Singapore)的溫室中16小時光照/8小時黑暗周期下生長。將含有Ds或Ac區(qū)段的起始品系雜交并篩選F2種子的轉(zhuǎn)座物(transposant),如Sundaresan。V．等，1995，基因與發(fā)育，9“1797-1810。從收集的轉(zhuǎn)座物中通過其雄性和雌性不育表型鑒別spl突變基因。用本領(lǐng)域已知技術(shù)進行遺傳學分析。示出spl突變基因是隱性的并由單-Ds插入產(chǎn)生。spl突變基因的表型由標準細胞學方法，如McCully,M.E.,1981，植物結(jié)構(gòu)研究原理及選擇方法，Termarcarphi，墨爾本，及全樣載片透明法如Herr,J.J.M.,1982，染色技術(shù)57:161-109所述進行鑒定。
實施例2 DNA分析基本如Sambrook J.等，1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版，冷泉港實驗室，紐約，所述進行DNA分析。
為進行Southern印跡分析，從花蕾中提取100～200ng擬南芥DNA，并用EcoRⅠ,Hind Ⅲ或XbaⅠ酶切及在1％瓊脂糖凝膠上電泳，之后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。Ds探針，一種基因阱構(gòu)建體5’末端的EcoRⅠ片段，DsG(見V.Sundaresan等，基因與發(fā)育9:1797-1810(1995))，通過用EcoRⅠ酶切含有部分Ds因子的質(zhì)粒pWS31，并經(jīng)電泳分離所得片段而制備。從凝膠中切下1.8kb的5’Ds因子的EcoRⅠ片段，使用購自Amersham的Rediprime試劑盒用32P-dCTP標記，標記的片段用于在標準DNA雜交條件下探查Southern印跡。
為分離緊鄰Ds因子側(cè)翼的DNA，大約10ng花蕾DNA用于TAILPCR(Liu等，1995，植物雜志8,457)，經(jīng)凝膠電泳分離擴增的片段并測序。PCR片段用32P-dCTP標記并用于篩選花cDNA文庫。純化文庫中與PCR片段雜交的噬菌體，并根據(jù)標準方法體外切割質(zhì)粒DNA。插入片段的大小通過用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ酶切質(zhì)粒而測定，這二種酶均購自Stratagene。
實施例3 RNA分析用圖2(SEQ ID NO:1)的cDNA克隆的1kb的Hind Ⅲ片段作探針，進行各種擬南芥組織polyA+RNA的Northern印跡分析。用標準方法從不同組織中提取RNA，每個樣本的10μg polyA+RNA在1％瓊脂糖凝膠上電泳并移至尼龍膜上。該膜然后用32P-dCTP標記的探針雜交。
實施例4 SPL基因的測序圖2(SEQ ID NO:1)的SPL cDNA克隆用熒光標記的終止子雙脫氧法測序。與含有SPL cDNA的質(zhì)粒載體雜交的T3和T7寡核苷酸引物，用于從克隆末端產(chǎn)生初始序列。然后設(shè)計基于以上序列的SPL基因內(nèi)的其它引物，并用于對SPL基因的中心區(qū)測序。從每個引物可閱讀克隆的大約600～700bp。
實施例5 SPL mRNA的原位定位花蕾用FAA在4℃固定20小時，用乙醇脫水并用二甲苯制成半透明的。將組織包埋在透明質(zhì)中，并制成7～10μm薄片。然后用二甲苯將此薄片脫石蠟并原位雜交。為得到有義RNA探針，含有SPLcDNA的質(zhì)粒用KpnⅠ線性化，并在存在DIG-UTP的情況下用T3 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。為得到反義RNA探針，將質(zhì)粒用BamHⅠ酶切，并在存在DIG-UTP時用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。探針的長度用堿處理而縮短至長度大約為150bp的片段。依據(jù)標準方案進行雜交，參見Jackson,D.,1991，植物中原位雜交，植物病理學實驗指導，牛津大學出版。
實施例6測定SPL蛋白質(zhì)是核蛋白現(xiàn)已確定SPL蛋白是核蛋白。SPL蛋白與GUS受體基因的翻譯融合體(Jefferson,R.A,自然342(6251):837-8(1989.12))用于此目的。測定核定位的方法先前已對其它蛋白質(zhì)進行闡述(例如，Pepper等，細胞78(1):109-116(1994))。
二個引物，SPL-Xba-S:5’CTAGTCTAGTCTAGAAGATCATCA3’(SEQ ID NO:16)和SPL-Bam H1-T:5’CGGATCCAAGCTTCAAGGACAAATCAATGGT3’(SEQ ID NO:17)，其分別在緊鄰于SPL起始密碼子和SPL終止密碼子上游導入限制性酶位點，用于從cDNA中擴增完整SPL編碼序列。此擴增的片段克隆在pBI221載體(Clontech)中GUS基因的前面，得到pBI221-SPL克隆，其編碼SPL-GUS融合體。pBI221-SPL中的基因融合體由35S啟動子驅(qū)動，并將導致在植物細胞中合成由N末端的完整SPL蛋白和C末端的GUS蛋白組成的融合蛋白。
pBI221-SPL質(zhì)粒DNA用BioRad PDS-1000/He顆粒轟擊系統(tǒng)導入蔥屬植物表皮細胞中。樣本在室溫保持過夜并用X-Gluc染色，X-Gluc是一種檢測GUS活性的組織化學染色劑(Jefferson,R.A.,自然14:342(6251):837-8(1989.12)。發(fā)現(xiàn)SPL-GUS融合蛋白僅在核中定位，而在相同實驗中未融合的對照GUS蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中定位。此試驗表明SPL是核蛋白，這與其作為孢母細胞發(fā)育所需的調(diào)節(jié)蛋白的預期功能相一致。
實施例7 SPL基因的啟動子SPL基因起始密碼子上游的2690個核苷酸的DNA片段融合入稱為pZIP111(Hajdukiewicz,P.等，植物分子生物學25:989-994(1994))的二元T-DNA載體中的無啟動子的GUS基因中以轉(zhuǎn)化植物。SPL啟動子-GUS共構(gòu)建體通過真空滲入導入Landsberg植物中，并通過標準方法選擇轉(zhuǎn)化的植物(例如，Bechtold,N.,和Pelletier,G.,分子生物學方法82:259-266(1998))。組織化學染色法用于監(jiān)測GUS報道基因的表達(Jefferson,RA.,自然342(6251):837-8(1989.12))。轉(zhuǎn)基因植物顯示在大孢子母細胞和小孢子母細胞中GUS報道基因的表達。通過SPL RNA的原位定位測定(參見實施例5)觀測到GUS表達的模式類似于SPL基因的表達模式。此試驗示出SPL起始密碼子上游的2690堿基對DNA含有SPL啟動子區(qū)，且此DNA序列足以賦予異源轉(zhuǎn)基因如GUS基因以SPL基因的表達特異性(即孢母細胞中的表達)。
本發(fā)明通過一些優(yōu)選的實施方案已詳加闡述，但應理解的是在所述權(quán)利要求的范圍內(nèi)可加以修改和變化。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸或其互補序列，其包含編碼SEQ ID NO:4的蛋白質(zhì)的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸或其互補序列，其中所述核酸包含SEQ ID NO:1所示核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸或其互補序列，其中所述核酸包含SEQ ID NO:1的81～1024位核苷酸所示核酸。
4.一種編碼參與植物性母細胞形成的蛋白質(zhì)的分離的核酸或其互補序列，其中所述核酸包括植物中天然存在的DNA，或所述天然存在的DNA的簡并DNA，該核酸在中等嚴格條件下與(a)SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3或其部分，或(b)SEQ ID NO:1或其部分的DNA雜交，其中天然存在的DNA與(a)或(b)的DNA具有至少大約70％的相同性，且其中所述天然存在的DNA編碼所述蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的分離的核酸或其互補序列，其與(a)SEQ IDNO:1的81～1024位核苷酸或其部分，或(b)編碼與(a)編碼的相同的氨基酸序列，但對一些氨基酸采用不同密碼子的(a)的變體具有至少大約70％的相同性。
6.一種編碼參與植物性母細胞形成的蛋白質(zhì)的分離的核酸，其中所述蛋白質(zhì)包含(a)如SEQ ID NO:4所示的相同的氨基酸序列，或(b)與SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少80％同源性，且參與植物性母細胞形成的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的分離的核酸，其中所述核酸被突變以阻斷、降低或提高植物性母細胞形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的分離的核酸，其中所述核酸通過插入一或多個遺傳因子而突變。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述遺傳因子包括Ds序列。
10.一種植物性母細胞形成所需的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括(a)如SEQ ID NO:4所示的相同的氨基酸序列，或(b)與SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少80％同源性，且參與植物性母細胞形成的氨基酸序列。
11.一種識別并與權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
12.一種包含權(quán)利要求10任一氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)。
13.一種用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物，該核酸序列包含編碼SEQ ID NO:4的蛋白質(zhì)的核酸。
14.權(quán)利要求13的用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1所示核酸。
15.權(quán)利要求14的用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1的81～1024位核苷酸所示的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求13、14或15的植物，其中所述核酸被突變以阻斷，降低或提高所述植物中性母細胞形成。
17.一種用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物種子，該核酸序列包含編碼SEQ ID NO:4的蛋白質(zhì)的核酸。
18.權(quán)利要求17的用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物種子，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1所示核酸。
19.權(quán)利要求18的用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物種子，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1的81～1024位核苷酸所示的核酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17、18或19的植物種子，其中所述核酸被突變以阻斷，降低或提高植物性母細胞形成。
21.一種用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物細胞，該核酸序列包含編碼SEQ ID NO:4的蛋白質(zhì)的核酸。
22.權(quán)利要求21的用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物細胞，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1所示核酸。
23.權(quán)利要求22的用分離的核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化的植物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1的81～1024位核苷酸所示的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求21、22或23的植物細胞，其中所述核酸被突變阻斷，降低或提高植物性母細胞形成。
25.一種生產(chǎn)能結(jié)基本上無籽果實或基本上無花粉花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用包含編碼SEQ ID NO:4的蛋白質(zhì)的核酸的核酸或其互補序列轉(zhuǎn)化植物。
26.權(quán)利要求25的生產(chǎn)能結(jié)基本上無籽果實或基本上無花粉花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1所示核酸序列。
27.權(quán)利要求26的生產(chǎn)能結(jié)基本上無籽果實或基本上無花粉花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用核酸序列或其互補序列轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1的81～1024位核苷酸所示核酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求25、26或27的方法，其中所述核酸被突變以阻斷，降低或提高植物性母細胞形成，從而使所述植物能結(jié)所述無籽果實或無花粉花。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸是權(quán)利要求27的核酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸通過插入一或多個遺傳因子而被突變。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述遺傳因子包括Ds序列。
32.一種生產(chǎn)植物的基本上無籽果實或基本上無花粉花的方法，包括在所述植物中表達包含編碼SEQ ID NO:4蛋白質(zhì)的核酸序列的分離的核酸序列或其互補序列，其中所述核酸被突變以阻斷，降低或提高性母細胞形成，從而在所述植物中產(chǎn)生所述無籽果實或無花粉花。
33.權(quán)利要求32的生產(chǎn)植物的基本上無籽果實或基本上無花粉花的方法，包括在所述植物中表達分離的核酸序列或其互補序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1所示核酸序列，其中所述核酸被突變以阻斷，降低或提高性母細胞形成，從而在所述植物中產(chǎn)生所述無籽果實或無花粉花。
34.權(quán)利要求33的生產(chǎn)植物的基本上無籽果實或基本上無花粉花的方法，包括在所述植物中表達分離的核酸序列或其互補序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1和81～1024位核苷酸所示核酸序列，其中所述核酸被突變以阻斷，降低或提高性母細胞形成，從而在所述植物中產(chǎn)生所述無籽果實或無花粉花。
35.根據(jù)權(quán)利要求32、33或34的方法，其中所述核酸通過插入一或多個遺傳因子而被突變。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述遺傳因子包括Ds序列。
37.一種用作雜交探針的分離的核酸或其互補序列，其中所述核酸包括具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其部分的核酸。
38.一種生產(chǎn)能結(jié)基本上無籽果實或基本上無花粉花的植物的方法，包括突變所述植物的負責性母細胞形成的內(nèi)源DNA，其中所述性母細胞形成被阻斷，降低或提高，且所述植物能產(chǎn)生無籽果實或無花粉花。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述內(nèi)源DNA通過直接誘變而被突變。
40.一種分離的核酸或其互補序列，包括編碼阻斷，降低或提高植物性母細胞形成的突變SPL多肽的核酸。
41.一種分離的DNA或其互補序列，包括具有SEQ ID NO:1的81～1024位堿基的至少8個連續(xù)核苷酸的DNA。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的分離的DNA，其中所述的DNA具有SEQID NO:1的81～1024位堿基的至少15個連續(xù)核苷酸。
43.一種分離的DNA或其互補序列，其中所述分離的DNA由SEQ ID NO:1的81～1024位核苷酸序列的8或更多個連續(xù)苷酸組成。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的分離的DNA，其中所述DNA由SEQ IDNO:1的81～1024位核苷酸序列的15或更多個連續(xù)核苷酸組成。
45.一種分離的核酸序列，包含SEQ ID NO:15的-2690～-1位核苷酸所示核酸序列，或與所述序列雜交并啟動與所述核苷酸序列可操縱連接的編碼序列的表達的核苷酸序列。
46.一種能調(diào)節(jié)與其可操縱連接的基因的表達的分離的核苷酸序列或其功能片段，所述序列包含位于SEQ ID NO:15所示核苷酸序列-2690～-1位核苷酸內(nèi)的核苷酸序列，或與所述序列雜交并啟動與其可操縱連接的基因的表達的核苷酸序列。
47.一種在細胞中指導外源或內(nèi)源基因表達的分離的DNA片段，所述片段包含與外源或內(nèi)源基因的ATG超始密碼子可操縱連接的SEQ ID NO:15的-2690～-1位核苷酸所示序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求45或46的分離的核苷酸序列，可操縱地與外源或內(nèi)源功能基因連接。
49.一種調(diào)節(jié)基因表達的方法，包括提供與SPL基因啟動子可操縱連接的相應基因，將所述可操縱連接的基因轉(zhuǎn)移進細胞，并在基因表達條件下表達所述基因，其中所述SPL基因啟動子包含位于SEQ IDNO:15所示核苷酸序列的-2690～-1位核苷酸內(nèi)的核苷酸序列，或與所述序列雜交并啟動與其可操縱連接的基因的表達的核苷酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述細胞是植物的生殖細胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述生殖細胞是孢母細胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述基因編碼核糖核酸酶，轉(zhuǎn)座酶或重組酶。
53.一種植物，包含用可操縱連接于權(quán)利要求45或46所示核苷酸序列并在其控制下的外源基因轉(zhuǎn)化的細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了參與植物生長期間性母細胞形成的基因和所編碼的蛋白質(zhì)。用改變或未改變形式的這些基因轉(zhuǎn)化植物和植物相關(guān)宿主,或突變內(nèi)源形式的這些基因,使植物在生長期間能結(jié)無籽果實和/或無花粉花。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)能結(jié)無籽果實和/或無花粉花的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1310764SQ9980886
公開日2001年8月29日 申請日期1999年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月22日
發(fā)明者葉德, 楊維才, 文卡特森·孫達森, 須健 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學院