專(zhuān)利名稱(chēng)：植物抗病基因的克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
植物抗病基因的克隆，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物在其長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中常受到一些病原微生物的侵襲.它們?cè)谏鷳B(tài)系統(tǒng)中 長(zhǎng)期并存，相互影響乃至協(xié)同進(jìn)化，在這一過(guò)程中植物逐漸獲得了一系列防御機(jī)制來(lái)保護(hù)
自己。90年代初以前，人們?cè)谥参锟剐陨砑翱共⌒栽谏a(chǎn)中的應(yīng)用等方而做了大量的工 作，但植物抗病的分子生物學(xué)研究進(jìn)展一直很緩慢。近幾年來(lái)，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、定位克隆 技術(shù)及染色體登陸技術(shù)的應(yīng)用使人們克隆到了一系列植物抗病基因。

發(fā)明內(nèi)容
基因克隆就是利用體外重組技術(shù)，將特定的基因插入到能夠自主復(fù)制的DNA載體 上，從而引入到寄主細(xì)胞中進(jìn)行增殖的操作。
1 、常用的植物基因克隆技術(shù)
1)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù) 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)是將轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入到欲分離基因的內(nèi)部或附近，基因發(fā)生 突變而被標(biāo)識(shí)然后利用插入DNA片段做探針克隆到該基因。利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)克隆到的 有玉米的Hml基因，蕃茄的Cf-9基因，煙草的N基因和亞麻的L6基因。玉米中的可轉(zhuǎn)移因 子如Ac/Ds， Spm及Mu為克隆植物中未知結(jié)構(gòu)和功能的抗病基因帶來(lái)了一線希望。但是由 于太高的突變率而使R基因的克隆受到阻滯，如玉米的Rpl。 第一個(gè)利用轉(zhuǎn)座子技術(shù)克隆到的是玉米的Hml基因，Hml定位于第一染色體的 長(zhǎng)臂上，它對(duì)真菌病原物Cochliobolus carbo皿m的一號(hào)小種有抗性，它編碼一個(gè)依賴(lài)于 NADra的HC毒素還原酶，并與二氫葉酸還原酶高度同源，造成HC毒素分子毒性位點(diǎn)羰基的 失活。與那些依賴(lài)于Avr基因的R基因不同，其抗病機(jī)制并不符合基因?qū)蚰Ｊ?，因?yàn)镠ml 的毒素降解方式并不涉及到Avr基因，不能誘導(dǎo)過(guò)敏性植物細(xì)胞死亡，沒(méi)有基因?qū)虻?一些顯著標(biāo)志。Hm2基因?qū)υ摬≡镉胁糠挚剐裕欢ㄎ辉诘诰湃旧w的長(zhǎng)臂上，是Hml 的復(fù)等位基因。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)運(yùn)用的前提條件是被操作的植物有現(xiàn)成的操作系統(tǒng)或有成 熟的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及有效的大規(guī)模突變體篩選的手段。
2)圖位克隆技術(shù) 圖位克隆技術(shù)是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，目標(biāo) 基因精確定位在染色體特定位置之后，用目標(biāo)基因兩側(cè)緊密連鎖的標(biāo)記篩選含有大的插入 片段的基因組文庫(kù)(如BAC和YAC)，通過(guò)染色體步行(Chromosome Walking)篩選到含有目 標(biāo)基因的克隆，最后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。其核心技術(shù)是染色體步行，如 果能找到與目標(biāo)基因很近的標(biāo)記，以至于二者之間的距離小于基因組文庫(kù)中克隆的平均插 入片段大小，就可以直接篩選到含有目標(biāo)基因的克隆，最終得到候選基因，這種策略稱(chēng)為染 色體登陸(Chromosome Landing) (Tanksley et al，1995)。
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圖位克隆技術(shù)的發(fā)展大大加速了抗病基因的克隆，利用圖位克隆技術(shù)克隆到的抗 病基因有蕃茄的Pto基因、Cf-2基因，擬南芥的RPS2基因、RPM基因、NPR1基因和水稻的 Xa21、 Xal、 Pi_b等基因。蕃茄的Pto基因是第一個(gè)圖位克隆到的抗病基因，它符合基因?qū)?基因模式，利用與Pto緊密連鎖的RFLP標(biāo)記得到一個(gè)含有Pto區(qū)域的YAC克隆，此YAC克 隆用于分離Pto區(qū)域的cDNA，然后利用遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)鑒定cDNA克隆。此基因含有一個(gè)由 963bp構(gòu)成的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，其蛋白產(chǎn)物是一個(gè)沒(méi)有明顯跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)
域的絲_蘇氨酸蛋白激酶，它在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。
3)同源克隆法 同源克隆法的理論基礎(chǔ)是，幾乎所有的基因之間都彼此相關(guān)。人們將功能相似，來(lái) 自相同始祖的基因歸為一個(gè)家族，基因家族的成員往往成簇存在，幾個(gè)基因家族組成一個(gè) 超基因家族，超基因家族各成員之間既有高度同源區(qū)域，也有高度趨異區(qū)。首先根據(jù)基因家 族各成員間保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后用簡(jiǎn)并引物對(duì)含有目的基因的DNA文庫(kù)進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和功能鑒定。
4)差異表達(dá)基因的克隆 生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及衰老過(guò)程是遺傳信息有序地時(shí)空表達(dá)的結(jié)果，因而分離差 異表達(dá)基因?qū)⑹钦J(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程的切入點(diǎn)。分離差異表達(dá)基因的有三種方法差異篩選 (differentialscreening)、扣除雜交(subtraction hybridization)禾口差異顯不反轉(zhuǎn)錄 PCR(differential displayreverse transcription PCR，DDRT-PCR)，前兩種方法因缺點(diǎn)較 多，應(yīng)用較少，DDRT-PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用較多。DDRT-PCR技術(shù)利用真核生物成熟mRNA具有 3' -Poly (A)結(jié)構(gòu)，用Oligo-dTMN(M = ACG， N = AGCT)作為錨定引物與mRNA的Poly (A) 結(jié)合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以原Oligo-dTMN和10bp隨機(jī)引物 組成的引物對(duì)在不同來(lái)源的cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。把用相同引物對(duì)在不同來(lái)源cDNA中獲 得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并排在聚丙烯酰胺測(cè)序膠上電泳分離，由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同 位素或熒光素標(biāo)記，通過(guò)自顯影或顯色，即可獲得差異表達(dá)基因擴(kuò)增的條帶。將差異表達(dá)的 cDNA條帶回收、克隆后，作為探針通過(guò)Northern雜交驗(yàn)證，即可用于全長(zhǎng)基因的分離。該技 術(shù)具有簡(jiǎn)便、靈敏、RNA用量少、效率高，可同時(shí)比較多種生理狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)mRNA樣品等優(yōu)點(diǎn)。
5)表達(dá)序列標(biāo)簽法 表達(dá)序列標(biāo)簽是完整基因上能夠特異性標(biāo)記基因的一部分序列，通常包含了基因 足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，從而與其它基因相區(qū)分?；具^(guò)程為對(duì)已知的部分序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)分 析，篩選出代表新基因的EST及相應(yīng)的重疊群、定位信息等，根據(jù)所得信息設(shè)計(jì)引物，制備 探針；用探針進(jìn)行cDNA文庫(kù)篩選，得cDNA陽(yáng)性克隆，接著用所設(shè)計(jì)的引物與所得cDNA陽(yáng) 性克隆載體臂進(jìn)行巢式PCR和5'、3' -RACE，得S'端和、3'端部分序列；對(duì)所得陽(yáng)性克隆和 末端序列進(jìn)行測(cè)序；通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)新序列進(jìn)行分析；若第一步有新EST的定位信息，即可對(duì) 基因進(jìn)行定位和結(jié)構(gòu)分析，若無(wú)定位信息，還要篩選基因組文庫(kù)，進(jìn)行測(cè)序和熒光原位雜交 (FISH)定位等工作；最后對(duì)新發(fā)現(xiàn)的基因進(jìn)行突變檢測(cè)和表達(dá)分析。
權(quán)利要求
常用的植物基因克隆技術(shù)1)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)是將轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入到欲分離基因的內(nèi)部或附近，基因發(fā)生突變而被標(biāo)識(shí)然后利用插入DNA片段做探針克隆到該基因，利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)克隆到的有玉米的Hm1基因，蕃茄的Cf-9基因，煙草的N基因和亞麻的L6基因，玉米中的可轉(zhuǎn)移因子如Ac/Ds，Spm及Mu為克隆植物中未知結(jié)構(gòu)和功能的抗病基因帶來(lái)了一線希望，但是由于太高的突變率而使R基因的克隆受到阻滯，如玉米的Rp1，2)圖位克隆技術(shù)圖位克隆技術(shù)是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，目標(biāo)基因精確定位在染色體特定位置之后，用目標(biāo)基因兩側(cè)緊密連鎖的標(biāo)記篩選含有大的插入片段的基因組文庫(kù)(如BAC和YAC)，通過(guò)染色體步行(Chromosome Walking)篩選到含有目標(biāo)基因的克隆，最后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。其核心技術(shù)是染色體步行，如果能找到與目標(biāo)基因很近的標(biāo)記，以至于二者之間的距離小于基因組文庫(kù)中克隆的平均插入片段大小，就可以直接篩選到含有目標(biāo)基因的克隆，最終得到候選基因，這種策略稱(chēng)為染色體登陸(Chromosome Landing)(Tanksley et al，1995)，3)同源克隆法同源克隆法的理論基礎(chǔ)是，幾乎所有的基因之間都彼此相關(guān)。人們將功能相似，來(lái)自相同始祖的基因歸為一個(gè)家族，基因家族的成員往往成簇存在，幾個(gè)基因家族組成一個(gè)超基因家族，超基因家族各成員之間既有高度同源區(qū)域，也有高度趨異區(qū)。首先根據(jù)基因家族各成員間保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后用簡(jiǎn)并引物對(duì)含有目的基因的DNA文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和功能鑒定。4)差異表達(dá)基因的克隆生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及衰老過(guò)程是遺傳信息有序地時(shí)空表達(dá)的結(jié)果，因而分離差異表達(dá)基因?qū)⑹钦J(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程的切入點(diǎn)。分離差異表達(dá)基因的有三種方法差異篩選(differentialscreening)、扣除雜交(subtraction hybridization)和差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(differential displayreverse transcription PCR，DDRT-PCR)，前兩種方法因缺點(diǎn)較多，應(yīng)用較少，DDRT-PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用較多。DDRT-PCR技術(shù)利用真核生物成熟mRNA具有3′-Poly(A)結(jié)構(gòu)，用Oligo-dTMN(M＝ACG，N＝AGCT)作為錨定引物與mRNA的Poly(A)結(jié)合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以原Oligo-dTMN和10bp隨機(jī)引物組成的引物對(duì)在不同來(lái)源的cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。把用相同引物對(duì)在不同來(lái)源cDNA中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并排在聚丙烯酰胺測(cè)序膠上電泳分離，由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素或熒光素標(biāo)記，通過(guò)自顯影或顯色，即可獲得差異表達(dá)基因擴(kuò)增的條帶。將差異表達(dá)的cDNA條帶回收、克隆后，作為探針通過(guò)Northern雜交驗(yàn)證，即可用于全長(zhǎng)基因的分離。該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、靈敏、RNA用量少、效率高，可同時(shí)比較多種生理狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)mRNA樣品等優(yōu)點(diǎn)。5)表達(dá)序列標(biāo)簽法表達(dá)序列標(biāo)簽是完整基因上能夠特異性標(biāo)記基因的一部分序列，通常包含了基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，從而與其它基因相區(qū)分?；具^(guò)程為對(duì)已知的部分序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)分析，篩選出代表新基因的EST及相應(yīng)的重疊群、定位信息等，根據(jù)所得信息設(shè)計(jì)引物，制備探針；用探針進(jìn)行cDNA文庫(kù)篩選，得cDNA陽(yáng)性克隆，接著用所設(shè)計(jì)的引物與所得cDNA陽(yáng)性克隆載體臂進(jìn)行巢式PCR和5’、3’-RACE，得5’端和、3’端部分序列；對(duì)所得陽(yáng)性克隆和末端序列進(jìn)行測(cè)序；通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)新序列進(jìn)行分析；若第一步有新EST的定位信息，即可對(duì)基因進(jìn)行定位和結(jié)構(gòu)分析，若無(wú)定位信息，還要篩選基因組文庫(kù)，進(jìn)行測(cè)序和熒光原位雜交(FISH)定位等工作；最后對(duì)新發(fā)現(xiàn)的基因進(jìn)行突變檢測(cè)和表達(dá)分析。
全文摘要
基因克隆就是利用體外重組技術(shù)，將特定的基因插入到能夠自主復(fù)制的DNA載體上，從而引入到寄主細(xì)胞中進(jìn)行增殖的操作。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101760462SQ20081023857
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者李祥 申請(qǐng)人:李祥