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      通過胞質內精子注射進行哺乳動物基因轉移的制作方法

      文檔序號:454425閱讀:643來源:國知局
      專利名稱:通過胞質內精子注射進行哺乳動物基因轉移的制作方法
      本申請要求了美國臨時專利申請60/096,078(1998年8月11日提交)和60/133,970(1999年5月13日提交)的優(yōu)先權。
      美國政府在本發(fā)明中有一個已支付的許可,并且在一定情況下有權根據國立兒童健康與人類發(fā)育研究所資助合同No.HD-34362中的條款要求專利所有人以合理的條件許可他人。
      背景技術
      轉基因動物對于科學、藥物和農業(yè)用途很重要。用基因工程改造的牲畜在牛奶中產生外來蛋白被認為是一種適合用于生產治療性重組蛋白的系統(tǒng)。另外,將人基因插入諸如豬等動物的基因組中就可使這些動物作為活的器官或細胞“工廠”用于生產不會被人免疫系統(tǒng)排斥的人器官或細胞。
      現已報道了幾種方法通過將外來DNA導入其體細胞和生發(fā)細胞來獲得轉基因哺乳動物。這些方法中有一種是前核顯微注射,該方法已被廣泛采用,它在1980年代早期首先從小鼠模型發(fā)展而成。前核顯微注射需要將轉基因(tg)DNA注射入單細胞胚的前核中[J.W.Gordon,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,7380(1980);J.W.Gordon和F.H.Ruddle,Science 214,1244(1981);R.D.Palmiter和R.L.Brinster,Annu.Rev.Genet.20,465(1986);和J.W.Gordon,Int.Rev.Cytol.115,171(1989)]。盡管小鼠中前核合子的產生是簡單的,但是對于諸如較大的商用動物品種等動物種類卻不一定如此。例如,在牛和豬中,當大量脂質使得合子變得不透明時,合子是難以進行前核注射的基質;相反,小鼠的合子是透明的。
      通過DNA構建物轉染獲得的轉基因胚干細胞(ES)已被用于獲得牛、羊等的嵌合動物。該方法涉及將攜帶有所需突變的基因工程改造的ES細胞注射入處于胚胎發(fā)育的桑椹胚期(約20-50個細胞)或胚泡期(約100個細胞)的受精胚中。植入后,這些胚胎通常形成嵌合的動物,該動物隨后與野生型動物交配,導致ES細胞衍生的基因組的種系傳遞的頻度不同(通常等于0)。由于轉基因的效率低且需要大量受體動物進行胚胎轉移,因此用該方法很難產生大的轉基因動物。
      上述的前核顯微注射方法和ES細胞轉染方法至今均未能得到受控制或預期的tg插入結果,因為異源DNA導入細胞通常會導致不利的“位置”或拷貝數效應,這些效應是由轉基因或其多個拷貝整合到宿主基因組中的準隨機方式引起的(J.W.Gordon,同上)。因此,這些方法生產大的轉基因動物的效率很低。
      已經報道,用轉染了能同源重組的DNA構建物的小鼠ES細胞系可較好地控制轉基因整合的結果[M.J.Evans和M.H.Kaufman,Nature 292,154(1981);M.Kuehn,等人,同上,326,295(1987)]。這些“基因導向”的ES細胞是這樣的細胞,其中一個或多個特異性基因以非常精確的方式經剔除或修飾而不影響整個基因組的其它任何基因座。已經建立了“無限增殖的”轉基因ES細胞系,并在體外作了充分地特性鑒定,以確認構建物整合位點。然而,基因導向目前還局限于存在已確定種系貢獻的ES細胞系的一種動物—小鼠。
      改進哺乳動物種系的現有策略的限制刺激著尋找另一種方法,包括用重組逆轉錄病毒來感染卵母細胞或植入前的胚胎[D.Jahner,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,6927(1985);A.W.S.Chan,等人,同上,95,14028(1998)],和用復制缺陷型腺病毒介導的輸送系統(tǒng)[Y.Kanegae,等人,Nucl.Acids Res.23,3816(1995)]。然而,病毒方案暗示克隆需要額外的步驟,且必須對重組腺病毒和逆轉錄病毒工程改造需要有專業(yè)的防范設施。用這些方法輸送病毒還需要顯微注射設備或是從卵母細胞中除去透明帶。
      另有報道,體外受精(IVF)期間可用精子作為輸送DNA的載體[M.Lavitrano,等人,Cell 57,717(1989)]。在該方法中,用活的精子作為將重組DNA導入體外卵母細胞的載體。盡管精子介導DNA轉移給后代具有明顯簡化轉基因動物的產生的潛力,但是關于活精子方法促進轉基因的效率方面還有很多爭論,因為它持續(xù)產生轉基因動物的能力不可靠[M.Lavitrano,等人,1989,同上;R.N.Brinster,等人,Cell 59,239(1989);B.Maione,等人,Mol.Reprod.Dev.50,406(1998)]。在一份報道中,已經證實外源DNA能以可逆方式修飾完整精子[M.Lavitrano,等人,Mol.Reprod.Dev.,31,161(1992)],暗示膜結構可能對精子頭與外源重組DNA的穩(wěn)定連接起了屏障作用。在另一個報道中,活小鼠精子與質粒DNA體外培育2小時顯示出外源DNA有些被胞核和質膜吸收。如6小時前于輸精管內注入質粒DNA,來自輸精管的精子也顯示出有些胞核吸收。然而,這些精子都不能用來使卵母細胞受精[E.Huguet和P.Esponda,Mol.Reprod.Dev.,51,42(1998)]。
      因此,仍然需要一種能可靠地用來產生轉基因動物的有效的轉基因轉移方法。更具體地說,需要一種獲得經基因工程改造的牲畜或其它大動物用作藥物“工廠”和異種移植用人器官或細胞來源的有效的方法。
      發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種獲得轉基因胚胎的方法,該方法包括下列步驟將外源核酸和膜被破壞的精子頭或脫膜的精子頭一起插入未受精卵母細胞胞質,形成轉基因受精的卵母細胞,使該轉基因受精的卵母細胞發(fā)育成轉基因胚胎,如果需要,發(fā)育成活的后代。共同插入的步驟宜包含使膜被破壞的或脫膜的精子頭與外源核酸預培育30秒至大約5分鐘的步驟,培育時間通常約為45秒至3分鐘,更典型的約為1分鐘至2分鐘。精子頭和外源核酸的共同插入卵母細胞是通過顯微注射實現的,較佳的是用壓電驅動的顯微注射來實現。與膜經破壞或脫膜的精子頭混合的外源核酸可含有多個轉基因,用以產生多個轉基因的轉基因胚胎。
      適用于本發(fā)明的膜經破壞的精子頭可從凍融的精子或重新水化的凍干的精子獲得。用凍干法保藏精子并用所得重建的凍干精子來使卵母細胞體外受精產生胚胎和活后代的方法是我們的待批美國專利申請No.09/177,391(1998年10月23日提交)中的主題,該文內容納入本文作為參考。適用于本發(fā)明的脫膜精子頭包含胞核和核周物質,它可通過洗滌劑處理新鮮精子來獲得(如下所述)。
      本發(fā)明的方法可用來產生轉基因胚胎或諸如靈長類動物、羊、牛、豬、熊、貓、狗、馬和嚙齒類動物等哺乳動物的活后代。該方法還可用來產生轉基因的無脊椎動物,例如但不局限于海膽、龍蝦、鮑魚或有殼的水生動物。該方法還可用來產生轉基因魚類、兩棲動物、爬行動物和鳥類。本文已經發(fā)現,用本發(fā)明方法產生的活的轉基因后代(起始動物(founder animal))本身能產生轉基因后代,這表明轉基因穩(wěn)定地整合到起始動物的基因組中,且起始動物具有生殖力。
      本文描述的哺乳動物轉基因方法與以前的體外方法形成對比,以前的方法是將外源DNA前核注射入受精的卵母細胞中,或是將活的完整的精子與外源DNA混合并用這些經處理的精子使卵母細胞受精,從而形成轉基因胚胎。在本發(fā)明方法中,未受精的中期II卵母細胞的使用顯示出該方法比需要受精卵的方法更為簡化和容易。另外,用胞質內精子注射(ICSI)進行轉基因可避免前核顯微注射的某些缺點。例如,使用管尖大100倍(例如直徑1微米的前核顯微注射管口約為0.78μm2,而直徑為10微米的ICSI管口約為78μm2)的顯微注射移液管有利于處理大的構建物,例如酵母或哺乳動物人工染色體。另外,利用本發(fā)明的方法,轉基因DNA與膜破壞或脫膜的精子頭的連接暗示著兆堿基和亞兆堿基構建物可進一步得到穩(wěn)定和保護。
      附圖簡述

      圖1的顯微照片描述了通過小鼠精子頭的典型矢狀切面,其中精子是完整(新鮮)的(A)、或膜已被Triton X-100破壞(B)、經過凍融(C)、或冷凍干燥(D)。ac,頂體帽;eq,赤道段;pa,頂體后區(qū)。
      圖2的顯微照片描述了單發(fā)(single-shot)雙重轉基因產生的轉基因胚胎。用經pCX-LacZ和pCX-EGFP tg DNA混合物預培養(yǎng)的精子顯微注射卵母細胞。圖2A、2B和2C(X400)分別顯示了3.5天后的相同的胚胎,圖2A用Hoffman調節(jié)相差顯微鏡觀察,不染色;圖2B長波長(480nm)紫外光下觀察的GFP表達;圖2C用X-gal染色來觀察β-半乳糖苷酶表達。
      圖3的顯微照片描述了對轉基因起始動物和非轉基因對照動物尾端活檢物的分析。(圖3A)非轉基因(a)(小鼠16)和轉基因的有綠色熒光(b)(小鼠3)小鼠系尾端的熒光立體顯微鏡檢查(X40)。綠色熒光皮膚可通過非綠色毛發(fā)來看出。(圖3B)用pCX-EGFP片段作為探針,對對照B6D2F1(野生型,wt)(0)以及小鼠3(5-9)、19(>50)、28(5-9)和41(2)的總DNA進行Southern印跡分析。每個基因組中估計的轉基因拷貝數顯示在括號內。(圖3C)對小鼠16、17、30、36、47、49、對照B6D2F1(野生型)、小鼠3、19、28和41的總DNA進行PCR分析。
      發(fā)明詳述本發(fā)明提供了獲得轉基因胚胎的方法,該方法是將外源核酸和膜經破壞的精子頭或脫膜的精子頭一起共同插入到未受精的卵母細胞內。本發(fā)明的方法包括下列步驟(i)獲得膜破壞的精子或脫膜的精子頭,(ii)使膜破壞的精子或脫膜的精子頭與含有所需基因的外源核酸混合,和(iii)將外源核酸和膜破壞的精子頭或脫膜的精子頭共同插入到分離的未受精的卵母細胞內,以形成表達所需轉基因的轉基因胚胎。該方法還包括這樣一個步驟,即將轉基因胚胎植入代孕母親子宮內,使該胚胎發(fā)育成活的轉基因后代。
      下面將更詳細地描述本發(fā)明方法各步驟和亞步驟的實施方案。
      新鮮精子的制備無脊椎動物和脊椎動物的新鮮精子可用本領域技術人員已知的方法來收集。例如嚙齒類動物(如小鼠、金色(Syrian)倉鼠、豚鼠)、家兔等的成熟精子可以從附睪尾收集;而在其他種類的動物如人、豬、馬、公牛、山羊、禽等情況下,可以從能育雄性剛射出的精液分離出成熟精子。魚(例如劍尾魚(swordtail),Xiphophorus helleri)以及無脊椎動物如海膽(Tripneustes gratilla)的精子可以從成熟雄性的睪丸收集得到。
      下面是從附睪尾獲得精子的一個方法例子。摘取成熟雄性小鼠(出生后約8周或以上)的附睪尾。除去附睪尾表面的血液和脂肪組織。然后將其壓縮,釋放出稠密的精子團。將1滴(約2微升)精子團置于1.5毫升聚丙烯離心試管底部,用0.5毫升溫熱的生理培養(yǎng)液(如CZB培養(yǎng)液(其組成如下所述)、磷酸鹽緩沖鹽水或等滲鹽溶液)覆蓋。置37℃下約10至20分鐘后,可以從上清液中收集到游動的精子。
      下面是從精液中獲得精子方法的一個例子。使新鮮射出的人精液在室溫下(約25℃)液化約30分鐘。然后用約10毫升鹽水稀釋精液,并過濾通過大約兩層紗紙,除去碎片。然后以400xg離心該濾液大約10分鐘,將沉淀的精子重懸于生理溶液中至所需濃度。
      下面是從睪丸獲得精子的方法的一個例子。將切下的睪丸置于紅細胞裂解緩沖液(例如155mM NH4Cl,10mM KHCO3,2mM EDTA,pH 7.2-7.4)中,用細剪刀剪碎,并通過約兩層紗紙過濾除去碎片。然后離心濾液(例如700xg,5分鐘),將沉淀重懸于生理溶液中至所需濃度。
      圖1(A)中描述了具有完整原生質和頂體膜的如此回收的小鼠精子,該圖是通過小鼠精子頭的典型矢狀切面的顯微照片,其中"ac"代表頂體帽,"eq"代表赤道段,"pa"代表頂體后區(qū)。將精子懸于備用于凍融或冷凍干燥過程的下述生理培養(yǎng)基中?;蛘撸蓪幼鬟M一步加工,以獲得脫膜的精子頭。
      膜破壞的精子的制備膜破壞的新鮮精子如上所述獲得的新鮮精子的膜可通過機械方式來破壞,例如在顯微注射移液管中通過施加來自壓電驅動顯微注射單元(如下所述)的單脈沖,使精子頭與尾部離位。本文所用的術語“新鮮的”精子指這些用于顯微注射到未受精卵母細胞中的膜被破壞的精子,它們與以前IVF報道中用作輸送DNA的載體的“活的”精子不同。
      凍融的精子冷凍然后融化精子,使質膜破壞,質膜破壞可通過如下文詳細描述的存活力染色技術來測定,該技術能區(qū)分質膜完整(活的)和質膜受損(死的)細胞。如此凍融的膜受破壞的精子在常規(guī)意義上認為是“死的”。凍融精子可根據T.Wakayama,等人,J.Reprod.Fert.112,11(1996)和S.Kuretake,等人,Biology ofReproduction 55,789(1996)中描述的方法來制備。具體地說,將小鼠附睪精子懸于CZB培養(yǎng)基中,然后用或不用諸如18%(w/v)蜜三糖的冷凍保護劑冷卻至-20℃、-50℃或-196℃,冷凍保藏1-28天,然后融化,當其頭部顯微注射到未受精卵母細胞中后,它能支持發(fā)育成正常能育的活后代。
      在冷凍小鼠附睪精子的典型方法中,CZB培養(yǎng)基中的精子濃度約為3-10×106/毫升。將100微升精子懸液一份轉移到1.5毫升聚丙烯微量離心管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中,與含有或不含36%(w/v)D(+)-蜜三糖(最終濃度為18%蜜三糖)的等體積CZB培養(yǎng)基充分混合。將50微升此懸浮液分散在有標記的1毫升低溫小管(A/SNUNC,Copenhagen)中。緊密蓋上小管,直接置于-20℃或-50℃冷凍機或液氮(-196℃)中。樣品保藏期為1天至4周。
      至于融化,將小管從冷凍機或液氮中取出,在24或26℃的水或空氣中放置大約10分鐘?,F在融化的精子懸液就可用于如下所述的胞質內精子注射(ICSI)。
      盡管這里描述了針對小鼠附睪精子獲得凍融精子的方法,但是本領域技術人員無需過多實驗就可將該方法改用于其它脊椎動物和無脊椎動物的精子。
      重新水化的凍干的精子凍干的精子使質膜受到破壞,質膜破壞可通過能區(qū)分質膜完整(活的)和質膜受損(死的)細胞的存活力染色技術(如下所述)來測定。如此凍干的膜受破壞的精子在常規(guī)意義上認為是“死的”。凍干精子可根據T.Wakayama及R.Yanagimachi,NatureBiotechnology 16,639,(1998)以及我們的待批美國專利申請No.09/177,391(1998年10月23日)中描述的方法來制備。具體地說,該專利申請公開了一種可用于凍干脊椎動物和無脊椎動物精子的通用方法。在一個典型的方法中,將小鼠附睪精子懸于(1)不含乙二胺四乙酸(EDTA)、含有4毫克/毫升BSA的CZB培養(yǎng)基中,或(2)添加了10%(v/v)胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中,然后在液氮中冷凍,干燥至含水量接近0%,凍干保藏長達6個月,然后重新水化,當精子重新水化且精子頭顯微注入未受精的卵母細胞中后,精子支持發(fā)育成正常能育的活后代。
      在一個典型的冷凍小鼠附睪精子的方法中,CZB或DMEM培養(yǎng)基中的精子濃度約為3-10×106/毫升。將精子懸液一份(100微升)置于2毫升安瓿(Wheaton Scientific,Millville,NJ,目錄號651506)中,將安瓿直接放入液氮中。10分鐘后,將安瓿放入與冷凍干燥系統(tǒng)(10-020型,VirTis Co.,Gardner,NY)相連的預冷(-50℃)冷凍瓶中。入口壓力約為1微米汞柱。大約12小時后,在系統(tǒng)中充入氣體干燥罐(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA目錄號09-204)提供的氬氣后,從系統(tǒng)中取出冷凍瓶。將每個安瓿與真空泵相連,在99%以上的氣體被抽出后,密封安瓿結構。安瓿各自用鋁箔包裹,于暗處室溫(約25℃)或4℃下保藏待用,最多可保藏1年。
      為了重新水化上述冷凍干燥的精子,將上述制得的含凍干精子的安瓿打開,將100微升蒸餾水加入安瓿內,形成重建的精子懸液。
      盡管這里描述了針對小鼠附睪精子來獲得重新水化的冷凍干燥的精子的方法,但是本領域技術人員無需過多實驗就可將該方法改用于其它脊椎動物和無脊椎動物的精子,正如美國專利申請No.09/177,391中指出的那樣。
      已經注意到,精子頭注射后卵母細胞的激活和正常受精的發(fā)生率看來隨凍干精子重新水化后的時間的增加而減少。重新水化和注射之間可允許的時間可能因動物種類而異;然而,作為一個例子,對于小鼠精子,該期間宜為1小時或更少。
      脫膜精子頭的制備脫膜的精子頭是缺少所有膜(包括質膜以及頂體內膜和外膜)、但是保留了胞核和核周物質的經洗滌劑抽提的頭部。例如,可用含有或不含SDS(十二烷基硫酸鈉)的Triton X-100處理使精子頭脫膜。Triton X-100是熟知的非離子表面活性劑,它廣泛用于在非變性條件下除去膜組分。SDS是陰離子洗滌劑,用來使各種蛋白(包括膜蛋白)增溶。在小鼠中,用Triton X-100脫膜的精子頭表明能激活卵母細胞,導致正常的胚胎發(fā)育。
      下面是對精子頭脫膜的一個典型方法。對上述制得的精子懸液一份進行超聲處理。例如,將上述從附睪尾、睪丸或精液中收集的精子懸浮在5毫升BM緩沖液(75mM氯化鈉、24mM EDTA和50mM Tris-HCl,pH 7.2)中,在Biosonik超聲儀(BronwillScientific,Rochester,NY)以70-80%輸出功率超聲處理30秒。該處理使95%以上的精子斷頭。為了使精子頭脫膜,使超聲后的精子懸液以700xg離心5分鐘,用BM緩沖液洗滌沉淀,然后在室溫下用1%Triton X-100(以NIM培養(yǎng)液配制)處理5分鐘(NIM培養(yǎng)液由123.0mM氯化鉀、2.6mM氯化鈉、7.8mM磷酸二氫鈉、1.4mM磷酸二氫鉀、3mM EDTA二鈉組成,pH 7.2)。然后用NIM培養(yǎng)液充分洗滌頭部,并重懸于精子懸浮培養(yǎng)液中。
      精子存活力的測定圖1(B),(C)和(D)的顯微照片代表了通過精子頭前區(qū)的矢狀切面,這些圖表明,經Triton X-100(洗滌劑)處理(B)、凍融(C)或冷凍干燥(D)的精子中除赤道區(qū)以外的質膜和頂體膜不存在或被破壞。精子存活力可用能區(qū)分常規(guī)意義上是活的或死的精子的任何染色方法來測定。一種適用于本發(fā)明的市售的存活力測試試劑盒是購自Molecular Probes,Eugene,Oregon的Live/dead FertiLight,它能在碘化丙錠/SYBR 14染色后根據UV顯微鏡下的熒光圖案來區(qū)分質膜完整的(活的)和質膜受損的(死的)細胞。具有完整質膜的“活的”精子的胞核熒光呈綠色,而“死”的精子胞核的熒光呈亮橙紅色。預期上述所有用物理膜破壞、凍融、凍干和脫膜過程制得的精子在常規(guī)意義下都是“死”的。
      含有轉基因的外源核酸的選擇和制備根據本發(fā)明,基因轉化是將外源外來DNA穩(wěn)定地整合到受精卵的基因組內,包括將外來DNA整合到宿主細胞胞核DNA和/或線粒體中的胞外DNA中。外來DNA是受精卵在轉化前并不固有的(或通常不存在的)、或是通常不以一個以上拷貝存在的遺傳物質。然而,“外來”DNA可包括固有基因或基因序列的另一拷貝,它們?yōu)榱斯惨种频哪康亩鴮搿?br> 外來遺傳物質可包括任何來源的DNA,這些來源包括但不局限于,植物、細菌、病毒、噬菌體、質粒、質體、哺乳動物和合成的DNA構建物。DNA可以是環(huán)形的或線形的,可以是單鏈或雙鏈。DNA可以有義或反義的構型、以單鏈或雙鏈形式插入宿主細胞DNA。插入宿主細胞的所有或部分DNA可以整合入宿主的基因組中。
      含有特異性基因的質粒和其它克隆載體的選擇和/或合成構建是本領域中熟知的。嵌合質粒的合成構建物含有感興趣的基因,且通常含有從不同來源獲得的啟動子和/或前導序列,以實現插入宿主基因組。盡管原核克隆載體序列對顯微注射基因的整合頻度沒有明顯的影響,但是注意到,它們能嚴重地抑制導入哺乳動物(如小鼠)種系的真核基因的表達[見,B.Hogan,等人,《小鼠胚胎的操作》E部分,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,22頁(1994)]。因此,可以建議在將其導入諸如小鼠的哺乳動物種系之前除去克隆基因的基本上所有的載體序列,如果希望基因表達最優(yōu)的話。載體序列可用用本領域技術人員已知的方法根據載體上的限制性位點用限制性酶來除去,以產生含有所需基因、啟動子、增強子等的片段。
      導入基因的表達水平主要取決于啟動子強度以及轉染細胞中整合的DNA的拷貝數。因此,表達載體采用非常強的啟動子,例如SV40早期或晚期啟動子、巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV-IE)、胞質β-肌動蛋白啟動子和腺病毒主要晚期啟動子。
      DNA成功輸送入細胞可通過“報道”基因的表達來初步評價。報道基因是用于轉化的DNA的一個組分,它可與賦予其它所需特性的轉基因相同或不同。該報道基因賦予轉化細胞或組織的特性通常容易用組織化學或熒光試驗來檢測。有許多常用的體外報道基因可用來定量測定轉染效率,且含有報道轉基因的眾多質粒和克隆載體可從商業(yè)途徑購得,本領域技術人員已知的例如有Sratagene,Inc.,LaJolla,CA和Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto。用于本發(fā)明的典型的報道基因包括,但不局限于,分泌型堿性磷酸酶[SEAP]、β-半乳糖苷酶(β-gal)、火螢螢光素酶和氯霉素乙酰轉移酶(CAT)。體內報道物試驗,如原位β-gal染色、原位β-葡糖醛酸酶(GUS)試驗和原位螢光素酶試驗也可用來檢測固定細胞或組織切片中的基因轉移。這些過程能在用酶促底物或抗體染色后顯示出轉染的細胞。在這些過程中,大腸桿菌LacZ基因表達后的原位β-gal染色是一種廣泛使用的方法,因為該方法簡單、靈敏。在該過程中,β-gal與X-gal底物的反應產生了易在光學顯微鏡下顯色的深藍色,從而提供了直接測定轉染效率的方法。
      水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(GFP)已經成為一種監(jiān)測各種細胞和生物體中基因表達和蛋白質位置的重要的報道物[R.Y.Tsien,Annu.Rev.Biochem.67,509(1998);G.Zhang,等人,Biochemical and Biophysical Research Communications 227,707-711(1996);T.Takada,等人,Nature Biotechnology 15,458-460(1997)]。由于GFP不需要任何底物來用于檢測,因此它是選擇轉基因胚胎的合適的標記物。當細胞被UV或藍光激發(fā)時,真核細胞中表達的GFP產生綠色熒光。GFP中的發(fā)色團是蛋白質一級結構中固有的,且來自GFP的熒光不需要其它輔因子、底物或其它基因產物。GFP熒光是穩(wěn)定的,不依賴于動物種類,可用熒光顯微鏡檢技術、流式細胞計數和肉眼成像來作非侵入性地監(jiān)測。為了增強受藍光激發(fā)時的GFP熒光強度,已經構建出了增強型GFP(EGFP)變體(pEGFP-C1購自Clonteeh Laboratories),它含有人CMV的立即早期啟動子和SV40聚腺苷酸化信號,以推動哺乳動物細胞中EGFP基因的表達。
      精子與含有所需轉基因的載體片段的混合上述制得的精子可以不經進一步制備(新鮮的)或在經受上述三種膜破壞過程之一后與載體片段混合。在典型的混合過程中,將1微升含有載體片段(約2.5毫微克/微升)的DNA溶液與9微升諸如CZB或NIM的生理培養(yǎng)基中含有大約2-5×105個精子的懸浮液混合,混合用移液管進行,使最終DNA片段濃度為7毫微克/微升。在室溫(約25℃)或冰上培育該混合物約30秒至5分鐘,通常約45秒至3分鐘,更典型的約1-3分鐘,較佳的大約1分鐘。精子和DNA片段的濃度,以及培育時間和溫度可以因片段大小、精子大小等本領域技術人員已知的因素而異。
      精子和DNA片段的混合物的顯微注射通常在室溫下在精子-DNA混合后的一小時內或精子脫膜后的1小時內進行。
      卵母細胞受體可用于本發(fā)明方法的卵母細胞受體包括從動物收集獲得的未成熟(例如GV期)并隨后在體外成熟的、以及成熟的(即MetII期)卵母細胞。成熟的卵母細胞可以這樣獲得,例如,通過注射促性腺素或其它激素(例如依次給予馬和人絨毛膜促性腺激素)誘導動物超排卵,然后在排卵后不久(例如在家貓開始動情后80-84小時,奶牛開始動情后72-96小時,以及小鼠開始動情后13-15小時)用外科方法收獲卵細胞。在只能獲得未成熟卵母細胞時,將它們培養(yǎng)在促進成熟的培養(yǎng)基中,直至它們進展至Met II期;這稱為體外成熟(“IVM”)。未成熟牛卵母細胞的IVM方法在WO98/07841中有所描述,未成熟小鼠卵母細胞的IVM方法在Eppig &amp; Telfer(Methods in Enzymology 225,77-84,Academic Press,1993)中有所描述。
      已有報道說,受精時卵母細胞的體內成熟階段對于產生胚胎的體外胞核轉移方法的成功是很重要的。已知卵母細胞細胞質的化學成分變化貫穿于整個成熟過程中。例如,與成熟有關的胞質活性中期促進因子(“MPF”)在處于第一次減數分裂中期的未成熟卵母細胞中最高,隨著第一極體的形成和排出而下降,在MetII時再次達到高水平。MPF活性在停滯于MetII的卵母細胞中保持高水平,在卵母細胞激活后迅速降低。通常,哺乳動物胞核轉移的報道描述了采用MetII卵母細胞作為受體。MetII卵母細胞是準備被有受精能力的精子激活的細胞類型。當將一個細胞胞核引入未受精的MetII卵母細胞(即MPF活性高的卵母細胞)的細胞質中后,細胞核膜破裂(如果它有的話),染色質凝縮,導致形成中期染色體。
      用外科手段從輸卵管收獲得到卵母細胞-卵丘細胞復合物形式的受體卵母細胞,置于諸如Hepes-CZB培養(yǎng)基(如下所述)等緩沖培養(yǎng)基中。用諸如0.1%牛睪丸透明質酸酶(例如300USP單位/毫克,ICN Pharmaceuticals,Costa Mesa,CA)等分散性酶分散卵丘細胞。較佳的是,在進一步處理前,將無卵丘細胞的卵母細胞置于在含5%(v/v)CO2的空氣中、37.5℃、礦物油(例如購自E.R.Squibb和Sons,Princeton,NJ)下平衡的培養(yǎng)基(如CZB培養(yǎng)基)中短于1小時。
      成功體外受精所需的精子組分已經知道,在小鼠中,正常受精可通過將分離的精子頭注射入卵母細胞中來實現,質膜和頂體膜以及所有尾部組分是正常胚胎發(fā)育所非必需的。小鼠,可能大多數常用實驗室嚙齒類動物是“例外的”,因為正常受精不需要精子中心體,在正常受精期間,精子頸區(qū)的精子中心體注定會在受精后在卵母細胞中退化。
      相反,在大多數其它真獸亞綱哺乳動物(包括牛和人)中,精子中心體在雄性和雌性前核合并所必需的微管形成以及隨后胚胎發(fā)育期間的卵裂中起重要作用。因此,在這些動物種類中,為了產生正常的后代,精子核(頭)以及中心體必須都導入卵母細胞中?,F在還不知道是否所有動物種類的精子中心體均能在凍融、凍干或洗滌劑脫膜后存活。如果不能,必須將未經冷凍的精子的中心體與經過凍融、凍干或脫膜的精子頭一起注射入卵母細胞,以便保證正常的胚胎發(fā)育。然而,引入過多的中心體會導致前核發(fā)育以及胚胎發(fā)育不正常。
      當精子頭和尾分離時,中心體通常與精子頭后端或精子尾前端相連。因此,精子中心體可能與精子頭一起同時插入卵母細胞,也可能通過同時或依次插入精子尾來插入。
      將精子胞核插入受體卵母細胞整個精子可以和外源核酸一起共同注射入受體卵母細胞的胞質內,但是對于精子較大的動物種類來說,宜用顯微注射技術將分離的精子頭(胞核)直接注射入受體卵母細胞的細胞質內。在將外源核酸以及凍融的、重新水化的凍干精子頭或脫膜精子頭一起共同顯微注射入受體卵母細胞的較佳方法中,采用的是壓電驅動的微量移液方法。
      合適的壓電驅動單元由Prime Tech Ltd.(Tsukuba,Ibaraki-ken,Japan)以壓電顯微操作儀/壓電沖擊驅動單元(Piezo Micromanipulator/Piezo Impact Drive Unit)的名稱出售。該單元利用壓電效應使(注射)移液管支架以受高度控制的快速方式向前推進非常小的距離(約0.5微米)。每次脈沖之間的強度和間隔可以變化,由一個控制單元調節(jié)。
      為了注射入卵母細胞,首先將精子/精子頭與外源核酸混合物中的單個精子注射移液管中,尾部(如果它有尾部的話)首先抽入,該移液管具有內徑約為5微米的短的平嘴,并根據生產商說明書安置在壓電驅動的單元中。向頸區(qū)施加一個或數個壓電脈沖,以分離精子頭和尾。然后將頭部深深吸入移液管。或者,可將精子/精子頭和外源核酸混合物中的單個精子頭抽入注射移液管,用于注射入卵母細胞。
      在精子頭(胞核)和外源核酸共同注射的整個過程中,用常規(guī)夾持移液管固定卵母細胞。使含有所選精子頭的注射移液管嘴與卵母細胞的透明帶緊密接觸,施加數個壓電脈沖(用控制器設定強度等級為1-5,速度為4-6),以推進移液管,同時維持移液管內輕度負壓。當移液管嘴通過透明帶時,將獲得的透明帶堵塞物擠入卵周隙,精子頭被向前推至靠近移液管嘴。然后將移液管嘴置于質膜附近,并向卵母細胞的相對面推進,夾持移液管幾乎到達卵母細胞皮質的對側?,F在,卵母細胞質膜被深深地套在注射針嘴周圍。施加1至2次壓電脈沖(通常強度為1-2,速度為1)后,卵膜在移液管嘴處被刺破,表現為清晰可見的卵膜迅速松弛。然后,將精子頭和伴隨的最少量(約6pl)的含有外源核酸的培養(yǎng)基排入卵漿中。然后輕輕抽出移液管,使新導入的頭部留在卵母細胞的細胞質內。該方法的進行很迅速,通常一批10-15個卵母細胞,它們在其它時間維持在培養(yǎng)狀態(tài)下。
      采用常規(guī)注射移液管的其它顯微注射方案也可用于該共同注射過程。采用常規(guī)移液管將精子頭注射入倉鼠卵母細胞的合適顯微注射方法例子在Yanagida,K.,Yanagimachi,R.,Perreault,S.D.和R.G.Kleinfeld,Biology of Reproduction 44,440-447(1991)中有所描述,有關這些方法的公開內容被納入本文作參考。
      外源核酸與精子/精子頭/脫膜精子頭的共同顯微注射提供了幾個優(yōu)點。首先,用顯微注射輸送精子/精子頭適用于各種類型的精子,無論其大小、形態(tài)等如何。第二,顯微注射在注射時能仔細控制使其它試劑(除了上述的外源核酸)和供體精子/精子頭一起共同注射入卵母細胞。這些在下文有例舉。第三,在本發(fā)明的實施方案中,精子/精子頭的插入靠的是壓電驅動的顯微注射,因此提供了迅速有效的樣品處理,從而減少了經歷操作時精子和卵母細胞的損傷。一些種類動物(如小鼠)的卵母細胞不適合用常規(guī)針頭作顯微注射,而壓電驅動的顯微注射提供了高成功率。
      受精卵母細胞的激活已知小鼠卵母細胞可通過注射入單個完整的小鼠精子或其分離的頭部來激活。分離的精子尾不能激活卵母細胞?;钚跃訑y帶的卵母細胞激活因子通常在圓形精子細胞轉變成精子時出現。這些因子的作用并不具非高度種類特異性,因為注射外源種類(如倉鼠、家兔、豬、人、甚至是魚)的精子也可激活小鼠卵母細胞。已有報道說,一種這樣的激活因子是存在于頂體赤道段區(qū)域內的33千道爾頓的蛋白。該蛋白稱為振蕩蛋白(oscillin),它容易通過簡單的凍融從成熟(倉鼠)精子中抽提得到。除了振蕩蛋白外,成熟精子看來還攜帶了另一種激活因子,該因子不易被抽提,但是可通過用Triton X-100和SDS依次處理精子來獲得。還不知道易抽提的振蕩蛋白和抗凍融抽提的因子在生物學和化學上是否相同。
      已經知道,在Triton X-100存在下超聲處理的精子頭喪失了除胞核和核周物質外的所有組分。然而,當用顯微外科方法注入卵母細胞內后,這些經Triton X-100處理過的精子頭(具有胞核和核周物質,但是沒有質膜)能象完整精子一樣有效地激活卵母細胞。
      如我們的待批美國專利申請No.09/177,391和T.Wakayama,等人(同上)中所述的,至少在小鼠中,精子攜帶的卵母細胞激活分子必定對凍融和冷凍干燥有耐受力,因為在注射入凍融或凍干的精子頭后存活的大多數卵母細胞能被正常地激活和受精。
      如果在其他動物種類中,精子頭的注射沒有起激活卵母細胞的作用,則激活可能是通過單性生殖方式發(fā)生的,例如通過電激活、注射入一種或多種激活卵母細胞的物質、或將卵母細胞轉移到含有一種或多種激活卵母細胞的物質的培養(yǎng)基中。能提供激活刺激(或激活刺激組合)的試劑包括,但不局限于,精子細胞質激活因子以及某些藥理學化合物(如Ca2+和其他信號轉導調節(jié)劑),它們可在精子頭以及外源核酸共同注射的同時或之后通過顯微注射來導入。將受精的卵母細胞轉移至含有激活性化合物亞組的一個或多個成員的培養(yǎng)基中后,就可提供某些激活刺激,這些激活化合物包括Ca2+釋放刺激劑(如咖啡堿,Ca2+離子載體如A23187和離子霉素,以及乙醇)、磷蛋白信號傳導的調節(jié)劑(例如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成的抑制劑(例如A23187、環(huán)己酰亞胺)、6-二甲基氨基嘌呤或前述物質的組合(例如6-二甲基氨基嘌呤和離子霉素)。在一個典型的方法中,是通過在含有2-10mM Sr2+、不含Ca2+的CZB培養(yǎng)液中培育1-6小時來激活小鼠卵母細胞的。
      胚胎發(fā)育產生活的胎兒和后代在形成前核后,可以體外培養(yǎng)胚胎,直至其達到2-8細胞階段或桑椹胚/胚泡階段,此時可將胚胎轉移到代孕母親的輸卵管或子宮內。
      與精子頭同時注射生物學感興趣的物質在本發(fā)明的一個實施方案中,將精子頭和外源核酸共同顯微注射入卵母細胞時允許在將精子頭注射入卵母細胞之前、期間或之后導入一種或多種具有改變胚胎發(fā)育結果潛力的物質。例如,可在精子頭和外源核酸的共同注射之前或之后通過顯微注射將其它核糖核酸(RNA)或DNA導入卵母細胞。例如,注射入攜帶所需順式活性信號的重組DNA可導致重組DNA上的序列通過已存在的或共注射的轉錄因子來轉錄,隨后表達出對發(fā)育抑制因子有拮抗作用、或對胚胎發(fā)育有正作用的編碼蛋白質。另外,轉錄物可具有針對編碼發(fā)育抑制蛋白的mRNA的反義活性?;蛘撸赏ㄟ^注射入核酸(或其衍生物)來實現反義調節(jié),這些核酸能通過與沒有在卵母細胞中先行轉錄的它們的核酸靶標直接相互作用來發(fā)揮抑制作用。
      通過本發(fā)明方法導入的重組DNA(線形或其它形狀)可含有一個功能性復制子,該復制子含有一個或多個在啟動子控制下表達的功能性基因,該基因能表現出從窄到寬的發(fā)育表達分布圖。例如,當啟動子僅在早期受精卵中有活性時,該啟動子可能指導立即而簡短的表達。導入的DNA可能在胚胎發(fā)育期間的某一時刻喪失,或整合入一個或多個基因組基因座,在所得轉基因個體的整個生命中穩(wěn)定地復制。在一個實施方案中,編碼推定的“抗衰老”蛋白(如端粒酶或超氧化物歧化酶)的DNA構建物可通過顯微注射來導入卵母細胞。另外,也可直接注射這些蛋白。
      實施例為描述本發(fā)明的方法,評價了膜破壞的和/或脫膜的精子將含有表達報道基因的質粒的復制缺陷型片段轉移到未受精卵母細胞內的能力,以及轉基因小鼠胚胎及其活的轉基因后代的發(fā)育。用報道基因使我們能直接鑒定表達轉基因的胚胎和活后代。
      本文描述的例子不起限制作用,本領域技術人員會認識到其它轉基因、除小鼠外的其它來源的精子和卵母細胞以及其它生理介質或試劑也可用于本發(fā)明的方法。
      材料和試劑所有無機和有機化合物均購自Sigma Chemical Co.,(St.Louis,MO),除非另有所述。
      在外源DNA和膜破壞的精子或脫膜精子頭的共同注射前,將收獲的卵母細胞培養(yǎng)在CZB培養(yǎng)液(Chatot,等人,1989.J.Reprod.Fert.86,679-688)中。CZB培養(yǎng)基包含81.6mM氯化鈉、4.8mM氯化鉀、1.7mM氯化鈣、1.2mM硫酸鎂、1.8mM磷酸二氫鉀、25.1mM碳酸氫鈉、0.1mM EDTA二鈉、31mM乳酸鈉、0.3mM丙酮酸鈉、7單位/毫升青霉素G、5單位/毫升硫酸鏈霉素和4毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)。用于從輸卵管收集卵母細胞、隨后的處理以及顯微操作的培養(yǎng)液是改進的CZB,它含有20mMHepes、減少量的碳酸氫鈉(5mM)和3毫克/毫升BSA。該培養(yǎng)液在這里稱為Hepes-CZB。為了顯微注射的目的,較佳的是將BSA置于含有0.1毫克/毫升聚乙烯醇(PVA,可溶于冷水,平均分子量為10×103)的Hepes CZB中,因為與BSA相比,PVA能在更長時間內使注射移液管壁粘度更低,這在重復使用單根移液管進行精子頭/卵母細胞的多次轉移期間是有利的。兩種培養(yǎng)基的pH均約為7.4。在室溫下(23℃-25℃)空氣中,在礦物油下的Hepes緩沖的CZB(Hepes-CZB)中進行所有卵母細胞的操作。
      用于分離新鮮精子的培養(yǎng)基是CZB培養(yǎng)基。將凍融的和重新水化的凍干精子懸于CZB培養(yǎng)基或123.0mM氯化鉀、2.6mM氯化納、7.8mM磷酸二氫鈉、1.4mM磷酸二氫鉀、3mM EDTA二鈉組成的胞核分離培養(yǎng)基(NIM)中。加入少量1M HCl調節(jié)其pH值至7.2。用于脫膜的新鮮精子收獲在NIM中,且在NIM中用Triton X-100進行抽提處理。洗滌后,將脫膜的精子頭懸于NIM或CZB培養(yǎng)基中。在精子(在CZB或NIM中)和外源DNA一起培育后,在混合物中添加PVP(平均分子量為360,000,ICNBiochemicals,Costa Mesa,CA)。
      動物這些實施例中所用的動物按照夏威夷大學實驗動物服務部(Laboratory AnimalService at the University of Hawaii)以及實驗資源國立研究委員會研究所的實驗動物管理和使用委員會(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Resources National Research Council)制定的指南(DHEW公布號[NIH]80-23,1985年修訂)來飼養(yǎng)。動物的處理方法得到夏威夷大學動物管理和使用委員會的監(jiān)督和批準。
      實施例1卵母細胞的制備通過連續(xù)(相隔48小時)注射7.5國際單位(IU)的妊娠的母馬血清促性腺激素和7.5國際單位的人絨毛膜促性腺激素(hCG),誘導成熟B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)雌小鼠超排卵。注射hCG后14小時,從輸卵管收集卵丘-卵母細胞復合物,用添加了牛睪丸透明質酸酶(300USP單位/毫升,ICN Biochemicals,Costa Mesa,CA)的Hepes-CZB培養(yǎng)基處理3分鐘,使卵丘細胞分散。在注射精子胞核前,清洗卵母細胞,并在5%(v/v)CO2空氣中、37℃下平衡的礦物油下的CZB培養(yǎng)基中保藏最高4小時。
      實施例2新鮮精子的制備從B6D2F1雄性小鼠的附睪尾收集新鮮的精子。用手指擠壓每個附睪,同時用鋒利的鉗子刺穿其遠側部。將從附睪中滲出的稠密的精液團轉移到培養(yǎng)皿中。將數滴(約2微升)精子置于1.5毫升聚丙烯微量離心管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)的底部,用0.2-0.5毫升CZB培養(yǎng)基覆蓋。培育大約20分鐘后,收集上方0.4毫升的培養(yǎng)基并檢查。該懸浮液中90%以上的精子(每毫升約3-10×106個)能活潑地游動。
      實施例3凍融精子的制備根據T.Wakayama,D.G.Whittingham和R.Yanagimachi,J.Reprod.Fert.,112,11-17,1998中描述的方法制備凍融的精子。簡言之,將附睪尾獲得的精子幾滴置于1.5毫升聚丙烯離心管底部,用0.5毫升溫熱的CZB覆蓋。37℃下約20分鐘后,收集上方0.2毫升的培養(yǎng)基。每毫升懸浮液含有大約3-10×106個。將一份(100微升)精子懸液轉移到1.5毫升聚丙烯微量離心管中,與含有或不含36%(w/v)D(+)-蜜三糖的等體積CZB培養(yǎng)基充分混合。蜜三糖的最終濃度分別為18%或0%(w/v)。將各懸液一份(50微升)分散在有標記的1毫升低溫小管(A/S NUNC,Copenhagen)中。緊密蓋上每個小管,直接置于-20℃或-50℃冷凍機或液氮(-196℃)中。所有樣品保藏期為1天至4周。
      為了融化,將小管從冷凍機或液氮中取出,在24-26℃的水或空氣中放置大約10分鐘。如上文所述的那樣,用市售的精子存活力測試試劑盒(Live/dead FertiLight,Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon)檢查融化的精子懸液樣品的游動力和“活力”。所有在不存在蜜三糖時冷凍的精子不能游動,是“死的”(膜被破壞)。在蜜三糖存在下在任一溫度冷凍的精子至少有97%不能游動,是“死的”。
      洗滌融化的精子懸液一次,重懸于400微升CZB培養(yǎng)液中,然后與外源DNA混合。
      如圖1(C)所述,用電子顯微鏡檢查確認膜的破壞。頂體帽的膜破壞最明顯。
      實施例4重新水化的冷凍干燥的精子的制備根據T.Wakayama和R.Yanagimachi,Nature Biotechnology 16,638-640,1998以及我們的待批美國專利申請No.09/177,391中描述的方法制備重新水化的冷凍干燥的精子。簡言之,將上述制得的小鼠精子懸液一份(100微升)轉移到1.5毫升聚丙烯微量離心管中,與1毫升不含EDTA、含有4毫克/毫升BSA的CZB培養(yǎng)基或添加了10%(v/v)胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)充分混合。37.5℃下培育30分鐘后,從試管中取出0.3-0.5毫升的上方培養(yǎng)基。每毫升懸浮液含有大約3-10×106個精子。
      將精子懸液一份(100微升)置于2毫升安瓿(Wheaton Scientific,Millville,NJ)中,將安瓿直接放入液氮中。10分鐘后,將安瓿放入與冷凍干燥系統(tǒng)(10-020型,VirTis Co.,Gardner,NY)相連的預冷(-50℃)的冷凍瓶中。入口壓力約為1微米汞柱。大約12小時后,在系統(tǒng)中充入氣體干燥罐(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA目錄號09-204)提供的氬氣后,從系統(tǒng)中取出瓶。每個安瓿與真空泵相連,在99%以上的氣體被抽出后,密封安瓿結構。每一安瓿用鋁箔包裹,于暗處保藏于室溫(約25℃)或4℃下。
      為了重新水化,將上述制得的含凍干精子的安瓿打開,將100微升蒸餾水加入安瓿內,形成重建的精子懸液。
      如圖1(D)所示,用電子顯微鏡檢查確認膜的破壞。頂體帽的膜破壞最明顯。
      實施例5脫膜精子頭的制備如下分離出用于Triton X-100抽提的精子在0-1℃的NIM培養(yǎng)基中將兩個附睪尾切細,過濾所得精子懸浮液,獲得最終體積為900微升。至于Triton X-100抽提,在900微升NIM中的精子懸液中加入100微升0.5%(v/v,在NIM中)Triton X-100,并在冰上研磨混合30秒。在20000xg、2℃下離心細胞1分鐘使其沉淀,并充分重懸于2毫升冰冷的NIM中,然后于20000xg、2℃下重新沉淀2分鐘。將最終的沉淀物重懸于400微升CZB或NIM中。
      如圖1(B)所示,用電子顯微鏡檢查確認精子頭脫膜。頂體帽的膜破壞最明顯。
      實施例6轉基因的制備增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉基因是質粒pCX-EGFP的大的(3.5kb)Sal GI-BamHI片段。該片段攜帶有從強的巨細胞病毒-IE-雞β-肌動蛋白增強子-啟動子組分表達出的EGFP基因,但是缺少真核細胞復制起點。[H.Niwa,K.Yamamura,J.Miyazaki,Gene 108,193(1991);G.Zhang,G.Vanessa,S.R.Kain,Biochemical and BiophysicalResearch Communications 227,707(1996);T.Takada,等人,Nature Biotechnology 15,458(1997)]。用限制性酶Sal GI和Bam HI消化質粒pCX-EGFP,并用本領域技術人員已知的方法純化,獲得含有EGFP基因的3.5kb的片段。
      用Sal GI或Xho I和Sal GI消化,獲得px-CANLacZ的純化的攜帶lacZ的線形片段。px-CANLacZ XhoI-Sal GI片段缺少復制起點。px-CANLacZ編碼的β-半乳糖苷酶含有胞核定位信號。
      在下述的一些實驗中,用Sal GI和Pst I消化產生pCX-LacZ Sal GI-Pst I片段,獲得質粒pCX-LacZ的片段。pCX-LacZ是pCX-EGFP的衍生物,其中EGFP基因被編碼β-半乳糖苷酶的基因代替。
      實施例7DNA片段和精子的混合物的制備如下所述,使上述制得的精子不經進一步制備(新鮮的)或在經受上述三種膜破壞過程(凍融,冷凍干燥,或用Triton X-100抽提)之一后與DNA片段混合。
      用移液管使1微升上述含有GFP基因的片段與9微升前述制得的精子懸浮液(含有2-5×105個精子)混合,提供最終濃度為7毫微克/微升的DNA GFP片段。類似地,使1微升的Sal GI或Xho I/Sal GI片段分別與9微升一份的精子懸液混合,使Sal GIpx-CANLacZ片段的最終濃度分別為4.5毫微克/微升和9毫微克/微升。
      在用單發(fā)雙重轉基因于一次顯微共注射后產生兩個轉基因共表達的胚胎的某些實驗中,在注射前,將精子頭與兩個轉基因,即含有pCX-EGFP Sal Gi-Bam HI片段(最終濃度為2.5毫微克/微升)和pCX-LacZ Sal GI-PstI片段(最終濃度為2.5毫微克/微升)的單一DNA溶液混合。
      在室溫下(約25℃)或冰上培育上述DNA-精子混合物1分鐘,然后與聚乙烯吡咯烷酮(PVP,平均分子量為360000)溶液混合至最終濃度約為10%(w/v)PVP。
      在一些實驗中,為了確定與質粒片段培育后洗滌精子的影響,在與pCX-EGFPDNA混合并培育1分鐘后,立即將DNA-精子混合物分成兩個5微升的等份。將一等份(洗滌的精子)與50微升冰冷的新鮮的CZB或NIM充分混合來稀釋并洗滌。然后使兩個等份在20000xg、2℃下沉淀2分鐘。仔細地除去經洗滌的精子等份的上清液,用5微升新鮮的CZB或NIM代替。用第二一份的上清液來重懸其自己的沉淀物。(因此,該樣品未經洗滌)。
      在某些實驗中,為了確定單獨注射DNA片段而不共注射精子的作用,在注射前將新鮮的質粒pCX-EGFP的Sal GI-Bam HI片段(7毫微克/微升,在NIM中)的稀釋液與等體積的PVP 20%(v/v)混合。
      對于所有實驗,然后都是將上述獲得的混合物置于顯微鏡臺上進行如下所述的顯微注射。所有注射均在精子與DNA混合或精子與Triton X-100混合后1個小時內在室溫下Hepes-CZB培養(yǎng)基中進行。
      實施例8將精子胞核顯微注射到卵母細胞中為了將精子頭和外源DNA共注射入制得的卵母細胞內,用塑料平皿(100毫米×150毫米;Falcon Plastics,Oxnard,CA,目錄號1001)的蓋子(深度為10毫米)制得顯微注射室。將兩滴圓形液滴和一滴伸長的液滴沿平皿的中心線放置成一排。第一滴液滴(2微升;直徑為2毫米)用于洗滌移液管(Hepes-CZB,含有12%[w/v]PVP,平均分子量為360000道爾頓)。第二滴(2微升;直徑為2毫米)是如上所述制得的含有精子與DNA片段的混合物。第三滴伸長的液滴(6微升;寬2毫米,長6毫米)是用于卵母細胞的Hepes-CZB培養(yǎng)液。這些液滴的每一滴均用礦物油(E.R.Squibb and Sons,Princeton,NJ)覆蓋。將平皿置于倒置顯微鏡相差鏡頭的載物臺上。
      用前面描述的壓電顯微注射儀方法,采用Prime Tech Ltd.(Tsukuba,Ibaraki-ken,Japan)的MB-U型壓電顯微操作儀,將精子胞核和外源DNA共同顯微注射入卵母細胞中。該單元采用壓電效應來使移液管夾持器以非常高的速度一次推進非常小的距離(例如0.5微米)。脈沖的強度和速度由控制儀來調控。
      為了注射入上述制得的卵母細胞內,將與外源DNA混合的單個精子頭吸入已經和壓電移液管驅動單元相連的注射移液管(嘴部內徑約5微米)中。在采用整個精子時,首先將單個精子的尾部先吸入注射移液管。向精子頸部區(qū)域施加一個或數個壓電脈沖,使精子頭和尾部分開。脈沖的強度和速度(頻率)由控制儀PMAS-CT01(控制儀設定等級強度2,速度1)調控。然后將頭部深深吸入移液管內,將少量(約0.5微升)水銀置于注射移液管的近端。精子頭和尾的離位破壞了膜,因此表示了用于這些實施例的新鮮精子與以前報道的活精子通過IVF促進轉基因的不同之處。
      同時,將成熟的未受精的卵母細胞置于顯微鏡載物臺上的Hepes-CZB培養(yǎng)液內。用夾持移液管夾持卵母細胞,使注射移液管嘴在3點鐘位置與透明帶緊密接觸。施加數個壓電脈沖(強度為1-2,速度為1-2),以推進移液管,同時向其施加稍稍的負壓。當移液管嘴部通過透明帶后,就將移液管內透明帶圓柱狀片段擠入卵周隙。在將精子頭向前推至靠近移液管嘴后,用機械方式推進移液管,直至其嘴部幾乎到達卵母細胞皮質的對側。施加1或2次壓電脈沖(強度為1-2,速度為1),刺破卵膜,將精子頭擠入卵質中。據估計,每次注射從移液管內部排除大約1皮升(pl)的含有外源DNA的混合物。然后輕輕抽出移液管,使精子頭留在卵質內。
      所有注射在Hepes-CZB中室溫下進行。每個卵母細胞注射一個精子頭。用該方法在10-15分鐘內可顯微注射約5-20個卵母細胞。棄去在注射后不久裂解的卵母細胞。
      在確定不共注射精子而單獨注射DNA片段的效果的實驗中,每個卵母細胞中注射上述的大約1皮升含質粒pCX-EGFP的Sal GI-Bam HI片段的PVP。室溫下回收5-10分鐘后,將已注射的卵母細胞轉移到不含Ca2、含有10mM SrCl2和胞質分裂阻滯劑細胞松弛素B(5微克/毫升)的CZB中,37℃培育6小時。沒有被精子或精子頭激活的卵母細胞必須用其它方式來激活,以便使胚胎發(fā)育。用鍶離子來激活是本領域技術人員已知的眾多單性生殖激活方法中的一種,該方法在我們的待批美國專利申請09/132,104(1998年8月10日)中有所描述,關于卵母細胞激活的內容全部納入本文作為參考。用胞質分裂阻滯劑防止染色體擠出是本領域技術人員熟知的。美國專利申請No.09/132,104中涉及阻滯卵母細胞中胞質分裂的內容也納入本文作為參考。
      然后將單性生殖激活的卵母細胞轉移到CZB培養(yǎng)基中,在下述的標準胚胎培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3.5天后在培養(yǎng)物中用下述方法評價胚胎的GFP表達。
      實施例9卵母細胞的檢查、胚胎培養(yǎng)和轉移至代孕母親在含5%(v/v)CO2的空氣中平衡的礦物油下37℃的CZB中培育注射了精子頭-外源DNA的卵母細胞,5-6小時后用倒置顯微鏡檢查。具有兩個明顯的前核和第二極體的那些卵母細胞被認為是正常受精的,讓它們在CZB中培養(yǎng)4天。將達到桑椹胚或胚泡階段的那些受精卵轉移到受體雌鼠(通常為CD-1雌性白化體)的子宮角內,該雌鼠在3天前已經和切除輸精管的CD-1雄鼠交配過,以使胚胎發(fā)育階段與子宮內膜的階段同步。將平均數目為八個的桑椹胚/胚泡轉移到每個子宮角內。使雌鼠分娩和喂養(yǎng)其代孕的后代。隨機選出一些成熟的雄性和雌性后代并交配以檢查它們的生育力。
      實施例10檢查胚胎的轉基因表達顯微注射3-3.5天后,用具有UV光源(480納米)和異硫氰酸熒光素濾片的表面熒光顯微鏡檢查胚胎的GFP表達。這能清楚地鑒定出沒有熒光的(不表達GFP)、熒光弱的和熒光強的胚胎和嵌合體,然后給予相應的評分。
      如T.Tsukul等人,Nature Biotechnology 14,982(1996)中所述,在室溫下用含有1%(v/v)甲醛、0 2%(v/v)戊二醛和BSA(5毫克/毫升)的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.6)固定5分鐘后,測定第3天的胚胎中px-CANLacZβ-半乳糖苷酶的表達。用含有BSA(5毫克/毫升)的PBS充分洗滌固定的胚胎,然后在含有BSA(5毫克/毫升)、4mM鐵氰化鉀、4mM亞鐵氰化鉀、2mM氯化鎂和5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)(1毫克/毫升)的PBS中于37℃培育5小時染色。用光學顯微鏡檢查并給胚胎評分。
      在兩個轉基因與精子頭共注射的實驗中,用上述方法首先評價3-3.5天胚胎的GFP表達,然后評價β-半乳糖苷酶表達。為了制成照片,將胚胎封固在顯微鏡載玻片和蓋波片之間,收集圖象以顯示固定前的發(fā)育和GFP表達,進行染色以顯示LacZ表達。
      實施例11檢查活后代的轉基因表達在分娩后1-4天,檢查從上述植入代孕母親的胚胎獲得的活后代的異位GFP表達。在UV光源(480納米)的入射照射下,明顯能觀察到皮膚呈綠色,即有GFP表達。
      實施例12轉基因的基因組整合的分析用Southern印跡或聚合酶鏈反應(PCR)來物理分析尾尖基因組DNA。對3-6周齡的隨機選出的綠色小鼠幼崽及其非綠色的同窩出生的幼崽進行尾尖活檢。用本領域技術人員熟知的方法從尾尖組織抽提出總基因組DNA。在裝有480/440納米濾片的熒光立體顯微鏡下對尾進行拍照。
      至于Southern印跡分析,用Eco RI消化每份樣品10微克基因組DNA,以pCX-EGFP的733堿基對的Eco RI片段進行探測。為了檢出GFP基因,每個反應用1微克基因組DNA進行PCR,PCR采用正向(TTGAATTCGCCACCATGGTGAGC)和反向(TTGAATTCTTACTTGTACAGCTCG-TCC)寡核苷酸引物。反應參數為95℃9分鐘(1輪),94℃45秒,60℃30秒,72℃45秒(40輪)。電泳分離PCR產物,用溴化乙錠染色后顯示。
      用編碼外源報道物的DNA或精子頭或兩者顯微注射中期II卵母細胞后產生的胚胎中的轉基因表達在精子和DNA預培養(yǎng)1分鐘然后共注射后體外培育3.5天的胚胎中,記錄GFP和β-半乳糖苷酶的表達。如上所述,用表面熒光顯微鏡檢測GFP,用染色檢測β-半乳糖苷酶。結果示于表1。當pCX-EGFP DNA與新鮮精子共注射時,含有熒光卵裂球的胚胎的比例最低(26%),但當DNA與經Triton X-100處理(64%)、凍融(82%)或凍干(87%)而膜受破壞的精子共注射時,該比例升高至較高的數值。經線性px-CANLacZDNA片段以及凍融或凍干精子共注射的未受精的卵母細胞也產生了高比例的表達lacZ轉基因產物β-半乳糖苷酶的胚胎(92%或94%)。另外,精子頭和兩種不同轉基因DNA(分別編碼GFP和LacZ)的混合物的共注射產生了一次顯微注射就表達兩種轉基因的胚胎。圖2描述了用此單發(fā)雙重轉基因法產生的轉基因胚胎。用已經與pCX-LAcZ和pCX-EGFP轉基因DNA混合物預培育的精子顯微注射入卵母細胞。圖2A、2B和2C(X400)分別顯示了3.5天后的相同的胚胎,圖2A用Hoffinan調節(jié)相差顯微鏡觀察,不染色;圖2B長波長(480nm)紫外光下觀察的GFP表達;圖2C用X-gal染色來觀察β-半乳糖苷酶表達。
      總之,上述數據表明膜被破壞的精子頭與外源核酸共注射入未受精的卵母細胞能有效地產生轉基因胚胎。
      與pCS-EGFP DNA混合后經新鮮培養(yǎng)基洗滌的精子保留了產生熒光性卵裂球的能力,但是與未經洗滌的對應物相比,其效率稍低(63%對80%)(表1)。這提示外源DNA和精子在混合時迅速結合(在注射前)。
      為了調查卵母細胞內是否會發(fā)生類似的相互作用(注射后),我們依次注射入精子頭和pCX-EGFP DNA,在注射前不混合。我們始終不能發(fā)現有外源(GFP)DNA表達,即使75%的陽性對照胚胎(表1中的凍融的精子頭和pCX-EGFP共注射)有熒光。與500皮克/微升pCX-EGFP(而不是50皮克/微升)共注射的凍融精子頭產生了可觀察到有GFP表達的胚泡。該GFP檢測臨界值(相當于每毫升有50-500皮克pCX-EGFP DNA)代表了注射的每皮升中平均有15-150個分子。
      與和精子頭共注射相反,單獨注射相似量的GFP轉基因DNA不排除良好的單性生殖發(fā)育(98%的在注射后存活的卵母細胞發(fā)育至桑椹胚-胚泡階段)(表1)。然而,得到的胚胎沒有一個顯示出能觀察到轉基因表達。因此,在不存在精子頭時,幾乎沒有轉基因表達或具轉錄活性的轉基因DNA的表染色體持續(xù)(epichromosomalpersistence)。
      表1的數據支持了這樣一個概念,即可以想像到注射前外源DNA和精子頭亞膜結構之間的結合主要涉及核周基質的堿性蛋白[F.J.Longo,等人,J.Cell Biol.105,1105(1987)]。在我們實驗室的其它實驗中,我們發(fā)現精子胞核含有至少一種核酸內切酶,25℃脫膜的精子迅速喪失支持全部胚胎發(fā)育的能力[B.Maione,等人,DNACell Biol.16,1087(1997)]。因此,這里所用的精子基因組DNA不可能不受損,這與促進卵母細胞介導的轉基因整合的單鏈斷裂的存在相符。
      我們好奇地發(fā)現,在精子頭-pCX-EGFP共注射后出現含GFP陽性和陰性卵裂球(+/-桑椹胚-胚泡)的嵌合胚胎,但是在單獨注射pCX-EGFP DNA后沒有這種卵裂球(表1)。這種+/-嵌合體的頻度暗示轉基因DNA整合有時延遲至ICSI后細胞周期的第一個S期后。如果轉基因DNA和精子頭不共同注射,這種延遲的整合看來就不會發(fā)生。該現象的一種解釋是精子衍生的物質使外源DNA在早期胚胎內穩(wěn)定,從而有助于延遲整合;在不存在該物質(例如在單性生殖生物中)時,外源DNA會在能夠整合前降解。
      在共注射精子頭-pCX-EGFP后,胚胎發(fā)育的潛力隨所含的熒光性卵裂球的比例的增加而減小(表1)。相反,精子頭-pxCANLacZ共注射后的轉基因表達沒有抑制胚胎發(fā)育(表1)。不希望受理論的束縛,這可能反映了GFP表達有不利的影響。即,早期的胚胎發(fā)育可能對伴隨GFP發(fā)色團成熟而放出H2O2非常敏感(R.Y.Tsien,同上)。
      用編碼外源報道物的DNA或精子頭或兩者顯微注射入中期II的卵母細胞后產生的活后代中的轉基因表達。
      為了確定轉基因DNA構建物的基因組整合是否能在活后代(起始小鼠)中表現出來,將經受三種膜破壞過程之一的精子頭與pCX-EGFP DNA一同注射。如上所述,在體外培養(yǎng)所得胚胎3.5-4天(至桑椹胚-胚泡階段),然后非選擇性地(即不根據熒光)轉移到代孕母親體內。轉基因整合的表型分析是在長波長紫外光下分別檢查轉基因小鼠和非轉基因的對照小鼠的尾尖活檢物(分別如圖3A(a)和圖3A(b)所示)。轉基因小鼠的發(fā)綠色熒光的皮膚可通過非綠色的毛發(fā)來顯示。就皮膚中可觀察到的GFP表達而言,高比例(17-21%)的后代是轉基因的(表2)。該表達效率不取決于用來制備精子的膜破壞方法。合子發(fā)育至足月的比例對三組膜破壞精子頭的每一組是相當的(12%-14%),但是比無外源DNA存在時顯微注射作類似處理的精子頭后獲得的比例低。
      這些數據與表1所示的結果相符。數據表明,含有GFP陰性細胞的胚胎比含全部為陽性的細胞的更能可能發(fā)育至足月。另外,評為陰性的某些活后代可能是從培養(yǎng)3.5天時含有GFP陽性和陰性細胞的嵌合胚胎產生的。不希望受理論的束縛,可認為共注射的pCX-EGFP DNA可能對植入前和植入后的胚胎發(fā)育均有不利的影響。然而,還不知道對植入后發(fā)育的抑制是轉基因表達的結果還是外源DNA本身存在的結果。
      用Southern印跡(圖3B)或PCR(圖3C)對尾尖總基因組DNA進行物理分析,結果表明,所有表現出綠色熒光的起始小鼠系具有轉基因,包括最初評為表型陰性、但是活檢的尾尖表現出GFP表達的一個小鼠。在這三例中,PCR證明缺少可檢測的綠色熒光的起始動物中存在有轉基因。不希望受理論的束縛,認為不表達轉基因是因為轉基因整合基因座局部區(qū)域有順式活性元件。圖3B中描述了對照B6D2F1(野生型)(0)以及起始小鼠3(5-9)、19(>50)、28(5-9)和41(2)用pCX-EGFP片段作探針的總DNA的Southern印跡分析,其中估計的每個基因組中轉基因拷貝數顯示在括號內。Southern印跡分析表明起始動物中的轉基因拷貝數為≤1至>50。該結果與前核顯微注射后的轉基因整合方式相似?;蚪MpCX-EGFP DNA的物理鑒定和GFP表達的效率表明轉基因DNA在整合時沒有經歷總體重排。
      圖3C中描述了小鼠16、17、30、36、47、49、對照B6D2F1(野生型)、3、19、28和41的總DNA的PCR分析結果,并確認小鼠17、3、19和28中存在GFP轉基因。
      隨機選出12個表達GFP的起始動物(8個雌性,4個雄性,來自表2和類似的系列)與非轉基因動物雜交,除一個例子(雌性)外,所有動物均產生幼崽。在11個能育的起始動物中,8個產生的幼崽皮膚異位表達GFP,頻度為27%-50%(平均為40%)。在大多數情況下,轉基因遺傳的方式與單個基因座GFP基因的孟德爾種系傳遞相符。
      盡管本發(fā)明已經參照較佳實施方案作了描述,但應理解這并不意味著本發(fā)明局限于所公開的具體形式。相反,這意味著覆蓋了在本發(fā)明精神和范圍內的所有改進和變化形式。
      表1將編碼外源報道物的DNA或精子頭或兩者顯微注射入中期II卵母細胞中后產生的胚胎的體外培養(yǎng)和轉基因表達第3天時全部桑椹胚-胚泡(m-b)和熒光(GFP)或染色(LacZ)片段*精子處理卵母細胞數 m-b(%) -§+/-§ +**§pCX-EGFP 無(新鮮) 162 134(83)a1001321apCX-EGFP Triton X-100270 212(79)a75 37100bpCX-EGFP 凍融313 155(50)b28 3196bpCX-EGFP 凍干278 154(55)b20 23111bpx-CANLacZ 凍融151 110(73)a7 4558bpx-CANLacZ 凍干136 106(78)a8 3266bpCX-EGFP 洗滌153 114(75)c43 4 67cpCX-EGFP 未洗滌 117 83(71)c17 3 63c①凍融→②pGX-EGFP 7156(79)56 0 0①pCX-EGFP→②凍融 5135(69)35 0 0pCX-EGFP單獨 - 4948(98)48 0 0*外源DNA片段是pCX-EGFP-Bam HI-Sal GI或px-CANLacZ-Sal GI,Sal GI-XhoI或XhoI。
      在比較同一欄中有上標"a"和"b"的數值時,它們差別顯著(P<0.05)。同一欄中具有上標"c"的數值差別不顯著。
      §轉基因表達-,陰性;+,陽性;+/-,m-b含有+和-細胞(嵌合體)。
      表2表型轉基因(綠色)幼崽及其同胞動物的發(fā)育精子處理*卵母細胞數轉移的m-b總幼崽數+(綠色)幼崽§凍干116 67(4)143**凍融9753(3)122**Triton X-100 218 150(9) 316***每一行記錄了以脫膜精子頭和質粒pCX-EGFP片段共注射的卵母細胞產生的胚胎和幼崽的發(fā)育。
      m-b,桑椹胚-胚泡。括號內的數值表示用作胚胎轉移受體的代孕母親數。
      §轉基因表達+在其皮膚上異位表達GFP的陽性幼崽。
      **數值沒有顯著差異。
      權利要求
      1.一種獲得轉基因胚胎的方法,該方法包括下列步驟將外源核酸和膜受破壞的精子頭或脫膜精子頭共同插入未受精的卵母細胞中,形成受精的轉基因卵母細胞;和使受精的轉基因卵母細胞發(fā)育成轉基因胚胎。
      2.根據權利要求1所述的方法,其中共同插入步驟用壓電驅動的顯微注射來實現。
      3.根據權利要求2所述的方法,其中將外源核酸和膜受破壞的精子頭共同注射到未受精卵母細胞的胞質內。
      4.根據權利要求1所述的方法,其中膜受破壞的精子頭從經過冷凍和融化的精子獲得。
      5.根據權利要求1所述的方法,其中膜受破壞的精子頭從重新水化的冷凍干燥的精子獲得。
      6.根據權利要求1所述的方法,其中精子頭是包含胞核和核周物質的脫膜的頭部。
      7.根據權利要求6所述的方法,其中膜受破壞的精子頭從經洗滌劑處理的精子獲得。
      8.根據權利要求1所述的方法,其中未受精的卵母細胞是中期II的卵母細胞。
      9.根據權利要求1所述的方法,其中共插入步驟包括首先使膜受破壞的或脫膜的精子頭與外源核酸預培育第一段時間的分步驟。
      10.根據權利要求9所述的方法,其中所述第一段時間為30秒至5分鐘。
      11.根據權利要求10所述的方法,其中所述第一段時間為45秒至3分鐘。
      12.根據權利要求11所述的方法,其中所述第一段時間為1分鐘至2分鐘。
      13.根據權利要求1所述的方法,其中外源核酸包含多個轉基因。
      14.根據權利要求1所述的方法,該方法還包括使轉基因胚胎發(fā)育成活后代的步驟。
      15.根據權利要求14所述的方法,其中使胚胎發(fā)育的步驟包括將轉基因胚胎移植到代孕母親體內的分步驟。
      16.根據權利要求1所述的方法,其中卵母細胞和精子頭來自哺乳動物。
      17.根據權利要求15所述的方法,其中哺乳動物選自靈長類動物、羊、牛、豬、熊、貓、狗、馬和嚙齒類動物。
      18.根據權利要求1所述的方法,其中卵母細胞和精子頭來自無脊椎動物。
      19.根據權利要求1所述的方法,其中卵母細胞和精子頭來自魚類、兩棲動物、爬行動物或鳥類。
      20.根據權利要求1所述的方法,其中卵母細胞和精子頭來自海膽、龍蝦、鮑魚或有殼的水生動物。
      21.一種獲得轉基因胚胎的方法,該方法包括下列步驟獲得膜受破壞的或脫膜的精子頭;將膜受破壞的或脫膜的精子頭與含有所需基因的外源核酸混合;將該混合物共同注射到分離的未受精的中期II的卵母細胞中,形成受精的轉基因卵母細胞;和使受精的轉基因卵母細胞發(fā)育成轉基因胚胎。
      全文摘要
      將精子頭和編碼轉基因的外源核酸共同注射到未受精的小鼠卵母細胞中,結果產生表達轉基因的胚胎,這反映出核酸和精子頭在共同注射前發(fā)生結合。將共注射獲得的胚胎非選擇性地轉移到代孕母親中,產生了表達被整合的轉基因的后代。
      文檔編號C12N15/89GK1334870SQ99810082
      公開日2002年2月6日 申請日期1999年8月10日 優(yōu)先權日1998年8月11日
      發(fā)明者R·揚吉馬奇 申請人:夏威夷大學
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