專利名稱：生產(chǎn)葡糖胺的方法和原料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法。本發(fā)明還涉及用遺傳工程方法修飾的用于生產(chǎn)葡糖胺的微生物菌株。
背景技術(shù)：
氨基糖通常是作為復(fù)合寡糖和多糖中的單體殘基。葡糖胺是這種單糖，葡萄糖的氨基衍生物。葡糖胺和其他氨基糖是許多天然多糖的重要組成部分。例如，含氨基糖的多糖可形成細胞的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，類似于結(jié)構(gòu)蛋白。
葡糖胺被制成營養(yǎng)品用于治療動物和人的骨關(guān)節(jié)炎。葡糖胺的市場日益增大。此外，葡糖胺的世界市場價格不會顯著降低。
目前通過酸水解幾丁質(zhì)，一種衍生于N-乙酰-D-葡糖胺的復(fù)雜碳水化合物獲得葡糖胺。或者，通過酸水解各種乙酰化的殼聚糖生產(chǎn)葡糖胺。運些方法產(chǎn)率低(底物到葡糖胺的轉(zhuǎn)化率為50％)。此外，原料(即幾丁質(zhì)源，例如蟹殼)日益缺乏。因此，為了商業(yè)銷售和使用的目的，工業(yè)上需要一種成本合算的用于高產(chǎn)率生產(chǎn)葡糖胺的方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個實施方案涉及通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法。該方法包括以下步驟(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)氨基糖代謝途徑中有遺傳修飾的微生物；(b)回收從培養(yǎng)步驟產(chǎn)生的選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產(chǎn)物。這類氨基糖代謝途徑選自將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成另一種化合物的途徑、用于合成葡糖胺-6-磷酸的途徑、將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)運出所述微生物的途徑、將葡糖胺轉(zhuǎn)運到所述微生物中的途徑以及與葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)有關(guān)的底物競爭的途徑。發(fā)酵培養(yǎng)基包括可吸收的碳、氮和磷源。在優(yōu)選的實施方案中，所述微生物是細菌或酵母，更優(yōu)選埃希菌屬的細菌，最佳為大腸桿菌。
在一個實施方案中，通過從微生物中回收細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸和/或從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收細胞外葡糖胺可回收產(chǎn)物。在另一實施方案中，回收步驟可包括從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化葡糖胺，從微生物中分離葡糖胺-6-磷酸和/或?qū)⑵咸前?6-磷酸去磷酸化以產(chǎn)生葡糖胺。在一實施方案中，回收至少約1g/L產(chǎn)物。
在另一實施方案中，培養(yǎng)步驟包括將培養(yǎng)基中的碳源保持在約0.5％-約5％的濃度。在另一實施方案中，培養(yǎng)步驟在約28℃-約37℃完成。在另一實施方案中，培養(yǎng)步驟是在發(fā)酵罐中完成。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述微生物在其編碼蛋白質(zhì)的基因中有修飾，所述蛋白質(zhì)包括但不限于N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、葡糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和/或磷酸酶。
在另一實施方案中，遺傳修飾包括其中提高微生物中的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用的遺傳修飾。所述遺傳修飾包括用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化所述微生物以提高所述微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用和/或使所述微生物過量表達葡糖胺-6-磷酸合酶。在一個實施方案中，將所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連。在另一實施方案中，將所述重組核酸分子整合到所述微生物的基因組中。在另一實施方案中，編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的所述重組核酸分子含有可提高所述合酶之作用的遺傳修飾。所述遺傳修飾例如可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用。
在一實施方案中，含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的本發(fā)明重組核酸分子編碼氨基酸序列SEQ ID NO:16。在另一實施方案中，所述重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核酸序列。優(yōu)選的本發(fā)明重組核酸分子包括pKLN23-28、nglmS-282184和nglmS-281830。
本發(fā)明還包括編碼葡糖胺-6-磷酸合酶并含有可提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用之遺傳修飾的重組核酸分子(即葡糖胺-6-磷酸合酶同系物)。所述遺傳修飾可例如降低所述合酶的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用。在一個實施方案中，在編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的本發(fā)明重組核酸分子中的所述遺傳修飾產(chǎn)生至少一個氨基酸修飾，其選自增加、取代、缺失和/或衍生葡糖胺-6-磷酸合酶的一個氨基酸殘基。在一個實施方案中，所述氨基酸修飾是在修飾的蛋白質(zhì)(即同系物)中的氨基酸序列位置上，對應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO:16的下列一個或多個位置Ile(4)、Ile(272)、Ser(450)、Ala(39)、Arg(250)、Gly(472)、Leu(469)。在另一實施方案中，所述氨基酸修飾選自下列氨基酸的取代(a)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ile(4)；(b)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ile(272)；(c)有一個脂肪族側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ser(450)；(d)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ala(39)；(e)帶有含硫例基團的氨基酸殘基取代Arg(250)；(f)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Gly(472)；(g)有一個脂肪族側(cè)基團的氨基酸殘基取代Leu(469)；以及(h)(a)-(g)的組合。
在本發(fā)明的另一實施方案中，上述氨基酸修飾優(yōu)選是選自下列的取代Ile(4)變?yōu)門hr、Ile(272)變?yōu)門hr、Ser(450)變?yōu)镻ro、Ala(39)變?yōu)門hr、Arg(250)變?yōu)镃ys、Gly(472)變?yōu)镾er、Leu(469)變?yōu)镻ro以及其組合。
在另一實施方案中，本發(fā)明的遺傳修飾的重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述合酶含有選自SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發(fā)明的遺傳修飾的重組核酸分子含有選自SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的遺傳修飾的重組核酸分子包括pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。
本發(fā)明的另一實施方案涉及具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述合酶由具有遺傳修飾的核酸序列編碼，所述修飾導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸作用的提高。所述核酸序列是上述本發(fā)明的重組核酸分子。
本發(fā)明的另一實施方案涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法，所述方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾的微生物，其中所述遺傳修飾的微生物是通過含下列步驟的方法產(chǎn)生的(1)在含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的分離的核酸分子中產(chǎn)生修飾以產(chǎn)生多個修飾的核酸序列；(2)用所述修飾的核酸序列轉(zhuǎn)化微生物以產(chǎn)生遺傳修飾的微生物；(3)就葡糖胺-6-磷酸合酶作用篩選經(jīng)遺傳修飾的微生物；(4)篩選具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾的微生物；(b)回收產(chǎn)物。培養(yǎng)步驟從所述微生物中產(chǎn)生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產(chǎn)物。
在另一實施方案中，本發(fā)明微生物在編碼N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan的基因中還有遺傳修飾，其中所述修飾減弱了所述蛋白質(zhì)的作用。在另一實施方案中，本發(fā)明的微生物在編碼磷酸酶的基因中還有遺傳修飾，其中所述修飾提高了所述磷酸酶的作用。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物在編碼下列蛋白質(zhì)的基因中還有遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶和N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag，所述修飾包括但不限于缺失至少所述基因的一部分。
本發(fā)明的另一實施方案涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法，所述方法包括步驟(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌以生產(chǎn)產(chǎn)物，(b)回收產(chǎn)物。所述產(chǎn)物包括從大腸桿菌中回收的細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸和/或從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收的細胞外葡糖胺。在本實施方案中，所述重組核酸分子提高了大腸桿菌對葡糖胺-6-磷酸合酶的表達，而且所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連。在一個實施方案中，所述重組核酸分子含有可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用的遺傳修飾。在另一實施方案中，所述大腸桿菌在選自下列的至少一個基因中還有遺傳修飾nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG和/或磷酸酶基因。在另一實施方案中，其他修飾包括nagA、nagB、nagC、nagD、nagE的缺失和manXYZ中的突變，其中所述修飾導(dǎo)致N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶和N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag的酶活性降低。
本發(fā)明的另一實施方案涉及通過生物合成方法生產(chǎn)葡糖胺的微生物。用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化所述微生物，其中將所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連。所述重組核酸分子還含有可提高葡糖胺-6-磷酸合酶之作用的遺傳修飾。所述重組核酸分子的表達提高了微生物對葡糖胺的生產(chǎn)。在優(yōu)選的實施方案中，將所述重組核酸分子整合到所述微生物的基因組中。在另一實施方案中，所述微生物在編碼選自下列的蛋白質(zhì)的基因中至少還有一個遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述修飾減弱了所述蛋白質(zhì)的作用。在另一實施方案中，本發(fā)明的微生物在編碼磷酸酶的基因中還有遺傳修飾，其中所述修飾提高了所述磷酸酶的作用。在另一實施方案中，所述微生物在編碼下列蛋白質(zhì)的基因中還有遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶和N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的酶活性。在優(yōu)選的實施方案中，所述遺傳修飾是缺失所述基因的至少一部分。
在另一實施方案中，所述微生物是大腸桿菌，其在選自nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、ptsGg基因和/或磷酸酶基因的基因中有修飾。在一實施方案中，所述大腸桿菌缺失了nag調(diào)節(jié)子基因，在另一實施方案中，所述大腸桿菌缺失了nag調(diào)節(jié)子基因并在manXYZ基因中有遺傳修飾以便由manXYZ基因編碼的所述蛋白質(zhì)具有降低的作用。
本發(fā)明的另一實施方案是上述微生物，當(dāng)在含14g/L K2HPO4、16g/LKH2PO4、1g/L二水合檸檬酸鈉、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、lmM CaCl2和約0.2-約1mM IPTG的pH7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在約28℃-約37℃培養(yǎng)約10-60小時達到細胞干重至少約8g/L的細胞密度時，所述微生物產(chǎn)生至少約1g/L葡糖胺。
本發(fā)明的另一實施方案是用于通過生物合成方法生產(chǎn)葡糖胺的微生物，所述微生物含有(a)與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子；(b)在編碼選自下列蛋白質(zhì)的基因中至少一個遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述修飾減弱了所述蛋白質(zhì)的作用。在另一實施方案中，所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還有至少一個遺傳修飾，其中所述修飾提高了所述磷酸酶的作用。所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物中葡糖胺-6-磷酸合酶的作用。在另一實施方案中，所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
附圖簡述

圖1是大腸桿菌中葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代謝途徑的示意圖。
圖2是對大腸桿菌中與葡糖胺過量生產(chǎn)中氨基糖代謝途徑有關(guān)的途徑的修飾示意圖。
圖3是含manXYZ、ptsG和△nag突變組合的大腸桿菌菌株的生產(chǎn)示意圖。
圖4說明向培養(yǎng)基中加入額外的葡萄糖和硫酸銨對葡糖胺積累的作用的線性圖。
圖5說明通過葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺抑制葡糖胺-6-磷酸合酶的線性圖。
圖6是說明在突變體glmS克隆中，葡糖胺-6-磷酸合酶的產(chǎn)物抑制活性的線性圖。
圖7是說明構(gòu)建含突變glmS基因的大腸桿菌菌株的策略示意圖。
圖8說明在含整合的突變glmS基因的大腸桿菌菌株中，葡糖胺-6-磷酸合酶的產(chǎn)物抑制作用的線性圖。
圖9說明在含整合的突變glmS基因的突變大腸桿菌菌株中，葡糖胺生產(chǎn)的線性圖。
圖10說明在生產(chǎn)葡糖胺的菌株中，葡糖胺-6-磷酸合酶的抑制作用的線性圖。
圖11A說明在45℃，生產(chǎn)葡糖胺的菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶熱穩(wěn)定性的線性圖。
圖11B說明在50℃，生產(chǎn)葡糖胺的菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶熱穩(wěn)定性的線性圖。
圖12說明IPTG濃度對葡糖胺生產(chǎn)的影響的線性圖。
圖13說明IPTG濃度和溫度對葡糖胺生產(chǎn)的影響的線性圖。
圖14A是說明30℃時葡糖胺生產(chǎn)菌株2123-54的生長和葡糖胺生產(chǎn)情況線性圖。
圖14B說明37℃時葡糖胺生產(chǎn)菌株2123-54的生長和葡糖胺生產(chǎn)情況線性圖。
圖15A是說明30℃時葡糖胺生產(chǎn)菌株2123-49的葡糖胺生產(chǎn)的線性圖。
圖15B是說明30℃時葡糖胺生產(chǎn)菌株2123-124的葡糖胺生產(chǎn)的線性圖。
圖16A是說明37℃時在葡萄糖限量的發(fā)酵罐中葡糖胺生產(chǎn)菌株的葡糖胺生產(chǎn)情況線性圖。
圖16B是說明30℃時在葡萄糖限量的發(fā)酵罐中葡糖胺生產(chǎn)菌株的葡糖胺生產(chǎn)情況線性圖。
圖16C是說明30℃時在葡萄糖過量的發(fā)酵罐中葡糖胺生產(chǎn)菌株的葡糖胺生產(chǎn)情況線性圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生產(chǎn)葡糖胺的生物合成方法。所述方法包括發(fā)酵遺傳工程修飾的微生物以生產(chǎn)葡糖胺。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)葡糖胺的遺傳工程修飾的微生物，例如大腸桿菌菌株。文中所用術(shù)語葡糖胺和N-葡糖胺可以交換使用。同樣，術(shù)語葡糖胺-6-磷酸和N-葡糖胺-6-磷酸也可以交換使用。還可將葡糖胺縮寫為GlcN，將葡糖胺-6-磷酸縮寫為GlcN-6-P。
本發(fā)明通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的新方法不昂貴，而且葡糖胺的產(chǎn)率超過目前每成本通過水解方法生產(chǎn)葡糖胺的產(chǎn)率。另外，通過使用本文所述的遺傳工程方法修飾的微生物，很容易對本發(fā)明方法進行改變以便根據(jù)葡糖胺的生產(chǎn)適用于特定的問題或者變化的要求。
N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖胺(GlcN)等氨基糖是微生物中非常重要的分子，因為它們是主要大分子，具體地講，是糖結(jié)合物(即含共價寡糖鏈的大分子)生物合成的前體。例如，在大腸桿菌中，N-乙酰葡糖胺和葡糖胺是兩種細胞膜大分子，肽聚糖和脂多糖的前體。阻斷肽聚糖或脂多糖之生物合成的突變是致死的，會導(dǎo)致喪失細胞膜的完整性并最終導(dǎo)致細胞溶解。
本發(fā)明的一個實施方案涉及通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法。該方法包括步驟(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)在氨基糖代謝途徑具有遺傳修飾的微生物，所述代謝途徑包括將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成另一種化合物的途徑、合成葡糖胺-6-磷酸的途徑、將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸運輸?shù)剿鑫⑸锿獾耐緩?、將葡糖胺運輸?shù)剿鑫⑸飪?nèi)的途徑以及與葡糖胺-6-磷酸生成競爭底物的途徑，以由所述微生物生成包括細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸和/或細胞外葡糖胺的產(chǎn)物；及(b)通過從所述微生物中回收細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸和/或從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收細胞外葡糖胺來回收產(chǎn)物。發(fā)酵培養(yǎng)基包含可吸收的碳、氮和磷源。
本發(fā)明的另一實施方案涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法。所述方法包括步驟(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)用重組核酸分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，所述核酸分子編碼葡糖胺-6-磷酸并與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連；(b)回收選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產(chǎn)物。所述重組核酸分子可提高大腸桿菌葡糖胺-6-磷酸合酶的表達。在另一實施方案中，所述重組核酸分子含有降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用的遺傳修飾。在另一實施方案中，所述大腸桿菌還至少有一個選自nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和/或磷酸酶基因的遺傳修飾。
為了通過本發(fā)明的發(fā)酵方法以顯著高的產(chǎn)率生產(chǎn)葡糖胺，對微生物進行遺傳修飾以提高葡糖胺的生產(chǎn)。如文中所述，遺傳修飾的微生物例如大腸桿菌含有從其正常(即野生型或天然)形式修飾(即突變或改變的)的基因組。利用經(jīng)典菌株開發(fā)和/或分子遺傳學(xué)技術(shù)可以完成微生物的遺傳修飾。所述技術(shù)通常公開于例如Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)冷泉港實驗室出版社。Sambrook等的文獻全文引入本文作為參考。另外，在實施例節(jié)詳細描述了用于遺傳修飾微生物的技術(shù)。遺傳修飾的微生物可包括天然遺傳變體以及其中以所述修飾可在所述微生物內(nèi)提供所需作用的方式已對核酸分子進行插入、缺失或修飾(即突變；例如通過核苷酸的插入、缺失、取代和/或倒置)的微生物。根據(jù)本發(fā)明，遺傳修飾的微生物包括已用重組技術(shù)修飾過的微生物。如文中所用，可將導(dǎo)致基因表達、基因功能或基因產(chǎn)物(即由該基因編碼的蛋白質(zhì))之功能降低的遺傳修飾稱為基因的失活(完全的或部分的)、缺失、斷裂、阻斷或下調(diào)。例如，導(dǎo)致基因編碼之蛋白質(zhì)功能降低的基因中的遺傳修飾可能是下列原因的結(jié)果所述基因完全缺失(即該基因不存在，因此所述蛋白質(zhì)不存在)、導(dǎo)致蛋白質(zhì)不完整或不翻譯(例如蛋白質(zhì)不表達)的基因中的突變、或者降低或消除了所述蛋白質(zhì)的天然功能(例如被表達的蛋白質(zhì)的酶活性或作用降低或沒有活性或作用)的基因突變?？蓪?dǎo)致基因表達或功能增強的遺傳修飾稱為基因的擴增、過量生產(chǎn)、過量表達、激活、提高、增加或上調(diào)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，微生物的遺傳修飾提高或降低了與本發(fā)明氨基糖代謝途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的作用。所述遺傳修飾包括任何類型的修飾，具體包括通過重組技術(shù)和經(jīng)典誘變產(chǎn)生的修飾。例如，在一實施方案中，本發(fā)明的微生物含有提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾。應(yīng)注意本文所討論的葡糖胺-6-磷酸合酶及其他酶作用(或活性)的提高指導(dǎo)致下列結(jié)果的所述微生物中的任何遺傳修飾所述酶功能提高并包括所述酶的較高活性(例如比活性或體內(nèi)酶活性)、所述酶的抑制作用降低或所述酶的降解以及所述酶的過量表達。例如可增加基因拷貝數(shù)、利用比天然啟動子有更高表達水平的啟動子可以提高表達水平或者通過遺傳工程方法或經(jīng)典誘變可改變基因以提高所述酶的作用。在實施例節(jié)中描述了已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾提高了葡糖胺-6-磷酸合酶之作用的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸分子的實例。同樣，本文所討論的酶作用的降低指可導(dǎo)致下列結(jié)果的任何遺傳修飾酶功能降低并包括酶活性(例如比活性)降低、酶的抑制作用增強或者降解增加以及所述酶表達的減少或消除。例如通過阻斷或減少所述酶的生產(chǎn)、降低酶活性或者抑制所述酶的活性可以降低本發(fā)明酶的作用。酶生產(chǎn)的阻斷或減少包括將編碼所述酶的基因放在啟動子的控制下，所述啟動子需要在生長培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)化合物。通過確定條件從所述培養(yǎng)基中除去所述誘導(dǎo)劑，可以關(guān)閉編碼所述酶之基因的表達(并因此，關(guān)閉酶合成)。酶活性的阻斷或降低還可包括利用與美國專利4,743,546所述相似的切割技術(shù)，該專利引入本文作為參考。為了利用該方法，將編碼目的酶的基因克隆在可使得特異性地有控制地從基因組中切割所述基因的特異性遺傳序列間。例如按美國專利4,743,546所述通過培養(yǎng)溫度的改變或者通過一些其他物理或營養(yǎng)信號可以促進切割。
氨基糖是糖的一種氨基衍生物(例如氨基代替了羥基的糖)。根據(jù)本發(fā)明，氨基糖代謝途徑是與氨基糖的生物合成、合成代謝或分解代謝有關(guān)或影響其生物合成、合成代謝或分解代謝的任何生物化學(xué)途徑。本文所用氨基糖代謝途徑包括與氨基糖和其前體運輸入或出細胞有關(guān)的途徑，還可包括競爭氨基糖生物合成或分解代謝有關(guān)的底物的生物化學(xué)途徑。例如，最早形成的氨基糖之一的中間前體是果糖-6-磷酸(F-6-P)，其在與谷氨酰胺(Gln，氨基供體)的生物化學(xué)反應(yīng)中形成葡糖胺-6-磷酸。果糖-6-磷酸還是糖酵解途徑的中間產(chǎn)物。因此，通過底物果糖-6-磷酸的競爭，糖酵解途徑與葡糖胺-6-磷酸生物合成途徑競爭。另外，通過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)可將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成其它氨基糖并形成各種大分子的組分。因此，果糖-6-磷酸/葡糖胺-6-磷酸途徑、果糖-6-磷酸糖酵解途徑在其影響葡糖胺-6-磷酸之生物合成的程度上，以及葡糖胺-6-磷酸/大分子生物合成途徑均被認(rèn)為是本發(fā)明的氨基糖代謝途徑。
總之，帶有遺傳修飾的氨基糖代謝途徑的微生物含有至少一個上述遺傳修飾，與同樣條件下培養(yǎng)的野生型微生物相比，所述修飾導(dǎo)致上述一個或多個氨基糖代謝途徑的改變。氨基糖代謝途徑中的這類修飾改變了所述微生物生產(chǎn)氨基糖的能力。根據(jù)本發(fā)明，遺傳修飾的微生物與同樣條件培養(yǎng)的野生型微生物相比優(yōu)選其具有提高的生產(chǎn)葡糖胺的能力。通?？蓪⒂绊懫咸前飞a(chǎn)的氨基糖代謝途徑劃歸至少下列途徑之一(a)將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成其它化合物的途徑，(b)合成葡糖胺-6-磷酸的途徑，(c)將葡糖胺運輸?shù)郊毎械耐緩剑?d)將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸運輸出細胞的途徑以及(e)與生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸競爭底物的途徑。
用于本發(fā)明方法的遺傳修飾的微生物通常具有至少一種修飾的至少與一種氨基糖代謝途徑有關(guān)的基因，所述修飾導(dǎo)致(a)將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成其他化合物的能力降低(即葡糖胺-6-磷酸分解代謝或合成代謝途徑的抑制作用)，(b)生產(chǎn)(即合成)葡糖胺-6-磷酸的能力提高，(c)將葡糖胺運輸進細胞的能力降低，(d)將葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺運輸出細胞的能力提高和/或(e)使用與葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)有關(guān)的底物進行競爭性生物化學(xué)反應(yīng)的能力降低。
應(yīng)理解，本發(fā)明公開了在發(fā)酵過程中利用具有生產(chǎn)商業(yè)有用量葡糖胺之能力的微生物的方法(即優(yōu)選與在相同條件下培養(yǎng)的野生型微生物相比生產(chǎn)葡糖胺的能力提高)。通過遺傳修飾編碼與氨基糖代謝途徑有關(guān)之蛋白質(zhì)的一個或多個基因而完成所述方法，所述遺傳修飾導(dǎo)致生成(表達)與相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)相比具有改變的(例如提高或降低的)功能的蛋白質(zhì)。所述改變的功能提高了遺傳修飾的微生物生成葡糖胺的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解生產(chǎn)經(jīng)如實施例所述特異性篩選技術(shù)所得含本文特定之功能改變的遺傳修飾微生物可產(chǎn)生許多符合特定功能要求的生物，但需經(jīng)各種遺傳修飾。例如，在指定核酸序列中的不同的隨機核苷酸缺失和/或取代均可產(chǎn)生相同的表型(例如由所述序列編碼之蛋白質(zhì)作用的減弱)。本發(fā)明設(shè)想了可產(chǎn)生具有本文所述特征之微生物的任何這類遺傳修飾。
對于不同微生物來說，已闡明了許多氨基糖代謝途徑。具體地講，已闡明了大腸桿菌中葡糖胺和N乙酰葡糖胺及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代謝途徑。這些途徑包括利用這些氨基糖為碳源的多運輸系統(tǒng)。已克隆并測序了大腸桿菌中編碼直接與氨基糖之運輸、分解代謝和生物合成有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)的基因。另外，已分離了在氨基糖代謝幾乎每一步阻斷的大腸桿菌的各突變株。圖1說明了大腸桿菌氨基糖代謝的已知途徑。
如下文將詳細討論的，盡管已闡明了與氨基糖代謝途徑有關(guān)的許多途徑和基因，但直到本發(fā)明為止，并不知道在許多可能的遺傳修飾中究竟哪一種對于產(chǎn)生可生產(chǎn)商業(yè)顯著量葡糖胺之微生物是必需的。確實，本發(fā)明人首次設(shè)計并生產(chǎn)出具有遠大于任何已知野生型或突變微生物之葡糖胺生成能力的葡糖胺-生成微生物。本發(fā)明人還首次認(rèn)識到所述遺傳修飾的微生物可用于生產(chǎn)商業(yè)用葡糖胺的方法。
用于本發(fā)明發(fā)酵方法的微生物優(yōu)選是細菌或酵母。更優(yōu)選所述微生物是埃希菌屬的細菌。大腸桿菌是用于本發(fā)明發(fā)酵方法的最佳微生物。特別優(yōu)選的大腸桿菌菌株包括K-12、B和W，最佳為K-12。盡管大腸桿菌是最佳的，但應(yīng)理解生成葡糖胺的并可經(jīng)遺傳修飾以提高葡糖胺生成的任何微生物均可用于本發(fā)明方法。還可將用于本發(fā)明發(fā)酵方法的微生物稱為生產(chǎn)微生物。
下文將描述作為本發(fā)明具體實施方案的大腸桿菌的氨基糖代謝途徑。應(yīng)理解，其他微生物，具體地講，其他細菌具有類似的氨基糖代謝途徑以及在所述途徑內(nèi)具有類似結(jié)構(gòu)和功能的基因和蛋白質(zhì)。因此，下丈有關(guān)大腸桿菌的原理也適用于其他微生物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，遺傳修飾的微生物包括合成葡糖胺-6-磷酸的能力提高的微生物。根據(jù)本發(fā)明，“合成產(chǎn)物的能力提高”指在涉及產(chǎn)物合成的氨基糖代謝途徑中的任何提高或上調(diào)以致與相同條件下培養(yǎng)的野生型微生物相比，本發(fā)明微生物生成產(chǎn)物的數(shù)量增加。在本發(fā)明的一實施方案中，微生物合成葡糖胺-6-磷酸能力的提高是通過增加葡糖胺-6-磷酸合酶基因的表達而完成的，在大腸桿菌中，該基因是glmS基因，其產(chǎn)物是葡糖胺-6-磷酸合酶。葡糖胺-6-磷酸合酶催化其中果糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸的反應(yīng)。在大腸桿菌中，例如通過導(dǎo)入編碼glmS基因的重組核酸分子可增加葡糖胺-6-磷酸合酶的表達。
glmS的過量表達對于葡糖胺-6-磷酸的細胞內(nèi)積累并最終生成葡糖胺是很重要的，因為細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸合酶的水平將控制碳流出糖酵解途徑和進入葡糖胺-6-磷酸合成途徑。glmS基因位于大腸桿菌染色體上的84min,該染色體區(qū)的序列分析表明glmS與glmU基因位于同一操縱子內(nèi)，glmS編碼雙功能酶，葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶在通過一系列生物化學(xué)反應(yīng)將葡糖胺-6-磷酸摻入大分子的氨基糖代謝途徑中發(fā)揮功能。在glmS上游未檢測到明顯的啟動子；glmUS操縱子的轉(zhuǎn)錄是從glmU上游的兩個啟動子序列開始的。因此，優(yōu)選將glmS基因克隆在人工啟動子的控制下。所述啟動子可以是任何可在生產(chǎn)生物體中提供保持足夠水平的葡糖胺-6-磷酸合酶所需之glmS表達水平的啟動子。優(yōu)選的啟動子是組成型(而不是誘導(dǎo)型)啟動子，因此而不需要加入昂貴的誘導(dǎo)劑。所述啟動子包括已通過遺傳修飾，例如較弱的突變阻遏基因的應(yīng)用而成為功能組分或“滲漏”的正?？烧T導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)?？膳cglmS一起使用的特別優(yōu)選的啟動子是lac,λPL和T7。根據(jù)最大產(chǎn)物形成量的要求可以改變glmS基因的量(拷貝數(shù))。在一實施方案中，將重組glmS基因整合到大腸桿菌染色體中。
因此，本發(fā)明的一個實施方案是提供用含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的微生物，例如大腸桿菌，此時葡糖胺-6-磷酸是由glmS基因編碼的。含所述核酸序列的優(yōu)選重組核酸分子包括含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子，所述葡糖胺-6-磷酸合酶含有氨基酸序列SEQ ID NO:16。本發(fā)明其他優(yōu)選的重組核酸分子包括含有選自SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:15之核酸序列的核酸分子。本發(fā)明特別優(yōu)選的重組核酸分子包括含有核酸分子nglmS-282184和/或nglmS-281830的核酸分子。稱為pKLM23-28的一個本發(fā)明的重組分子包括SEQ ID NO:13、14和15，且對于在微生物中表達葡糖胺-6-磷酸合酶是特別有用的。上述鑒定的核酸分子代表了含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)之野生型(即天然或內(nèi)源)核酸序列的核酸分子。本發(fā)明還包括含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶同系物(即修飾的和/或突變的)之核酸序列的遺傳修飾的核酸分子，下文將詳細描述。
報道的大腸桿菌果糖-6-磷酸合酶對果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的Km分別是2mM和0.4mM。這些值相對較高(即該酶對其底物的親和性相當(dāng)弱)。因此，本發(fā)明的另一實施方案是提供葡糖胺-6-磷酸合酶與其底物的親和性提高的微生物?？赏ㄟ^任何適宜的遺傳修飾或蛋白質(zhì)工程方法生產(chǎn)與其底物親和性提高的葡糖胺-6-磷酸合酶。例如，可以用以計算機為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)工程設(shè)計具有較高穩(wěn)定性和較好底物親和性的葡糖胺-6-磷酸合酶。參見例如Maulik等，1997，分子生物技術(shù)治療應(yīng)用與策略(Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications and Strategies)；Wiley-Liss,Inc.，已全文引入本文作為參考。
White(1968，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)106:847-858)首次表明葡糖胺-6-磷酸合酶是由葡糖胺-6-磷酸抑制的。本發(fā)明確定這種抑制作用是限制葡糖胺在本發(fā)明設(shè)計的商業(yè)用葡糖胺生產(chǎn)菌株中積累的關(guān)鍵因素。因此，本發(fā)明的另一實施方案提供了具有減弱的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物反饋抑制作用之葡糖胺-6-磷酸合酶的微生物。具有減弱的產(chǎn)物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶可以是突變的(即遺傳修飾的)葡糖胺-6-磷酸合酶基因，例如可以通過任何適宜的遺傳修飾方法產(chǎn)生。例如通過插入、缺失和/或取代核苷酸的方法，例如通過易錯PCR可修飾編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子。用該方法，在導(dǎo)致高頻率摻入錯誤的條件下通過用于擴增的DNA聚合酶擴增所述基因。結(jié)果，在PCR產(chǎn)物中得到高頻突變。在實施例5中將詳細描述該方法。然后通過檢測突變基因使被測微生物與攜帶非突變的重組葡糖胺-6-磷酸合酶核酸分子的微生物進行比較具有提高的葡糖胺生產(chǎn)能力，可篩選具有減弱的產(chǎn)物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶基因突變株。應(yīng)注意，葡糖胺-6-磷酸合酶的產(chǎn)物抑制作用降低通常會導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸合酶的作用提高，甚至當(dāng)與天然葡糖胺-6-磷酸酶相比，該酶的比活性仍相同或?qū)嶋H上降低時也會如此。因此，本發(fā)明的一個實施方案是生產(chǎn)具有提高的作用和提高的體內(nèi)酶活性的遺傳修飾的葡糖胺-6-磷酸合酶，遺傳修飾的所述酶與天然葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有未改變的或者甚至降低的比活性。本發(fā)明還包括遺傳修飾的具有提高的比活性的葡糖胺-6-磷酸合酶。
因此，本發(fā)明的一個實施方案用遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的微生物，例如大腸桿菌，所述核酸分子含有編碼突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白或葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的核酸序列。本文將這類葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白也稱為葡糖胺-6-磷酸合酶同系物。下丈將詳細描述蛋白質(zhì)同系物。含這類核酸序列的優(yōu)選重組核酸分子包括含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子，所述酶含有選自下列的氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:31。其他優(yōu)選的重組核酸分子含有選自下列的核酸序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29和/或SEQ ID NO:30。可用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的遺傳修飾的重組核酸分子包括含選自下列之核酸分子的核酸分子nglmS-492184、nglmS-491830,nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。質(zhì)粒pKLN23-49、pKLN23-54、PKLN23-124、pKLN23-149和pKLN23-151是本發(fā)明的重組核酸分子，它們對于在微生物中表達本發(fā)明葡糖胺-6-磷酸合酶同系物是特別有用的。
在細胞內(nèi)有足夠的谷氨酰胺(Gln)對于葡糖胺-6-磷酸合酶反應(yīng)是很重要的。檢查葡糖胺-6-磷酸的合成和降解途徑表明存在潛在的無效循環(huán)，借助該循環(huán)果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸的連續(xù)互變會導(dǎo)致谷氨酰胺的不經(jīng)濟消耗。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過對生產(chǎn)生物體進行遺傳修飾以提高細胞內(nèi)的谷氨酰胺生產(chǎn)，或者通過修飾發(fā)酵培養(yǎng)基(即向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入谷氨酰胺)可以提高谷氨酰胺的供應(yīng)以確保谷氨酰胺的供應(yīng)不會限制葡糖胺-6-磷酸的生產(chǎn)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述潛在的果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸無效循環(huán)是通過抑制或阻斷葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成果糖-6-磷酸的逆向反應(yīng)而實現(xiàn)的。在該實施方案中，遺傳修飾微生物以便其催化該轉(zhuǎn)變的基因，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶失活或缺失，在大腸桿菌中該基因是nagB基因。nagB基因是數(shù)個nag基因中的-種，這些nag基因是nag調(diào)節(jié)子的一部分。與葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺降解有關(guān)的nag基因作為調(diào)節(jié)子存在于大腸桿菌染色體上的15min。在另一實施方案中，使完整的nag調(diào)節(jié)子失活或缺失。下文將詳細討論缺失全部nag調(diào)節(jié)子的優(yōu)點。
如上所討論，葡糖胺-6-磷酸合酶的過量生產(chǎn)導(dǎo)致果糖-6-磷酸合成轉(zhuǎn)成葡糖胺-6-磷酸合成。但是，許多其他酶可以爭奪底物果糖-6-磷酸。因此，本發(fā)明的一個實施方案包括其中阻斷這些競爭性副反應(yīng)的微生物。在優(yōu)選的實施方案中，提供了含有完全或部分失活的編碼磷酸果糖激酶之基因的微生物。糖酵解途徑的第二步通過磷酸果糖激酶將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變成果糖-1,6-二磷酸，在大腸桿菌中，磷酸果糖激酶作為由pfkA或pfkB編碼的兩種同工酶存在。pfkA或pfkB基因的完全或部分失活會降低果糖-6-磷酸進入糖酵解途徑的速度，并促進果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變成葡糖胺-6-磷酸。丈中所用基因的失活指對導(dǎo)致所述基因之活性(即表達或功能)降低的基因的任何修飾，包括活性的減弱或活性的完全缺失。
在本發(fā)明的另一實施方案中，遺傳修飾的微生物將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成其他化合物的能力降低。如上所述，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的失活代表一種所述修飾，但是，葡糖胺-6-磷酸是其他生物化學(xué)反應(yīng)的底物。導(dǎo)致大分子例如大腸桿菌脂多糖和肽聚糖產(chǎn)生之途徑中的第一步是通過磷酸葡糖胺變位酶將葡糖胺-6-磷酸變?yōu)槠咸前?1-磷酸，在大腸桿菌中，所述變位酶是glmM基因的產(chǎn)物。最近通過克隆glmM基因確定了脂多糖和肽聚糖的生物合成有該酶活性的參與。結(jié)果，尚未詳細研究出glmM基因的調(diào)節(jié)，其天然產(chǎn)物，磷酸葡糖胺變位酶。但是已表明磷酸葡糖胺變位酶與所研究的所有其他磷酸己糖變位酶一樣均是通過磷酸化調(diào)節(jié)的。這種酶水平的調(diào)節(jié)通常對該途徑末端產(chǎn)物的水平極為敏感。因此，通過磷酸葡糖胺變位酶的碳流可能是自我調(diào)節(jié)的，并且不是葡糖胺-6-磷酸積累的問題。glmM基因序列是已知的，但是，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是提供其中磷酸葡糖胺變位酶編碼基因被中斷或缺失的微生物。更優(yōu)選，將編碼磷酸葡糖胺變位酶的基因通過突變下調(diào)，但不是完全失活，以便不會完全阻斷重要細胞膜組分的生物合成。
導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成另一化合物的另一途徑是由N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶催化的。N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶能夠催化葡糖胺-6-磷酸(加乙酰CoA)轉(zhuǎn)變成N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸的逆反應(yīng)。這可能導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸和N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸的無效循環(huán)并導(dǎo)致產(chǎn)生由葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺組成的混合物。因此，本發(fā)明的另一實施方案是提供其中編碼N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶的基因，在大腸桿菌中是nagA基因失活的遺傳修飾的微生物。
本發(fā)明的另一實施方案是使微生物中葡糖胺的運輸系統(tǒng)失活以便細胞一旦分泌出葡糖胺后，不會再攝入。這種修飾有助于避免對細胞有毒的高水平的細胞內(nèi)葡糖胺，并促進產(chǎn)物的回收，因為產(chǎn)物仍在細胞外。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將葡糖胺的運輸系統(tǒng)失活以便微生物一旦產(chǎn)生葡糖胺后，將葡糖胺保持在所述微生物外。在大腸桿菌在僅以葡糖胺為碳源生長的過程中，通過PEP甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(PTS)系統(tǒng)將葡糖胺運輸?shù)郊毎麅?nèi)，該系統(tǒng)不僅能夠?qū)⑵咸前愤\輸?shù)郊毎麅?nèi)，而且是由葡糖胺誘導(dǎo)的。因此，本發(fā)明的一個實施方案是提供沒有將葡糖胺運輸?shù)郊毎麅?nèi)之能力的微生物。例如，manXYZ突變株(即編碼PEP甘露糖PTS之EIIM,P/ⅢMan的基因缺乏或有突變的大腸桿菌)不能通過該機制將葡糖胺運輸?shù)郊毎麅?nèi)。另一方面，大腸桿菌的PEP葡萄糖PTS能夠?qū)⑵咸烟呛推咸前愤\輸?shù)郊毎麅?nèi)，但是葡糖胺不能誘導(dǎo)該系統(tǒng)。因此，為了使manXYZ突變株在葡糖胺上生長，必須使細胞先在葡萄糖上生長以誘導(dǎo)(可替換的)葡萄糖運輸系統(tǒng)的表達并允許葡萄糖(優(yōu)選的碳源)運輸?shù)郊毎麅?nèi)。然后這些被誘導(dǎo)的細胞能夠經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白將葡糖胺運輸?shù)郊毎麅?nèi)。類似的情況存在于經(jīng)PEP果糖PTS運輸葡糖胺，盡管在這種情況下，通過酶ⅡFru運輸?shù)钠咸前泛苌?。下文討論抑制這些二級葡糖胺運輸途徑的方法。本發(fā)明的另一實施方案是提供PEP葡萄糖PTS(上述)功能降低的微生物。所述修飾對于避免來自培養(yǎng)基的葡糖胺再吸收可能是必需的。例如，ptsG突變株(即編碼PEP葡萄糖PTS之酶ⅡGlc的基因缺乏或有突變)。由于所述微生物利用葡萄糖作為碳源的生長能力降低，因此，可對所述生物體進行進一步地遺傳修飾以便通過與PEP葡萄糖PTS無關(guān)的機制攝入葡萄糖。例如已表明可篩選PEP葡萄糖PTS缺陷型突變微生物，所述微生物仍有在葡萄糖上生長的能力(Flores等，1996，天然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)14:620-623)。
大腸桿菌nag調(diào)節(jié)子的DNA測序表明nagE基因位于所述調(diào)節(jié)子的一個臂上并由所述調(diào)節(jié)子另一臂上的其它nag基因(nagBACD)轉(zhuǎn)錄，它編碼PEP糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(PTS)系統(tǒng)中的N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag蛋白，該酶與葡糖胺運輸?shù)郊毎麅?nèi)有關(guān)。因此，導(dǎo)致大腸桿菌運輸葡糖胺至細胞內(nèi)之能力降低的另一遺傳修飾是nagE基因的失活或缺失，或者編碼用于本發(fā)明方法的任何微生物中類似酶之基因的失活或缺失。
如上所述，在本發(fā)明的一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的遺傳修飾大腸桿菌的整個nag調(diào)節(jié)子已缺失。完整染色體nag調(diào)節(jié)子的缺失是優(yōu)選的，因為將同時使許多不利于葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)生的基因失活。上文已詳細討論了nagA、nagB和nagE基因。nagC基因編碼一調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白是nag調(diào)節(jié)子的阻遏物并且既是glmUS操縱子的激活劑，也是glmUS操縱子的的阻遏物。上文詳細討論了glm基因。nagD基因的功能是未知的，但由于其位于nag調(diào)節(jié)子內(nèi)，因此認(rèn)為其也與氨基糖代謝有關(guān)。因此，在大腸桿菌中，nag調(diào)節(jié)子的全部缺失避免了在用于過量生產(chǎn)葡糖胺的大腸桿菌菌株中，初始細胞內(nèi)產(chǎn)物(葡糖胺-6-磷酸)的分解代謝。優(yōu)選的具有nag調(diào)節(jié)子缺失的大腸桿菌突變株是具有ΔnagEBACD∷tc缺失/插入的大腸桿菌。
就glmUS操縱子的失活(nagC的功能)而言，盡管編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的glmS基因的失活為所需，但是glmU基因產(chǎn)物，葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶水平的增加對于葡糖胺-6-磷酸的積累可能不利，因為它可能導(dǎo)致碳源流向細胞膜組分。因此，本發(fā)明的一個實施方案是使本發(fā)明方法所用微生物的葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶失活。在其中g(shù)lmUS操縱子或其等同物已被失活或缺失的微生物中，本發(fā)明的另一實施方案是通過重組方法在所述微生物中產(chǎn)生位于人工啟動子控制下的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之基因，從而遺傳修飾所述微生物。
在本文所述之遺傳修飾微生物中的初始細胞內(nèi)產(chǎn)物是葡糖胺-6-磷酸。在許多微生物，包括大腸桿菌中，葡糖胺-6-磷酸通常在運輸出細胞前去磷酸化成為葡糖胺。然而，本發(fā)明的另一實施方案是提供經(jīng)遺傳修飾具有將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成葡糖胺的相應(yīng)磷酸酶活性的微生物。這類磷酸酶包括但不限于，例如堿性磷酸酶。在優(yōu)選的實施方案中，這類大腸桿菌具有增強的(即提高的)磷酸酶活性(即磷酸酶作用)。
如上所述，在本發(fā)明生產(chǎn)葡糖胺的方法中，在用于生產(chǎn)葡糖胺的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有遺傳修飾的氨基糖代謝途徑的微生物。適宜的或有效的發(fā)酵培養(yǎng)基指當(dāng)被培養(yǎng)時，本發(fā)明遺傳修飾的微生物能夠產(chǎn)生葡糖胺的任何培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基通常是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基還可包括適宜的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其他營養(yǎng)成份。本文所述的對微生物之遺傳修飾的一項優(yōu)點是盡管所述遺傳修飾顯著地改變了氨基糖的代謝，但是對于生產(chǎn)生物體并沒有任何營養(yǎng)需求。因此，優(yōu)選用以葡萄糖為唯一碳源的基本-鹽培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。用于葡糖胺發(fā)酵的基本-鹽-葡萄糖培養(yǎng)基還有利于葡糖胺產(chǎn)物的回收和純化。
還可在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物?？赏ㄟ^任何發(fā)酵方法培養(yǎng)所述微生物，所述方法包括但不限于分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、細胞再循環(huán)以及連續(xù)發(fā)酵。優(yōu)選，通過分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)發(fā)酵方法培養(yǎng)本發(fā)明微生物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，接種前，使發(fā)酵培養(yǎng)基達到理想溫度，通常約20-約40℃，優(yōu)選約25℃-約40℃，約28℃-約37℃，在一些實施方案中，約30℃-約37℃是最佳的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)受控于T7-lac啟動子(參見實施例節(jié))的核酸分子所轉(zhuǎn)染的本發(fā)明微生物于30℃培養(yǎng)時停止生長但繼續(xù)生產(chǎn)葡糖胺，于37℃時生長和葡糖胺生產(chǎn)并存。37℃生長比30℃稍微好些，但是30℃時的葡糖胺生產(chǎn)顯著好于37℃。應(yīng)注意本發(fā)明微生物的生長和葡糖胺生產(chǎn)的最佳溫度可隨各種因素而改變。例如，用于微生物中重組核酸分子表達的特定啟動子的篩選可能會影響最佳培養(yǎng)溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如實施例節(jié)中所述的用于本發(fā)明微生物的技術(shù)確定本發(fā)明任何微生物的最佳生長和葡糖胺生產(chǎn)溫度。
用經(jīng)過合理的生長期足以產(chǎn)生高細胞密度量的遺傳修飾的微生物的活躍生長培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基。使細胞生長至至少約10g/l的細胞密度，優(yōu)選約10g/l-約40g/l，更優(yōu)選至少約40g/l。該過程通常需要約10-60小時。
在發(fā)酵過程中須將足夠的氧加到培養(yǎng)基中以便在開始的細胞生長中保持細胞生長并保持代謝和葡糖胺生產(chǎn)。一般通過培養(yǎng)基的攪拌和通氣提供氧?？捎脭嚢杌蛘袷幍瘸Ｒ?guī)方法給培養(yǎng)基通氣。培養(yǎng)基中的氧濃度優(yōu)選大于飽和值(即在大氣壓和約30-40℃，培養(yǎng)基中的氧溶解度)的約15％，更優(yōu)選大與飽和值的約20％，盡管如果對發(fā)酵沒有不利影響，可達到較低的氧濃度。通過常規(guī)方法例如用氧電極可監(jiān)測培養(yǎng)基的氧濃度?？梢允褂闷渌踉矗缥聪♂尩难鯕夂陀贸酝獾钠渌栊詺怏w稀釋的氧氣。
由于葡糖胺的發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)選以葡萄糖為唯一碳源，因此在優(yōu)選的實施方案中，將在大腸桿菌中誘導(dǎo)PEP葡萄糖PTS。因此，甚至在沒有PEP甘露糖PTS的功能性EIIM,P/ⅢMan的情況下(例如，在帶有manXYZ突變的大腸桿菌中)，仍將由細胞經(jīng)誘導(dǎo)的葡萄糖運輸系統(tǒng)攝入產(chǎn)物葡糖胺。但在有過量葡萄糖時，葡糖胺的攝入受到嚴(yán)重抑制。因此，本發(fā)明的一個實施方案是通過在發(fā)酵生物反應(yīng)器中保持過量葡萄糖來抑制葡糖胺產(chǎn)物的攝入。本文所用“過量”的葡萄糖指葡萄糖的量高于正常條件，例如上述培養(yǎng)條件下保持微生物生長所需的量。優(yōu)選，將葡萄糖濃度保持在發(fā)酵培養(yǎng)基重量/體積約0.5％-約5％。在另一實施方案中，將葡萄糖濃度保持在約5g/L-約50g/L發(fā)酵培養(yǎng)基，最佳為約5g/L至約20g/L發(fā)酵培養(yǎng)基。在一實施方案中，通過任何適宜的方法(例如用葡萄糖檢測條)監(jiān)測發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖濃度，當(dāng)葡萄糖濃度耗盡或接近耗盡時，再向培養(yǎng)基中加入葡萄糖。在另一實施方案中，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中半連續(xù)或連續(xù)補料來保持葡萄糖的濃度。本文公開的葡萄糖參數(shù)適用于本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基所用的任何碳源。還應(yīng)理解，可使碳源在發(fā)酵過程的任何適宜時間段達到不可檢測的水平，只要其可促進葡糖胺的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一實施方案是根據(jù)保持和/或促進生產(chǎn)生物體生產(chǎn)葡糖胺的需要，補充和/或控制發(fā)酵培養(yǎng)基的其他組分和參數(shù)。例如，在一個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基含有硫酸銨，而且通過加入過量硫酸銨補充培養(yǎng)基中硫酸銨的濃度。優(yōu)選將發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸銨量保持在約0.1％-約1％(重量/體積)，優(yōu)選約0.5％。在另一實施方案中，監(jiān)測發(fā)酵培養(yǎng)基pH的波動。在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，優(yōu)選將pH保持在約pH6.0-約pH8.0，更優(yōu)選約pH7.0。在本發(fā)明方法中，如果發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH為7.0，則監(jiān)測發(fā)酵培養(yǎng)基的pH是否顯著偏離pH7.0，并通過例如加入氫氧化鈉作相應(yīng)調(diào)整。
本發(fā)明的另一實施方案是改變碳流，使其從乙酸鹽生產(chǎn)流向較低毒性副產(chǎn)物的生產(chǎn)。用所述方法，可避免與發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖過量有關(guān)的毒性問題。從乙酸鹽生產(chǎn)改變碳流向的方法是本領(lǐng)域已知的。
在本發(fā)明的分批發(fā)酵過程中，持續(xù)發(fā)酵直到通過細胞外葡糖胺的積累表明葡糖胺的形成基本上停止為止。總發(fā)酵時間通常為約40-約60小時，更優(yōu)選約48小時。在連續(xù)發(fā)酵過程中，隨葡糖胺在培養(yǎng)基中的積累將其從反應(yīng)器中取出。本發(fā)明的方法可生產(chǎn)包括細胞內(nèi)或細胞外葡糖胺-6-磷酸和細胞內(nèi)或細胞外葡糖胺的產(chǎn)物。
本發(fā)明方法還包括回收產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可以是細胞內(nèi)糖胺-6-磷酸或細胞外葡糖胺。術(shù)語“回收葡糖胺”簡單指從發(fā)酵生物反應(yīng)器中收集產(chǎn)物，并不指其他分離或純化步驟。例如，回收步驟指從生物反應(yīng)器中取出全部培養(yǎng)物(即微生物和發(fā)酵培養(yǎng)基)，從生物反應(yīng)器中取出含細胞外葡糖胺的發(fā)酵培養(yǎng)基，和/或從生物反應(yīng)器中取出含細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸的微生物。這些步驟后可進行進一步純化。優(yōu)選回收基本上純形式的葡糖胺。本文所用“基本上純的”指葡糖胺作為用于商業(yè)銷售的營養(yǎng)化合物可有效使用的純度。在一實施方案中，優(yōu)選從生產(chǎn)生物體和其他發(fā)酵培養(yǎng)基組分中分離葡糖胺產(chǎn)物。下文描述完成所述分離的方法。
通過本發(fā)明方法，優(yōu)選從微生物和/或發(fā)酵培養(yǎng)基中回收至少約1g/L產(chǎn)物(即葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸)。通過本發(fā)明方法，更優(yōu)選回收至少約5 g/L產(chǎn)物，最佳至少約10g/L產(chǎn)物，更好至少約20g/L產(chǎn)物，更好至少約50g/L產(chǎn)物。在一實施方案中，回收約1g/L-約50g/L的葡糖胺產(chǎn)物。
通常，用本發(fā)明方法生產(chǎn)的大部分葡糖胺是細胞外的。通過常規(guī)方法，例如通過過濾或離心可從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收所述微生物。在一實施方案中，回收產(chǎn)物的步驟包括從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化葡糖胺。通過常規(guī)方法，例如色譜、提取、結(jié)晶(例如蒸發(fā)結(jié)晶)、膜分離、反滲透和蒸餾可從無細胞發(fā)酵培養(yǎng)基中回收葡糖胺。在優(yōu)選的實施方案中，通過結(jié)晶從無細胞發(fā)酵培養(yǎng)基中回收葡糖胺。在另一實施方案中，回收產(chǎn)物的步驟包括濃縮細胞外葡糖胺的步驟。
在一實施方案中，葡糖胺-6-磷酸在細胞內(nèi)積累，回收產(chǎn)物的步驟包括從所述微生物中分離葡糖胺-6-磷酸。例如，通過不會降解葡糖胺產(chǎn)物的方法溶解微生物細胞，離心裂解物以除去不溶的細胞碎片，然后通過上述常規(guī)方法回收葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸可回收產(chǎn)物。
在本文所述的遺傳修飾的微生物中的初始細胞內(nèi)產(chǎn)物是葡糖胺-6-磷酸。通常認(rèn)為，在從微生物向外運輸?shù)倪^程中，磷酸化的中間產(chǎn)物被去磷酸化，最可能歸因于微生物的壁膜間隙中存在堿性磷酸酶。在本發(fā)明的一實施方案中，在從細胞向外運輸前或過程中，通過天然磷酸酶將葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以便有利于生成所需產(chǎn)物葡糖胺。在該實施方案中，不需要提高細胞內(nèi)重組磷酸酶的活性或者用磷酸酶處理發(fā)酵培養(yǎng)基。在另一實施方案中，通過包括但不限于遺傳修飾內(nèi)源磷酸酶基因的方法或者通過重組修飾微生物以表達磷酸酶基因可提高生成生物體中的磷酸酶水平。在另一實施方案中，在葡糖胺-6-磷酸被釋放到培養(yǎng)基后，例如按上述溶解細胞后，用磷酸酶處理回收的培養(yǎng)基。
如上所述，本發(fā)明方法生成了顯著量的細胞外葡糖胺。具體地講，該方法生成細胞外葡糖胺，占總葡糖胺約50％以上的是細胞外的，更優(yōu)選約75％以上的均是細胞外的，最佳約90％以上的均是細胞外的。通過本發(fā)明方法，細胞外葡糖胺的濃度可大于約1g/l，優(yōu)選大于約5g/l，更優(yōu)選大于約10g/l，最佳大于約20g/L，甚至優(yōu)選大于約50g/l。
本發(fā)明的一個實施方案涉及通過發(fā)酵生成葡糖胺的方法，所述方法包括步驟(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)帶有遺傳修飾的氨基糖代謝途徑的大腸桿菌以生成產(chǎn)物，(b)回收產(chǎn)物。所述產(chǎn)物包括從大腸桿菌中回收的細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸和/或從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收的細胞外葡糖胺。
本發(fā)明的一個實施方案涉及用于通過生物合成方法生成葡糖胺的微生物。用與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化所述微生物。所述重組核酸分子帶有可降低葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用的遺傳修飾。所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶的表達。在優(yōu)選的實施方案中，所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。在另一實施方案中，所述微生物在編碼選自下列蛋白質(zhì)的基因中帶有至少一個另外的遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和/或磷酸酶。所述遺傳修飾降低了蛋白質(zhì)的作用，例外是在磷酸酶的情況下，其中優(yōu)選提高了所述磷酸酶的作用。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述微生物在編碼N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag的基因中帶有修飾，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的作用。在一實施方案中，所述遺傳修飾是缺失至少所述基因的一部分。
在優(yōu)選的實施方案中，所述遺傳修飾的微生物是細菌或酵母，更優(yōu)選埃希菌屬的細菌，最佳是大腸桿菌。遺傳修飾的大腸桿菌優(yōu)選在包括但不限于下列的基因中帶有修飾nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG或磷酸酶基因。在另一實施方案中，所述遺傳修飾的大腸桿菌帶有nag調(diào)節(jié)子基因的缺失，在另一實施方案中，帶有nag調(diào)節(jié)子基因的缺失并在manXYZ基因中帶有遺傳修飾以致由manXYZ基因編碼的蛋白質(zhì)具有降低的作用。
本發(fā)明的另一實施方案涉及通過生物合成方法生成葡糖胺的微生物，所述微生物含有與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子；并在編碼選自下列蛋白質(zhì)的基因中含有至少一個遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、和/或PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan。所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的作用，所述重組核酸分子的表達提高了微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶表達。在另一實施方案中，所述微生物在磷酸酶基因中至少有一個遺傳修飾，使該基因編碼的磷酸酶的作用增強。在另一實施方案中，所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
本發(fā)明的另一實施方案涉及任何上述微生物，其在pH7.0的含14g/LK2HPO4、16g/L KH2PO4、1g/L二水合檸檬酸鈉、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和1mM IPTG的發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)約24小時達到至少約8g/L細胞干重的細胞密度時，所述微生物產(chǎn)生至少約1g/L葡糖胺。
本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案涉及上述任何微生物，當(dāng)在pH7.0的含14g/LK2HPO4、16g/L KH2PO4、1g/L二水合檸檬酸鈉、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和0.2mM-約1mM IPTG的發(fā)酵培養(yǎng)基中在約28℃-約37℃培養(yǎng)約10-約60小時達到至少約8g/L細胞干重的細胞密度時，所述微生物產(chǎn)生至少約1g/L葡糖胺。在優(yōu)選的實施方案中，IPTG的量是約0.2mM。
本發(fā)明的另一實施方案涉及任何上述遺傳修飾的微生物，其在本文所述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時，產(chǎn)生至少約1g/L，優(yōu)選至少約5g/L，更優(yōu)選至少約10g/L，甚至更優(yōu)選至少約20g/L，甚至更優(yōu)選至少約50g/L葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸。本發(fā)明的另一實施方案涉及任何上述遺傳修飾的微生物，其比相同條件下培養(yǎng)的野生型(即未修飾的天然)微生物生產(chǎn)至少多約2倍的葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸，優(yōu)選至少多約5倍，更優(yōu)選至少多約10倍，更優(yōu)選多至少約25倍，更優(yōu)選多至少約50倍，甚至更優(yōu)選多至少約100倍，甚至更優(yōu)選多至少約200倍葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸。在實施例節(jié)中鑒定了許多具體的微生物。本發(fā)明的其他實施方案包括這些微生物和具有實施例中具體鑒定之微生物的特定特征的微生物。所述微生物優(yōu)選是酵母或細菌，更優(yōu)選是細菌，最佳是大腸桿菌。所述鑒定特征可包括實施例中微生物的任何或所有基因型和/或表型特征，包括其生產(chǎn)葡糖胺的能力。
本發(fā)明優(yōu)選的微生物包括已用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。優(yōu)選所述核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。特別優(yōu)選的微生物是大腸桿菌菌株2123-12。菌株2123-12含有整合到其基因組中的含核酸序列SEQ ID NO:15的重組核酸分子，所述核酸序列代表含有氨基酸序列SEQ ID NO:16之野生型(即正常、未修飾的或天然)葡糖胺-6-磷酸合酶的編碼區(qū)。本發(fā)明特別優(yōu)選的微生物已用含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化，已對所述核酸序列進行了遺傳修飾以致所述合酶具有提高的作用(上述)。最佳，與未用所述核酸分子轉(zhuǎn)化的微生物相比，所述遺傳修飾提高了所述微生物生產(chǎn)葡糖胺的能力。在實施例節(jié)中描述了本發(fā)明特別優(yōu)選的遺傳修飾的微生物，包括大腸桿菌菌株2123-49、2123-54、2123-124、2123-149和2123-151。
用經(jīng)典菌株培育和分子遺傳技術(shù)均可開發(fā)經(jīng)遺傳修飾，生產(chǎn)葡糖胺之能力提高的微生物?？傊?，產(chǎn)生具有提高的葡糖胺生產(chǎn)之微生物的策略是(1)失活或缺失至少一個，優(yōu)選一個以上其中對葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)有不利影響(即抑制)的氨基糖代謝途徑；(2)擴增至少一個，優(yōu)選一個以上其中提高葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)的氨基糖代謝途徑。因此，本發(fā)明遺傳修飾的微生物具有(a)將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成其他化合物的能力降低(即葡糖胺-6-磷酸分解代謝或合成代謝途徑的抑制作用)；(b)生產(chǎn)(即合成)葡糖胺-6-磷酸的能力提高；(c)將葡糖胺運輸?shù)郊毎麅?nèi)的能力降低；(d)將葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺運輸出細胞的能力提高和/或(e)利用與葡糖胺-6-P生產(chǎn)有關(guān)之底物競爭進行生物化學(xué)反應(yīng)的能力減弱。
如前文所討論的，在一實施方案中，遺傳修飾的微生物可以是以下微生物，其中核酸分子已缺失、插入或修飾(如通過核苷酸插入、缺失、取代和/或倒置)而在所述微生物內(nèi)提供所需的影響。在某些實施方案中，所述遺傳修飾可以在核酸分子之編碼蛋白的編碼區(qū)內(nèi)，其使為所述微生物提供所需影響的蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸序列內(nèi)的氨基酸修飾如插入、缺失、取代。遺傳修飾的微生物可通過重組技術(shù)例如將分離的核酸分子導(dǎo)入微生物中來修飾。例如，可用編碼目的蛋白，如需提高表達之蛋白的重組核酸分子轉(zhuǎn)染遺傳修飾的微生物。轉(zhuǎn)染的核酸分子以其表達能力得到保持的方式成為染色體外組分或者整合到轉(zhuǎn)染(重組)的宿主細胞染色體上一個或多個位點。優(yōu)選，用核酸分子轉(zhuǎn)染本發(fā)明的宿主細胞后，將所述核酸分子整合到宿主細胞基因組中。整合的顯著優(yōu)點是可以將核酸分子穩(wěn)定地保持在細胞內(nèi)。在優(yōu)選的實施方案中，整合的核酸分子與可被誘導(dǎo)以控制所述核酸分子表達的轉(zhuǎn)錄控制序列(下文)有效相連。
通過隨機或定靶整合可將核酸分子整合到宿主細胞的基因組中。所述整合方法是本領(lǐng)域已知的。例如，按實施例2中的詳細描述，大腸桿菌菌株ATCC47002(表1)含有使其不能保持含ColE1復(fù)制起點之質(zhì)粒的突變。當(dāng)這類質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到該菌株中時，對該質(zhì)粒上所含遺傳標(biāo)記的選擇會使該質(zhì)粒整合到染色體中。例如用含目的基因和大腸桿菌lacZ基因之5’和3’末端側(cè)翼的可選擇標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該菌株。lacZ序列可將接納的DNA靶向染色體中的lacZ基因。lacZ位點的整合取代了編碼β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因，其中部分lacZ基因被目的基因隔斷。根據(jù)β-半乳糖苷酶陰性可篩選成功的整合體。也可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的利用等方法將核酸分子導(dǎo)入受體細胞基因組中，以產(chǎn)生遺傳修飾的微生物。利用重組技術(shù)和轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體技術(shù)以產(chǎn)生本發(fā)明的不同遺傳修飾的微生物是本領(lǐng)域已知的并在實施例節(jié)中詳細描述。根據(jù)本發(fā)明，一種基因，例如pstG基因包括與天然pstG基因有關(guān)的所有核酸序列，例如控制該基因編碼的pstG蛋白質(zhì)(PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc)生產(chǎn)的調(diào)節(jié)區(qū)(例如但不限于轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后控制區(qū))以及其編碼區(qū)本身。在另一實施方案中，一種基因，例如pstG基因可以是與編碼給定的pstG基因的核酸序列相似但不相同的等位基因變體(即天然等位基因變體)。具有給定的核酸序列之pstG基因的等位基因變體是在與給定核酸序列基本相同的基因組座位上出現(xiàn)，但由于例如突變或重組引起的天然變異而具有相似但不相同序列的基因。等位基因變體通常編碼與其對照基因編碼的蛋白質(zhì)具有類似活性的蛋白質(zhì)。等位基因變體還可在所述基因的5’或3’非翻譯區(qū)(例如在調(diào)節(jié)控制區(qū))含有改變。等位基因變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并被認(rèn)為會在給定的微生物例如大腸桿菌和/或兩種或多種微生物中發(fā)現(xiàn)。
盡管術(shù)語“核酸分子”主要指物理核酸分子，而術(shù)語“核酸序列”主要指所述核酸分子上的核苷酸序列，但這兩個術(shù)語可以互換使用，尤其關(guān)于核酸分子或核酸序列能夠編碼與氨基糖代謝途徑有關(guān)的基因時。另外，術(shù)語“重組分子”主要指與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連的核酸分子，但可與在宿主細胞中分離并表達的術(shù)語“核酸分子”互換使用。
知道本發(fā)明特定核酸分子，特別是大腸桿菌核酸分子的核酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以例如(a)制備這些核酸分子的拷貝和/或(b)得到含至少所述核酸分子一部分(例如含全長基因，全長編碼區(qū)，調(diào)控序列，截短的編碼區(qū)的核酸分子)的核酸分子。所述核酸分子可以用各種方法得到，包括利用寡核苷酸探針篩選適宜的文庫或DNA，然后用寡核苷酸引物PCR擴增適宜的文庫或DNA的傳統(tǒng)克隆技術(shù)。用于篩選或從中擴增核酸分子的優(yōu)選文庫包括細菌和酵母基因組DNA文庫，特別是大腸桿菌基因組DNA文庫。在例如Sambrook等，同上文中公開了克隆和擴增基因的技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子是已脫離其天然環(huán)境(即經(jīng)過人為操作)的核酸分子。因此，“分離的”并不反映所述核酸分子已被純化的程度。分離的核酸分子可包括DNA、RNA或者DNA或RNA的衍生物。對核酸分子的最大長度沒有限制，不同于實踐限制，因為核酸分子可包括基因的一部分，完整的基因或者多個基因，或者其部分。
本發(fā)明分離的核酸分子可從其天然來源以完整(即全部)基因或其能與該基因形成穩(wěn)定雜化物的部分的形式而獲得。還可用重組DNA技術(shù)(例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增、克隆)或者化學(xué)合成方法生產(chǎn)分離的核酸分子。分離的核酸分子包括天然核酸分子和其同系物，所述同系物包括但不限于天然等位基因變體和修飾的核酸分子，所述修飾指核苷酸已插入、缺失、取代和/或倒置，從而為所述微生物提供所需效應(yīng)。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法(參見例如Sambrook等，見上丈)均可生產(chǎn)核酸分子同系物。例如可用各種技術(shù)修飾核酸分子，所述技術(shù)包括但不限于經(jīng)典誘變技術(shù)和重組DNA技術(shù)，例如定點誘變，對核酸分子進行化學(xué)處理以誘導(dǎo)突變，核酸片段的限制酶裂解，核酸片段的連接，核酸序列所選區(qū)域的PCR擴增和/或誘變，寡核苷酸混合物的合成以及混合物組的連接以“建立”核酸分子混合物及所述方法結(jié)合使用。通過篩選由所述核酸編碼之蛋白質(zhì)的功能和/或與野生型基因雜交可從修飾核酸的混合物中篩選核酸分子同系物。在實施例節(jié)中詳細描述了所述技術(shù)的實例。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明核酸分子的核酸同系物優(yōu)選含有導(dǎo)致由所述核酸同系物編碼之蛋白質(zhì)的作用改變的遺傳修飾。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種遺傳修飾的重組核酸分子，該核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)同系物的核酸序列，其中優(yōu)選與編碼沒有所述遺傳修飾的天然葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子相比，所述遺傳修飾提高了葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的作用。所述遺傳修飾通過例如編碼具有減弱的葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用和/或提高的比活性的葡糖胺-6-磷酸合酶來提高葡糖胺-6-磷酸合酶的作用。帶有遺傳修飾的所述重組核酸分子在本文稱為編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的野生型核酸分子的核酸同系物。根據(jù)本發(fā)明，具有因其核酸分子之遺傳修飾所致修飾的蛋白質(zhì)在本文稱為蛋白質(zhì)同系物或給定蛋白質(zhì)的同系物。
因此，例如具有葡糖胺-6-磷酸合酶活性并可用于本發(fā)明的葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)可以是全長葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)，全長葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)的酶活性部分，或者所述蛋白質(zhì)的任何同系物，例如含有至少一個或數(shù)個氨基酸修飾的葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白，其中氨基酸殘基已被缺失(例如所述蛋白質(zhì)的截短物，例如肽)、插入、倒置、取代和/或衍生(例如通過糖基化，磷酸化，乙?；罐Ⅴ；?，異戊二烯化，棕櫚酸化，酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的加成)的。
本發(fā)明所述的氨基糖代謝途徑內(nèi)之任何蛋白質(zhì)的同系物是具有與天然蛋白質(zhì)氨基酸序列(即天然、未修飾的或野生型)足夠相似之氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其核酸序列在嚴(yán)緊條件下能夠與編碼天然蛋白質(zhì)的核酸分子雜交(即與編碼天然蛋白質(zhì)氨基酸序列的核酸鏈互補)。本發(fā)明任何核酸序列的互補核酸序列指與所引述之序列鏈互補(即能與整個分子形成雙螺旋)的核酸鏈的核酸序列。應(yīng)注意，已確定是由SEQ ID NO表示其一條鏈的本發(fā)明的雙鏈核酸分子還包括含有該SEQ ID NO之互補鏈序列的互補鏈。因此，本發(fā)明的核酸分子可以是雙鏈的或單鏈的，包括在嚴(yán)緊雜交條件下與本文的某一SEQ ID NO和/或該SEQ ID NO之互補物(在本文中可標(biāo)明或不標(biāo)明)形成穩(wěn)定雜交物的那些核酸分子。推導(dǎo)互補序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明蛋白質(zhì)同系物的最小長度是足以由能夠與編碼相應(yīng)天然蛋白質(zhì)之核酸分子的互補序列形成穩(wěn)定雜交物的核酸分子編碼的長度。另外，本發(fā)明蛋白質(zhì)同系物的最小長度是足以具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用(例如催化或酶活性部分)的長度，優(yōu)選可提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的長度。因此，編碼所述蛋白質(zhì)同系物之核酸分子的長度取決于核酸組成以及核酸分子與互補序列間的同源百分比和雜交條件本身(例如溫度，鹽濃度以及甲酰胺濃度)對核酸分子的最大長度沒有限制，不同于實踐限制，因為核酸分子可包括基因的一部分，完整的基因或者多個基因，或者其部分。同樣，本發(fā)明蛋白質(zhì)同系物的最小長度為約4-約6個氨基酸，優(yōu)選長度取決于是否需要所述蛋白質(zhì)的全長，多價(即具有一個以上功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)或者功能部分。
文中所用嚴(yán)緊雜交條件指用于鑒定相似核酸分子之核酸分子的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件。所述標(biāo)準(zhǔn)條件公開于例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A LAboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，1989。Sambrook等，出處同上，全文引入本文作為參考(具體參見9.31-9.62頁，11.7和11.45-11.61)。另外，在例如Meinkoth等，1984,分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)138,267-284中公開了計算適宜雜交和洗滌條件以完成允許不同程度核苷酸錯配之雜交的公式；Meinkoth等，出處同上，全文引入本文作為參考。
更具體地講，本文所稱嚴(yán)緊雜交條件指在雜交反應(yīng)中可以分離與用作探針的核酸分子具有至少約70％，優(yōu)選至少約75％，最佳至少約80％核酸序列同一性之核酸分子的條件。所述條件根據(jù)是否形成DNA:RNA或DNA:DNA雜交物而改變。計算的DNA:DNA雜交物的解鏈溫度比DNA:RNA雜交物的低10℃。在具體的實施方案中，DNA:DNA雜交物的嚴(yán)緊雜交條件包括0.1X SSC(0.157M Na+)的離子強度，溫度為約20℃-約35℃，更優(yōu)選約28℃-約40℃，最佳約35℃-約45℃。在具體的實施方案中，DNA:RNA雜交物的嚴(yán)緊雜交條件包括0.1×SSC(0.157M Na+)的離子強度，溫度為約30℃-約45℃，更優(yōu)選約38℃-約50℃，最佳約45℃-約55℃。這些值根據(jù)大于約100個核苷酸，0％甲酰胺和G+C含量約50％的分子的解鏈溫度計算?；虬碨ambrook等，同上文11.55-11.57頁所述憑經(jīng)驗計算Tm。
與本發(fā)明氨基糖代謝途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的同系物可以是天然等位基因變異或天然突變的結(jié)果。本發(fā)明的蛋白質(zhì)同系物也可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)，所述技術(shù)包括但不限于直接修飾蛋白質(zhì)或修飾編碼該蛋白質(zhì)的基因，如用經(jīng)典或重組DNA技術(shù)以引起隨機或定靶誘變，如上文所討論。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的本發(fā)明重組核酸分子中的遺傳修飾產(chǎn)生至少一個選自下列的氨基酸修飾(即所編碼蛋白的氨基酸序列改變)葡糖胺-6-磷酸合酶的氨基酸殘基的增加、取代、缺失和/或衍生。通過與野生型或天然葡糖胺-6-磷酸合酶例如含有氨基酸序列SEQID NO:16的葡糖胺-6-磷酸合酶進行比較可確定所編碼蛋白的氨基酸序列中的修飾。與具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的天然葡糖胺-6-磷酸合酶相比，一個或多個所述氨基酸修飾導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸合酶的作用提高。在一個實施方案中，所述氨基酸修飾位于所修飾蛋白質(zhì)(即同系物)中對應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO:l 6的Ile(4),Ile(272),Ser(450),Ala(39),Arg(250),Gly(472),Leu(469)的一個或多個位置上。
在另一實施方案中，所述氨基酸修飾選自下列取代(a)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ile(4)；(b)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ile(272)；(c)有一個脂肪族側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ser(450)；(d)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ala(39)；(e)帶有含硫側(cè)基團的氨基酸殘基取代Arg(250)；(f)有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Gly(472)；(g)有一個脂肪族側(cè)基團的氨基酸殘基取代Leu(469)；以及(h)(a)-(g)的組合。根據(jù)本發(fā)明，帶有脂肪族羥基的氨基酸殘基包括絲氨酸和蘇氨酸，帶有脂肪族側(cè)基團的氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸和脯氨酸。
在本發(fā)明的另一實施方案中，上述氨基酸修飾優(yōu)選是選自下列的取代Ile(4)到Thr、Ile(272)到Thr、Ser(450)到Pro、Ala(39)到Thr、Arg(250)到Cys、Gly(472)到Ser、Leu(469)到Pro以及其組合。在實施例節(jié)中詳細描述了具有導(dǎo)致所述氨基酸修飾的遺傳修飾的重組核酸分子的實例。
含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶(其作用提高)的核酸序列的優(yōu)選遺傳修飾之重組核酸分子包括含有編碼下述葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸分子的重組核酸分子，所述合酶含選自下列之氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31。其它優(yōu)選的遺傳修飾的重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:30的核酸序列。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的遺傳修飾的重組核酸分子包括含選自下列之核酸分子的核酸分子pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830。
本發(fā)明包括重組載體，所述載體包括至少一個本發(fā)明的分離的核酸分子，其已插入到能夠?qū)⒑怂岱肿觽鬟f到細菌細胞中的任何載體中。所述載體可含有天然情況下不與待插入到載體中的核酸分子相鄰的細菌核酸分子。所述載體可以是RNA或DNA，通常是質(zhì)粒?？蓪⒅亟M載體用于克隆、測序和/或核酸分子的其它操作?？蓪⒈疚姆Q為重組核酸分子并在下文詳細描述的一種重組載體用于表達核酸分子。優(yōu)選的重組載體能夠在轉(zhuǎn)化的細菌或酵母細胞，特別是大腸桿菌細胞中復(fù)制。
通過可將核酸分子插入到細胞中的任何方法完成核酸分子向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)染，電穿孔和顯微注射。
本發(fā)明的重組分子可以是DNA或RNA，還可含有其他調(diào)節(jié)序列，例如翻譯調(diào)節(jié)序列，復(fù)制起點和與重組細胞相容的其他調(diào)節(jié)序列。可用本發(fā)明的一個或多個重組分子生產(chǎn)編碼產(chǎn)物(即葡糖胺-6-磷酸合酶)。在一實施方案中，通過在有效生成編碼蛋白的條件下表達本發(fā)明的核酸分子來生成該蛋白質(zhì)。這類條件(即培養(yǎng)條件)已在上丈描述并將在實施例節(jié)進一步討論。生產(chǎn)編碼蛋白的優(yōu)選方法是用本發(fā)明的一個或多個重組分子轉(zhuǎn)染宿主細胞以形成重組細胞。
如上所討論，本發(fā)明的優(yōu)選重組分子包括nglmS-282184、nglmS-281830、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-15l2184、nglmS-1511830、pKLN23-28、pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149和/或pKLN23-151。
優(yōu)選用一個或多個重組分子轉(zhuǎn)化細菌細胞(即宿主細胞)來生產(chǎn)重組細胞，所述重組分子各含有一個或多個有效相連至表達載體(其含一個或多個轉(zhuǎn)錄控制序列)的核酸分子。術(shù)語，有效相連指核酸分子以其轉(zhuǎn)化到宿主細胞中能夠被表達的方式向表達載體的插入。本文所用表達載體是能夠轉(zhuǎn)化宿主細胞并能夠影響具體核酸分子表達的DNA或RNA載體。優(yōu)選所述表達載體還能夠在所述宿主細胞內(nèi)復(fù)制。在本發(fā)明中，表達載體通常是質(zhì)粒。本發(fā)明的表達載體包括在酵母宿主細胞或細菌宿主細胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細胞中可發(fā)揮功能(即指導(dǎo)基因表達)的任何載體。在實施例節(jié)中列出了本發(fā)明優(yōu)選的重組細胞。
可將本發(fā)明的核酸分子與表達載體有效相連，所述表達載體含有調(diào)節(jié)序列例如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點和與重組細胞相容和控制本發(fā)明核酸分子表達的其他調(diào)節(jié)序列。具體地講，本發(fā)明的重組分子包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的開始、延伸和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄開始的序列，例如啟動子、增強子、操縱子和阻遏子序列。適宜的轉(zhuǎn)錄控制序列包括在酵母或細菌細胞，優(yōu)選大腸桿菌中發(fā)揮作用的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。各種此類轉(zhuǎn)錄控制序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解重組DNA技術(shù)的應(yīng)用可通過操作如宿主細胞內(nèi)的核酸分子拷貝數(shù)，所述核酸分子的轉(zhuǎn)錄效率，所得轉(zhuǎn)錄子的翻譯效率以及翻譯后的修飾效率而提高轉(zhuǎn)化的核酸分子的表達。用于提高本發(fā)明核酸分子表達的重組技術(shù)包括，但不限于將核酸分子與高拷貝數(shù)的質(zhì)粒有效相連，將核酸分子整合到宿主細胞染色體中，將載體穩(wěn)定性序列加到質(zhì)粒中，取代或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(例如啟動子、操縱子、增強子)，取代或修飾翻譯控制序列，對本發(fā)明的核酸分子進行修飾以對應(yīng)于宿主細胞的慣用密碼子，缺失使轉(zhuǎn)錄子不穩(wěn)定的序列，以及利用控制信號使發(fā)酵過程中的重組細胞生長與重組酶生產(chǎn)在不同時間發(fā)生。通過將編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子片段化、修飾或衍生可提高本發(fā)明表達之重組蛋白質(zhì)的活性。在實施例節(jié)詳細描述了所述修飾。
提供下列實施例是為了說明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1下列實施例描述了大腸桿菌突變株的產(chǎn)生，所述菌株中與葡糖胺降解有關(guān)的氨基糖代謝途徑被阻斷。
構(gòu)建本文所述所有葡糖胺過量生產(chǎn)菌株的起始菌株是大腸桿菌W3110(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心以編號ATCC 25947獲得)，該菌株是原養(yǎng)型，大腸桿菌K-12的F-λ-衍生物(Bachmann,1987，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，細胞和分子生物學(xué)1190-1219頁；該文獻全文引入本文作為參考)。在表1中列出了下列實施例中所用和所生產(chǎn)的所有菌株。
表1．細菌菌株
阻斷了葡糖胺攝入和降解的宿主菌株是通過在nagE、manXYZ和ptsG基因中導(dǎo)入突變以阻斷葡糖胺的轉(zhuǎn)運、在與葡糖胺-6-磷酸代謝有關(guān)的nagA、-B、-C和-D基因中導(dǎo)入突變而構(gòu)建。已在前文詳細描述了這些基因。用轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體Plvir(如Miller,1972，分子遺傳學(xué)實驗(Experiments inMolecular Genetics)所述，冷泉港實驗室出版社，該文獻全文引入本文作為參考)將這些基因中的突變導(dǎo)入菌株。
在該技術(shù)中，用轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體Plvir將來自一個菌株(供體菌)的基因或突變轉(zhuǎn)移到受體菌中。當(dāng)噬菌體Plvir在供體菌中生長時，所產(chǎn)生的少部分噬菌體顆粒含有供體菌染色體DNA，而不含噬菌體DNA的正?；パa物。用在供體菌上生長的噬菌體轉(zhuǎn)染受體菌后，含供體菌染色體DNA的噬菌體顆?？蓪⒃揇NA轉(zhuǎn)移到受體菌中。如果對供體菌的DNA存在強選擇，可選出含供體菌相應(yīng)基因或突變的受體菌。
為使Plvir在供體菌中生長，用現(xiàn)有的噬菌體原液感染該菌株的培養(yǎng)物。使受體菌在37℃的LBMC培養(yǎng)基(10g/L細菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl,1mM MgCl2,5mMCaCl2)中生長直到在600nm的吸收值為約1.0，相當(dāng)于約6×108細胞/mL培養(yǎng)物。然后以約1個噬菌體/10個細胞的比例使稀釋的噬菌體原液感染1毫升培養(yǎng)物。在37℃，將混合物非振蕩培養(yǎng)20分鐘，然后轉(zhuǎn)移到125毫升帶擋板之錐形瓶中的10毫升預(yù)熱LBMC肉湯中。將所得培養(yǎng)物在37℃劇烈振蕩2-3小時。在該過程中，通常觀察到培養(yǎng)物變渾濁，這標(biāo)明細菌生長。在該培養(yǎng)期結(jié)束時，培養(yǎng)物將變澄清，這表明由于噬菌體的生長使細胞溶解。溶解發(fā)生后，將培養(yǎng)物在冰上冷卻，加入數(shù)滴氯仿，短時振蕩。然后將燒瓶的內(nèi)含物離心以除去細胞碎片和氯仿，所得的上清液通常含108-109噬菌體/mL。
通過用上述適宜供體菌中生長的Plvir進行轉(zhuǎn)導(dǎo)將突變轉(zhuǎn)移到受體菌。為了進行Plvir轉(zhuǎn)導(dǎo)，使受體菌培養(yǎng)物在37℃的LBMC肉湯中過夜生長。將0.1mL培養(yǎng)物與在無菌試管中的0.1mL噬菌體裂解物或者裂解物的系列稀釋物混合，然后在37℃保溫20分鐘。將0.2mL檸檬酸鈉加到試管中，將混合物鋪板于選擇性培養(yǎng)基上。為每次轉(zhuǎn)導(dǎo)如上述設(shè)置含未感染細胞和無細胞噬菌體裂解物的對照。為了生產(chǎn)葡糖胺降解阻斷的菌株，按下文所述篩選四環(huán)素抗性。通過鋪在含12.5μg/mL四環(huán)素和10mM檸檬酸鈉的LB培養(yǎng)基(10g/L細菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)中篩選四環(huán)素抗性突變株。
將nag基因中的突變作為缺失突變(Δnag∷TcR)同時導(dǎo)入。在含該突變的菌株IBPC590(Plumbridge，表1)中，已用四環(huán)素-抗性(TcR)決定簇代替nag基因。結(jié)果，將除去了nag功能之突變通過四環(huán)素抗性篩選轉(zhuǎn)移到適宜的受體宿主中。在這種情況下，由于在所需突變中含有TcR決定簇，所以Δnag與TcR突變100％連鎖。即所有接受了IBPC590之TcR決定簇的受體菌也接受了Δnag突變。這可以通過因在IBPC590上生長的Plvir轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的四環(huán)素抗性菌株的生長表型來確定。所有這類菌株均不能在以葡糖胺或N-乙酰葡糖胺為碳源的培養(yǎng)基上生長，這表明存在Δnag突變。
通過用菌株IBPC566和IBPC522(Plumbridge，表1)中的Plvir噬菌體進行轉(zhuǎn)導(dǎo)也可分別在manXYZ和ptsG基因中導(dǎo)入突變。這些菌株也含有與所需突變連鎖的四環(huán)素抗性決定簇(分別稱為zdj-225∷Tn10和zcf-229∷Tn10)。在這些菌株中，TcR決定簇不在該基因內(nèi)，但與該基因連鎖。因此，并不是所有接受TcR決定簇的受體菌均含所需突變。連鎖程度可說明TcR決定簇與所需突變在染色體上的距離。結(jié)果，必需篩選manXYZ和ptsG的四環(huán)素抗性菌株。manXYZ菌株在甘露糖上生長緩慢，不能以葡糖胺為唯一碳源生長。ptsG菌株以葡萄糖為唯一碳源生長緩慢。
由于上述突變的所有篩選均是針對四環(huán)素抗性，因此，如果要導(dǎo)入多個突變，則需要在各步驟間使菌株具有四環(huán)素敏感性。為了達到該目的，將四環(huán)素抗性菌株鋪在用于篩選四環(huán)素敏感性突變株的TCS培養(yǎng)基(15g/L瓊脂，5g/L細菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，50mg/L鹽酸金霉素，10g/LNaCl,10g/L NaH2PO4H2O,12mg/L鐮孢菌酸和0.1mM ZnCl2)中(描述于Maloy和Nunn,1981，細菌雜志(J.Bacteriol.),145:1110-1112，該文獻引入本文作為參考)。將該培養(yǎng)基上長出的菌落通過在相同培養(yǎng)基上再劃線來純化，然后鋪板于含有和不含12.5μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上以逐個檢查每個菌落的四環(huán)素敏感性。
圖3圖示了用于產(chǎn)生含manXYZ、ptsG和Δnag突變組合的菌株的上述方案。
實施例2下列實施例描述了glmS基因的克隆和過量表達以及T7-glmS基因盒向大腸桿菌染色體中的整合。
glmS基因的克隆和過量表達用從glmS基因的公開序列(Walker等，1984，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.),224:799-815，該文獻全文引入本文作為參考)獲得的信息，合成引物以便用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從W3110菌株(表1)分離的基因組DNA中擴增該基因。用于PCR擴增的引物被稱為Up1和Lo8，并具有下列序列Up1:5＇-CGGTCTCCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3＇(SEQ ID NO:1)Lo8:5＇-CTCTAGAGCGTTGATATTCAGTCAATTACAAACA-3＇(SEQ IDNO:2)Up1引物含有位于BsaI限制性核酸內(nèi)切酶位點(GGTCTC,SEQ ID NO:1中的核苷酸2-7)后glmS基因的前20個核苷酸的序列。Lo8引物含位于XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點(TCTAGA,SEQ ID NO:2的核苷酸2-7)下游的glmS基因的下游145-171堿基(SEQ ID NO:2的核苷酸8-34)的序列。用標(biāo)準(zhǔn)方法完成PCR擴增，以產(chǎn)生以BsaⅠ和XbaⅠ位點為側(cè)翼的、包含glmS基因及其下游DNA的171個堿基對的片段。用制造商提供的材料和說明將該DNA片段克隆到載體pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,California)中。所得質(zhì)粒稱為pKLN23-20。
該克隆的結(jié)果之一是將唯一的SacⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點放在該基因的下游。這使得可用限制性核酸內(nèi)切酶BsaⅠ和SacⅠ從pKLN23-20中切割含glmS基因的DNA片段。然后將該片段克隆在表達載體pET-24d(+)(Novagen,Inc.,Madison,Wisconsin)的NcoⅠ和SacⅠ位點之間以產(chǎn)生質(zhì)粒pKLN23-23。pET-24d(+)表達載體是基于T7啟動子系統(tǒng)(Studier和Moffatt,1986，分子生物學(xué)雜志(J.MoL Biol.),189:113-130)。用這種方法克隆使glmS基因被置于pET-24d(+)中T7-lac啟動子之后。T7-lac啟動子由T7RNA聚合酶特異性識別并僅在含克隆的T7基因1(編碼T7 RNA聚合酶)的菌株中表達。在稱為λDE3的缺陷型λ噬菌體中含有克隆的T7聚合酶基因。其中λDE3元件被整合到染色體中的菌株含有由lacUV5啟動子驅(qū)動的T7 RNA聚合酶基因。在那些菌株中，用乳糖類似物異丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)T7RNA聚合酶基因的表達。因此，將IPTG加到所述培養(yǎng)基中會誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶基因并表達T7或T7-lac啟動子控制的任何基因。
為了證實pKLN23-23含有由T7-lac啟動子驅(qū)動的glmS基因，將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到菌株BL21(DE3)(Novagen,Inc.)(表1)中。使菌株BL21(DE3)/pKLN23-23在含50mg/L卡那霉素(該質(zhì)粒編碼卡那霉素抗性)的LB培養(yǎng)基中生長，一式兩份。其中一份用1mMIPTG誘導(dǎo)；而另一份不用。當(dāng)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測這兩份培養(yǎng)物的總蛋白質(zhì)時，在來自誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細胞中，顯著觀察到分子量為約70000的蛋白質(zhì)，這對應(yīng)于glmS基因產(chǎn)物的預(yù)測大小，但在來自未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細胞中則觀察不到。來自誘導(dǎo)培養(yǎng)物的初步酶檢測表明在誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中，葡糖胺-6-磷酸合酶活性比用野生型菌株觀察到高數(shù)百倍。
T7-glmS基因盒整合到大腸桿菌染色體中通過多步驟的方法，將由T7-lac(T7-glmS基因盒)啟動子驅(qū)動的glmS基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌菌株的染色體中。首先，將該盒克隆到質(zhì)粒pBRINT-Cm(Balbas等，1996,基因(Gene)96:65-69，該文獻全文引入本文作為參考)。然后通過Balbas等，1996，同上文，描述的技術(shù)，將該基因盒整合到ATCC47002(表1)的染色體中以產(chǎn)生菌株T-71和T-81(表1)。最后，通過下文所述的Plvir轉(zhuǎn)導(dǎo)將該基因盒轉(zhuǎn)移到所需的菌株中。
通過用限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ部分消化和用限制性核酸內(nèi)切酶HinDⅢ完全消化，從pKLN23-23中切割T7-glmS盒。質(zhì)粒pKLN23-23在T7啟動子上游約20個堿基對的位置含有BglⅡ位點。glmS基因也含有兩個BglⅡ位點。運用該酶進行的部分消化是在質(zhì)粒上游T7啟動子處切割，而避開兩個內(nèi)含位點所必需的。質(zhì)粒pKLN23-23還在glmS基因下游含有唯一的HinDⅢ位點。將切割出的T7-glmS盒克隆到pBRINT-Cm的唯一BamHI和HinDⅢ位點之間。這樣產(chǎn)生稱為pKLN23-27和pKLN23-28的質(zhì)粒。質(zhì)粒pKLN23-27和pKLN23-28含有T7-glmS盒，還含有氯霉素抗性決定簇，其兩側(cè)為大腸桿菌lacZ基因的5’和3’末端。
ATCC 47002(表1)含有使其不能保持帶ColE1復(fù)制起點的質(zhì)粒例如pBRINT-Cm的突變。當(dāng)將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到該菌株中時，對該質(zhì)粒上所含遺傳標(biāo)記的篩選使得該質(zhì)粒整合到染色體中(Balbas等，1996，同上文)。如上所述，質(zhì)粒pKLN23-27和-28含有T7-glmS盒和兩側(cè)帶有大腸桿菌lacZ基因的5’和3’末端的氯霉素抗性決定簇。lacZ序列將導(dǎo)入的DNA靶向染色體中所含的lacZ基因。lacZ位點的整合使編碼β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因為T7-glmS-Cm盒所隔斷的部分lacZ基因所取代。結(jié)果，在lacZ的整合導(dǎo)致該菌株變成β-半乳糖苷酶陰性。該質(zhì)粒還含有遠離5’-lacZ-T7-glmS-cm-lacZ-3’盒的氨芐青霉素抗性決定簇。在lacZ的整合和質(zhì)粒的丟失導(dǎo)致對氨芐青霉素的敏感。
將質(zhì)粒pKLN23-27和-28轉(zhuǎn)移到ATCC 47002中，然后將細胞鋪在含10μg/mL氯霉素，1mM IPTG和40μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中所含的X-gal是β-半乳糖苷酶的產(chǎn)色底物。β-半乳糖苷酶水解X-gal產(chǎn)生藍色衍生物。X-gal以及誘導(dǎo)天然lacZ基因的IPTG的存在導(dǎo)致出現(xiàn)藍色lacZ陽性菌落和白色lacZ陰性菌落。然后篩選并純化白色(lacZ-陰性)氯霉素抗性菌落。然后通過鋪在含有和不含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中確定所述菌株對氨芐青霉素的敏感性。按Balbas等1996(同上文)所述的PCR方案進一步證實DNA整合。整合子T-71和T-81(表1)分別是因質(zhì)粒pLN23-27和pKLN23-28的目的片段整合到ATCC47002的染色體中而產(chǎn)生的。
然后按實施例1所述，用菌株T-71和T-81的裂解物通過Plvir轉(zhuǎn)導(dǎo)，將T7-glmS-Cm盒轉(zhuǎn)移到W3110(DE3),7101-9(DE3),7101-17(DE3)和2123-4(DE3)菌株中。這些菌株除含有從T7-lac啟動子表達所必需的λDE3元件外，還含有Δnag、manXYZ和ptsG突變的不同組合。用Novagen,Inc.(Madison,Wisconsin)生產(chǎn)的λDE3溶原化試劑盒將λDE3元件導(dǎo)入這些菌株。在含30μg/mL氯霉素和10mM檸檬酸鈉的LB瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)子。在含X-gal和IPTG的平板上確定β-半乳糖苷酶活性的喪失，按Balbas等，1996(同上文)所述的PCR方案進一步確定DNA整合。
在含有和不含有IPTG的LB培養(yǎng)基中生長后，測定含整合的T7-glmS盒之生產(chǎn)菌中的葡糖胺-6-磷酸合酶活性(表2)。用下文所述的比色或分光光度檢測(Badet等，1987，生物化學(xué)(Biochemistry)26:1940-1948)檢測細胞粗提物中的葡糖胺-6-磷酸合酶。通過將洗滌過的細胞沉淀以每克細胞濕重5mL的比例懸浮在0.1M KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中，讓懸浮液以16,000psi通過French壓力機，將破碎的細胞懸浮液以35,000-40,000xg離心15-20分鐘來制備用于那些檢測的提取物。用上清液作為所述檢測的酶的來源。
為了進行比色檢測，制備含45mM KH2PO4/K2HPO4,20mM果糖-6-磷酸，15mML-葡糖胺，2.5mM EDTA,pH7.5和細胞提取物的1mL反應(yīng)液。將反應(yīng)液在37℃保溫20分鐘，然后通過煮沸4分鐘終止反應(yīng)。通過離心除去所得沉淀，然后按基本如Zalkin(1985，酶學(xué)方法113:278-281)所述但已改進的Elson和Morgan方法(1933，生物化學(xué)雜志27:1824-1828)檢測上清液的葡糖胺-6-磷酸，所述兩篇文獻均全文引入本文作為參考。向100微升上述上清液中加入12.5微升飽和的NaHCO3和12.5微升冷的新鮮制備的5％含水醋酸酐。在室溫保溫3分鐘后，將混合物煮沸3分鐘以蒸掉過量醋酸酐。冷卻到室溫后，加入150微升0.8M硼酸鉀，pH9.2(用KOH將pH調(diào)到9.2的0.8MH3BO3)，然后將混合物煮沸3分鐘。冷卻到室溫后，將1.25mL Ehrlich＇s試劑(在含0.125N HCl的冰醋酸中的1％對二甲氨基苯甲醛)加到各試管中。在37℃保溫30分鐘后，測量在585nm的吸收值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定形成的葡糖胺-6-磷酸量。不存在底物果糖-6-磷酸時，或者當(dāng)檢測中使用煮沸的提取物時，在585nm沒有觀察到顯著的吸收值。
在室溫下用含50mM KH2PO4/K2HPO4,10mM果糖-6-磷酸，6mM L-葡糖胺，10mM KCl,0.6mM乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)和50-60單位的L-谷氨酸脫氫酶(來自牛肝的Sigma TypeⅡ)的1毫升反應(yīng)液進行分光光度檢測。加入提取物后，監(jiān)測在365nm的吸收值跟蹤活性，并用不存在提取物時的觀察值來校正吸收值的少量增加。用APAD的摩爾消光系數(shù)9100計算活性。
表2在含整合的T7-glmS盒的生產(chǎn)菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性
表2表明，平均來說，含整合的T7-glmS盒的生產(chǎn)菌株中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性在用IPTG誘導(dǎo)時比不誘導(dǎo)時高約3-至4倍。該活性明顯高于用其天然啟動子驅(qū)動的野生型glmS菌株的(其通常為0.05-0.1μmol/分鐘/mL提取物)。菌株2123-6明顯帶有異常整合，因為其活性比其它菌株的低，而且不受培養(yǎng)基中IPTG存在的影響。
實施例3下列實施例說明菌株基因型對葡糖胺積累的影響。
使按實施例2所述生產(chǎn)的帶有T7-glmS整合子的菌株以及不帶整合DNA的相應(yīng)親本菌株在含M9A培養(yǎng)基(14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合檸檬酸鈉，5g/L(NH4)2SO4,pH7.0)的振蕩燒瓶中生長，所述培養(yǎng)基添加有20g/L葡萄糖，10mM MgSO4，1mM CaCl2和1mM IPTG。每兩天取一次樣，用實施例2中所述的改進的Elson-Morgan試驗測量培養(yǎng)上清液中的葡糖胺濃度。樣品用醋酸酐處理和不處理，用標(biāo)準(zhǔn)曲線從凈吸收值確定存在的葡糖胺量。
表3列出了培養(yǎng)24小時后，濃度達峰值時葡糖胺的濃度。表3的結(jié)果表明，既然有顯著的葡糖胺生產(chǎn)，則一定存在T7-glmS基因盒。數(shù)據(jù)還表明宿主中Δnag突變的存在導(dǎo)致與其不存在相比，葡糖胺積累有顯著的增加。在該試驗中，幾乎觀察不到manXYZ突變的影響。但在進一步的振蕩燒瓶試驗中，菌株2123-12積累的葡糖胺濃度稍高于一貫的基礎(chǔ)。
表3生產(chǎn)菌株培養(yǎng)上清液中的葡糖胺
實施例4下列實施例說明向培養(yǎng)基中補充營養(yǎng)對葡糖胺的積累的影響。
在早期試驗中，觀察到當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡時，葡糖胺積累停止。在表4和圖4總結(jié)的試驗中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖和硫酸銨快耗盡時補充它們可以提高葡糖胺積累。為了進行該試驗，使2123-12菌株在添加了10mM MgSO4,1mM CaCl2和1mM IPTG的M9A培養(yǎng)基中生長。按表4所示改變起始葡萄糖濃度和補料方案。在一個燒瓶中，起始硫酸銨的濃度為10g/L，而不是M9A培養(yǎng)基中所用的正常濃度5g/L。在培養(yǎng)過程中，用Diastix葡萄糖檢測條(Bayer Corporation Diagnostics Division,Elkhart,Indiana)監(jiān)測燒瓶中葡萄糖濃度。當(dāng)葡萄糖濃度耗盡或接近耗盡(剩余＜5g/L)時，按表4的說明補充葡萄糖和/或硫酸銨。培養(yǎng)過程中還要監(jiān)測pH。當(dāng)pH相對于起始pH7.0顯著改變時，用氫氧化鈉將其調(diào)整到7.0。
表4檢測葡萄糖補料之影響的振蕩燒瓶試驗
如圖4所表明的，增加葡萄糖的供應(yīng)對葡糖胺積累有積極作用。通過定期補充葡萄糖和硫酸銨(分別加入20g/L和5g/L)，觀察到最大葡糖胺積累0.4g/L，比沒有補充時高約4倍。
實施例5下列實施例描述突變的glmS基因的分離，所述基因編碼葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用減弱的葡糖胺-6-磷酸合酶基因。
White(1968，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)106:847-858)首先證實葡糖胺-6-磷酸合酶受葡糖胺-6-磷酸抑制。用實施例2所述的用于葡糖胺-6-磷酸合酶的分光光度檢測，測定葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺對葡糖胺-6-磷酸合酶的影響。為了確定產(chǎn)物抑制作用，在存在不同濃度加入的葡糖胺-6-磷酸的條件下進行檢測。
如圖5所示，葡糖胺-6-磷酸明顯抑制該酶，而葡糖胺稍微抑制該酶。這些結(jié)果與White,1968(同上文)得到的相似。該抑制作用是葡糖胺生產(chǎn)菌株中限制葡糖胺積累的關(guān)鍵因素。
為了進一步提高生產(chǎn)菌株中的葡糖胺合成，作出了很大努力以分離編碼具有降低的產(chǎn)物抑制作用的葡糖胺-6-磷酸合酶變體的glmS基因。為了達到該目的，用易錯PCR技術(shù)擴增克隆的基因。用該方法，通過用于擴增的DNA聚合酶，在導(dǎo)致高頻錯配的條件下擴增所述基因。結(jié)果，在PCR產(chǎn)物中得到高頻突變。
質(zhì)粒pKLN23-28在T7啟動子上游25個堿基對處和glmS基起點上游111個堿基對處含有一個唯一的SpeⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點。該質(zhì)粒還在glmS基因下游177個堿基對處含有一唯一的HinDⅢ位點。合成下列序列的PCR引物，所述引物分別對應(yīng)SpeⅠ緊鄰上游區(qū)和HinDⅢ緊鄰下游區(qū)5＇-ATGGATGAGCAGACGATGGT-3＇(SEQ ID NO:3)5＇-CCTCGAGGTCGACGGTATC-3＇(SEQ ID NO:4)用這些引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)擴增可以誘變含完整glmS基因的2247個堿基對區(qū)。PCR條件述于Moore和Amold,1996，天然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)14:458-467，該文獻全文引入本文作為參考。簡而言之，制備100微升溶液，所述溶液含有四種脫氧核苷三磷酸各1mM,16.6mM硫酸銨，67mM Tris-HCl,pH8.8,6.1mM MgCl2,6.7μM EDTA,10mM β-巰基乙醇，10μLDMSO，引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)各30ng,7或35ng用KpnⅠ線性化的質(zhì)粒pKLN23-28和2.5單位的Taq DNA聚合酶(PerkinElmer-Cetus,Emeryville,California)。用70μL礦物油覆蓋反應(yīng)混合物，然后放在熱循環(huán)儀中，將下列步驟重復(fù)25個循環(huán)94℃1分鐘42℃1分鐘72℃2分鐘據(jù)報道在這些條件下，錯誤頻率為每1000個堿基對約1個突變(Moore和Arno1d,1996，同上文)?；厥辗磻?yīng)產(chǎn)物，純化，然后用SpeⅠ和HinDⅢ消化，克隆到pKLN23-28的SpeⅠ-HinDⅢ骨架片段中，所述反應(yīng)產(chǎn)物有效取代了pKLN23-28的SpeⅠ-HinDⅢ片段上的野生型glmS基因。用克隆的DNA轉(zhuǎn)化菌株NovaBlue(Novagen,Inc.,Madison,Wisconsin)，然后將轉(zhuǎn)化的細胞鋪在含氨芐青霉素的LB瓊脂上。從氨芐青霉素平板上收集9000個含質(zhì)粒的菌落，然后從收集的細胞中制備質(zhì)粒DNA以得到pKLN23-28衍生的質(zhì)粒文庫，其在克隆的glmS基因中含有突變。
在Δnag manXYZ DE3宿主背景中篩選通過易錯PCR產(chǎn)生的突變質(zhì)粒提高葡糖胺生產(chǎn)的能力。該篩選是一種生物檢測，其中評估含質(zhì)粒的菌株互養(yǎng)需葡糖胺之大腸桿菌的能力。
葡糖胺-6-磷酸合酶缺陷型的大腸桿菌(Sarvas,1971，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)105:467-471；Wu和Wu,1971，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)105:455-466)和枯草芽孢桿菌(Freese等，1970，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)101:1046-1062)生長時需要葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。需要葡糖胺的大腸桿菌菌株用N-甲基-N＇-硝基-N-亞硝基胍(NG)誘變后進行分離。菌株LE392(表1)在LB培養(yǎng)基中生長至6×108個細胞/mL的密度。將溶解于甲醇的2.5mg/mL的NG50微升加到2mL該培養(yǎng)物中，然后將混合物在37℃培養(yǎng)20分鐘。該處理導(dǎo)致約10％的菌株存活。離心收集誘變的細胞，通過在0.9％NaCl中懸浮將細胞洗滌兩次，然后再離心。將洗滌過的細胞稀釋，然后以每平板50-200菌落形成單位的密度鋪到含0.2g/L N-乙酰葡糖胺的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA；5g/L細菌用蛋白胨，3g/L牛肉提取物，15g/L瓊脂)。約鋪13000個菌落。將這些菌落復(fù)制鋪板到含和不含0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA瓊脂上。在含0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA瓊脂上生長了24個菌落，但在不含0.2g/L N-乙酰葡糖胺的NA瓊脂上沒有。這些菌落通過劃線到含0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA瓊脂上純化，然后再檢查其生長表型。在選出的最初22個菌落中，5個有預(yù)期的LE392之glmS突變株表型。它們不能在NA上生長，但可以在添加了0.2g/L葡糖胺或0.2g/LN-乙酰葡糖胺的NA上生長。它們也不能在葡萄糖基本瓊脂上生長，但能在添加了0.2g/LN-乙酰葡糖胺的葡萄糖基本瓊脂上生長。將這些突變株之一命名為2123-16(表1)。
在互養(yǎng)實驗中，用2123-16菌株的培養(yǎng)細胞覆蓋含甘油或果糖作為主要生長碳源的瓊脂平板，按上述分離需要葡糖胺的菌株。將生成葡糖胺的菌株穿刺接種到瓊脂中，根據(jù)穿刺點周圍指示菌株所形成暈的大小評估生成葡糖胺的能力。圍有較大暈的穿刺點被認(rèn)為產(chǎn)生較大量的葡糖胺。
用于互養(yǎng)實驗的培養(yǎng)基由添加40mg/LL-甲硫氨酸(菌株LE392或菌株2123-16生長所必需)和2g/L甘油或果糖的M9基本培養(yǎng)基(6g/LNa2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/LNaCl,1g/L NH4Cl,1mM MgSO4,0.1mM CaCl2)組成。按下述用菌株2123-16覆蓋這些平板。在含1g/L N-乙酰葡糖胺的LB培養(yǎng)基中，在37℃使2123-16的培養(yǎng)物過夜生長。離心收集培養(yǎng)物，通過在0.9％NaCl中懸浮將細胞洗滌兩次，然后再離心。將洗滌過的細胞懸浮在原體積的0.9％NaCl中。對于待覆蓋的各平板，將0.1mL洗滌的細胞懸浮液與3mL溶化后的(50℃)F-頂層瓊脂(8g/L NaCl,8g/L瓊脂)混合，然后注到平板中。
將pKLN23-28突變質(zhì)粒的文庫轉(zhuǎn)移到菌株7101-17(DE3)中，然后將轉(zhuǎn)化的細胞鋪到含100μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂上。在這些平板上生長的每個菌落都含有一種突變質(zhì)粒文庫。將菌落從LB+氨芐青霉素平板中撿出，然后依次穿刺接種到(1)LB瓊脂+氨芐青霉素(2)用2123-16菌株覆蓋的甘油基本瓊脂；和(3)用2123-16覆蓋的果糖基本瓊脂中篩選菌落。
將所有平板在37℃保溫約24小時。保溫后，可在雙層平板中穿刺點周圍觀察到2123-16指示菌株的生長暈。從相應(yīng)的LB+氨芐青霉素平板中撿出產(chǎn)生較大暈的那些菌落，然后劃線純化。在最初篩選中，篩選了4368個候選突變株，鑒定出96個最初候選菌株。再篩選后，30似乎優(yōu)于其它的，即產(chǎn)生大于指示菌株的暈。
對6株如上分離的含質(zhì)粒菌株進行酶試驗表明，其中3株對葡糖胺-6-磷酸之抑制作用的敏感性低于對照菌株7101-17(DE3)/pKLN23-28的酶。使菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和1mM IPTG的LB肉湯中生長過夜。從那些培養(yǎng)物收集的細胞制備提取物，在添加和添加葡糖胺-6-磷酸的條件下，用分光光度檢測法(實施例2所述)檢測這些提取物的葡糖胺-6-磷酸合酶。突變克隆子11C、65A和8A對葡糖胺-6-磷酸的敏感性顯著低于對照菌株(圖6)。在該檢測法中其它突變株與對照無法區(qū)別。
實施例6下列實施例描述了構(gòu)建并鑒定在glmS基因中帶有導(dǎo)致產(chǎn)物抑制作用降低之突變的葡糖胺生產(chǎn)菌株。
將從上述克隆11C,52B和8A分離的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到ATCC 47002中，其曾用于將克隆的T7-glmS構(gòu)建體整合到大腸桿菌染色體中。用實施例2所述的方法很容易完成整合，將整合的DNA按實施例1所述通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到7101-17(DE3)中。這些方法產(chǎn)生與菌株2123-12有相同基因型，但在通過PCR產(chǎn)生的glmS基因中存在突變的菌株。將這些新突變的生產(chǎn)菌株分別稱為2123-49、2323-51和2123-54。圖7簡述了菌株構(gòu)建的策略。
使菌株2123-12,2123-49,2123-51和2123-54在含1mM IPTG的LB肉湯中生長過夜。從那些培養(yǎng)物收集細胞制備提取物，在添加和不添加葡糖胺-6-磷酸的條件下，用分光光度檢測法(實施例2所述)檢測所述提取物的葡糖胺-6-磷酸合酶。這些檢測的結(jié)果列于圖8。
這些突變株中的葡糖胺生產(chǎn)比菌株2123-12中的顯著提高。用前文實施例4所述葡萄糖和硫酸銨補料的方法在振蕩燒瓶獲得的培養(yǎng)物進行葡糖胺生產(chǎn)的分析時，當(dāng)培養(yǎng)物的細胞密度(測O.D.600)達到約14(約8.4g/L細胞干重)時，菌株2123-49,2123-51和2123-54分別產(chǎn)生1.5,2.4和5.8g/L葡糖胺(圖9)，而菌株2123-12產(chǎn)生0.3g/L葡糖胺。
實施例7下列實施例描述了在glmS中帶有導(dǎo)致產(chǎn)物抑制作用降低之突變的另一菌株的產(chǎn)生。
同樣實施例5所述，用互養(yǎng)試驗篩選含有通過實施例5所述易錯PCR產(chǎn)生的突變質(zhì)粒的另外6344個菌落。54個菌落產(chǎn)生比其余菌落大的暈。分離所有54個菌落的DNA，按實施例6所述構(gòu)建與菌株2123-12有相同基因型但glmS中的突變不同的菌株。
這些突變株中大部分的葡糖胺生產(chǎn)顯著高于2123-12菌株。在新分離的突變株中，產(chǎn)生最多葡糖胺的菌株是被稱為2123-124的菌株。當(dāng)用實施例4所述的葡萄糖和硫酸銨補料方法在振蕩燒瓶中檢測生產(chǎn)情況時，該菌株產(chǎn)生3.6g/L葡糖胺，而在平行試驗中，2123-54菌株產(chǎn)生4.3g/L葡糖胺。
實施例8下列實施例描述了對質(zhì)粒pKLN23-28中的克隆的野生型glmS基因的測序。另外，還測序并描述了在質(zhì)粒pKLN2349,pKLN23-54和pKLN23-124中的序列，這些質(zhì)粒含有分別用于構(gòu)建菌株2123-49,2123-54和2123-124的突變glmS基因。
用AmpliTaq DNA聚合酶和Applied Biosystems(ABI)Prism DyeTerminator Cycle測序方法完成DNA測序反應(yīng)。在ABIDNA測序儀373A或377上通過凝膠電泳分離所得產(chǎn)物。用來自ABI的ABI Sequencing Analysis3.0軟件和來自Gene Codes的Sequencher 3.1分析序列。
用于測序的引物如下PK-1:5＇-TGGATGAGCAGACGATGG-3＇(SEQ ID NO:5)PK-2:5＇-TCCGTCACAGGTATTTATTC-3＇(SEQID NO:6)PK-3:5＇-AGCTGCGTGGTGCGTAC-3＇(SEQ ID NO:7)PK-4:5＇-GGACCGTGTTTCAGTTCG-3＇(SEQID NO:8)PK-5A:5＇-GCCGTGGCGATCAGTAC-3＇(SEQ ID NO:9)PK-6A:5＇-GCCAATCACCAGCGGAC-3＇(SEQ ID NO:10)PK-7:5＇-ATGGTTTCCCGCTACTGG-3＇(SEQ ID NO:11)PK-8:5＇-GAACCAAGGTAACCCAGC-3＇(SEQ ID NO:12)確定含野生型glmS基因的質(zhì)粒pKLN23-28的核苷酸序列是本文SEQID NO:13表示的7408bp核酸序列。用上述引物確定SEQ ID NO:13之位置1130與3313之間的2184個堿基對。本文將代表SEQ ID NO:13之位置1130-3313的核酸分子稱為nglmS-282184，并進一步鑒定為SEQ ID NO:14。nglmS-282184表明包含用于按實施例5所述構(gòu)建突變體質(zhì)粒的SpeⅠ和HinDⅢ位點。SEQ ID NO:13的剩余DNA序列是基于用于構(gòu)建pKLN23-28之載體的已知序列。測定質(zhì)粒pKLN23-49,pKLN23-54和pKLN23-124中相同的2184個堿基對區(qū)。應(yīng)注意，為了討論這些質(zhì)粒的突變glmS基因(表5)，用SEQ ID NO:13作為參考描述含突變glmS的質(zhì)粒的核苷酸序列中突變的具體核苷酸位置。
SEQ ID NOs:13和14含有編碼glmS基因產(chǎn)物(即Glc6P合酶)的開放閱讀框架，其是本文稱為nglmS-281830的核酸分子，其核酸序列由SEQ ID NO:15表示。SEQ ID NO:15跨SEQ ID NO:13的核苷酸1253-3082，并包括跨苷酸1253-1255的起始密碼子和跨核苷酸3080-3082的終止密碼子。SEQ IDNO:15編碼本文稱為GlcN6P-S-28的609個氨基酸的蛋白質(zhì)，其推導(dǎo)的氨基酸序列由SEQ ID NO:16表示。應(yīng)注意為了討論本文所述突變菌株產(chǎn)生的突變glmS基因產(chǎn)物，用SEQ ID NO:16作為參考描述在突變glmS基因產(chǎn)物之氨基酸序列中的具體突變。
上述引物對應(yīng)于SEQ ID NO:13的下列核苷酸位置PK-1(SEQ ID NO:5):SEQ ID NO:13的位置1087-1104；PK-2(SEQ ID NO:6):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置3378-3359；PK-3(SEQ ID NO:7):SEQ ID NO:13的位置1707-1723；PK-4(SEQ ID NO:8):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置2772-2755；PK-5A(SEQ ID NO:9):SEQ ID NO:13的位置2667-2683；PK-6A(SEQ ID NO:10):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置1798-1782；PK-7(SEQ ID NO:11):SEQ ID NO:13的位置2177-2194；PK-8(SEQ ID NO:12):SEQ ID NO:13之互補核酸序列的位置2364-2347。
來自pKLN23-28的核酸分子nglmS-281830(SEQ ID NO:15，或者SEQ IDNO:13的位置1253-3082)的核酸序列在位置2509和2510(參照SEQ IDNO:13)不同于公開的序列(Walker,J.E.，等，1984，大腸桿菌unc操縱子鄰近的DNA序列，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)224:799-815)。在本實施例中pKLN23-28在這些位置上的核苷酸分別是G和C，而在公開的序列中報道是C和G。除此之外，glmS基因的公開序列和測定序列是相同的。經(jīng)測定glmS基因上游和下游序列是根據(jù)用于構(gòu)建pKLN23-28的載體的已知序列和用于構(gòu)建該質(zhì)粒的方法預(yù)測的那些。
按照上述用于pKLN23-28的所述方法，確定質(zhì)粒pKLN23-49,pKLN23-54和pKLN23-124的突變glmS基因的核苷酸序列。在每個質(zhì)粒中均發(fā)現(xiàn)了突變。在表5中總結(jié)了與在pKLN23-28上測定的野生型序列(SEQID NO:13)相比，在相應(yīng)突變glmS基因產(chǎn)物中的突變和預(yù)測的氨基酸改變。
表5在葡糖胺過量生產(chǎn)菌株的glmS基因中的突變
*參照在pKLN23-28序列(SEQ ID NO:13)中表示的核酸位置**glmS基因(nglmS-281830；SEQ ID NO:15)編碼長度為609個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:16)；由水解酶除去在位置1的甲硫氨酸殘基。
pKLN23-49含有本文稱為nglmS-492184的2184bp核酸分子，該核酸分子含有一個突變的glmS基因。nglmS-492184的核酸序列由本文SEQ IDNO:17表示。本文稱為nglmS-491830的跨SEQ ID NO:17中核苷酸124-1953的核酸分子代表編碼本發(fā)明突變的葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:17的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ ID NO:17的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-491830的核酸序列是SEQ ID NO:18。SEQID NO:18編碼本文稱為GlcN6P-S-49的609個氨基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)，在本文其推導(dǎo)的氨基酸序列是SEQ ID NO:19。SEQ ID NO:17含有與SEQ ID NO:13中1130-3313位(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之處在于如表5對質(zhì)粒pKLN23-49所標(biāo)明的突變。SEQ ID NO:18含有與SEQ ID NO:13中1253-3082位(即SEQ ID NO:15)基本相同的核酸序列，不同之處在于如表5所標(biāo)明的有關(guān)質(zhì)粒pKLN23-49的突變。
質(zhì)粒pKLN23-54含有本文稱為nglmS-542184的2184bp核酸分子，該核酸分子含有一個突變的glmS基因。nglmS-542184的核酸序列由本文SEQ IDNO:20表示。本文稱為nglmS-541830的跨SEQ ID NO:20中核苷酸124-1953的核酸分子代表編碼本發(fā)明突變的葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:20的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ IDNO:20的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-541830的核酸序列是SEQ IDNO:21。SEQID NO:21編碼本文稱為GlcN6P-S-54的609個氨基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)，在本文其推導(dǎo)的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。SEQ ID NO:20含有與SEQ ID NO:13的位置1130-3313(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之處在于如表5所標(biāo)明的有關(guān)質(zhì)粒pKLN23-54的突變。SEQ ID NO:21含有與SEQ ID NO:13的位置1253-3082(即SEQ ID NO:15)基本相同的核酸序列，不同之處在于如表5所標(biāo)明的有關(guān)質(zhì)粒pKLN23-54的突變。
質(zhì)粒pKLN23-124含有本文稱為nglmS-1242184的2184bp核酸分子，該核酸分子含有一個突變的glmS基因。nglmS-1242184的核酸序列由本文SEQID NO:23表示。本丈稱為nglmS-1241830的跨SEQ ID NO:23中核苷酸124-1953的核酸分子代表編碼本發(fā)明突變的葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:23的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ IDNO:23的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-1241830的核酸序列是SEQ IDNO:24。SEQ ID NO:24編碼本文稱為G1cN6P-S-124的609個氨基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)，在本文其推導(dǎo)的氨基酸序列是SEQ ID NO:25。SEQ ID NO:23含有與SEQ ID NO:13的位置1130-3313(即SEQ ID NO:14)基本相同的核酸序列，不同之處在于如表5所標(biāo)明的有關(guān)質(zhì)粒pKLN23-124的突變。SEQ ID NO:24含有與SEQ ID NO:13的位置1253-3082(即SEQ IDNO:15)基本相同的核酸序列，不同之處在于如表5所標(biāo)明的有關(guān)質(zhì)粒pKLN23-124的突變。
為了證實在染色體中已整合了突變的glmS基因的菌株中存在相同的突變，從菌株2123-49、2123-54和2123-124分離的基因組DNA產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。為了進行PCR擴增，使用實施例3中所列的用于誘變基因的引物(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)。在含20mM TrisHCl(pH8.8),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,20mMgSO4,0.1％Triton X-100,0.1mg/mL無核酸酶牛血清白蛋白，脫氧核苷三磷酸各0.05mM，每種引物各2μM，克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)1.25U和160ng基因組DNA的反應(yīng)液50微升中完成PCR反應(yīng)。將整個反應(yīng)體系放在RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler(Stratagene)上。在94℃3分鐘后，將下列三個步驟重復(fù)30個循環(huán)(1)94℃,30秒；(2)47℃,30秒和(3)72℃,2分鐘。此后在72℃保溫7分鐘。
所得的DNA除無關(guān)產(chǎn)物外還含有預(yù)期的擴增產(chǎn)物。用QIAquickPCR純化試劑盒純化含glmS基因的產(chǎn)物，然后在瓊脂糖凝膠上對純化的產(chǎn)物實施電泳，用QIAquick凝膠提取試劑盒分離正確的帶，用該分離的DNA作為模板再進行擴增。按照與上述初步擴增相同的方案擴增含該分離DNA的反應(yīng)液，不同的是用40ng DNA作為模板，并且僅實施20個循環(huán)的擴增。按上述回收這第二次擴增的產(chǎn)物。
用引物檢驗基因組DNA中突變的存在，所述引物特異于含有質(zhì)粒中所鑒定的突變的DNA區(qū)。對于2123-49，這些包括引物PK-1(SEQ ID NO:5),PK-3(SEQ ID NO:7),PK4(SEQ ID NO:8)和PK-5A(SEQ ID NO:9)。對于2123-124，使用引物PK-1(SEQ ID NO:5)；PK4(SEQ ID NO:8)和PK-5(SEQ IDNO:9)。對于2123-54，用前述所有8個引物(SEQ ID NOs:5-12)測定完整PCR產(chǎn)物的序列。對PCR產(chǎn)物的測序證實從質(zhì)粒中鑒定并列于表5的突變的存在。
實施例9本實施例描述從菌株2123-54構(gòu)建含突變glmS基因的菌株，所述突變glmS基因編碼的產(chǎn)物僅在位置472(SEQ ID NO:22)含有甘氨酸取代絲氨酸的改變。
如表5中所列，在菌株2123-124的GlcN6P合酶(GlcN6P-S-124)中，唯一的氨基酸改變是在位置469(SEQ ID NO:25)的脯氨酸變成亮氨酸，清楚地限定該突變引起菌株2123-124過量生產(chǎn)葡糖胺。這提示在菌株2123-54中GlcN6P-S-54的位置472上，絲氨酸變?yōu)楦拾彼?gly取代Ser472；SEQ IDNO:22)的可能性同樣是導(dǎo)致該菌株過量生產(chǎn)葡糖胺的原因。在嘗試說明這一點的過程中，用EcoRⅠ和HinDⅢ消化質(zhì)粒pKLN23-54，將所述改變與2123-54菌株中GlcN6P-S-54氨基酸序列(SEQ ID NO:22)中的其它兩個氨基酸改變(即Ala取代Thr39和Arg取代Cys250)分開。這些酶在質(zhì)粒上各有其唯一的裂解位點，分別在位置2241和3305(相對于pKLN23-28之SEQ ID NO:13的等價位置)切割，產(chǎn)生1064個堿基對和6344個堿基對的片段。該較小片段所含突變中唯一的氨基酸改變是pKLN23-54中472位ser變?yōu)間ly。將該較小的片段與pKLN23-28中含野生型glmS基因的相應(yīng)較大片段相連。
從該連接產(chǎn)生的兩個質(zhì)粒稱為pKLN23-149和pKLN23-151。用引物PK-1(SEQ ID NO:5),PK-3(SEQ ID NO:7)和PK-4(SEQ ID NO:8)測定來自這些質(zhì)粒的DNA序列證實，這些質(zhì)粒在質(zhì)粒pKLN23-54的位置2666含有突變，但在位置1367和2000沒有突變(表5，參照SEQ ID NO:13)。
本文將質(zhì)粒pKLN23-149之位置1130-3313間的2184個堿基對的核酸序列(這些位置經(jīng)測定對應(yīng)于SEQ ID NO:13的等價位置)稱為nglmS-1492184，其核酸序列由SEQ ID NO:26代表。SEQ ID NO:26含有本文稱為nglmS-1491830的跨核苷酸124-1953的核酸序列，該核酸序列代表編碼本發(fā)明突變葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:26的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ ID NO:26的核苷酸1951-1953。在本文nglmS-1491830的核酸序列是SEQ ID NO:27。SEQ ID NO:27編碼本文稱為GlcN6P-S-149的609個氨基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)，在本文其推導(dǎo)的氨基酸序列是SEQ ID NO:28。
本文將質(zhì)粒pKLN23-151之位置1130-3313間的2184個堿基對的核酸序列(這些位置經(jīng)測定對應(yīng)于SEQ ID NO:13的等價位置)稱為nglmS-1512184，其核酸序列由SEQ ID NO:29代表。SEQ ID NO:29含有本文稱為nglmS-1511830的跨核苷酸124-1953的核酸序列，該核酸序列代表編碼本發(fā)明突變葡糖胺-6-磷酸合酶的開放閱讀框架，起始密碼子是SEQ ID NO:29的核苷酸124-126，終止密碼子是SEQ ID NO:29的核苷酸1951-1953。在本文ng1mS-1511830的核酸序列是SEQ ID NO:30。SEQ ID NO:30編碼本文稱為GlcN6P-S-151的609個氨基酸的突變葡糖胺-6-磷酸合酶蛋白質(zhì)，在本文其推導(dǎo)的氨基酸序列是SEQ ID NO:31。
用圖7所示的方案構(gòu)建與菌株2123-12基因型相同，但含有使gly取代ser472之突變的菌株。分別從質(zhì)粒pKLN23-149和pKLN23-151產(chǎn)生菌株2123-149和2123-151。用實施例8所述的方法，對這些菌株之基因組DNA的PCR產(chǎn)物測序證實，在位置2666(SEQ ID NO:13)存在突變，而在位置1367和2000沒有突變。
實施例10
本實施例比較來自2123-12,2123-49,2123-54,2123-124,2123-149和2123-151菌株的GlcN6P合酶的特性。
使在上述實施例中所述的菌株2123-12,2123-49,2123-54,2123-124,2123-149和2123-151在37℃LB肉湯中生長過夜，然后轉(zhuǎn)移到新鮮LB肉湯中。培養(yǎng)物生長到在600nm的吸收值為0.8-0.9，然后通過加入1mMIPTG誘導(dǎo)GlcN6P合酶生產(chǎn)。在37℃，使培養(yǎng)物再生長3小時，然后收集。按實施例2所述，從那些培養(yǎng)物中收集的細胞制備提取物，然后按實施例2所述，用分光光度檢測法檢測葡糖胺-6-磷酸合酶，不同的是果糖-6-磷酸濃度為20mM。存在和不存在加入的葡糖胺-6-磷酸的條件下檢測該酶。不存在葡糖胺-6-磷酸的條件下，這些酶的比活性相似，只有菌株2123-124不同。表6的數(shù)據(jù)提示后者編碼該酶的較低活性的變體。
表6來自葡糖胺生產(chǎn)菌株的GlcN6P合酶的比活性
圖10表明菌株2123-49,2123-54和2123-124的GlcN6P合酶與菌株2123-12的酶相比明顯不太受GlcN6P的抑制。相比，菌株2123-149和2123-151的酶受GlcN6P抑制的程度比菌株2123-12的酶稍微。
這些酶的熱穩(wěn)定性也用這些提取物進行了檢測。將提取物在45℃(圖11A)或50℃(圖11B)保溫不同的時間，然后用分光光度檢測法檢測。圖11A和11B顯示菌株2123-49和菌株2123-54的酶的穩(wěn)定性遠不及菌株2123-12的酶的。菌株2123-124的酶的穩(wěn)定性與野生型酶的相當(dāng)，而菌株2123-149和菌株2123-151的酶在所述保溫條件下穩(wěn)定性略遜。
實施例11
下列實施例說明異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)濃度和溫度對葡糖胺生產(chǎn)的影響。
在37℃，在添加了20g/L葡萄糖，1mM MgSO4,0.1mM CaCl2和各種量的IPTG的M9A培養(yǎng)基(14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合檸檬酸鈉，5g/L(NH4)2SO4,pH7.0)上使菌株2123-54和2123-124的培養(yǎng)物生長20小時。在生長期結(jié)束時，取樣品，用實施例2所述的Elson-Morgan檢測法檢測培養(yǎng)上清液中的葡糖胺濃度。圖12所示的結(jié)果表明用于生產(chǎn)的最佳IPTG濃度為約0.2mM。
隨后，在含0.2或1mM IPTG的振蕩燒瓶中，在30或37℃，在與上述相同的培養(yǎng)基中使菌株2123-54生長。按實施例4所述向這些燒瓶培養(yǎng)物中添加葡萄糖和硫酸銨。間隔不同時間取樣，用實施例2所述的Elson-Morgan檢測法檢測培養(yǎng)上清液中的葡糖胺濃度。圖13表明在該試驗條件下，不同濃度的IPTG下葡糖胺的生產(chǎn)幾乎沒有差別。但是，在30℃生長時比在37℃生長有更高的葡糖胺生產(chǎn)。圖14A和14B的結(jié)果進一步說明，在30℃(圖14A)，生長停止后葡糖胺生產(chǎn)繼續(xù)，而在37℃(圖14B)，生長和葡糖胺生產(chǎn)同時停止。
在30℃含0.2mM IPTG的條件下使菌株2123-49和2123-124生長時，生長停止后，葡糖胺生產(chǎn)還在繼續(xù)，如圖15A(2123-49)和15B(2123-124)所示。如在37℃觀察的，用菌株2123-54得到最高濃度的葡糖胺，其次是2123-124再次是2123-49。還檢測了菌株2123-149和2123-151，它們并不比2123-12產(chǎn)生更高濃度的葡糖胺(表7)。
表730℃時的葡糖胺生產(chǎn)
實施例12下列實施例說明菌株2123-54的發(fā)酵罐培養(yǎng)比振蕩燒瓶培養(yǎng)產(chǎn)生更高濃度的葡糖胺。本實施例還說明在發(fā)酵罐中，菌株2123-54在30℃比在37℃產(chǎn)生更多葡糖胺。
菌株2123-54的發(fā)酵培養(yǎng)物在表8所示的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵時用NaOH將pH控制在pH6.7，用33％葡萄糖，8％硫酸銨的混合物補料。調(diào)整通氣和攪拌以使溶解氧的濃度大于20％空氣飽和度。
表8發(fā)酵培養(yǎng)基
*痕量金屬組分是0.7mg/L CoCl2,1.7mg/L H3BO3,0.6mg/LCuCl2·2H2O,10.5mg/L FeCl3·6H2O,12mg/L MnCl2·4H2O,1.5mg/LNa2MO4·2H2O,1.5mg/L ZnCl2。
在下列試驗中，在含一升容器中以600mL培養(yǎng)基開始進行三個發(fā)酵。變量檢測如下。
發(fā)酵罐#1補充33％葡萄糖和8％硫酸銨的混合物，其速度將保證發(fā)酵罐中沒有葡萄糖的積累。培養(yǎng)溫度為37℃。
發(fā)酵罐#2基本同發(fā)酵#1，但培養(yǎng)溫度為30℃。
發(fā)酵罐#3基本同發(fā)酵#2，但提高了補料速率以使發(fā)酵罐中的葡萄糖濃度穩(wěn)定在5-10g/L。
在圖16A,16B和16C中列出了這些發(fā)酵的結(jié)果。比較發(fā)酵罐1(圖16A)和2(圖16B)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)正如在振蕩燒瓶中所觀察到的，在30℃的葡糖胺滴度明顯高于在37℃的。觀察到的最大葡糖胺濃度是在30℃葡萄糖過量的發(fā)酵罐3中(圖16C)，為10.9g/L。在30℃，生長與葡糖胺濃度變化平行，似乎在葡萄糖過量條件下生長稍微有利。在隨后的發(fā)酵試驗中，在與發(fā)酵罐#3相似的條件下發(fā)酵，得到超過12g/L的葡糖胺濃度(數(shù)據(jù)未列出)。
總之，本發(fā)明人在本文描述了利用代謝工程產(chǎn)生第一個大腸桿菌的葡糖胺過量生產(chǎn)菌株。本文所證明的概念總體上適用于具有氨基糖生產(chǎn)途徑的任何微生物或者已導(dǎo)入氨基糖生產(chǎn)途徑的任何重組微生物。除本發(fā)明用于產(chǎn)生葡糖胺-生產(chǎn)菌的方法外(即減少葡糖胺降解和攝入并提高glmS基因的表達)，本發(fā)明還確立了減弱葡糖胺-6-磷酸合酶的葡糖胺-6-產(chǎn)物抑制作用可提高葡糖胺生產(chǎn)。
盡管已詳細描述了本發(fā)明的各種實施方案，但是顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對那些實施方案進行修飾和改變。但是，應(yīng)清楚地理解所述修飾和改變在本發(fā)明下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>Berry.AlanBurlingame.Richard P.Millis,James R.<120>生產(chǎn)葡糖胺的方法和材料<130>3161-18-C1-PCT<140>PCT/US99/15976<141>1999-07-15<150>PCT/US98/0080<151>1998-01-14<150>60/035,494<151>1997-01-14<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1cggtctccca tgtgtggaat tgtt ggcgc 29<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2ctctagagcg ttgatattca gtcaattaca aaca 34<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3atggatgagc agacgatggt 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4cctcgaggtc gacggtatc 19<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5tggatgagca gacgatgg18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6tccgtcacag gtatttattc 20<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7agctgcgtgg tgcgtac 17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>8ggaccgtgtt tcagttcg18<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>9gccgtggcga tcagtac 17<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10gccaatcacc agcggac 17<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>11atggtttccc gctactgg18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>12gaaccaaggt aacccagc18<210>13<211>7408<212>DNA<213>大腸桿菌<220><221>RBS<222>(1240)..(1245)<220><221>啟動子<222>(1165)..(1181)<220><221>沖突<222>(2509)..(2510)<400>13gaattgatcc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 60atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 120atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttccgg 180caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg 240tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtaacct 300atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc 360tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg 420gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac ggccaggaca 480gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa aaccgcctcg 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權(quán)利要求
1．通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法，該方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)在氨基糖代謝途徑中有遺傳修飾的微生物，所述氨基糖代謝途徑選自將葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)變成另一種化合物的途徑、用于合成葡糖胺-6-磷酸的途徑、將葡糖胺或葡糖胺-6-磷酸轉(zhuǎn)運出所述微生物的途徑、將葡糖胺轉(zhuǎn)運到所述微生物中的途徑以及競爭葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)的有關(guān)底物的途徑；其中所述培養(yǎng)步驟從所述微生物中產(chǎn)生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產(chǎn)物；(b)回收所述產(chǎn)物。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述葡糖胺-6-磷酸是細胞內(nèi)的，所述葡糖胺細胞外的，其中所述回收步驟包括選自從所述微生物中回收所述葡糖胺-6-磷酸、從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中回收所述葡糖胺以及其組合的回收步驟。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)物是通過所述微生物分泌到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡糖胺，且所述回收步驟包括從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中純化所述葡糖胺。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)物是細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸，且所述回收步驟包括從所述微生物中分離所述葡糖胺-6-磷酸。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)物是細胞內(nèi)葡糖胺-6-磷酸，且所述回收步驟還包括將所述葡糖胺-6-磷酸去磷酸化以產(chǎn)生葡糖胺。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括將所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源濃度保持在約0.5％至約5％。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟是在約28℃至約37℃完成的。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟是在發(fā)酵罐中完成的。
9．權(quán)利要求1的方法，其中回收至少約1g/L的所述產(chǎn)物。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳修飾是在編碼選自下列蛋白質(zhì)的核酸分子中的修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、葡糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan和磷酸酶。
11．權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物含有提高葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述遺傳修飾導(dǎo)致所述微生物過量表達葡糖胺-6-磷酸合酶。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述遺傳修飾包括用編碼具有葡糖胺-6-磷酸合酶活性之葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化所述微生物，其中所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶同系物的核酸序列。
15．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有編碼氨基酸序列SEQ ID NO:16的核酸序列。
16．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核酸序列。
17．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組核酸分子含有選自pKLN23-28,nglmS-282184和nglmS-281830的核酸分子。
18．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
19．權(quán)利要求13的方法，其中所述編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子含有提高所述葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子含有含有減弱所述葡糖胺-6-磷酸合酶之葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)物抑制作用的遺傳修飾。
21．權(quán)利要求19的方法，其中所述遺傳修飾導(dǎo)致至少一個選自下列的氨基酸修飾所述葡糖胺-6-磷酸合酶的至少一個氨基酸殘基的缺失、插入、倒置、取代和衍生，所述至少一個氨基酸修飾導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述至少一個氨基酸修飾是在一個氨基酸序列位置，其對應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO:16，選自Ile(4),Ile(272),Ser(450),Ala(39),Arg(250),GIy(472),Leu(469)和其組合。
23．權(quán)利要求22的方法，其中所述氨基酸修飾是選自下列的取代(a)帶有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ile(4)；(b)帶有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ile(272)；(c)帶有一個脂肪族側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ser(450)；(d)帶有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Ala(39)；(e)帶有含硫側(cè)基團的氨基酸殘基取代Arg(250)；(f)帶有一個脂肪族羥基側(cè)基團的氨基酸殘基取代Gly(472)；(g)帶有一個脂肪族側(cè)基團的氨基酸殘基取代Leu(469)；(h)(a)-(g)的組合。
24．權(quán)利要求22的方法，其中所述氨基酸修飾是選自下列的取代Ile(4)被Thr取代、Ile(272)被Thr取代、Ser(450)被Pro取代、Ala(39)被Thr取代、Arg(250)被Cys取代、Gly(472)被Ser取代、Leu(469)被Pro取代以及其組合。
25．權(quán)利要求22的方法，其中所述氨基酸修飾是在氨基酸序列位置Leu(469)由脯氨酸殘基取代亮氨酸殘基。
26．權(quán)利要求22的方法，其中所述氨基酸修飾是選自下列的氨基酸殘基的取代(a)蘇氨酸殘基取代Ala(39)位的丙氨酸殘基；(b)半胱氨酸殘基取代Arg(250)位的精氨酸殘基；(c)絲氨酸殘基取代Gly(472)位的甘氨酸殘基；以及(d)(a)、(b)或(c)的任意組合。
27．權(quán)利要求22的方法，其中所述氨基酸修飾是選自下列的取代(a)蘇氨酸殘基取代Ile(4)位的異亮氨酸殘基；(b)蘇氨酸殘基取代Ile(272)位的異亮氨酸殘基；(c)脯氨酸殘基取代Ser(450)位的絲氨酸殘基；以及(d)(a)、(b)或(c)的任意組合。
28．權(quán)利要求19的方法，其中所述重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述合酶含有選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQID NO:25、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
29．權(quán)利要求19的方法，其中所述重組核酸分子含有選自SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列。
30．權(quán)利要求19的方法，其中所述重組核酸分子含有選自pKLN23-49、pKLN23-54、pKLN23-124、pKLN23-149、pKLN23-151、nglmS-492184、nglmS-491830、nglmS-542184、nglmS-541830、nglmS-1242184、nglmS-1241830、nglmS-1492184、nglmS-1491830、nglmS-1512184和nglmS-1511830的核酸分子。
31．權(quán)利要求19的方法，其中所述重組核酸分子被整合到所述微生物的基因組中。
32．權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物在編碼選自下列蛋白質(zhì)的基因中還含有至少一個遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的作用。
33．權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還含有至少一個遺傳修飾，其中所述遺傳修飾提高所述磷酸酶的作用。
34．權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物在編碼下列蛋白質(zhì)的基因中還含有修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的作用。
35．權(quán)利要求34的方法，其中所述遺傳修飾是缺失所述基因的至少一部分。
36．權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物選自細菌和酵母。
37．權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是埃希菌屬的細菌。
38．權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
39．權(quán)利要求38的方法，其中所述遺傳修飾是在選自下列的大腸桿菌基因中的突變nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和磷酸酶基因。
40．通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法，該方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，其中所述重組核酸分子提高了所述大腸桿菌中的葡糖胺-6-磷酸合酶的作用，其中所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連；其中所述培養(yǎng)步驟從所述大腸桿菌中產(chǎn)生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產(chǎn)物；以及(b)回收所述產(chǎn)物。
41．權(quán)利要求40的方法，其中所述大腸桿菌在選自下列的至少一個基因中還含有至少一個遺傳修飾nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、ptsG基因和磷酸酶基因。
42．權(quán)利要求40的方法，其中所述至少一個另外的遺傳修飾包括nagA、nagB、nagC、nagD和nagE的一個缺失，manXYZ中的突變，所述修飾導(dǎo)致N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag的作用降低。
43．用于通過生物合成方法生產(chǎn)葡糖胺的微生物，所述微生物用編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化，所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連并含有提高所述葡糖胺-6-磷酸合酶作用的遺傳修飾；其中所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物的葡糖胺生產(chǎn)。
44．權(quán)利要求43的微生物，其中其中所述微生物在編碼選自下列蛋白質(zhì)的基因中還含有至少一個遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的作用。
45．權(quán)利要求43的微生物，其中所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還含有至少一個遺傳修飾，其中所述遺傳修飾提高了所述磷酸酶的作用。
46．權(quán)利要求43的微生物，其中所述微生物是在選自下列的基因中還含有至少一個遺傳修飾的大腸桿菌nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU和ptsG基因，其中所述遺傳修飾降低了由所述基因編碼之蛋白質(zhì)的作用。
47．權(quán)利要求43的微生物，其中所述微生物是含有nag調(diào)節(jié)子基因之缺失的大腸桿菌。
48．權(quán)利要求43的微生物，其中所述微生物是含有nag調(diào)節(jié)子基因之缺失以及在manXYZ基因中含有遺傳修飾以使所述manXYZ基因編碼之蛋白質(zhì)作用降低的大腸桿菌。
49．權(quán)利要求43的微生物，其中在含14g/L K2HPO4,16g/L KH2PO4,1g/L二水合檸檬酸鈉，5g/L(NH4)2SO4,20g/L葡萄糖，10mM MgSO4,1mMCaCl2和約0.2-約1mM IPTG的pH7.0培養(yǎng)基上，當(dāng)在約28-約37℃培養(yǎng)約10-約60小時，使細胞密度按細胞干重計算為至少約8g/L時，所述微生物產(chǎn)生至少約lg/L葡糖胺。
50．用于通過生物合成方法生產(chǎn)葡糖胺的微生物，所述微生物含有(a)編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的重組核酸分子，所述重組核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列有效相連，其中所述重組核酸分子的表達提高了所述微生物的葡糖胺-6-合酶的作用；和(b)在選自編碼下列蛋白質(zhì)的基因中至少一個遺傳修飾N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶、N-乙酰-葡糖胺-特異性酶ⅡNag、磷酸葡糖胺變位酶、葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸果糖激酶、PEP葡萄糖PTS的酶ⅡGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM,P/ⅢMan，其中所述遺傳修飾降低了所述蛋白質(zhì)的作用。
51．權(quán)利要求50的微生物，其中所述微生物在編碼磷酸酶的基因中還含有至少一個遺傳修飾，其中所述遺傳修飾提高了所述磷酸酶的作用。
52．含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶之核酸序列的重組核酸分子，其含有導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高的遺傳修飾。
53．權(quán)利要求52的重組核酸分子，其中所述遺傳修飾導(dǎo)致至少一個選自下列的氨基酸修飾所述葡糖胺-6-磷酸合酶的至少一個氨基酸殘基的缺失、插入、倒置、取代和衍生，所述至少一個氨基酸修飾導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高。
54．權(quán)利要求52的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子含有編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述葡糖胺-6-磷酸合酶含有選自SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
55．權(quán)利要求52的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子含有選自SEQID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30的核酸序列。
56．具有葡糖胺-6-磷酸合酶作用的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述合酶由含有導(dǎo)致葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高之遺傳修飾的核酸序列編碼。
57．權(quán)利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶含有選自至少一個氨基酸殘基之缺失、插入、倒置、取代和衍生的至少一個氨基酸修飾。
58．權(quán)利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶由選自SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的核酸序列編碼。
59．權(quán)利要求56的葡糖胺-6-磷酸合酶，其中所述合酶含有選自SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
60．通過發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺的方法，該方法包括(a)在含可吸收的碳、氮和磷源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有使葡糖胺-6-磷酸合酶作用提高之遺傳修飾的微生物，其中所述遺傳修飾的微生物由包含下列步驟的方法產(chǎn)生(1)從含編碼葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的分離的核酸分子中產(chǎn)生修飾以產(chǎn)生多個修飾的核酸序列；(2)用所述修飾的核酸序列轉(zhuǎn)化微生物以產(chǎn)生遺傳修飾的微生物；(3)根據(jù)葡糖胺-6-磷酸合酶作用篩選所述遺傳修飾的微生物；和(4)篩選具有提高的葡糖胺-6-磷酸合酶作用的所述遺傳修飾微生物；其中所述培養(yǎng)步驟從所述微生物中產(chǎn)生選自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的產(chǎn)物；(b)回收所述產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵遺傳修飾的微生物生產(chǎn)葡糖胺的方法和材料。本發(fā)明包括用于本發(fā)明生產(chǎn)葡糖胺之方法的遺傳修飾的微生物,以及重組核酸分子和由所述重組核酸分子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/70GK1314951SQ99810087
公開日2001年9月26日 申請日期1999年7月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月15日
發(fā)明者艾倫·貝里, 理查德·P·伯林蓋姆, 詹姆斯·R·米利斯 申請人:以生物技術(shù)資源的名義經(jīng)營的Dcv公司