專利名稱：用甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組莫內(nèi)林的制作方法
根據(jù)美國法典35§119(e)本申請要求以下申請的優(yōu)先權(quán)申請人Lingxun Duan，美國臨時申請序列號60/114,529，申請日1998年12月31日，名稱為用甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組莫內(nèi)林。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一個單鏈的莫內(nèi)林樣蛋白，該蛋白是穩(wěn)定的，且以重量為基礎(chǔ)至少比蔗糖甜100倍。本發(fā)明也涉及編碼所述莫內(nèi)林樣蛋白的核酸。優(yōu)選地，此核酸進(jìn)一步包括一個啟動子和一個信號序列，該序列在甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris中引導(dǎo)編碼的莫內(nèi)林樣蛋白的表達(dá)和分泌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一個含編碼莫內(nèi)林樣蛋白的核酸的重組Pichiapastoris細(xì)胞，一種從重組Pichia pastoris中生產(chǎn)莫內(nèi)林樣蛋白的方法及該方法的產(chǎn)物。
2.背景技術(shù)2.1.莫內(nèi)林莫內(nèi)林屬于來自熱帶植物的高甜蛋白家族(Dansby，自然生物技術(shù)學(xué)，1997，15419-420)。莫內(nèi)林比蔗糖甜大約3,000倍。其它相似的蛋白包括竹芋蛋白、非洲奇果蛋白、馬檳榔甜蛋白、pentadin和阿斯巴甜(Id.)。莫內(nèi)林最先是從西非植物Dioscorephyllum comminisii中分離的(美國專利第3,878,184和3,998,798號；Morris和Cagan，Biochim.Biophys.Acta，1972，261114-122)。莫內(nèi)林的氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)及各種物理和化學(xué)特性已被確定(Ogata等，自然，1987.328739-742；Morris等，生物化學(xué)雜志，1973.248534-539；Cagan，科學(xué)，1973，18132-35；Bohak和Li，Biochim.Biophys.Acta，1976，427153-170；Hudson和Beeman，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1976，71212-220；Van der Wel和Loeve，F(xiàn)EBS Lett.，1973，29181-183；和Frank和Zuber，HoppeSeyler’s Z Physiol.Chem.，1976，357585-592)。
美國專利第4,300,576號公開了含竹芋蛋白或莫內(nèi)林的煙熏顆粒。美國專利第4,562,076號公開了包被竹芋蛋白或莫內(nèi)林的口香糖。美國專利第4,412,984號公開了含竹芋蛋白或莫內(nèi)林的加味增效的口服組合物。然而，盡管其具有低卡路里甜味劑的優(yōu)勢，但由于它對熱和pH的不穩(wěn)定性、獲取供應(yīng)植物來源的缺乏以及作為食品添加劑時調(diào)配方式的不確定性，使得廣泛地商業(yè)應(yīng)用受到阻礙(Dansby，NatureBiotechnology，1997，15419-420)。
1989年，Sung-Hou Kim研究組報道通過基因工程在大腸桿菌內(nèi)生產(chǎn)單鏈莫內(nèi)林(Kim等，蛋白工程1989，2571-575)。發(fā)現(xiàn)純化的單鏈莫內(nèi)林對熱更穩(wěn)定并且能耐受較寬的pH范圍，而且保留了甜度。本發(fā)明的數(shù)個方面已經(jīng)成為某些美國專利的主題。例如，美國專利第5,234,834號公開了在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)單鏈莫內(nèi)林的構(gòu)成。美國專利第5,487,923號公開了分子式為B-C-A的甜蛋白化合物，其中B代表一個肽部分，與天然莫內(nèi)林B鏈的1-46殘基至少有90％的同一性并僅由保守取代基修飾；C是一個共價鍵，或是一個親水的、生理學(xué)可接受的、能夠提供相當(dāng)于1-10個氨基酸肽空間長度的共價連接單元，所選的氨基酸駐留在分子的外部而不干擾天然的構(gòu)型；A代表一個與天然莫內(nèi)林A鏈的6-45殘基至少90％一致并僅由保守取代基修飾的肽。美國專利第5,487,983號公開了一個制造美國專利第5,487,923號所公開的單鏈莫內(nèi)林的表達(dá)系統(tǒng)。美國專利第5,670,339號公開了編碼美國專利第5,487,923號所公開的單鏈莫內(nèi)林的DNA。美國專利第5,672,372號公開了用美國專利第5,487,923號所公開的單鏈莫內(nèi)林增加食物復(fù)合物甜味的方法。美國專利第5,264,558號公開了一個單鏈莫內(nèi)林蛋白，在標(biāo)準(zhǔn)的味覺測試中，以重量為單位至少是蔗糖的50倍。
最近，Kondo等，自然生物技術(shù)學(xué)，1997，15453-457公開了在念珠屬酵母細(xì)胞內(nèi)單鏈莫內(nèi)林蛋白的異源表達(dá)。它報道莫內(nèi)林可高水平表達(dá)，穩(wěn)定蛋白占＞50％。
2.2.在PICHIA PASTORIS中異源蛋白的表達(dá)甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris已被用作蛋白表達(dá)系統(tǒng)。此表達(dá)系統(tǒng)的數(shù)個方面已經(jīng)成為某些美國專利的主題。如，美國專利第4,837,148號公開了Pichia pastoris的自主復(fù)制序列。美國專利第4,855,231號公開了在Pichia pastoris細(xì)胞內(nèi)異源基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)。美國專利第4,882,279號公開了Pichia pastoris的位點選擇性基因組修飾。美國專利第4,929,555號公開了使Pichia pastoris全細(xì)胞處于感受態(tài)以便轉(zhuǎn)化的方法。美國專利第5,122,465號公開了在Pichia pastoris菌株中產(chǎn)生可選擇表型的步驟。美國專利第5,324,639號公開了在甲基營養(yǎng)細(xì)胞，包括Pichia pastoris細(xì)胞內(nèi)，胰島素樣生長因子-1的生產(chǎn)。
數(shù)個信號序列已被用于引導(dǎo)在Pichia pastoris細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的異源蛋白的分泌。這些信號序列的實例包括但不限于，Pichia pastoris酸性磷酸酶的信號序列、巨曲霉α-帚曲菌素的信號序列(Martinez-Ruiz等，Protein Expr.Purif.，1998，12(3)315-22；Abdulaev等，ProteinExpr.Purif.，1997，10(1)61-9；Kotake等，J.Lipid Res.，1996，37(3)599-605)、α-t-N-乙酰半乳糖胺酶的信號序列(alphaNAGAL，EC 3.2.1.49)(Zhu等，Arch.Biochem.Biophys.，1998，352(1)1-8)、OmpA蛋白的信號肽(Heim等，Biochim.Biophys.Acta.，1998，1396(3)306-19)、鼠α-因子信號(cCel1)的信號序列或胡椒內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶的天然信號序列(Ferrarese等，F(xiàn)EBS Lett.，1998，422(1)23-6)、從木質(zhì)溶解的霉菌Trametes中分離的蟲漆酶的信號肽(Jonsson等，Curr Genet.，1997，32(6)425-30)、鼠溶酶體酸性α-甘露糖苷酶的信號肽(Merkle等，Biochim.Biophys.Acta.，1997，1336(2)132-46)、豬碳酸酐酶抑制劑的信號肽(Wuebbens等，生物化學(xué)，1997，36(14)4327-36)、awamori曲霉菌葡糖淀粉酶的信號序列(Fierobe等，Protein Expr.Purif，1997，9(2)159-70)、鼠主要尿蛋白的信號序列(Ferrari等，F(xiàn)EBS Lett，1997，401(1)73-7)、pho 1的信號序列(Skory等，Curr.Genet.，1996，30(5)417-22)、兔血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的信號序列(Sadhukhan等，生物化學(xué)雜志，1996，271(31)18310-3)、Pichia pastoris天冬氨酸蛋白酶的前肽序列(Tsujikawa等，酵母，1996，12(6)541-53)、Pichia pastorisPRCl的信號序列(Ohi等，酵母，1996，12(1)31-40)、細(xì)菌熱穩(wěn)定α-淀粉酶的信號序列和來自釀酒酵母的SUC2基因信號序列(Paifer等，酵母，1994，10(11)1415-9)和釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號序列(Fidler等，J.Mol.Endocrinol.，1998，21(3)327-336)。
盡管甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris已被成功地用于產(chǎn)生各種異源蛋白，但美國專利第5,324,639號指出，以目前對甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)系統(tǒng)的了解水平，很難預(yù)測給定基因是否能在這種酵母中表達(dá)至適當(dāng)?shù)乃交蛟摻湍杆拗魇欠窨赡褪芷浼?xì)胞內(nèi)存在重組基因產(chǎn)物。美國專利第5,324,639號進(jìn)一步指出，特別困難的是預(yù)見一個特定蛋白是否可被甲基營養(yǎng)酵母宿主分泌，以及假如可分泌，以何效率分泌。例如，Vollmer等，免疫學(xué)方法雜志，1996，199(1)47-54,報道當(dāng)人sIL-6R的323個氨基酸殘基插入適合于甲基營養(yǎng)酵母Pichiapastoris的表達(dá)/分泌載體時，未觀察到可測定的重組蛋白的表達(dá)和分泌。至今，莫內(nèi)林尚未用Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和分泌過。
基于商業(yè)應(yīng)用莫內(nèi)林的強(qiáng)烈興趣，迫切需要更有效的方法以生產(chǎn)穩(wěn)定的莫內(nèi)林，它仍保留其天然甜度且簡化下游的純化步驟。本發(fā)明著眼于本領(lǐng)域內(nèi)的這些和其他需求。此上引用的文獻(xiàn)不應(yīng)被解釋為承認(rèn)這些文獻(xiàn)內(nèi)容是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及一個分離的核酸，該核酸包括一個編碼嵌合蛋白的核苷酸序列，所述的嵌合蛋白從N末端到C末端包括a)第一肽基片段，其由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成，其中百同一性分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)一個肽基鍵，或第二肽基片段，其由1-12個氨基酸組成；和c)第三肽基片段由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的，其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的且一定量的所述嵌合體蛋白至少比等量蔗糖甜100倍，在所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。優(yōu)選地，分離的核酸進(jìn)一步編碼一個能夠在Pichia pastoris內(nèi)引導(dǎo)蛋白表達(dá)的啟動子，和/或能夠引導(dǎo)所編碼的嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。
本發(fā)明也涉及一個含上述核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)嵌合體蛋白的方法，包括培養(yǎng)含上述核酸的重組Pichiapastoris細(xì)胞以使編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，及回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。最后，本發(fā)明涉及上述方法的產(chǎn)物。
4.附圖的簡要說明圖l顯示重組單鏈莫內(nèi)林蛋白的氨基酸序列和編碼重組單鏈莫內(nèi)林蛋白的DNA序列。氨基酸殘基1-50相當(dāng)于天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基；氨基酸殘基51是作為連接單元的甘氨酸；氨基酸殘基52-96相當(dāng)于天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基。
圖2顯示用于合成重組單鏈莫內(nèi)林蛋白的DNA寡聚體序列。
圖3顯示每個DNA寡聚體在合成的莫內(nèi)林DNA中的位置和其酶消化位點。
圖4顯示重組莫內(nèi)林蛋白表達(dá)載體pGWYS1的限制圖譜。
圖5顯示pGWYS1的構(gòu)建。
圖6顯示從培養(yǎng)基中分離的分泌的重組莫內(nèi)林蛋白的SDS-PAGE分析。
圖7顯示分泌的重組莫內(nèi)林蛋白的純化步驟。
5.本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一個編碼單鏈莫內(nèi)林樣蛋白的核酸，該蛋白是穩(wěn)定的且以重量為基礎(chǔ)至少比蔗糖甜100倍。優(yōu)選地，該核酸進(jìn)一步包括一個啟動子和信號序列，以在甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris中引導(dǎo)編碼的莫內(nèi)林樣蛋白的表達(dá)和分泌。本發(fā)明也提供了一個含編碼莫內(nèi)林樣蛋白的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，由重組Pichia pastoris生產(chǎn)莫內(nèi)林樣蛋白的方法和該方法的產(chǎn)物。
為闡明本公開，但并不作為限制，本發(fā)明的詳細(xì)描述分成下面的分部分。
5.1.編碼單鏈莫內(nèi)林蛋白的核酸本發(fā)明提供了一個包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，所述的嵌合體蛋白從N末端到C末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第一個肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)一個肽基鍵，或由1-12個氨基酸組成的第二個肽基片段；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第三個肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的，其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的且一定量的所述嵌合體蛋白至少比等量蔗糖甜100倍，在所述的核酸中，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第一個肽基片段由與天然莫內(nèi)林B鏈至少60％同一性的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，第一個肽基片段由與天然莫內(nèi)林B鏈至少90％同一性的氨基酸序列組成。更優(yōu)選地，第一個肽基片段由天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基組成。
在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第二個肽基片段由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO1)組成。優(yōu)選地，第二個肽基片段由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)組成。更優(yōu)選地，第二個肽基片段由氨基酸殘基Gyl組成。
仍然在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第三個肽基片段由與天然莫內(nèi)林A鏈至少60％同一性的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，第三個肽基片段由與天然莫內(nèi)林A鏈至少90％同一性的氨基酸序列組成。更優(yōu)選地，第三個肽基片段由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基組成。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一個包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第一個肽基片段由天然莫內(nèi)林B鏈的l-50氨基酸殘基組成，第二個肽基片段由氨基酸殘基Gly組成，第三個肽基片段由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基組成。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，該蛋白可被抗莫內(nèi)林或抗竹芋蛋白抗體免疫反應(yīng)地結(jié)合。
在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中嵌合體蛋白進(jìn)一步包括一個可引導(dǎo)所述嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。優(yōu)選地，分泌引導(dǎo)序列是Pichia pastoris的內(nèi)源性信號序列。更優(yōu)選地，內(nèi)源性信號序列選自Pichia pastoris酸性磷酸酶、Pichia pastoris天冬氨酸蛋白酶和由Pichia pastoris PRC1編碼的Pichia pastoris羧肽酶Y的信號序列。此外可選擇地，分泌引導(dǎo)序列是一個酵母信號序列，其中所述的酵母不是Pichia pastoris。優(yōu)選地，酵母信號序列是來自釀酒酵母的信號序列。更優(yōu)選地，釀酒酵母信號序列選自釀酒酵母SUC2和釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號序列。最優(yōu)選地，釀酒酵母信號序列是釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號序列。其它可用于本發(fā)明的分泌引導(dǎo)序列包括但不限于，巨曲霉α-帚曲菌素、α-N-乙酰半乳糖胺酶、OmpA蛋白、鼠α-因子(cCel1)、胡椒內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶、從溶木真菌Trametes中分離的蟲漆酶、鼠溶酶體酸性α-甘露糖苷酶、豬碳酸酐酶抑制劑、awamori曲霉菌葡糖淀粉酶、鼠主要尿蛋白、pho1、兔血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和細(xì)菌熱穩(wěn)定α-淀粉酶的信號序列。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，該核酸是DNA。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個分離核酸，它可與編碼嵌合體蛋白的DNA序列雜交。仍然在另一個特定的實施例中，本發(fā)明提供了一個與包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離核酸。
在一個特定的實施例中，本發(fā)明提供了一個編碼嵌合體蛋白的DNA，該DNA進(jìn)一步包括一個可在Pichia pastoris中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是Pichia pastoris的內(nèi)源性啟動子。更優(yōu)選地，內(nèi)源性啟動子是Pichia pastoris甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)的啟動子。另外，雖然不是優(yōu)選，但也可應(yīng)用甲基營養(yǎng)酵母中甲醇應(yīng)答基因的啟動子。這種甲醇應(yīng)答啟動子的實例包括但不限于，來自Pichiapastoris AOX1的一級乙醇氧化酶基因的啟動子、來自Pichia pastorisAOX2的二級乙醇氧化酶基因的啟動子、來自Pichia pastoris(DAS)的二羥丙酮合成酶基因的啟動子、來自Pichia pastoris的P40基因的啟動子、來自Pichia pastoris的過氧化氫酶基因的啟動子，等(見美國專利第5,324,639號)。
在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個編碼嵌合體蛋白的DNA，該DNA進(jìn)一步包括令其在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制和選擇的序列。以此方式，大量DNA片段可通過細(xì)菌內(nèi)復(fù)制而生產(chǎn)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一個編碼嵌合體蛋白質(zhì)的DNA，其中在編碼的嵌合體蛋白內(nèi)，第一個肽基片段由天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基組成，第二個肽基片段由氨基酸殘基Gly組成，第三個肽基片段由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基組成，并且所述的DNA進(jìn)一步包括Pichia pastoris GAP的啟動子和釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號序列。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一個編碼嵌合體蛋白的DNA，其中使用被Pichia pastoris細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一個編碼嵌合體蛋白的DNA，其中DNA分子包括如

圖1中描述的核苷酸序列或如圖4中描述的DNA載體。
包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸，或其任何片段、類似物或其衍生物，可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法獲得。核酸可被整個地化學(xué)合成。另外可選擇地是，編碼嵌合體蛋白每個片段，即第一、第二或第三肽基片段的核酸可通過分子克隆獲得，或從所需細(xì)胞內(nèi)純化。然后，編碼嵌合體蛋白每個片段的核酸可被化學(xué)地或酶聯(lián)地連接在一起，以形成包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸，或其任何片段、類似物或其衍生物。
任何Dioscoreophyllum comminisii細(xì)胞潛在地可作為核酸的來源以分離編碼莫內(nèi)林的核酸。另外可選擇地是，編碼莫內(nèi)林的核酸可根據(jù)圖1中描述的天然莫內(nèi)林氨基酸序列設(shè)計和合成(也見美國專利第5,478,923號)。
DNA可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的方法從克隆的DNA(如DNA“文庫”)中通過化學(xué)合成、cDNA克隆、或通過基因組DNA或其片段的克隆獲得，從所需要的細(xì)胞中純化(見，例如，Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.(編)，1985，DNA克隆研究實踐，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.I，II.)來源于基因組DNA的克隆除密碼子區(qū)域外，可含有調(diào)控和內(nèi)含子DNA區(qū)域；來自cDNA的克隆應(yīng)僅含外顯子序列。無論其來源，基因應(yīng)分子地克隆進(jìn)一個適合的載體以傳播基因。
在從cDNA來源的基因分子克隆中，cDNA是用本領(lǐng)域熟知的方法從總細(xì)胞RNA或mRNA中產(chǎn)生的?；蛞部蓮幕蚪MDNA中獲得，在產(chǎn)生DNA片段時(如用限制性酶或通過機(jī)械剪切)，其中一些可編碼所需的基因。然后線性DNA片段可按照大小采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行分離，包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析。
一旦包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸、或其任何片段、類似物或其衍生物被獲得，其同一性可通過核酸測序(用本領(lǐng)域熟知的任何方法)而確定并與已知的序列比較。DNA序列分析可用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于Maxam和Gilbert的方法(Maxam和Gilbert，1980，Meth.Enzymol.，65499-560)，Sanger雙脫氧方法(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，745463)，應(yīng)用T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，美國專利第4,795,699號)，應(yīng)用一個自動DNA測序儀(如Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，或PCT出版物WO97/15690中描述的方法。
與包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸、或其任何片段、類似物或其衍生物雜交的核酸，可在低、高或中度嚴(yán)格的條件下通過核酸雜交分離(也見Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，786789-6792)。
如這里所用的，“穩(wěn)定”是指聲明的單鏈莫內(nèi)林嵌合體蛋白在置于約4℃至少6個月、或約60℃至少2.5小時、或約100℃至少5分鐘后保留其至少70％的甜度。此外，“穩(wěn)定”是指聲明的單鏈莫內(nèi)林嵌合體蛋白在置于pH范圍約2.0-約11.0至少6小時后保留其至少70％的甜度。
聲明的單鏈莫內(nèi)林嵌合體蛋白的甜度可用本領(lǐng)域已知的普通味覺試驗測定。例如，在重量基礎(chǔ)上通過適度稀釋比較蔗糖的甜度(也見美國專利第5,478,923號)。
優(yōu)選的被酵母細(xì)胞利用的密碼子可用本領(lǐng)域已知的方法測定，如在Sharp等，核酸研究，1986,14(13)5125-43和Li和Luo，J.Theor.Biol.，1996，181(2)111-24中公開的方法。根據(jù)Sharp的方法，酵母中優(yōu)選密碼子的重要特征包括與tRNA多度相關(guān)、第三堿基嘧啶較大程度的偏差和較小的A+T堿基對傾向。Li和Luo公開了分類和預(yù)測大腸桿菌和酵母細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平的方法，其稱為自身相容的信息聚類(SCIC)。采用改良的密碼子采納指數(shù)(CAI)值，Li和Luo完成了對大腸桿菌和酵母中堿基組成、堿基相關(guān)和基因表達(dá)水平間關(guān)系的線性回歸分析。Li和Luo還提出了表達(dá)增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)位點(EENS)的假設(shè)，該假設(shè)的存在可通過基因表達(dá)和一個密碼子內(nèi)、相鄰密碼子內(nèi)和非相鄰密碼子內(nèi)堿基相關(guān)之間的線性方程來顯示。此外，可應(yīng)用已成功地用于在Pichia pastoris細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白的密碼子。這些密碼子的實例可見于美國專利第4,837,148號；美國專利第4,855,231號；美國專利第4,882,279號；美國專利第4,929,555號；美國專利第5,122,465號；美國專利第5,324,639號；Martinez-Ruiz等，Protein Expr.Purif.，1998，12(3)315-22；Abdulaev等，Protein Expr.確良Purif.，1997，10(1)61-9；Kotake等，J.Lipid Res.，1996，37(3)599-605；Zhu等，Arch.Biochem.Biophys.，1998.352(1)1-8；Heim等，Biochim.Biophys.Acta.，1998，1396(3)306-19；Ferrarese等，F(xiàn)EBS Lett.，1998，422(1)23-6；Jonsson等，Curr.Geneet，1997，32(6)425-30；Merkle等，Biochim.Biophys.Acta.，1997，1336(2)132-46；Wuebbens等，生物化學(xué)，1997，36(14)4327-36；Fierobe等，Protein Expr.Purif.，1997，9(2)159-70；Ferrari等，F(xiàn)EBS Lett.，1997，401(1)73-7；Skory等，Curr.Genet.，1996，30(5)417-22；Sadhukhan等，生成物化學(xué)雜志，1996，271(31)；18310-3；Tsujikawa等，酵母，1996，12(6)；541-53；Ohi等，酵母，1996，12(1)31-40；Paifer等，酵母，1994，10(11)1415-9；Fidler等，J.Mol.Endocrinol.，1998，21(3)327-336；和Brocca等，蛋白科學(xué)，1998，7(6)1415-22。
一個嵌合體蛋白是否能夠被抗莫內(nèi)林或抗竹芋蛋白抗體免疫反應(yīng)地結(jié)合可用本領(lǐng)域已知的方法確定。可用于本發(fā)明的抗莫內(nèi)林或抗竹芋蛋白抗體的實例包括但不限于下面公開的抗體，Slootstra等，Chem.Senses，1995.20(5)535-43；Antonenko和Zanetti，生命科學(xué)，1994，55(15)187-92；Bodani等，雜交瘤，1993，12(2):177-83；Mandal等，雜交瘤，1991，10(4)459-66和Haimovich，Isr.J.Med.Sci.，1975，11(11)1183。
5.2.來自重組PICHIA PASTORIS細(xì)胞的莫內(nèi)林蛋白的產(chǎn)生在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一個含編碼嵌合體蛋白的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，所述的嵌合體蛋白從N末端到C末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第一個肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)一個肽基鍵，或由1-12個氨基酸組成的第二個肽基片段；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第三個肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的，其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的且一定量的所述嵌合體蛋白至少是等量蔗糖的100倍甜，在其中所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選地使用的密碼子。優(yōu)選地，重組Pichia pastoris細(xì)胞含一個包括圖1中描述的核苷酸序列或圖4中描述的DNA載體的DNA分子。也提供了包含4.1節(jié)中公開的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化甲基營養(yǎng)酵母如Pichia pastoris的方法，及可應(yīng)用的培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域通常知道的，該酵母細(xì)胞的基因組中含有編碼異源蛋白的基因。優(yōu)選地，公開于美國專利第4,837,148號、美國專利第4,855,231號、美國專利第4,882,279號、美國專利第4,929,555號、美國專利第5,122,465號和美國專利第5,324,639號的轉(zhuǎn)化、陽性轉(zhuǎn)化物選擇和培養(yǎng)方法可用于本發(fā)明。
在另一個特定的的實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生莫內(nèi)林嵌合體蛋白的方法，包括培養(yǎng)含有4.1節(jié)公開的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使該細(xì)胞表達(dá)和分泌編碼的嵌合體蛋白，以及回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。優(yōu)選地，應(yīng)用含有DNA分子的重組Pichia pastoris細(xì)胞，該DNA分子包括如在圖1中所述的核苷酸酸序列或如圖4中所述的DNA載體。
在本方法中可使用本領(lǐng)域中任何合適的發(fā)酵方法。為了在如Pichiapastoris的甲基營養(yǎng)酵母中，大規(guī)模生產(chǎn)被GAP啟動子驅(qū)動的重組DNA為基礎(chǔ)的產(chǎn)物，優(yōu)選采用一個三期、高細(xì)胞密度的批量飼養(yǎng)發(fā)酵系統(tǒng)。在這個發(fā)酵系統(tǒng)的第一期或生長期中，表達(dá)宿主Pichia pastoris細(xì)胞在限定的極限培養(yǎng)基如BMGY(緩沖的極限甘油復(fù)合培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)，其中非誘導(dǎo)性的碳源(如甘油)是過量的。當(dāng)表達(dá)宿主Pichiapastoris細(xì)胞在這樣的碳源中生長時，異源基因表達(dá)被抑制，使得在缺乏異源蛋白表達(dá)的情況下產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)。在此生長期中，也優(yōu)選培養(yǎng)基的pH維持在大約5。下一步，表達(dá)宿主Pichia pastoris細(xì)胞在限制性非誘導(dǎo)性碳源中短時間生長以進(jìn)一步增加細(xì)胞團(tuán)，并抑制葡萄糖應(yīng)答啟動子。在此限制生長期，培養(yǎng)基的pH保持在4以下，優(yōu)選在大約2.0到大約3.5的范圍。最后一期是生產(chǎn)期，其中可以使用“過量葡萄糖批量飼養(yǎng)模式”或“混合培養(yǎng)批量飼養(yǎng)模式”。在“過量葡萄糖批量飼養(yǎng)模式”中，單獨加入2％葡萄糖。在“混合培養(yǎng)批量飼養(yǎng)模式”，在發(fā)酵罐中加入限量的非誘導(dǎo)性碳源和葡萄糖，以誘導(dǎo)由GAP啟動子驅(qū)動的莫內(nèi)林基因的表達(dá)。
分泌的莫內(nèi)林嵌合體蛋白可以從Pichia pastoris培養(yǎng)基中通過任何本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，美國專利第3,878,184號和第3,998,798號；Morris和Cagan，Biochim.Biophys.Acta，1972，261114-122；Kim等，蛋白工程(Protein Eng.)，1989，2571-575；和最近Kondo等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，1997，15453-457中公開的方法可用于回收和分離分泌的莫內(nèi)林嵌合體蛋白。優(yōu)選地，表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白采用包括離子交換層析的方法進(jìn)行回收。更優(yōu)選地，表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白采用包括CM-Sephadex柱層析或DEAE-Sephadex柱層析的方法進(jìn)行回收。
在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了上述方法的產(chǎn)物。
6.實施例6.1合成的重組莫內(nèi)林DNA的制備重組莫內(nèi)林蛋白的氨基酸序列和編碼重組莫內(nèi)林蛋白的DNA核苷酸序列在圖1中顯示。如在圖1中所示，核苷酸1-150編碼天然莫內(nèi)林蛋白B鏈的1-50殘基；核苷酸150-152編碼作為連接“L”部分的甘氨酸；核苷酸153-287編碼天然莫內(nèi)林蛋白A鏈的1-45殘基。重組莫內(nèi)林蛋白由下列氨基酸序列作為前導(dǎo)，該氨基酸序列對應(yīng)于一個蛋氨酸(Met)殘基和釀酒酵母雜交信息素α因子的信號序列Met-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-Ile-Ala-Ser-Ile-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe(SEQ IDNO3)。
這種編碼釀酒酵母雜交信息素α因子信號序列的合成DNA和重組莫內(nèi)林蛋白是由寡聚M1-M4和N1-N4制備的，這些寡聚體是采用ACTG公司的Applied Biosystems 380B DNA合成儀合成的(見圖2-3和5)。寡聚體用尿素一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并經(jīng)過一個Sep-pak C18柱(Whatman)純化，如圖3所示退火和連接，以獲得被EcoRI位點分段的合成DNA。
為合成編碼釀酒酵母雜交信息素α因子信號序列的合成DNA和重組莫內(nèi)林蛋白，在100μl PCR反應(yīng)體積中，寡聚體M2到N3各2pM與10pM的寡聚體M1和N4混合，在缺乏Tag DNA聚合酶的情況下加熱到94℃ 5分鐘。然后反應(yīng)混合物緩慢冷卻到37℃。在加入1單位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs公司)后，PCR反應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行。100微升PCR反應(yīng)混合物含50mM Tris-HCl(pH8.0)、2.5mMMgCl2、10mM DTT、1mM dNTP和1單位Vent DNA聚合酶。PCR反應(yīng)按如下步驟進(jìn)行每次循環(huán)94℃ 1分鐘，53℃ 1.5分鐘，72℃ 2分鐘；總共30個循環(huán)。最后，反應(yīng)混合物在72℃孵育10分鐘。反應(yīng)混合物用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，用1.2％低熔點瓊脂糖凝膠純化。純化的DNA片斷被插入到pT7bleu(R)載體(Novagen公司)中產(chǎn)生pT7yM質(zhì)粒(見圖5)。在20μl DNA連接反應(yīng)體系中，加入2μl 10mMATP、40單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司)，與1μg純化的莫內(nèi)林DNA片斷和50ng pT7blue(R)載體混合。反應(yīng)混合物在16℃保溫16小時。在200μl大腸桿菌NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞中添加5μl連接混合物而將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞(Messing，酶學(xué)方法，1983，10120-78)，所需的序列通過采用T7和U19啟動子進(jìn)行雙脫氧序列分析而確定(Sanger等，Proc.Natl.Acad..Sci.，1985.745463-5467)。
6.2表達(dá)載體pGWYS-1的制備pGAPZa表達(dá)載體從Invitrogen公司購買。合成的莫內(nèi)林DNA片斷用EcoRI從pT7yMenallin中移出，并插入到pGAPZa載體的EcoRI位點中以得到pGWYS。簡言之，5μg純化的pT7yMenallin質(zhì)粒在20μl反應(yīng)體積中，用5單位EcoRI(Promega公司)在37℃消化2小時。反應(yīng)混合物用1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離后，合成的莫內(nèi)林DNA片斷用Wizard PCR Preps DNA純化試劑盒(Promega公司)進(jìn)行純化。100ng純化的莫內(nèi)林DNA片斷用于連接進(jìn)pGAPZa表達(dá)載體中。在10μl連接反應(yīng)體系中，50ng EcoRI消化的pGAPZa載體與100ng純化的莫內(nèi)林DNA片斷混合。連接反應(yīng)在存在10μl 20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mMMgCl2、10mM DTT和200單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司)的情況下，在16℃過夜進(jìn)行，以得到pGWYS。連接混合物被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TOP10F’細(xì)胞(Invitrogen公司)中。挑選出20個抗Zeocin的克隆，用α因子(5’CTATTGCCAGCATTGCTGC3’)(SEQ ID NO4)和N4寡聚體通過PCR反應(yīng)篩查插入起始端。每個挑選的克隆轉(zhuǎn)移到含200μg/ml Zeocin的3毫升LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩孵育過夜。重組質(zhì)粒pGWYS采用Qiagen Tip20試劑盒系統(tǒng)(Qiagen公司)從1.5ml培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中制備。50ng純化的pGWYS質(zhì)粒被用作PCR模板以確定插入起始端。在25μl PCR反應(yīng)體系中，在存在1單位Taq DNA聚合酶(Promega公司)的情況下，50ng pGWYS質(zhì)粒與2.5pMα因子和N4寡聚體混合。PCR反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行每個循環(huán)94℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃ 2分鐘；總共40個循環(huán)。最后，反應(yīng)混合物72℃孵育10分鐘。PCR反應(yīng)混合物在1.2％瓊脂糖凝膠上分離后，含所需起始端的插入物的克隆之一被命名為pGWYS-1。插入物的序列進(jìn)一步通過DNA測序確定。
6.3用pGWYS-1轉(zhuǎn)化Pichia pastoris細(xì)胞為在Pichia pastoris中得到莫內(nèi)林高水平和穩(wěn)定的表達(dá)，純化的pGWYS-1質(zhì)粒用II型電穿孔儀(Electroporation Apparatus II)(Invitrogen公司)，按照Pichia pastoris表達(dá)試劑盒說明書所述的電穿孔技術(shù)，轉(zhuǎn)化進(jìn)Pichia pastoris細(xì)胞中。簡言之，500ml Pichia pastorisGS115細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中在30℃生長，至OD600達(dá)1.3。細(xì)胞在4℃經(jīng)1,500g離心5分鐘沉淀。沉淀細(xì)胞用500ml冰冷無菌水沖洗。分別用250ml和20ml冰冷無菌水重復(fù)沖洗步驟。然后，細(xì)胞用20ml冰冷的1M山梨醇沖洗，并懸浮于1ml冰冷的山梨醇中。在1M山梨醇中的酵母GS115細(xì)胞40μl與10μg純化的pGWYS-1質(zhì)粒混合至總體積50μl，混合物被轉(zhuǎn)移進(jìn)冰冷的透明試管中。含有混合物的透明試管冰浴5分鐘。根據(jù)II型電穿孔儀(Invitrogen公司生產(chǎn))操作參數(shù)進(jìn)行電穿孔。電脈沖之后，試管中加入1ml冰冷的1M山梨醇，并將試管的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到微量離心管中。200μl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于一個含400μg/ml Zeocin的5RDB培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板在30℃孵育直至集落出現(xiàn)。陽性轉(zhuǎn)染體以在各種濃度Zeocin存在的情況下生長為特征，如400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml。
6.4陽性轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性檢測選出三個陽性轉(zhuǎn)化體，根據(jù)其在存在800μg/ml Zeocin情況下的生長和在2％葡萄糖誘導(dǎo)下重組莫內(nèi)林的表達(dá)，進(jìn)一步確定特性。下面的實驗用于檢測其遺傳穩(wěn)定性。用無菌牙簽挑出這3個陽性轉(zhuǎn)化體的每一個，不加任何選擇在YPD培養(yǎng)板上30℃孵育，直至集落出現(xiàn)。挑出這些集落，置于新的YPD培養(yǎng)板上直至新的集落出現(xiàn)。在這種非選擇性的生長重復(fù)50次后，每個傳代集落在含有800μg/ml Zeocin的選擇性培養(yǎng)板上孵育。在2％葡萄糖誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)用SDS-PAGE進(jìn)行分析。在YPD培養(yǎng)板上傳代50次后，所有三個陽性轉(zhuǎn)化體顯示與源集落同樣的表現(xiàn)型。
6.5重組莫內(nèi)林蛋白的生產(chǎn)每個在5.4中選擇的三個陽性轉(zhuǎn)化體在置于5升燒瓶中的1升YPD培養(yǎng)基中，在30℃生長，并進(jìn)行強(qiáng)烈振蕩(250rpm)。分別在24、48和72小時后，從培養(yǎng)瓶中獲取2ml上清液。每個時間點收集的樣品5μl用15-20％梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。分泌的重組莫內(nèi)林被觀察到是12kD的蛋白帶。采用密度計(Densitometer)(Molecular Dynamic公司)進(jìn)行的SDS-PAGE定量分析顯示陽性菌株之一產(chǎn)生接近10克/升的分泌重組單鏈莫內(nèi)林。這個菌株被命名為GWyS1。
6.6分泌的重組莫內(nèi)林蛋白的純化采用蛋白質(zhì)方法純化從GwyS-1酵母菌株中分泌的重組莫內(nèi)林。根據(jù)第一個方法，培養(yǎng)72小時后，通過在12,000rpm(17,000g)離心收集上清液。收集后，上清液的pH采用0.1N NaOH溶液調(diào)節(jié)至6.8。1MNaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)以1∶100(v/v)加入到上清液中，并充分混合。然后將上清液裝于用0.01M NaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)溶液預(yù)平衡的CM-Sephadex柱(Phamacia公司)上。用5倍柱體積的0.01MNaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)溶液沖洗柱后，用0.3MNaCl-0.01MNaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)溶液洗脫重組莫內(nèi)林。在用水透析后，蛋白的純度通過凝膠電泳確定為大約98％。
根據(jù)第二個方法，培養(yǎng)72小時后，通過在12,000rpm(17,000g)離心收集上清液。收集后，上清液的pH采用0.1N NaOH溶液調(diào)節(jié)至大約7.2。1M NaCl-1M NaH2PO4-Na2HPO4(pH7.2)以1∶100(v/v)加入到上清液中，并充分混合。然后將上清液裝于用1MNaH2PO4-Na2HPO4(pH7.2)-1M NaCl溶液預(yù)平衡的DEAE-Sephadex柱(Phamacia公司)上。收集流動相并用水透析。蛋白的純度通過凝膠電泳確定為大約98％。
按照任一方法純化的重組莫內(nèi)林蛋白進(jìn)一步凍干成干粉，以測定其甜度。
6.7甜度和穩(wěn)定性檢測純化的重組莫內(nèi)林的甜度采用普通的味覺實驗進(jìn)行檢測。通過以重量為基礎(chǔ)的適當(dāng)稀釋進(jìn)行與蔗糖甜度的對比。在經(jīng)典的實驗中，1、10、25和50mg/ml的蔗糖水溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。比較純化的重組莫內(nèi)林蛋白和蔗糖能夠產(chǎn)生甜味的最小重量。本發(fā)明的重組莫內(nèi)林需要添加的量大約比蔗糖少1000倍。例如，50ng/ml重組莫內(nèi)林蛋白溶液與50mg/ml蔗糖(Lucky超市的Lady Lee牌糖)一樣甜。
以100μg/ml濃度，在pH2.0、4.0、6.3和7.5下溶解天然莫內(nèi)林(Sigma公司)和純化的重組莫內(nèi)林，以檢測穩(wěn)定性。每個樣品加熱到37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃ 15分鐘，并在品嘗前冷卻至室溫。最戲劇性的不同是，天然莫內(nèi)林在pH2.0加熱到50℃時丟失了其甜度，而純化的重組莫內(nèi)林即使在100℃加熱5分鐘仍然保持其甜度。本發(fā)明在范圍上并不受在此描述使用的微生物或特定的的實施方案所限制。實際上，從前面的描述和相關(guān)的圖表，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員可很清楚地對本發(fā)明進(jìn)行除在此描述之外的各種改良。這些改良方案是屬于附加權(quán)利要求范圍之內(nèi)的。
許多文獻(xiàn)在此引用，其公開部分被全部引入作為參考。
權(quán)利要求
1.包含編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離的核酸，所述嵌合體蛋白質(zhì)從N末端到C末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第一個肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)肽基鍵，或由1-12個氨基酸組成的第二個肽基片斷；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第三個肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；其中所述嵌合體蛋白是穩(wěn)定的，且給定劑量的所述嵌合體蛋白質(zhì)至少比相同量的蔗糖甜100倍，并且在所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第一個肽基片斷由與天然莫內(nèi)林B鏈至少有60％同一性的氨基酸序列組成。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第一個肽基片斷由與天然莫內(nèi)林B鏈至少有90％同一性的氨基酸序列組成。
4.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第一個肽基片斷由如圖1所描述的氨基酸殘基1-50(SEQ ID NO5)的天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基組成。
5.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第二個肽基片斷由氨基酸殘基Gly組成。
6.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第二個肽基片斷由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)組成。
7.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第二個肽基片斷由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO1)組成。
8.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第三個肽基片斷由與天然莫內(nèi)林A鏈至少有60％同一性的氨基酸序列組成。
9.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第三個肽基片斷由與天然莫內(nèi)林A鏈至少有90％同一性的氨基酸序列組成。
10.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第三個肽基片斷由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基，如在圖1中所描述的氨基酸殘基52-96(SEQ ID NO5)組成。
11.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，該核酸編碼圖1的氨基酸殘基1-96(SEQ ID NO5)。
12.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述嵌合體蛋白能被抗莫內(nèi)林抗體免疫反應(yīng)結(jié)合。
13.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述嵌合體蛋白能被抗竹芋蛋白抗體免疫反應(yīng)結(jié)合。
14.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述嵌合體蛋白進(jìn)一步包括能夠引導(dǎo)所述的嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列是Pichia pastoris的內(nèi)源性信號序列。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的核酸，其中所述內(nèi)源性信號序列選自Pichia pastoris酸性磷酸酶、Pichia pastoris天冬氨酸蛋白酶和由Pichia pastoris PRC1編碼的Pichia pastoris羧肽酶Y的信號序列。
17.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列是酵母信號序列，其中所述的酵母不是Pichia pastoris。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的核酸，其中所述酵母信號序列來自釀酒酵母信號序列。
19.如權(quán)利要求18所述的分離的核酸，其中所述釀酒酵母信號序列選自釀酒酵母SUC2和釀酒酵母雜交信息素α因子的信號序列。
20.如權(quán)利要求19所述的分離的核酸，其中所述釀酒酵母信號序列是釀酒酵母雜交信息素α因子的信號序列。
21.如權(quán)利要求11所述的分離的核酸，進(jìn)一步包括能引導(dǎo)所述嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列是釀酒酵母雜交信息素α因子的信號序列。
23.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列選自巨曲霉菌α-帚曲菌素、α-N-乙酰半乳糖胺酶、OmpA蛋白、鼠α-因子(cCel1)、胡椒內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶、從溶木真菌Trametes中分離的蟲漆酶、鼠溶酶體酸α-甘露糖苷酶、豬碳酸酐酶抑制劑、awamori曲霉菌葡糖淀粉酶、鼠主要尿蛋白、Pho1、兔血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和細(xì)菌熱穩(wěn)定α-淀粉酶的信號序列。
24.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述的核酸是DNA。
25.包含與權(quán)利要求1所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸。
26.與權(quán)利要求24所述的DNA序列雜交的分離的核酸。
27.如權(quán)利要求24所述的DNA，進(jìn)一步包括能在Pichia pastoris中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的啟動子。
28.如權(quán)利要求27所述的DNA，其中所述啟動子是Pichia pastoris的內(nèi)源性啟動子。
29.如權(quán)利要求28所述的DNA，其中所述內(nèi)源啟動子是Pichiapastoris甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動子。
30.如權(quán)利要求24所述的DNA，所述DNA編碼圖1的氨基酸殘基1-96(SEQ ID NO5)，所述DNA進(jìn)一步包括Pichia pastoris甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動子和釀酒酵母雜交信息素α因子的信號序列。
31.如權(quán)利要求24所述的DNA，其中使用優(yōu)選地被Pichia pastoris細(xì)胞使用的密碼子。
32.包含圖1中所示核苷酸序列的DNA分子。
33.如圖4所示的pGWYS1 DNA載體。
34.含權(quán)利要求1所述核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
35.含權(quán)利要求32所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
36.含權(quán)利要求33所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
37.產(chǎn)生嵌合體蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)含權(quán)利要求1所述核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使得編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，并回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。
38.產(chǎn)生嵌合體蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)含權(quán)利要求32所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使得編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，并回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。
39.產(chǎn)生嵌合體蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)含權(quán)利要求33所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使得編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，并回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白通過包括離子交換層析的方法回收。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所用的離子交換層析是CM-Sephadex柱層析。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所用的離子交換層析是DEAE-Sephadex柱層析。
43.權(quán)利要求37所述方法的產(chǎn)物。
44.權(quán)利要求38所述方法的產(chǎn)物。
45.權(quán)利要求39所述方法的產(chǎn)物。
46.權(quán)利要求40所述方法的產(chǎn)物。
47.權(quán)利要求41所述方法的產(chǎn)物。
48.權(quán)利要求42所述方法的產(chǎn)物。
49.一種嵌合體蛋白，所述的嵌合體蛋白從N-末端到C-末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第一個肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)肽基鍵，或由1-12個氨基酸組成的第二個肽基片斷；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第三個肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的，且給定劑量的所述嵌合體蛋白質(zhì)至少比相同量的蔗糖甜100倍，并在所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個單鏈的莫內(nèi)林樣蛋白,該蛋白是穩(wěn)定的,且以重量為基礎(chǔ)至少比蔗糖甜100倍。本發(fā)明還涉及編碼所述莫內(nèi)林樣蛋白的核酸。優(yōu)選地,此核酸進(jìn)一步包括一個啟動子和一個信號序列,該序列在甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris中引導(dǎo)編碼的莫內(nèi)林樣蛋白的表達(dá)和分泌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含編碼莫內(nèi)林樣蛋白的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞,一個從重組Pichia pastoris中生產(chǎn)莫內(nèi)林樣蛋白的方法及該方法的產(chǎn)物。
文檔編號C12R1/84GK1332802SQ99815165
公開日2002年1月23日 申請日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月31日
發(fā)明者段陵潯 申請人:基因緯生物技術(shù)公司, 段陵潯