專利名稱：Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
該申請(qǐng)要求1998年11月6日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/107,446號(hào)的權(quán)益，該申請(qǐng)通過引用全部結(jié)合到本文中。
1.介紹本發(fā)明涉及基因Nogo，具體涉及其編碼的蛋白產(chǎn)物Nogo以及其衍生物和類似物。也提供Nogo蛋白、衍生物和抗體的產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及治療組合物以及診斷和治療方法。
2.發(fā)明背景在高等脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，損傷后軸突的再生幾乎沒有，并且結(jié)構(gòu)可塑性也有限。與CNS髓磷脂相關(guān)的生長(zhǎng)抑制劑可能起重要作用。單克隆抗體(mAb)-IN-1證明了這一點(diǎn)，IL-1中和有效神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制性髓磷脂蛋白，因此在成年大鼠脊髓損傷或腦損傷后促進(jìn)長(zhǎng)距離軸突再生并增強(qiáng)代償可塑性。
許多體外和體內(nèi)觀察已經(jīng)揭示出神經(jīng)突生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的一個(gè)新方面，即是存在排斥性和抑制性信號(hào)和因子(Keynes和Cook，1995，Curr.Opin.Neurosci.575-82)。這些信號(hào)中的大多數(shù)看來是蛋白質(zhì)或糖蛋白。在鑒定所述因子方面的第一個(gè)突破是雞腦源生長(zhǎng)錐衰弱誘導(dǎo)分子-腦衰蛋白-1的純化和cDNA克隆，該分子現(xiàn)在稱為Semaphorin 3A。
最近純化和克隆的第二組排斥性指導(dǎo)信號(hào)現(xiàn)在命名為Ephrin。它們是Eph受體酪蛋白激酶家族的配體。Ephrin-A5和Ephrin-A2在雞胚視頂蓋中以梯度表達(dá)，其異位表達(dá)或缺失引起向內(nèi)生長(zhǎng)視網(wǎng)膜軸突(retinal axon)的指導(dǎo)錯(cuò)誤。與Semaphorin一樣，Ephrin家族有15-20個(gè)成員，每個(gè)成員均在神經(jīng)系統(tǒng)中和神經(jīng)系統(tǒng)外有復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的表達(dá)。這些分子中的大多數(shù)的功能仍有待分析。
可以排斥生長(zhǎng)軸突并在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的第三組指導(dǎo)信號(hào)是Netrin。Netrin同其C.elegans直向同源物(ortholog)unc-6一樣，已經(jīng)作為早期脊髓連合軸突的底板源化學(xué)引誘物純化出。Netrin-1證明，根據(jù)靶神經(jīng)元生長(zhǎng)錐是存在的受體類型，對(duì)于某些類型的神經(jīng)元具有排斥效應(yīng)(Tessier-Lavigne等，1996，Science 2741123-33)。
先前，Canoni和Schwab報(bào)道了與成年CNS少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓磷脂有關(guān)的有效神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制活性(1988，J.Cell Biol.1061281-1288)。一種主要組分是高分子量的膜蛋白(在大鼠中為NI-250，有一較小組分NI-35)，最近將其純化，它與本發(fā)明的主題相關(guān)，并且被中和性mAb IN-1結(jié)合(Canoni和Schwab，1988，J.Cell Biol.1061281-1288；美國(guó)專利第5,684,133、5,250,414號(hào)；PCT公布號(hào)WO93/00427)。
髓磷脂相關(guān)神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑在防止受損傷CNS軸突的再生中起關(guān)鍵性作用。當(dāng)在雞或大鼠中阻斷少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和髓磷脂形成時(shí)，CNS損傷后的再生許可期延長(zhǎng)。事實(shí)上，髓磷脂的形成與CNS表現(xiàn)出高都結(jié)構(gòu)可塑性和高再生潛力的發(fā)育期結(jié)束同時(shí)發(fā)生。
將IN-1體內(nèi)應(yīng)用于脊髓損害的成年大鼠，誘導(dǎo)長(zhǎng)距離范圍內(nèi)的皮質(zhì)脊髓軸突再生，并且允許運(yùn)動(dòng)和行為功能的恢復(fù)，尤其是與行進(jìn)有關(guān)的功能恢復(fù)，這證明NI-250和NI-35有可能是髓磷脂相關(guān)生長(zhǎng)抑制的主要組分。關(guān)于視神經(jīng)和膽堿能隔-海馬(cholinergic septo-hippocampal)途徑的相似實(shí)驗(yàn)也證明，IN-1識(shí)別的抗原NI-35/250的體內(nèi)相關(guān)性(Schnell和Schwab，1990，Nature 343269-272；Bregman等，1995，Nature 378498-501)。
未損傷的纖維系統(tǒng)也對(duì)IN-1中和神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑應(yīng)答。最近的實(shí)驗(yàn)總結(jié)性地表明，在選擇性皮質(zhì)脊髓束損傷(錐體束切斷術(shù))后，在完整的纖維生長(zhǎng)跨過脊髓和腦干中線，并在NI-1存在中的建立雙側(cè)神經(jīng)分布型，伴隨有精細(xì)運(yùn)動(dòng)幾乎完全的行為恢復(fù)(Z’Graggen等，1998，J.Neuroscience 18(12)4744-4757)。
編碼神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制蛋白的基因的分離，提供了多個(gè)機(jī)會(huì)來開發(fā)可用于神經(jīng)元再生以及用于治療各種神經(jīng)學(xué)疾病包括CNS腫瘤的制品。
上文對(duì)參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)這種參考文獻(xiàn)作為本發(fā)明現(xiàn)有技術(shù)而得到。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及Nogo基因(人、大鼠和牛Nogo和其它物種的Nogo同源物)的核苷酸序列以及它們的編碼蛋白的氨基酸序列及其衍生物(例如片段)和類似物。也提供可與前述核苷酸序列雜交或互補(bǔ)的核酸。在具體實(shí)施方案中，所述Nogo蛋白是大鼠、?；蛉说鞍?。
本發(fā)明也涉及與Nogo相互作用的基因的鑒定方法。
Nogo是本發(fā)明提供的、通過本發(fā)明的方法鑒定的基因，它既編碼神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白，又與神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白相互作用。
本發(fā)明也涉及有功能活性的本發(fā)明的Nogo衍生物和類似物，即它們能夠表現(xiàn)出一種或多種已知的與天然存在的Nogo蛋白相關(guān)的功能活性。例如，已經(jīng)鑒定出氨基酸542-722之間的一個(gè)主要抑制區(qū)。這種功能活性包括但不限于對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制、成纖維細(xì)胞的散布和遷移或表現(xiàn)出腫瘤生長(zhǎng)的任何細(xì)胞、與神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白相互作用或與所述相互作用競(jìng)爭(zhēng)的能力、與抗Nogo抗體結(jié)合(或與Nogo競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合)的能力-抗原性、產(chǎn)生與Nogo結(jié)合的抗體的能力-免疫原性。涉及有潛力誘導(dǎo)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或通過抑制Nogo功能而防止背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱的這些抗體、有能力抑制神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的Nogo功能片段或衍生物。
本發(fā)明還涉及Nogo的片段(和其衍生物和類似物)，所述片段包含一個(gè)或多個(gè)Nogo蛋白結(jié)構(gòu)域，例如酸性和富脯氨酸氨基末端(例如SEQ ID NO2的氨基酸31-58)、高度保守的羧基末端和大鼠Nogo中、也在羧基末端中的35個(gè)氨基酸和36個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的2段疏水序列(例如SEQ ID NO2的氨基酸988-1023和1090-1125)。
另外提供抗各種Nogo的抗體以及Nogo衍生物和類似物。特別是，例如，已經(jīng)衍生出兩種抗體，衍生名為AS472的第一種抗體，用作免疫原，是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸623-640的合成肽；產(chǎn)生了針對(duì)Nogo羧基末端-SEQ ID NO2的氨基酸762-1163的第二種抗體，名為AS Bruna。
也提供了Nogo蛋白、衍生物和類似物的產(chǎn)生方法，例如重組方法。
本發(fā)明也涉及基于Nogo蛋白和核酸的治療和診斷方法和組合物。本發(fā)明的治療化合物包括但不限于Nogo蛋白及其類似物和衍生物(包括片段)；其抗體；編碼Nogo蛋白的核酸、類似物或衍生物；和Nogo核酶或Nogo反義核酸。
本發(fā)明也涉及基于Nogo蛋白和核酸以及抗Nogo抗體的治療和診斷方法和組合物。本發(fā)明可供用于通過給予促進(jìn)Nogo活性的化合物(例如Nogo蛋白和功能活性類似物和衍生物包括其片段；編碼Nogo蛋白的核酸、類似物或衍生物、Nogo激動(dòng)劑)治療CNS和神經(jīng)衍生腫瘤。
本發(fā)明也可供用于通過給予干擾Nogo活性的化合物(例如顯性陰性Nogo衍生物；抗Nogo抗體；Nogo的反義核酸；Nogo核酶或結(jié)合Nogo活性位點(diǎn)的化學(xué)基團(tuán))治療最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害的疾病、紊亂或損害；例如包括但不限于以下的疾病、紊亂或損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)創(chuàng)傷(例如脊髓或腦損傷)、梗塞、感染、惡性腫瘤、暴露于毒性藥物、營(yíng)養(yǎng)缺乏、副腫瘤性綜合征和退行性神經(jīng)病(包括但不限于早老性癡呆、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化和進(jìn)行性supra-nuclear palsy)。
本發(fā)明也提供疾病誘因的動(dòng)物模型、診斷方法和篩選方法以及鑒定和評(píng)價(jià)Nogo激動(dòng)劑和拮抗劑的方法。
3.1定義本文中所用的，以下劃線或斜體標(biāo)注基因名稱應(yīng)該是指基因，相反，其編碼的蛋白產(chǎn)物以無下劃線或斜體的基因名稱表示。例如，“Nogo”應(yīng)該是指Nogo基因，而“Nogo”應(yīng)該是指Nogo基因的蛋白產(chǎn)物。
4.附圖描述

圖1a-1b(a)Nogo cDNA克隆CWP1-3是通過用簡(jiǎn)并寡核苷酸MSC5-8(混合的)和MSC9篩選牛脊髓白質(zhì)cDNA文庫(kù)分離的牛cDNA克隆。由該克隆衍生的互補(bǔ)RNA用于隨后的大鼠cDNA文庫(kù)篩選。Oli3和Oli18是從寡聚d(T)引發(fā)的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞文庫(kù)中分離的。R103U21、RO18U1和RO18U37-3是從六核苷酸引發(fā)的大鼠腦干/脊髓文庫(kù)(Stratagene)中分離的。在CWP1-3和R13U21上顯示了6種牛NI220(bNI220)肽序列的位置。不同外顯子的接點(diǎn)序列在每個(gè)克隆頂部標(biāo)注。RO18U1上顯示的問號(hào)鑒別該克隆上與任何其它Nogo克隆的序列不匹配的序列。RO18U37-3僅從5’端測(cè)序，以虛線表示未測(cè)序的部分。(b)證明產(chǎn)生三種Nogo轉(zhuǎn)錄物的假定機(jī)制的簡(jiǎn)圖。P1和P2代表可變啟動(dòng)子(alternative promoter)的推定位置。需要最少數(shù)目的三種外顯子來產(chǎn)生如圖所示的三種轉(zhuǎn)錄物，盡管每種外顯子可能潛在地被剪接成多個(gè)外顯子。
圖2a-2b(a)Nogo轉(zhuǎn)錄物A的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)(通過將RO18U37-3、Oli18和R1-3U21 cDNA序列連接產(chǎn)生的序列)。橢圓框假定的起始密碼子；以虛線下劃線酸性序列段；□潛在的PKC位點(diǎn)；Δ潛在的酪蛋白激酶II位點(diǎn)；粗下劃線羧基末端疏水區(qū)和潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域；細(xì)下劃線潛在的N-糖基化位點(diǎn)。(b)從大鼠和牛cDNA翻譯的已測(cè)序、純化的牛NI220(bNI220；SEQ ID NO3-8)和相應(yīng)的牛(SEQ ID NO9-14)和大鼠(SEQID NO15-20)序列之間的肽序列比較。與bNI220肽序列不匹配的大鼠和牛氨基酸序列為小寫。
圖3a-3b(a)NSP(人；SEQ ID NO21)、S-REX(大鼠)(SEQ IDNO22)、CHS-REX(雞；SEQ ID NO23)、NOGOBOV(牛；SEQID NO24)、NOGORAT(大鼠；SEQ ID NO25)、C.elegans EST克隆(W06A7A；SEQ ID NO26)和黑尾果蠅(D.melanogaster)EST克隆(US51048；SEQ ID NO27)的羧基末端180個(gè)氨基酸共同區(qū)的氨基酸序列比較。(b)兩個(gè)疏水區(qū)的進(jìn)化保守性。顯示了共同疏水區(qū)內(nèi)和所述共同疏水區(qū)物種間的相似性百分比。細(xì)線框注字母保守氨基酸。
圖4a-4c(a)Nogo共同探針對(duì)各種組織的RNA雜交。所述共同探針含有轉(zhuǎn)錄物A序列的核苷酸2583-4678。ON，視神經(jīng)；SC，脊髓；C，腦皮質(zhì)；DRG，背根神經(jīng)節(jié)；SN，坐骨神經(jīng)；PC12，PC12細(xì)胞系。(b)采用外顯子1特異性探針的脊髓和PC12細(xì)胞RNA的RNA印跡雜交(左圖)以及采用外顯子2特異性探針的后腦(HB)和骨骼肌(M RNA的RNA印跡雜交(右圖)。(c)采用Nogo共同探針的RNA印跡雜交。K，腎；B，軟骨(來自胸骨)；Sk，皮膚；M，骨骼??；Lu，肺；Li，肝；Sp，脾。標(biāo)記了所述三種主要轉(zhuǎn)錄物(4.6千堿基(kb)，2.6kb和1.7kb)。Δ擴(kuò)散但一致的大小約1.3kb條帶。
圖5a-5f成年大鼠脊髓和小腦切片的原位雜交。(a，d)可以觀察到用Nogo反義“共同”核糖核酸探針(riboprobe)標(biāo)記的分別在脊髓和小腦白質(zhì)中的多排少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)。這非常類似于在連續(xù)脊髓切片與反義plop核糖核酸探針雜交時(shí)檢測(cè)到的信號(hào)(b)。(c)也用Nogo反義“共同”核糖核酸探針標(biāo)記灰質(zhì)(GM)中的神經(jīng)元。WM白質(zhì)。分別為用Nogo反義“共同”核糖核酸探針(e)和抗GFAP抗體(f)雙重標(biāo)記的小腦切片的亮視野和熒光圖象。浦肯野細(xì)胞(雙箭頭)用Nogo探針強(qiáng)標(biāo)記，而星形膠質(zhì)細(xì)胞(黑色和白色箭頭)為陰性。也用Nogo探針標(biāo)記了粒細(xì)胞層(Gr)中的少數(shù)細(xì)胞，m分子層。標(biāo)度條a，b，d-f50p.m；c280p.m。
圖6a-6i在出生后不同天數(shù)的視神經(jīng)用或者Nogo或plp(反義或有義)探針的原位雜交(a，fP0；b，gP3；c，hP7；d，e，iP22)。(a-d)Nogo反義探針；(e)Nogo有義探針；(g-i)plp反義探針；(f)plp有義探針?？梢栽谠缰罰0在少突膠質(zhì)細(xì)胞前體中檢測(cè)到Nogo表達(dá)，而plp表達(dá)僅在接近視神經(jīng)交叉(g)的P3視神經(jīng)中開始可檢測(cè)到。
圖7AS Bruna和AS472均識(shí)別約200kD的髓磷脂蛋白。按照Spillmann等，1998，J.Biol.Chem.，273(30)19283-19293的方法制備大鼠髓磷脂提取物和牛q庫(kù)。AS Bruna和AS472各自識(shí)別牛髓磷脂中的200kD條帶以及幾條較小的條帶，它們可能是bNI220的降解產(chǎn)物。AS Bruna使大鼠髓磷脂中的200kD條帶染色。IAS Bruna；PAS Bruna，免疫前血清；E親和純化的AS472。
圖8a-8i采用IN-1(a-e)、AS Bruna(d-f)和AS472(g-i)進(jìn)行的大鼠脊髓和小腦的免疫組織化學(xué)，如各圖的左側(cè)所示。當(dāng)冷凍切片用乙醇/乙酸固定時(shí)，用所有三種抗體在兩個(gè)組織中均觀察到強(qiáng)髓磷脂染色(a，b，d，e，g，h)。除少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體外，用甲醇處理切片消除了髓磷脂染色(箭頭；c，f，i)。箭頭浦肯野細(xì)胞，WM，白質(zhì)；GM，灰質(zhì)，DR背根；Gr，粒細(xì)胞層；m，分子層。標(biāo)度條a，d，g415μm；b，c，e，f，h，i143μm。
圖9a-9d在不同生物測(cè)定中AS472和AS Bruna的中和活性。(a)將NIH3T3成纖維細(xì)胞接種到用q庫(kù)包被并用IN-1、AS Bruna、AS472或相應(yīng)的免疫前血清預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)平皿上。兩種多克隆血清甚至顯示出比IN-1略好的對(duì)抑制性底物的中和。免疫前血清對(duì)NIH3T3細(xì)胞的散布沒有顯著影響。過量的用來產(chǎn)生AS472的肽(P472)的加入競(jìng)爭(zhēng)所述中和活性，而非特異性肽(Px)沒有效應(yīng)。(b)用AS Bruna或AS472預(yù)處理所述抑制性底物，導(dǎo)致DRG神經(jīng)突外向生長(zhǎng)與可以在層粘連蛋白底物上觀察到的向外生長(zhǎng)相當(dāng)。在用PBS預(yù)處理(c；計(jì)分＝0)和用AS Bruna預(yù)處理(d；計(jì)分＝4)的q庫(kù)上的從DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的實(shí)例。
圖10a-10d用AS472注射視神經(jīng)外植體導(dǎo)致軸突向內(nèi)生長(zhǎng)。(a)解剖多對(duì)成年大鼠視神經(jīng)，用AS472或免疫前血清注射，并置于室培養(yǎng)物中，以使所述神經(jīng)的一端與解離的P0大鼠DRG神經(jīng)元接觸。(b)體外2周后，在距切割位點(diǎn)(箭頭A)3.5mm處取所述神經(jīng)的EM切片并系統(tǒng)篩選完整的軸突(3個(gè)實(shí)驗(yàn))。(c)再生的軸突束(箭頭)通過使AS472注射的視神經(jīng)退化而生長(zhǎng)。(d)再生的軸突與髓磷脂接觸。放大倍數(shù)c，12,000x；d，35,000x。
圖11a-11c轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞中重組Nogo A的表達(dá)。(a)蛋白質(zhì)印跡，顯示AS Bruna對(duì)重組Nogo A(2道)和得自原代培養(yǎng)大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)源Nogo A(3道)的免疫反應(yīng)性。在5％變性SDS凝膠上，這兩種蛋白的遷移率實(shí)際上是相同的，為約200kD。對(duì)照LacZ構(gòu)成物轉(zhuǎn)染樣品(1道)顯示出與AS Bruna沒有免疫反應(yīng)性。同一印跡也用抗myc抗體9E10探測(cè)，如圖所示。與AS Bruna反應(yīng)的條帶也與抗myc標(biāo)記抗體9E10反應(yīng)(5道)，而內(nèi)源NogoA不與9E10反應(yīng)(6道)。LacZ對(duì)照轉(zhuǎn)染樣品顯示出約118kD的預(yù)期條帶(4道)。用Nogo A構(gòu)成物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞用AS Bruna(b)和IN-1(c)雙重染色。用ASBruna陽性染色的細(xì)胞用IN-1染色也是陽性。
圖12牛Nogo cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO28)。
圖13與人Nogo的理論氨基酸序列(SEQ ID NO30)序列對(duì)比的大鼠Nogo A的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。人Nogo氨基酸序列得自已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)與大鼠Nogo序列的序列對(duì)比以及采用大鼠Nogo作為指導(dǎo)模板翻譯序列對(duì)比的人EST。
圖14大鼠Nogo C核酸(SEQ ID NO31)序列及其相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO32)。
圖15a-15eNogo A存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜上，通過免疫細(xì)胞化學(xué)和培養(yǎng)物中少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面生物素化證明。
免疫細(xì)胞化學(xué)(a-d)解離得自P10大鼠視神經(jīng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞并將其培養(yǎng)2天。肝細(xì)胞用mAb IN-1(a)或AS472(c)染色表明少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體和過程上的免疫反應(yīng)性。在競(jìng)爭(zhēng)肽P472存在下，AS472僅表現(xiàn)背景標(biāo)記(所有細(xì)胞類型)(d)。當(dāng)去除第一抗體時(shí)(b)，觀察到相似的非特異性染色。評(píng)估將編號(hào)的平皿隨機(jī)混合并由3個(gè)獨(dú)立的觀察者分類。8/10的平皿被所有三個(gè)觀察者正確分類為AS472陽性、mAb IN-1陽性或?qū)φ铡?br> 生物素化(e)富含少突膠質(zhì)細(xì)胞的大鼠P4全腦培養(yǎng)物在培養(yǎng)7天后，用膜不透性試劑進(jìn)行細(xì)胞表面生物素化。隨后，細(xì)胞勻漿用鏈霉抗生物素-Dynabead處理。沉淀(Ppt)和上清液(sup)用AS472印跡；它們表現(xiàn)出不同的蛋白圖型在沉淀中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面Nogo A表現(xiàn)出比胞內(nèi)Nogo A更大的表觀分子量。這種變化可能是因糖基化引起的。腔ER蛋白BiP和大部分的B-微管蛋白可能僅在胞內(nèi)部分發(fā)現(xiàn)。
圖16a-16j功能測(cè)定表明在少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜上存在NogoA。將視神經(jīng)培養(yǎng)物與AS472預(yù)溫育(a，b)，使得NIH3T3成纖維細(xì)胞散布至GalC(01抗體)免疫熒光染色描繪的高度分支的少突膠質(zhì)細(xì)胞上(a)。相應(yīng)的相差圖象(b)中的箭頭指明NIH3T3成纖維細(xì)胞散布到所述少突膠質(zhì)細(xì)胞頂部上。(c，d)當(dāng)AS472與P472一起加入時(shí)，NIH3T3成纖維細(xì)胞嚴(yán)格避開GalC陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域(箭頭)(Caroni和Schwab，1988，Neuron 185-96)。(e，f)在AS472存在下，P0大鼠解離的DRG神經(jīng)元能夠?qū)⑸窠?jīng)突延伸到高度分支的少突膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域上(f中的箭頭)。(g，h)肽P472有效地競(jìng)爭(zhēng)AS472的中和活性神經(jīng)突完全避開少突膠質(zhì)細(xì)胞。用于這些實(shí)驗(yàn)中的AS472是針對(duì)大鼠472肽序列產(chǎn)生的。(i，j)這些結(jié)果的定量分析(如方法中所述)證明AS472在兩種類型的測(cè)定中的強(qiáng)中和活性。標(biāo)度條40μm。
圖17a-17e重組Nogo A是一種抑制性底物，其抑制活性被mAbIN-1中和。對(duì)于NIH3T3成纖維細(xì)胞散布和DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定，包被得自穩(wěn)定的CHO-Nogo A細(xì)胞系的富RecNogo A提取物或從穩(wěn)定的CHO-LacZ細(xì)胞系中平行分離的β-半乳糖苷酶。(a)myc-his-標(biāo)記的recLacZ(1道)和recNogo A(2道)的銀凝膠表現(xiàn)出180kD的NogoA條帶。該NogoA條帶的身份通過與AS Bruna(3道)和抗myc抗體9E10(4道)溫育的蛋白質(zhì)印跡而證實(shí)。(b)RecNogo A包被的平皿明顯抑制NIH3T3的散布。與mAb IN-1或AS Bruna預(yù)溫育導(dǎo)致對(duì)抑制活性的高度顯著(p＜0.01)的中和。對(duì)照1gM mAb O1和免疫前血清無效。CHO-LacZ提取物對(duì)NIH3T3細(xì)胞具有部分抑制效應(yīng)，可能是因內(nèi)源CHO蛋白引起的。這種抑制活性不受與抗體預(yù)溫育的影響。
(c)對(duì)于DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定，將與(b)中相同的蛋白物質(zhì)與層粘連蛋白混合并包被。RecNogo A以依賴于劑量的方式對(duì)解離的DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)具有非常有效的抑制效應(yīng)。該活性被mAb IN-1中和(p＜0.001)，但不被對(duì)照mAb 01中和。從CHO-LacZ細(xì)胞中分離的蛋白物質(zhì)在所使用的任何濃度下均沒有抑制效應(yīng)，與抗體溫育對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)也沒有任何影響。計(jì)分實(shí)例示于(d)中1μg recNogoA，無神經(jīng)突計(jì)分或短神經(jīng)突(箭頭)計(jì)分2，計(jì)分實(shí)例還示于(e)中1μg CHO-LacZ，長(zhǎng)的分支神經(jīng)突(箭頭)計(jì)分5-6。用雙尾Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。標(biāo)度條280μm。
圖18Nogo缺失突變體的功能分析。如下文6.2.7一節(jié)中所述，產(chǎn)生編碼含Nogo片段或Nogo截短部分(如以下所列)的融合蛋白的以下缺失構(gòu)成物。Nogo-AHis標(biāo)記/T7標(biāo)記/載體/Nogo-A seq.aa1-1162Nogo-BHis標(biāo)記/T7標(biāo)記/載體/Nogo-A seq.aa1-171+975-1162Nogo-CHis標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-C N末端(11 aa)+Nogo-A seq.aa975-1162NiAextHis標(biāo)記/T7標(biāo)記/載體/Nogo-A seq.aa1-974/T7標(biāo)記NiR His標(biāo)記/T7標(biāo)記/載體/Nogo-A seq.aa1-171/載體NiG His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-974/His標(biāo)記EST His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 760-1162NiG-D1His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-908/載體NiG-D2His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-866/His標(biāo)記NiG-D3His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-723/His標(biāo)記NiG-D4 His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-646/His載體NiG-D5 His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 291-646/His標(biāo)記NiG-D7 His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-234+292-974/His標(biāo)記NiG-D8 His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-628NiG-D9 His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-259+646-974/His標(biāo)記NiG-D10His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 291-974/His標(biāo)記NiG-D14His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-259NiG-D15His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-189+491-974/His標(biāo)記NiG-D16His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-189+619-974/His標(biāo)記NiG-D17His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-189+257-974/His標(biāo)記NiG-D18His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 172-189+261-974/His標(biāo)記NiG-D20His標(biāo)記/T7標(biāo)記/Nogo-A seq.aa 542-722/His標(biāo)記所述氨基酸(aa)編號(hào)基于以第一個(gè)甲硫氨酸開始的大鼠Nogo A氨基酸序列編號(hào)(SEQ ID NO2)。His標(biāo)記和T7標(biāo)記由34個(gè)氨基酸組成。所述N末端和C末端載體序列衍生自表達(dá)載體pET28。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及Nogo基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及Nogo蛋白的片段以及其它衍生物和類似物。編碼這種片段或衍生物的核酸也在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明提供多種不同物種的Nogo基因及其所編碼的蛋白。本發(fā)明的Nogo基因包括人、大鼠和牛Nogo以及其它物種中的相關(guān)基因(同源物)。Spillman等，1998，J.Biol.Chem.27319283-19293中公開的牛亞序列不是本發(fā)明要求保護(hù)的部分。在具體實(shí)施方案中，所述Nogo基因和蛋白得自脊椎動(dòng)物，或更具體地講得自哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Nogo基因和蛋白來源于人類。提供了上述蛋白和衍生物的產(chǎn)生，例如通過重組方法產(chǎn)生。
本發(fā)明提供的Nogo基因包括編碼Nogo三種同種型的核酸分子，所述三種同種型即Nogo A、Nogo B和Nogo C。提及基因“Nogo”應(yīng)該包括編碼所有三種同種型的核酸分子，除非另有說明。同樣，提及Nogo蛋白應(yīng)該包括所有三種Nogo同種型，除非另有說明。本發(fā)明的Nogo蛋白可以阻止脊髓或腦中神經(jīng)元的再生(即非許可底物特性)，抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)，誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱，阻斷NIH3T3細(xì)胞散布，阻斷PC12神經(jīng)突向外生長(zhǎng)等。
所述Nogo蛋白及其片段和衍生物不含所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)；特別是，它們不含與所述Nogo蛋白天然連接的所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。這種物質(zhì)可以包括其它CNS髓磷脂蛋白、脂質(zhì)和糖類。本發(fā)明的Nogo蛋白、其片段和衍生物也最好不含從生物標(biāo)本中純化所用的試劑，例如去垢劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供通過本領(lǐng)域已知的方法制備的重組Nogo蛋白、其片段和衍生物，所述已知方法例如在遺傳工程細(xì)胞中表達(dá)所述Nogo基因。
本發(fā)明也涉及有功能活性的本發(fā)明的Nogo衍生物和類似物，即它們能夠表現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)與全長(zhǎng)(野生型)Nogo蛋白相關(guān)的已知功能活性。這種功能活性包括但不限于能夠與神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白相互作用(或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合)的能力；抗原性[與抗Nogo抗體結(jié)合(或與Nogo競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合)的能力]；免疫原性(產(chǎn)生與Nogo結(jié)合的抗體的能力)；防止脊髓或腦中神經(jīng)元的再生、賦予底物限制神經(jīng)細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、散布和遷移的特性；抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)；誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱；阻斷NIH3T3細(xì)胞的體外散布；阻斷PC12神經(jīng)突向外生長(zhǎng)；限制神經(jīng)可塑性等。
本發(fā)明還涉及包含一個(gè)或多個(gè)所述Nogo蛋白結(jié)構(gòu)域的Nogo片段(及其衍生物和類似物)。
另外提供抗Nogo抗體、其衍生物和類似物。
本發(fā)明也涉及基于Nogo蛋白和核酸和抗Nogo抗體的治療和診斷方法和組合物。本發(fā)明可供用于通過給予促進(jìn)Nogo活性的化合物(例如Nogo蛋白及其功能活性類似物和衍生物(包括片段)；編碼所述Nogo蛋白的核酸、類似物或衍生物、Nogo激動(dòng)劑)治療生長(zhǎng)調(diào)節(jié)細(xì)胞和器官的疾病。
本發(fā)明也提供通過給予拮抗或抑制Nogo功能的化合物(例如抗體、Nogo反義核酸、Nogo拮抗劑衍生物)治療神經(jīng)系統(tǒng)損害或疾病的方法。
本發(fā)明也提供疾病誘因的動(dòng)物模型、診斷方法和篩選方法。
為了清楚地公開并且不作為限制，將本發(fā)明的詳述分為以下幾個(gè)小節(jié)。
5.1 Nogo基因的分離本發(fā)明涉及Nogo基因或核酸的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，Nogo核酸包含被鑒定為圖1b中描述的Nogo A的、圖2a的大鼠cDNA序列(SEQ ID NO1)、或其編碼區(qū)、或編碼長(zhǎng)度為1163個(gè)氨基酸的Nogo蛋白或其任何功能片段或衍生物(例如具有SEQ ID NO2序列的蛋白，如圖2a中所示)的核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，Nogo核酸包含編碼Nogo B的核苷酸序列，而Nogo B蛋白是Nogo A的氨基末端172個(gè)氨基酸與羧基末端188個(gè)氨基酸融合，產(chǎn)生截短的360個(gè)氨基酸蛋白的等同物。由于去除間插核苷酸編碼序列的可變剪接，產(chǎn)生Nogo B的轉(zhuǎn)錄物。
在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，Nogo核酸包含編碼Nogo C的核苷酸序列，而Nogo C蛋白在其氨基末端含有Nogo A中不存在的11個(gè)氨基酸，并含有Nogo A和B的羧基末端188個(gè)氨基酸。Nogo C蛋白具有199個(gè)氨基酸。編碼Nogo C的轉(zhuǎn)錄物是從可變Nogo啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。
在再一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供牛Nogo核酸序列(SEQ IDNO28)。
在再一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼人Nogo、人Nogo蛋白片段的核苷酸序列，所述人Nogo包括大鼠Nogo A、Nogo B和Nogo C的人等同物。用大鼠Nogo A轉(zhuǎn)錄物作為模板，并將人已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)一起剪接，以揭示連續(xù)的核苷酸序列，來闡述人Nogo核酸序列。Nogo的大鼠和牛氨基酸序列也提供了關(guān)于正確轉(zhuǎn)錄讀框的信息，使得推斷出人Nogo的氨基酸序列。本發(fā)明也提供人Nogo基因片段的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供至少由Nogo序列的8個(gè)核苷酸組成(即可雜交部分)的純化核酸；在其它實(shí)施方案中，所述核酸由Nogo序列的至少25個(gè)(連續(xù))核苷酸、50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、150個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、700個(gè)核苷酸或800個(gè)核苷酸或全長(zhǎng)Nogo編碼序列組成。在另一實(shí)施方案中，所述核酸的長(zhǎng)度小于35、200或500個(gè)核苷酸。核酸可以是單鏈或是雙鏈。本發(fā)明也涉及與上述序列可雜交或互補(bǔ)的核酸。在具體方面，提供包含與Nogo基因的至少10、25、50、100或200個(gè)核苷酸或完整編碼區(qū)互補(bǔ)的序列的核酸。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供在低嚴(yán)格性條件下可與Nogo核酸(例如具有SEQ ID NO2；圖2a序列)或編碼Nogo衍生物的核酸雜交的核酸。作為實(shí)例且不是限制性的，采用這種低嚴(yán)格性條件的方法如下(也參見Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792)含DNA的濾膜在含以下物質(zhì)的溶液中于40℃預(yù)處理6小時(shí)35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、0.1％BSA和500μg/ml變性鮭精DNA。在具有以下修改的同一溶液中進(jìn)行雜交0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鮭精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20 X 106cpm32P標(biāo)記的探針。將濾膜在雜交混合物中于40℃下保溫18-20小時(shí)，然后于55℃在含有2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗滌1.5小時(shí)。用新鮮溶液取代洗滌溶液，再于60℃保溫1.5小時(shí)。將濾膜吸干并曝光進(jìn)行放射自顯影。如有必要，將濾膜于65-68℃洗滌第三次并對(duì)膠片再曝光?？梢允褂玫钠渌蛧?yán)格性條件是本領(lǐng)域眾所周知的(例如與用于交叉物種雜交一樣，如6.1.1一節(jié)中的實(shí)施例中證明)。
在另一具體實(shí)施方案中，提供在高嚴(yán)格性條件下可與Nogo核酸雜交的核酸。作為實(shí)例并且不是限制性的，采用這種高嚴(yán)格性條件的方法如下含DNA的濾膜在由以下物質(zhì)構(gòu)成的緩沖液中于65℃預(yù)雜交8小時(shí)至過夜6X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml變性鮭精DNA。濾膜在含有100μg/ml變性鮭精DNA和5-20 X 106cpm32P標(biāo)記的探針的預(yù)雜交混合物中于65℃雜交48小時(shí)。于37℃在含有2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中進(jìn)行1小時(shí)的洗滌濾膜。接著于50℃下在0.1X SSC中洗滌45分鐘，然后進(jìn)行放射自顯影?？梢允褂玫钠渌邍?yán)格性條件是本領(lǐng)域眾所周知的。
在另一具體實(shí)施方案中，提供在中等嚴(yán)格性條件下可與Nogo核酸雜交的核酸。例如但不限于，采用這種中等嚴(yán)格性條件的方法如下含DNA的濾膜于55℃在含有6X SSC、5X Denhart溶液、0.05％SDS和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中預(yù)處理6小時(shí)。在同一溶液中進(jìn)行雜交并使用5-20 X 106cpm32P標(biāo)記的探針。濾膜在雜交混合物中于55℃保溫18-20小時(shí)，然后于60℃下在含有1X SSC和0.1％SDS的溶液中洗滌兩次，每次30分鐘。將濾膜吸干并曝光進(jìn)行放射自顯影?？梢允褂玫钠渌械葒?yán)格性條件是本領(lǐng)域眾所周知的。于37℃在含有2X SSC、0.1％SDS的溶液中洗滌濾膜1小時(shí)。這種嚴(yán)格性條件適合于在另一物種中分離包含Nogo基因序列的核酸分子，例如采用大鼠或牛Nogo cDNA克隆作為探針以分離人Nogo cDNA。
當(dāng)與本發(fā)明的Nogo基因序列區(qū)段比較時(shí)，在公布的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的許多人已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)表現(xiàn)出高度序列同一性。采用ENTREZ核苷酸查詢，鑒定出以下初步列出的人EST，并以其Genbank登錄號(hào)列出AA158636(SEQ ID NO35)、AA333267(SEQID NO36)、AA081783(SEQ ID NO37)、AA167765(SEQ ID NO38)、AA322918(SEQ ID NO39)、AA092565(SEQ ID NO40)、AA081525(SEQ ID NO41)和AA081840(SEQ ID NO42)。在本發(fā)明之前，沒有一個(gè)上述鑒定的EST在這些EST在體內(nèi)可以編碼的氨基酸序列方面進(jìn)行特征鑒定。對(duì)于包含所述人EST的預(yù)測(cè)氨基酸序列的蛋白的功能一無所知。此外，與大鼠Nogo cDNA的5’端序列對(duì)齊(align)的一種EST例如AA158636和與大鼠cDNA3’端序列對(duì)齊的另一EST例如AA081840不重疊，認(rèn)為可能不是同一人cDNA序列的部分。
根據(jù)本發(fā)明的Nogo基因序列，認(rèn)為這些人EST代表在獲得所述EST的組織中表達(dá)的人Nogo基因的部分。因此，本發(fā)明包括包含兩種或兩種以上的以上鑒定的人EST的核酸分子。所述EST可能在同一人組織中表達(dá)，或可能在不同的人組織中表達(dá)。最好是，本發(fā)明的核酸分子包含至少兩種相互不重疊、或不與第三或更多人EST重疊的人EST的核苷酸序列。
因?yàn)橛捎诳寺×伺：痛笫驨ogo核酸，以上鑒定的人EST現(xiàn)在被鑒定為人Nogo基因的片段，所以設(shè)想人EST具有相對(duì)于本發(fā)明各種方法中其它Nogo核酸分子的相似功能，所述方法例如但不限于例如，表達(dá)人Nogo多肽、雜交測(cè)定和作為反義核酸分子抑制Nogo表達(dá)等。
此外，本發(fā)明提供并包括人Nogo蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列及其片段。如圖13所示，大鼠Nogo蛋白的氨基酸序列(圖2a；SEQ ID NO2)與人Nogo蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列(圖13；SEQ ID NO30)進(jìn)行序列對(duì)比。因此，本發(fā)明包括包含以下序列的人Nogo蛋白人Nogo預(yù)測(cè)的氨基酸序列，圖13和SEQ ID NO30；或人Nogo的預(yù)測(cè)氨基酸序列中由至少6個(gè)氨基酸殘基組成的亞序列；或一個(gè)或多個(gè)人Nogo片段的以下預(yù)測(cè)氨基酸序列MEDLDQSPLVSSS(人Nogo，相應(yīng)于SEQID NO43的氨基酸1-13)、KIMDLKEQPGNTISAG(人Nogo，相應(yīng)于SEQ ID NO44的氨基酸187-203)、KEDEVVSSEKAKDSFNEKR(人Nogo，相應(yīng)于SEQ ID NO45的氨基酸340-358)、QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS(人Nogo，相應(yīng)于SEQ ID NO46的氨基酸570-619)。天然存在的的人Nogo和重組人Nogo以及氨基酸序列基本上類似于上述氨基酸序列并且能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合的其片段在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明還提供編碼氨基酸序列基本類似于圖13所示氨基酸序列(圖13；SEQ ID NO30)的人Nogo蛋白的核酸分子。在具體實(shí)施方案中，也設(shè)想了編碼氨基酸序列基本類似于圖13所示氨基酸序列(SEQID NO30)的人Nogo蛋白片段的核酸分子，前提是這種核酸分子不包含以上鑒定的人EST的核苷酸序列。
在使用采用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序例如BLAST計(jì)算機(jī)檢索(Altschul等，1994，Nature Genet.6119-129)進(jìn)行序列對(duì)比的計(jì)算機(jī)算法時(shí)，如果在一種氨基酸序列和人Nogo蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列這兩種分子中超過50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的氨基酸殘基是相同的，則認(rèn)為所述氨基酸序列基本上類似于人Nogo蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
例如但不限于，有用的計(jì)算機(jī)同源性程序包括以下基本局部序列對(duì)比檢索工具(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，J.of Molec.Biol.，215403-410，“BLAST算法；Altschul等，1997，Nuc.Acids Res.253389-3402)，這是一種適用于檢索序列相似性的啟發(fā)性檢索算法，它采用Karlin和Altschul的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(1990，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，872264-68；1993，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 905873-77)確定顯著性。5種具體的BLAST程序執(zhí)行以下任務(wù)1)BLASTP程序?qū)被岵樵冃蛄袑?duì)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。
2)BLASTN程序?qū)⒑塑账岵樵冃蛄袑?duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。
3)BLASTX程序?qū)⒑塑账岵樵冃蛄?兩條鏈)的6種讀框概念翻譯產(chǎn)物(six-frame conceptual translation product)對(duì)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。
4)TBLASTN程序?qū)⒌鞍撞樵冃蛄袑?duì)以所有6種讀框(兩條鏈)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。
5)TBLASTX程序?qū)⒑塑账岵樵冃蛄械?種讀框翻譯物對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的6種讀框翻譯物進(jìn)行比較。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，對(duì)于鑒定具有所需同一性百分比的核酸TBLASTN程序特別有用，而對(duì)于鑒定具有所需同一性百分比的氨基酸序列BLASTP程序特別有用。
Smith-Waterman(數(shù)據(jù)庫(kù)歐洲生物信息研究所wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/)(Smith-Waterman，1981，J.of Molec.Biol.，147195-197)是用于序列對(duì)比的一種數(shù)學(xué)上嚴(yán)格的算法。
FASTA(參見Pearson等，1988，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，852444-2448)是Smith-Waterman算法的直觀推斷近似法。關(guān)于BLAST、Smith-Waterman和FASTA算法的方法和益處的總體討論，請(qǐng)參見Nicholas等，1998，“檢索序列數(shù)據(jù)庫(kù)和序列計(jì)分法教程(ATutorial on Searching Sequence Databases and Sequence ScoringMethods)”(www.psc.edu)和其中引用的參考文獻(xiàn)。
應(yīng)用人Nogo的預(yù)測(cè)氨基酸序列或人EST核苷酸序列包括編碼人Nogo預(yù)測(cè)氨基酸序列的簡(jiǎn)并序列，來分離或鑒定人Nogo基因、片段、其天然存在的突變體和變異體，屬于本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這種應(yīng)用包括但不限于使用所述信息制備核酸探針，以用于DNA文庫(kù)篩選、DNA擴(kuò)增、人群的基因篩選；以及制備合成肽，以制備抗體。在本文下面的小節(jié)中提供這種應(yīng)用的某些應(yīng)用的詳細(xì)描述。
另外提供編碼Nogo蛋白的衍生物和類似物的核酸、以及Nogo反義核酸。正如顯而易見的，本文所用的“編碼Nogo蛋白片段或部分的核酸”應(yīng)該解釋為是指僅編碼所述Nogo蛋白所列舉片段或部分、而沒有所述Nogo蛋白的其它連續(xù)部分作為連續(xù)序列的核酸。在這方面，一部分是指一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
也提供包含在相同物種或不同物種的其它Nogo核酸之間保守(與所述其它Nogo核酸同源)的區(qū)域的Nogo核酸片段。圖2a中提供了編碼一個(gè)或多個(gè)Nogo結(jié)構(gòu)域的核酸，例如，大鼠Nogo的保守羧基末端結(jié)構(gòu)域，它具有約180個(gè)氨基酸，并且由終止密碼子之前的編碼序列的最后540個(gè)核苷酸編碼。也提供了在大鼠Nogo A中保守羧基末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)的兩個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域(即氨基酸988-1023和氨基酸1090-1125)的核苷酸序列和氨基酸序列。也提供了大鼠Nogo A殘基31-58的氨基末端酸性結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和氨基酸序列。
為了進(jìn)行Nogo各個(gè)區(qū)的功能分析，已經(jīng)產(chǎn)生了Nogo基因中的一系列缺失，并將其通過重組DNA技術(shù)克隆到表達(dá)載體中，并作為融合蛋白表達(dá)。提供了編碼Nogo蛋白片段的核酸，例如編碼SEQ ID NO2的以下氨基酸殘基的核酸氨基酸殘基1-171、172-974、259-542、542-722、172-259、722-974或975-1162或它們的組合；或編碼SEQID NO30的以下氨基酸殘基的核酸1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939和940-1127或它們的組合。某些缺失構(gòu)成物包含截短的Nogo部分和編碼六組氨酸標(biāo)記和/或T7標(biāo)記的額外核苷酸序列。提供了核酸，所述核酸編碼缺乏SEQ ID NO2的氨基酸殘基172-259、氨基酸殘基974-1162或氨基酸殘基172-259和974-1162、而在其它部分包含SEQ ID NO2其余部分的截短N(yùn)ogo蛋白；或編碼缺乏SEQ ID NO30的氨基酸殘基132-206、氨基酸殘基939-1127或氨基酸殘基132-206和939-1127、但在其它部分包含SEQID NO30其余部分的截短N(yùn)ogo蛋白。典型的缺失構(gòu)成物的結(jié)構(gòu)示于圖18中。缺失構(gòu)成物當(dāng)引入細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生Nogo片段或截短部分。在6.2.7一節(jié)的表2描述的各種功能測(cè)定中，測(cè)試了這些突變體的生物活性。
克隆Nogo基因的具體實(shí)施方案作為一個(gè)具體實(shí)施例介紹，但不是限制性的，如下所述為了表達(dá)克隆(本領(lǐng)域通常已知的技術(shù))，通過本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建一個(gè)表達(dá)文庫(kù)。例如，分離mRNA(例如人)，制備cDNA，并將其連接到表達(dá)載體(例如噬菌體衍生物)中，以使它能夠被隨后所引入的宿主細(xì)胞表達(dá)。然后可以采用各種篩選測(cè)定來選擇表達(dá)的Nogo產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用抗Nogo抗體來選擇。
在另一實(shí)施方案中，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增所需序列，然后進(jìn)行選擇。代表已知的Nogo序列的寡核苷酸引物可以用作PCR中的引物。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述寡核苷酸引物代表不同物種的Nogo之間強(qiáng)同源性的Nogo保守區(qū)段的至少一部分。所述合成寡核苷酸可以用作引物，來通過PCR從一種潛在目標(biāo)來源(RNA或DNA)、最好是cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增序列。例如可以利用Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀和Taq聚合酶(Gene AmpTM)進(jìn)行PCR。擴(kuò)增的DNA可以包括得自任何真核生物物種的mRNA或cDNA或基因組DNA。人們可以選擇來合成幾種不同的簡(jiǎn)并引物，以用于PCR反應(yīng)。也可以改變引發(fā)PCR反應(yīng)中所用的雜交條件的嚴(yán)格性，以在已知Nogo核苷酸序列和分離的核酸同源物之間提供更高或更低程度的核苷酸序列相似性。對(duì)于雜交物種的雜交，最好使用低嚴(yán)格性條件。對(duì)于同一物種的雜交，最好使用中等嚴(yán)格性條件。
在成功擴(kuò)增Nogo同源物區(qū)段后，可以對(duì)該區(qū)段進(jìn)行分子克隆和測(cè)序并且用作探針以分離完整的cDNA或基因組克隆。這進(jìn)而又允許確定該基因的完整核苷酸序列、其表達(dá)分析和產(chǎn)生其蛋白產(chǎn)物以進(jìn)行功能分析，如下文所述。以這種方式，可以鑒定出編碼Nogo蛋白和Nogo類似物的另外的基因。
上述方法不意味著限制以下可以獲得Nogo克隆的方法的一般描述。
任何真核細(xì)胞均可以潛在地用作分子克隆所述Nogo基因的核酸源。可以從脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、人、豬、鼠、牛、貓、鳥類、馬、犬以及其它靈長(zhǎng)類來源、昆蟲等中分離編碼Nogo的核酸序列?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，從克隆的DNA(例如DNA“文庫(kù)”)中獲得所述DNA，或通過化學(xué)合成、cDNA克隆或通過從所需細(xì)胞中純化的基因組DNA或其片段的克隆，獲得所述DNA。(參見例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.(主編)，1985，DNA CloningA Practical Approach，MRLPress，Ltd.，Oxford，U.K.第I、II卷)。得自基因組DNA的克隆除含有編碼區(qū)外，還可能含有調(diào)節(jié)區(qū)和內(nèi)含子DNA區(qū)；得自cDNA的克隆將僅含外顯子序列。無論何種來源，均應(yīng)該將所述基因分子克隆到合適的載體中，用于基因的繁殖。
在得自基因組DNA的基因的分子克隆中，產(chǎn)生DNA片段，其中某些片段將編碼所需基因?？梢圆捎酶鞣N限制酶于特定位點(diǎn)切割所述DNA?；蛘?，人們可以在鎂存在下使用DNA酶，以將所述DNA片段化，或可以將所述DNA進(jìn)行物理剪切，如例如通過超聲處理。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括但不限于瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析，可以根據(jù)大小分離所述線性DNA片段。
一旦產(chǎn)生所述DNA片段后，可以以多種方式完成含所需基因的特定DNA片段的鑒定。例如，如果可以得到一定量的Nogo(或任何物種的)基因的一部分或其特定RNA或其片段(參見6.1.1一節(jié))，并可以將其純化和標(biāo)記，則可以通過與所述標(biāo)記探針進(jìn)行核酸雜交來篩選所產(chǎn)生的DNA片段(Benton，W.和Davis，R.，1977，Science 196180；Grunstein，M.和Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。與所述探針具有相當(dāng)大同源性的那些DNA片段將雜交。也可以通過限制酶消化和將片段大小與按照已知限制圖譜(如果可得到)預(yù)測(cè)的片段大小進(jìn)行比較，來鑒定合適的片段。根據(jù)該基因的特性可以進(jìn)行進(jìn)一步選擇。
或者，通過基于其表達(dá)產(chǎn)物的物理、化學(xué)或免疫學(xué)特性的測(cè)定，可以檢測(cè)基因的存在。例如，可以選擇雜交選擇正確mRNA的cDNA克隆或DNA克隆，這將產(chǎn)生例如電泳遷移率、等電聚焦行為、蛋白水解消化圖譜、翻譯后修飾、酸性或堿性特性或抗原性特性與Nogo已知特性相似或相同的蛋白?？傻玫娇筃ogo抗體，例如IN-1和IN-2(美國(guó)專利5,684,133)、AS Bruna和AS 472。AS Bruna和AS472的制備在6.1.7一節(jié)中描述?？梢酝ㄟ^在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)型方法中標(biāo)記抗體與推定的Nogo合成克隆結(jié)合，或通過純化的或全細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡，鑒定所述Nogo蛋白。
也可以通過核酸雜交然后進(jìn)行體外翻譯進(jìn)行mRNA選擇，鑒定出所述Nogo基因。在該方法中，片段用來通過雜交分離互補(bǔ)mRNA。這種DNA片段可以代表其它物種(例如小鼠、人類)的可得到的、純化的Nogo DNA。所分離mRNA的分離產(chǎn)物的體外翻譯產(chǎn)物的免疫沉淀分析或功能測(cè)定(例如體外聚集能力；與受體結(jié)合；參見下文)鑒定所述mRNA，并因此鑒定含有所需序列的互補(bǔ)DNA片段。另外，通過將分離自細(xì)胞的多核糖體吸附至特異性針對(duì)Nogo蛋白的固定化抗體，可以選擇特異性mRNA?？梢圆捎盟x擇的mRNA(得自吸附的多核糖體)作為模板，合成放射標(biāo)記的Nogo cDNA。然后，放射標(biāo)記的mRNA或cDNA可以用作探針，來從其它基因組DNA片段中鑒定Nogo DNA片段。
分離Nogo基因組DNA的替代方法包括但不限于根據(jù)已知序列化學(xué)合成該基因序列本身，或制備編碼Nogo蛋白的mRNA的cDNA。例如，可以從表達(dá)Nogo的細(xì)胞中分離用于Nogo基因cDNA克隆的RNA。其它方法也是可能的，并且在本發(fā)明范圍內(nèi)。
然后將所鑒定和分離的基因插入合適的克隆載體中。可以使用本領(lǐng)域已知的多種載體-宿主系統(tǒng)?？赡艿妮d體包括但不限于質(zhì)?；蛐揎棽《?，但所述載體系統(tǒng)必須與所用的宿主細(xì)胞相匹配。這種載體包括但不限于噬菌體例如λ衍生物、或質(zhì)粒例如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物或Bluescript載體(Stratagene)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將Nogo克隆到具有附加表位以簡(jiǎn)化蛋白表達(dá)分析的pcDNA3中(6.1.10一節(jié))。
例如通過將所述DNA片段連接到具有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體中，可以完成插入到克隆載體中。然而，如果在克隆載體中不存在用來將所述DNA片段化的互補(bǔ)限制位點(diǎn)，則可以酶促修飾所述DNA分子的末端?；蛘?，通過將核苷酸序列(接頭)連接到所述DNA末端上，可以產(chǎn)生所需的任何位點(diǎn)；這些連接接頭可以包含特異性化學(xué)合成的、編碼限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的寡核苷酸。在一個(gè)替代方法中，所切割的載體和Nogo基因可以通過同聚物加尾修飾?？梢詫⒅亟M分子通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等引入宿主細(xì)胞，以使產(chǎn)生許多拷貝的所述基因序列。
在一個(gè)替代方法中，所述所需基因可以在以“鳥槍”法插入合適的克隆載體中后進(jìn)行鑒定和分離。在插入克隆載體之前，可以通過例如大小分級(jí)來富集所述所需基因。
在具體實(shí)施方案中，用摻入分離的Nogo基因的重組DNA分子、cDNA或合成DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，能夠產(chǎn)生多拷貝的該基因。因此，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從所述轉(zhuǎn)化體中分離重組DNA分子，必要時(shí)從所分離的重組DNA中挽回所插入的基因，可以大量獲得所述基因。
本發(fā)明提供的Nogo序列包括所編碼的氨基酸序列基本上與天然Nogo蛋白相同的那些核苷酸序列、以及具有功能等同氨基酸的那些編碼的氨基酸序列、以及編碼其它Nogo衍生物或類似物的那些序列，如以下6.2.1和6.2.2小節(jié)中關(guān)于Nogo衍生物和類似物描述。
5.2 Nogo基因的表達(dá)可以將編碼Nogo蛋白或其功能活性類似物或片段或其它衍生物的核苷酸序列(參見圖1b和2a；6.2.1和6.2.2小節(jié))插入合適的表達(dá)載體中，即含有所插入蛋白編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體。必需轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)也可以由天然Nogo基因和/或其側(cè)翼區(qū)提供。也可以用充分描述的抗原或具有與結(jié)合配偶體(例如myc附加表位、組氨酸標(biāo)記、T7附加表位等，參見6.2.6一節(jié)和圖11a-11c)的已知結(jié)合特性的生物分子的編碼序列標(biāo)記編碼序列。然后可以利用這種額外的序列，利用結(jié)合基團(tuán)與連接到固相基質(zhì)的其相應(yīng)的伴侶的相互作用，來純化Nogo蛋白、蛋白片段或衍生物。
可以使用多種宿主-載體系統(tǒng)，來表達(dá)蛋白編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不限于用病毒(痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，例如含酵母載體的酵母，或用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。載體的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性方面不同。根據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用多種合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任一種。在具體實(shí)施方案中，表達(dá)人Nogo基因或編碼人Nogo功能活性部分的序列，作為一個(gè)具體實(shí)例，或者表達(dá)Nogo A、Nogo B或Nogo C(圖1b)。在再一實(shí)施方案中，表達(dá)包含所述Nogo蛋白一個(gè)結(jié)構(gòu)域的Nogo片段。
如本文所用，如果在通過例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)等將細(xì)胞中天然不存在的核酸引入細(xì)胞或其祖先中后，這種細(xì)胞含有所述核酸，則所述細(xì)胞被所述核酸“轉(zhuǎn)化”。
也提供了編碼人Nogo A片段的核苷酸序列，所述片段包含選自SEQ ID NO30的氨基酸殘基1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939和940-1127的氨基酸序列。也提供了編碼人Nogo A截短部分的核苷酸序列；所述截短蛋白缺乏SEQ ID NO30的氨基酸殘基132-206、氨基酸殘基939-1127或氨基酸殘基132-206和939-1127，但在其它部分包含SEQ ID NO30的其余部分。
先前描述的將DNA片段插入載體中的任何方法均可以用來構(gòu)建含嵌合基因的表達(dá)載體，所述嵌合基因包含合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)和蛋白編碼序列。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組體(遺傳重組)。編碼Nogo蛋白或肽片段的核酸序列的表達(dá)，可以通過第二核酸序列來調(diào)節(jié)，以使所述Nogo蛋白或肽在用所述重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)。例如Nogo蛋白的表達(dá)可以由本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件控制。典型的實(shí)施方案是應(yīng)用6.2.1一節(jié)中討論的Nogo天然啟動(dòng)子之一，或者是P1或者是P2。也可以使用非天然啟動(dòng)子?？梢杂脕砜刂芅ogo表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、勞斯肉瘤病毒3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列中含有的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-799)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature 29639-42)；原核生物表達(dá)載體，例如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；也參見在于Scientific American，1980，24274-94的“得自重組細(xì)菌的有用蛋白”；包含胭脂堿合成酶啟動(dòng)子區(qū)(Herrera-Estrella等，Nature 303209-213)或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.92871)和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動(dòng)子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310115-120)的植物表達(dá)載體；得自酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件，例如Gal4啟動(dòng)子、ADC(乙醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，以及表現(xiàn)出組織特異性并已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的以下動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等，1984，Cell 38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，Cell 38647-658；Adames等，1985，Nature318533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、在睪丸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，Cell 45485-495)、在肝臟中有活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1268-276)、在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer等，1987，Science 23553-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1161-171)、在髓樣細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，Nature315338-340；Kollias等，1986，Cell 4689-94)；在大腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制(Readhead等，1987，Cell 48703-712)；在骨骼肌中有活性的髓磷脂輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature 314283-286)和在下丘腦中有活性的促性腺素釋放素基因控制區(qū)(Mason等，1986，Science 2341372-1378)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用的載體包含一個(gè)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子有效連接于Nogo編碼核酸、一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和任選的一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記(例如抗生素抗生基因)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過將Nogo編碼序列亞克隆到三種pGEX載體(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體；Smith和Johnson，1988，Gene 731-40)的每一種EcoRI限制位點(diǎn)中，制備表達(dá)構(gòu)成物。這便于從所述亞克隆中以正確的讀框表達(dá)所述Nogo蛋白產(chǎn)物。
通過以下三種通用方法可以鑒定含有Nogo基因插入片段的表達(dá)載體(a)核酸雜交，(b)“標(biāo)記”基因功能的存在與否，和(c)所插入序列的表達(dá)。在第一種方法中，采用包含與所插入的Nogo基因同源的序列的探針，通過核酸雜交可以檢測(cè)出插入表達(dá)載體中的Nogo基因的存在。在第二種方法中，根據(jù)因Nogo基因插入載體中而引起的某些“標(biāo)記”基因功能(例如胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、在桿狀病毒中形成包含體等)的存在與否，可以鑒定和選擇所述重組載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果Nogo基因插入該載體的標(biāo)記基因序列中，則根據(jù)標(biāo)記基因功能的缺乏可以鑒定出含所述Nogo插入片段的重組體。在第三種方法中，通過分析所述重組體表達(dá)的Nogo產(chǎn)物，可以鑒定重組表達(dá)載體。這種測(cè)定可以基于例如體外測(cè)定系統(tǒng)中Nogo蛋白的物理特性或功能特性，例如與抗Nogo抗體的結(jié)合。
一旦鑒定并分離出特定的重組DNA分子，則可以用本領(lǐng)域已知的幾種方法來繁殖所述DNA分子。一旦確立了合適的宿主系統(tǒng)和生長(zhǎng)條件，則可以繁殖重組表達(dá)載體和大量制備。如前所解釋，可以使用的表達(dá)載體包括但不限于以下載體或其衍生物人或動(dòng)物病毒，例如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒，例如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如λ)以及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，這僅例舉少數(shù)實(shí)例。
另外，可以選擇調(diào)節(jié)所插入序列表達(dá)、或以所需特定方式修飾和加工所述基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。來自某些啟動(dòng)子的表達(dá)在某些誘導(dǎo)物存在的可以增加；因此，可以控制遺傳工程N(yùn)ogo蛋白的表達(dá)。此外，不同的宿主細(xì)胞具有用于轉(zhuǎn)錄和翻譯后加工和修飾(例如蛋白的糖基化、磷酸化)的特征性和特異性的機(jī)制。可以選擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)的外源蛋白的所需修飾和加工。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可以用來產(chǎn)生未糖基化的核心蛋白產(chǎn)物。在酵母中的表達(dá)將產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可以用來確保異源蛋白的“天然”糖基化。此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可以在不同程度上影響加工反應(yīng)。
在其它具體實(shí)施方案中，所述Nogo蛋白、片段、類似物或衍生物可以作為融合物、或嵌合蛋白產(chǎn)物(包含通過肽鍵連接于異源蛋白序列(不同蛋白的)的所述蛋白、片段、類似物或衍生物)來表達(dá)。通過采用本領(lǐng)域已知的方法，將編碼所需氨基酸序列的合適核酸序列在正確的編碼框內(nèi)相互連接，并通過本領(lǐng)域通常已知的方法表達(dá)所述嵌合產(chǎn)物，可以制備這種嵌合產(chǎn)物?；蛘?，通過蛋白合成技術(shù)，例如利用肽合成儀，可以制備這種嵌合產(chǎn)物。
可以克隆并表達(dá)cDNA序列和基因組序列。
5.3 Nogo基因產(chǎn)物的鑒定和純化在特定方面，本發(fā)明提供Nogo、特別是人Nogo、包含抗原決定簇(即可以被抗體識(shí)別的)或有其它功能活性的其片段和衍生物的氨基酸序列、以及編碼上述氨基酸序列的核酸序列。本文所用的“功能活性”Nogo物質(zhì)是指表現(xiàn)出一種或多種與全長(zhǎng)(野生型)Nogo A蛋白相關(guān)的已知功能活性，例如非許可底物特性、背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱、NIH3T3散布抑制、神經(jīng)突向外生長(zhǎng)抑制、與Nogo底物或Nogo結(jié)合配偶體的結(jié)合、抗原性(與抗Nogo抗體的結(jié)合)、免疫原性等。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供Nogo蛋白的片段，所述片段包含至少6個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸、17個(gè)氨基酸、50個(gè)氨基酸、100個(gè)氨基酸或至少220個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，所述蛋白包含或高度保守的Nogo羧基末端結(jié)構(gòu)域(Nogo A的羧基末端188個(gè)氨基酸)或基本上由所述結(jié)構(gòu)域組成。也提供片段或包含片段的蛋白，所述片段缺乏Nogo蛋白的保守羧基末端結(jié)構(gòu)域或疏水羧基末端序列段、或氨基末端酸性結(jié)構(gòu)域、或氨基末端聚脯氨酸區(qū)或其任何組合。提供編碼上述片段或蛋白的核酸。
一旦鑒定出表達(dá)Nogo基因序列的重組體，則可以分析所述基因產(chǎn)物。通過根據(jù)所述產(chǎn)物的物理或功能特性的測(cè)定，包括將所述產(chǎn)物放射性標(biāo)記，然后通過凝膠電泳、免疫測(cè)定等進(jìn)行分析，可以完成這一步。
一旦鑒定出Nogo蛋白，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法將其分離和純化，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括層析(例如離子交換層析、親和層析和大小柱層析)、離心、差別溶解度或蛋白純化的其它任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。采用任何合適的測(cè)定，包括背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱、NIH 3T3散布抑制、抑制視神經(jīng)中的神經(jīng)突再生(參見6.2.4-6.2.5小節(jié))，可以評(píng)估功能特性。
或者，一旦鑒定出由重組體產(chǎn)生的Nogo蛋白，則可以根據(jù)所述重組體中包含的嵌合基因的核苷酸序列推導(dǎo)出所述蛋白的氨基酸序列。因此，可以采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法(例如參見Hunkapiller，M.等，1984，Nature 310105-111)合成所述蛋白。
在另一替代實(shí)施方案中，采用標(biāo)準(zhǔn)方法例如上述方法(例如免疫親和純化)，從天然來源中純化天然Nogo C。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，無論是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的，還是通過化學(xué)合成方法或純化天然蛋白產(chǎn)生的這種Nogo蛋白，包括但不限于含有作為第一氨基酸的基本上如圖2a(SEQ ID NO2)中所示、圖12(SEQ ID NO29)中的牛、或圖13(SEQ ID NO30)中的人的氨基酸序列的全部或部分、以及片段和其它衍生物(例如但不限于圖18中所示的)和其類似物的那些蛋白，包括與其同源的蛋白。最好是，本發(fā)明的Nogo蛋白不含與所述Nogo蛋白天然連接的所有CNS髓磷脂物質(zhì)。
5.4 Nogo基因和蛋白的結(jié)構(gòu)通過本領(lǐng)域已知的各種方法和以下小節(jié)中描述的這些方法中的幾種方法，可以分析Nogo基因和蛋白的結(jié)構(gòu)。
5.4.1遺傳分析采用包括但不限于DNA印跡雜交(Southern，E.M.，1975，J.Mol.Biol.98503-517)、RNA印跡雜交(參見例如Freeman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.804094-4098)、限制性內(nèi)切核酸酶圖譜(Maniatis，T.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)和DNA序列分析的方法，可以分析相應(yīng)于Nogo基因的克隆的DNA或cDNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；美國(guó)專利第4,683,202、4,683,195和4,889,818號(hào)；Gyllenstein等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857652-7656；Ochman等，1988，Genetics 120621-623；Loh等，1989，Science 243217-220)，然后用Nogo特異性探針進(jìn)行DNA印跡雜交，可以允許檢測(cè)出得自各種細(xì)胞類型的DNA中的Nogo基因。非PCR的擴(kuò)增方法是通常已知的，也可以使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用DNA印跡雜交來測(cè)定Nogo的遺傳連鎖?？梢杂肦NA印跡雜交分析來確定Nogo基因的表達(dá)?？梢詼y(cè)試不同發(fā)育狀態(tài)和活性狀態(tài)的各種細(xì)胞類型的Nogo表達(dá)?？梢钥刂艱NA和RNA印跡雜交的雜交條件的嚴(yán)格性，以確保具有所需程度的與所用的特異性Nogo探針相關(guān)性的核酸的檢測(cè)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域通常已知的這些方法和其它方法的修改方法。
可以用限制性內(nèi)切核酸酶圖譜來大致確定Nogo基因的基因結(jié)構(gòu)。通過限制性內(nèi)切核酸酶酶切得到的限制性圖譜可以通過DNA序列分析來證實(shí)。
可以采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，包括但不限于Maxam和Gilbert的方法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)、Sanger雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)、應(yīng)用T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，美國(guó)專利第4,795,699號(hào))或應(yīng)用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(例如Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，進(jìn)行DNA序列分析。
5.4.2蛋白分析通過從DNA序列推導(dǎo)，或者通過蛋白直接測(cè)序例如用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀，可以得到Nogo蛋白的氨基酸序列。
通過親水性分析(Hopp，T.和Woods，K.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824)，可以進(jìn)一步特征鑒定Nogo蛋白序列?？梢杂糜H水性分布型來鑒定Nogo蛋白的疏水區(qū)和親水區(qū)以及編碼這些區(qū)的基因序列的相應(yīng)區(qū)。
其次，也可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(Chou，P.和Fasman，G.，1974，Biochemistry 13222)，以鑒定Nogo的采取特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域。
采用本領(lǐng)域可利用的計(jì)算機(jī)軟件程序，也可以完成序列同源物的操作、翻譯、和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、可讀框預(yù)測(cè)和作圖以及測(cè)定。
也可以利用其它結(jié)構(gòu)分析方法。這些包括但不限于X射線晶體學(xué)(Engstom，A.，1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)和計(jì)算機(jī)制作模型(Fletterick，R.和Zoller，M.(主編)，1986，Computer Graphics andMolecular Modeling，載于Current Communications in MolecularBiology，Dold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)。
5.5抗Nogo蛋白的抗體及其衍生物的產(chǎn)生按照本發(fā)明，所述Nogo蛋白、其片段或其它衍生物或其類似物可以用作免疫原，以產(chǎn)生免疫特異性地結(jié)合這種免疫原的抗體。這種抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)。產(chǎn)生針對(duì)大鼠和牛Nogo重組片段的抗體(6.1.7一節(jié))，這些抗體也與其它種類的表位交叉反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，鑒定為親水性的Nogo蛋白片段用作免疫原，以用于抗體產(chǎn)生。
本領(lǐng)域已知的各種方法可以用以產(chǎn)生抗Nogo蛋白或衍生物或類似物的多克隆抗體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，可以獲得針對(duì)圖2a中SEQ ID NO2、圖12中SEQ ID NO29、圖14中SEQ ID NO32或圖13中SEQ ID NO30(分別為大鼠NogoA、牛Nogo、大鼠NogoC或人Nogo)的序列或其亞序列編碼的Nogo蛋白表位的兔多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，可以通過用所述天然Nogo蛋白或合成形式的Nogo蛋白或其衍生物(例如片段)注射，可以免疫各種宿主動(dòng)物，所述動(dòng)物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。可以根據(jù)宿主物種使用各種佐劑來增加免疫應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、無機(jī)凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和可能有用的人用佐劑例如BCG(卡介菌)和小棒桿菌。
對(duì)于針對(duì)Nogo蛋白序列或其類似物的單克隆抗體的制備，可以使用提供用于由培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)。例如，最初由Kohler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature 256495-497)以及trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，ImmunologyToday 472)和EBV-雜交瘤技術(shù)，以產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan.R.Liss，Inc.，第77-96頁)?？梢岳卯?dāng)前的技術(shù)(PCT/US90/02545)，在無菌動(dòng)物中生產(chǎn)單克隆抗體。按照本發(fā)明，可以使用人抗體，并且可以采用人雜交瘤(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030)或通過用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第77-96頁)獲得人抗體。事實(shí)上，按照本發(fā)明，可以使用開發(fā)用于生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851-6855；Neuberger等，1984，Nature312604-608；Takeda等，1985，Nature 314452-454)，即通過將得自Nogo特異性小鼠抗體分子的基因與得自具有合適生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起；這種抗體在本發(fā)明范圍內(nèi)。
按照本發(fā)明，描述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)可以用來生產(chǎn)Nogo特異性單鏈抗體。描述用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)也可以利用(Huse等，1989，Science 2461275-1281)，以提供快速且容易鑒定對(duì)Nogo蛋白、衍生物或類似物具有所需特異性的單克隆Fab片段。
可以采用已知技術(shù)產(chǎn)生含有獨(dú)特型所述分子的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于F(ab’)2片段，可以通過胃蛋白酶消化所述抗體分子產(chǎn)生； Fab’片段，可以通過還原F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生；Fab片段，可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生；和Fv片段。
在抗體生產(chǎn)中，可以采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，完成所需抗體的篩選。例如，為了選擇識(shí)別Nogo蛋白特定結(jié)構(gòu)域的抗體，人們可以測(cè)定所產(chǎn)生雜交瘤的與含這種結(jié)構(gòu)域的Nogo片段結(jié)合的產(chǎn)物。對(duì)于特異性結(jié)合第一Nogo同源物、但不特異性地結(jié)合不同Nogo同源物的抗體的選擇，人們可以在與所述第一Nogo同源物結(jié)合但缺乏與所述第二Nogo同源物結(jié)合的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。
也提供對(duì)Nogo蛋白一個(gè)結(jié)構(gòu)域特異性的抗體。
上述抗體可以用于本領(lǐng)域中已知的方法中，所述方法涉及本發(fā)明Nogo蛋白序列的定位和活性，例如用于這些蛋白的成象、在合適生理樣品中、在診斷方法中測(cè)定Nogo蛋白的水平等。
抗Nogo抗體以及含所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其片段是治療劑。
5.6 Nogo蛋白、衍生物和類似物本發(fā)明還涉及Nogo蛋白以及Nogo蛋白的衍生物(包括但不限于片段)和類似物。也提供編碼Nogo蛋白衍生物和蛋白類似物的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Nogo蛋白由上文5.1一節(jié)中描述的Nogo核酸編碼。在特定方面，動(dòng)物例如小鼠、大鼠、豬、牛、狗、猴子人、蠅或青蛙的Nogo A、Nogo B或Nogo C蛋白以及衍生物或類似物在本發(fā)明范圍內(nèi)。
與Nogo相關(guān)的衍生物和類似物的生產(chǎn)和應(yīng)用也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述衍生物或類似物是有功能活性的，即能夠表現(xiàn)出與全長(zhǎng)野生型Nogo蛋白相關(guān)的一種或多種功能活性。作為一個(gè)實(shí)例，具有所需免疫原性或抗原性的這種衍生物或類似物可以用于例如免疫測(cè)定、用于免疫、用于抑制Nogo活性等。保留或者缺乏或者抑制所需目的Nogo特性(例如與Nogo結(jié)合配偶體結(jié)合)的衍生物或類似物，可以分別用作這種特性及其生理相關(guān)特性的誘導(dǎo)物或抑制劑。一個(gè)具體實(shí)施方案涉及可以被抗Nogo抗體結(jié)合的Nogo片段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，包括但不限于6.1.10-6.1.12節(jié)中描述的測(cè)定，測(cè)試Nogo的衍生物或類似物的所需活性。
為了將Nogo的活性區(qū)作圖，可以通過如6.2.7中描述的重組DNA技術(shù)，制備一系列Nogo缺失突變體。缺失突變體中存在的Nogo部分示于圖18中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供Nogo片段，例如包含Nogo A(SEQ ID NO2)的氨基酸1-171、172-974、259-542、542-722、722-974、172-259或975-1162或上述的組合(或者由上述氨基酸或它們的組合組成)的片段。也提供缺乏SEQ ID NO2的氨基酸172-259和/或975-1162的Nogo的截短突變體，因?yàn)檫@些區(qū)看來是非必需的，并且可以從Nogo中除去而不影響生物活性。也提供包含SEQ ID NO30的氨基酸1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939或940-1127(或者由上述氨基酸)的人Nogo A相應(yīng)的片段。也提供缺乏SEQ ID NO30的氨基酸殘基132-206、氨基酸殘基939-1127或氨基酸殘基132-206和939-1127的人Nogo A的截短突變體。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述片段不含所有CNS髓磷脂物質(zhì)和/或表現(xiàn)出對(duì)Nogo的抑制活性。也提供包含與非Nogo序列融合的一種或多種上述片段的融合蛋白。
通過提供功能等同分子的置換、添加或缺失而改變Nogo序列，可以制備Nogo基因衍生物。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，編碼基本上與Nogo基因相同的氨基酸序列的其它DNA序列可以用于實(shí)施本發(fā)明。這些包括但不限于包含Nogo基因的全部或部分的核苷酸序列，其中所述Nogo基因通過置換編碼該序列內(nèi)功能等同氨基酸殘基的不同密碼子而改變，由此產(chǎn)生沉默改變。同樣，本發(fā)明的Nogo衍生物包括但不限于含有作為第一氨基酸序列的Nogo蛋白氨基酸的全部或部分，其中所述Nogo蛋白的氨基酸包括改變的序列，其中功能等同氨基酸殘基取代了該序列內(nèi)的殘基，導(dǎo)致沉默改變。例如，該序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被具有相似極性的另一氨基酸保守性取代，這可用作功能等同物，導(dǎo)致沉默改變。該序列內(nèi)氨基酸的置換可以選自所述氨基酸所屬類別的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了由Nogo蛋白片段組成或包含所述片段的蛋白，所述片段由Nogo蛋白的至少10個(gè)(連續(xù)的)氨基酸組成。在其它實(shí)施方案中，所述片段由所述Nogo蛋白的至少17個(gè)或50個(gè)氨基酸組成。在具體實(shí)施方案中，這種片段不大于35、100或200個(gè)氨基酸。Nogo的衍生物或類似物包括但不限于包含以下區(qū)的那些分子基本上與Nogo或其片段同源的區(qū)(例如在不同實(shí)施方案中，在相同大小的氨基酸序列內(nèi)或當(dāng)同其中由本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序序列對(duì)比的序列對(duì)比序列進(jìn)行比較時(shí)，同一性至少為60％或70％或80％或90％或95％，所述計(jì)算機(jī)同源性程序例如BLAST計(jì)算機(jī)檢索(Altschul等，1994，Nature Genet.6119-129))；或其編碼核酸在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或非嚴(yán)格條件下能夠與Nogo編碼序列雜交的那些區(qū)。
也提供包含Nogo片段的分子，例如含有與其它部分(包括標(biāo)記或生物活性部分)碳?xì)滏I合的分子。
可以采用各種本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生本發(fā)明的Nogo衍生物和類似物。導(dǎo)致其產(chǎn)生的操作可以發(fā)生在基因水平或蛋白水平上。例如，可以通過本領(lǐng)域已知的多種策略中的任一種(Maniatis，T.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)，修飾所克隆的Nogo基因序列?？梢詫⒃撔蛄性诤线m的位點(diǎn)用限制性內(nèi)切核酸酶切割，然后如有需要進(jìn)行進(jìn)一步的酶促修飾、分離和體外連接。在編碼Nogo衍生物或類似物的基因的產(chǎn)生中，應(yīng)該小心確保所修飾的基因保留在與Nogo相同的翻譯讀框內(nèi)，在編碼所需Nogo活性的基因區(qū)域內(nèi)不被翻譯終止信號(hào)中斷。
另外，所述Nogo編碼核酸序列可以在體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或在編碼區(qū)中產(chǎn)生變異和/或形式新的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或破壞現(xiàn)有的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，以促進(jìn)進(jìn)一步的體外修飾?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于化學(xué)誘變、體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson，C.等，1978，J.Biol.Chem 2536551)、應(yīng)用TAB接頭(Pharmacia)等。
也可以在蛋白水平進(jìn)行Nogo序列的操作。本發(fā)明范圍內(nèi)包括在翻譯期間或翻譯后例如通過以下方法差別修飾的Nogo蛋白片段或其它衍生物或類似物，所述方法例如糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、用已知的保護(hù)基團(tuán)/封閉基團(tuán)衍生、蛋白水解酶切、與抗體分子或其它細(xì)胞配體連接等。可以用已知技術(shù)，包括但不限于采用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特異性切割；乙酰化、甲?；?、氧化、還原；在衣霉素存在下的代謝合成等進(jìn)行多種化學(xué)修飾的任一種。
另外，可以化學(xué)合成Nogo的類似物和衍生物。例如，可以利用肽合成儀，合成對(duì)應(yīng)于Nogo蛋白含有所需結(jié)構(gòu)域或介導(dǎo)體外所需活性的部分的肽。此外，如有需要，可以將非典型氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物作為置換或添加引入到Nogo序列中。非典型氨基酸一般包括但不限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸Abu、2-氨基丁酸γ-Abu、ε-Ahx 6-氨基己酸、Aib2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、設(shè)計(jì)者氨基酸(designer amino acid)例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸類似物。此外，所述氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述Nogo衍生物是嵌合蛋白或融合蛋白，包含一種Nogo蛋白或其片段(最好由至少一個(gè)Nogo蛋白結(jié)構(gòu)域或基序、或Nogo蛋白的至少10個(gè)氨基酸組成)，所述Nogo蛋白或其片段在其氨基末端或羧基末端通過肽鍵連接于一種不同蛋白的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過重組表達(dá)編碼該蛋白的核酸(包含與不同蛋白的編碼序列符合讀框地連接的Nogo編碼序列)產(chǎn)生這種嵌合蛋白。通過將編碼所需氨基酸序列的合適的核酸序列通過本領(lǐng)域已知的方法在正確的讀框中相互連接，并通過本領(lǐng)域通常已知的方法表達(dá)所述嵌合產(chǎn)物，可以制備這種嵌合產(chǎn)物?；蛘?，通過蛋白合成技術(shù)，例如利用肽合成儀，可以制備這種嵌合產(chǎn)物。可以構(gòu)建包含與任何異源蛋白編碼序列融合的Nogo部分的嵌合基因。這種異源蛋白編碼序列包括例如六組氨酸標(biāo)記和T7標(biāo)記。一個(gè)具體實(shí)施方案涉及包含Nogo的至少6個(gè)氨基酸的片段的嵌合蛋白。
在另一具體實(shí)施方案中，所述Nogo衍生物是包含一個(gè)與Nogo蛋白同源的區(qū)的分子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Nogo衍生物(例如片段)是非天然存在的蛋白。
衍生物和類似物的其它具體實(shí)施方案在以下小節(jié)和下文的實(shí)施例一節(jié)中描述。
5.6.1含有一個(gè)或多個(gè)Nogo蛋白結(jié)構(gòu)域的Nogo衍生物在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及Nogo衍生物和類似物，特別涉及包含一個(gè)或多個(gè)Nogo蛋白結(jié)構(gòu)域或者由所述結(jié)構(gòu)域組成的Nogo片段和這種片段的衍生物，所述片段包括但不限于保守的羧基末端和疏水結(jié)構(gòu)域或氨基末端酸性或富聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域、上述任一種的功能(例如結(jié)合)片段、或上述的任何組合。
一個(gè)具體實(shí)施方案涉及包含Nogo特定片段的分子，所述特定片段是在各種Nogo蛋白中與大鼠或牛Nogo蛋白的特定片段同源性最強(qiáng)的那些片段。包含Nogo同源物的一個(gè)結(jié)構(gòu)域的片段可以通過如6.1.2、6.1.8、6.1.9、6.1.10、6.1.11或6.1.12中描述的蛋白分析方法來鑒定。
在另一具體實(shí)施方案中，提供包含Nogo蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(或其功能部分)、但也缺乏Nogo蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(或其功能部分)的分子。在另一實(shí)施方案中，提供包含Nogo蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(或其功能部分)并具有Nogo蛋白的一個(gè)或多個(gè)突變(例如由缺失或點(diǎn)突變引起的)結(jié)構(gòu)域(例如以使所述突變結(jié)構(gòu)域功能降低了)的分子。
5.7 Nogo蛋白、衍生物和類似物的分析Nogo蛋白、衍生物和類似物的功能活性可以通過各種方法分析。在以下部分中描述功能測(cè)定不是意味著限制性的，可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它測(cè)定。
5.7.1 Nogo體外神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制的測(cè)定在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以采用體外組織培養(yǎng)(6.1.10一節(jié))分析Nogo蛋白、衍生物和類似物對(duì)NIH3T3散布的抑制或?qū)C12神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的抑制。
在一個(gè)替代實(shí)施方案中，可以用Nogo蛋白、衍生物和類似物來分析由于Nogo存在而誘導(dǎo)的外植雞背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱。同樣，可以根據(jù)對(duì)外植雞背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的抑制，分析Nogo的功能(Spillman等，1998，J.Biol.Chem.27319283-19293)。
5.7.2 Nogo體內(nèi)功能特性的分析在一個(gè)實(shí)施例中，Nogo蛋白、衍生物和類似物的拮抗劑可以用于采用在長(zhǎng)距離內(nèi)皮質(zhì)脊髓束(CST)再生和行為恢復(fù)的動(dòng)物模型的體內(nèi)功能測(cè)定中。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過外科切除術(shù)或脊髓挫傷損傷嚙齒動(dòng)物皮質(zhì)脊髓束，然后給予所述動(dòng)物Nogo的拮抗劑。關(guān)于結(jié)構(gòu)可塑性或再生，通過解剖學(xué)技術(shù)，主要通過標(biāo)記限定的神經(jīng)束，監(jiān)測(cè)與未處理對(duì)照動(dòng)物或?qū)φ湛贵w處理的動(dòng)物相比的神經(jīng)可塑性、再生和功能恢復(fù)。通過用嚙齒動(dòng)物進(jìn)行的行動(dòng)和通過電生理學(xué)殺傷試驗(yàn)(例如粘性紙?jiān)囼?yàn)(sticky paper test)、足彈丸達(dá)到任務(wù)(food pellet reaching task)等)(Thallmair等，1998，Nat.Neuroscience 1(2)124-131)，測(cè)定功能的恢復(fù)。
5.7.3 Nogo配體結(jié)合抑制及其測(cè)定在分析與野生型Nogo結(jié)合或與野生型Nogo競(jìng)爭(zhēng)與抗Nogo抗體結(jié)合能力的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種免疫測(cè)定方法，包括但不限于采用諸如以下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾層”免疫測(cè)定、免疫放射分析、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、原位免疫測(cè)定(采用例如膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測(cè)定(例如凝膠凝集測(cè)定、血凝測(cè)定)、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、A蛋白測(cè)定和免疫電泳測(cè)定等。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過檢測(cè)第一抗體上的標(biāo)記來檢測(cè)抗體結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，通過檢測(cè)第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合，檢測(cè)第一抗體。在再一實(shí)施方案中，標(biāo)記第二抗體。本領(lǐng)域已知用于在免疫測(cè)定中檢測(cè)結(jié)合的許多方法，這些方法在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在鑒定Nogo結(jié)合蛋白的另一實(shí)施方案中，可以例如通過本領(lǐng)域眾所周知的方法分析結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，可以分析Nogo與其底物結(jié)合的生理相關(guān)物。
其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在本發(fā)明范圍內(nèi)。
5.8治療應(yīng)用本發(fā)明可供用于通過給予治療化合物(本文稱為“治療劑”)治療或預(yù)防各種疾病和紊亂。這種“治療劑”包括但不限于Nogo蛋白及其類似物和衍生物(包括片段)(例如如上所述的)；其抗體(如上所述)；編碼所述Nogo蛋白、類似物或衍生物的核酸(例如如上所述的)；Nogo反義核酸以及Nogo激動(dòng)劑和拮抗劑。通過給予促進(jìn)Nogo功能的治療劑，治療或預(yù)防涉及使細(xì)胞生長(zhǎng)去調(diào)節(jié)的疾病例如CNS腫瘤。通過給予拮抗(抑制)Nogo功能的治療劑，治療神經(jīng)突生長(zhǎng)、再生或維持缺陷或希望神經(jīng)突生長(zhǎng)、再生或維持缺陷的疾病。上述內(nèi)容在以下小節(jié)中詳細(xì)描述。
一般而言，最好是給予物種來源或物種反應(yīng)性(在抗體的情況下)與患者相同的制品。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將人Nogo蛋白、衍生物、或類似物、或核酸、或抗人Nogo蛋白的抗體治療性或預(yù)防性地給予病人。
5.8.1涉及去調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病的治療和預(yù)防通過給予促進(jìn)(即增加或供應(yīng))Nogo功能的治療劑，治療或預(yù)防涉及去調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病或紊亂。這種治療劑的實(shí)例包括但不限于Nogo蛋白、衍生物或有功能活性的、特別是在抑制神經(jīng)突延伸或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制方面有活性(例如在體外測(cè)定或動(dòng)物模型中證明的)的片段；和編碼Nogo蛋白或其功能活性衍生物或片段的核酸(例如用于基因治療)。最好是，所述Nogo蛋白、衍生物或其片段不含與其天然連接的所有CNS髓磷脂物質(zhì)。采用體外測(cè)定或動(dòng)物模型(其實(shí)例在下文描述)，可以鑒定出可以使用的其它治療劑，例如Nogo激動(dòng)劑。
在具體實(shí)施方案中，在以下疾病或紊亂中治療性(包括預(yù)防性)給予促進(jìn)Nogo功能的治療劑(1)涉及Nogo蛋白或功能缺乏或水平降低(相對(duì)于正常或所需的)的疾病或紊亂，例如在Nogo蛋白缺乏、遺傳缺陷、無生物活性或活性不足或表達(dá)不足的患者中；或(2)其中體外(或體內(nèi))測(cè)定(參見下文)表明Nogo激動(dòng)劑給予效用的疾病或紊亂。例如通過獲得患者組織樣品(例如得自活檢組織)并體外分析其RNA或蛋白水平、所表達(dá)的RNA或蛋白的結(jié)構(gòu)和/或活性，可以容易地檢測(cè)到Nogo蛋白或功能缺乏或水平降低。因此可以使用本領(lǐng)域的許多標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于激酶測(cè)定、檢測(cè)和/或顯現(xiàn)Nogo蛋白的免疫測(cè)定(例如蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細(xì)胞化學(xué)等)和/或通過檢測(cè)和/或顯現(xiàn)Nogo mRNA檢測(cè)Nogo表達(dá)的雜交測(cè)定(例如RNA印跡測(cè)定、斑點(diǎn)印跡、原位雜交等)等。
可以治療或預(yù)防涉及去調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病或紊亂包括但不限于增生性疾病、惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等。以下詳細(xì)描述這些疾病或紊亂的實(shí)例。
5.8.1.1腫瘤生長(zhǎng)可以通過給予促進(jìn)Nogo功能的治療劑治療或預(yù)防的腫瘤生長(zhǎng)和相關(guān)疾病，包括但不限于表1所列的(關(guān)于這類疾病的綜述，請(qǐng)參見Fishman等，1985，Medicine，第二版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphoa)表1腫瘤生長(zhǎng)和相關(guān)疾病實(shí)體瘤肉瘤和癌神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤星形細(xì)胞瘤成神經(jīng)細(xì)胞瘤顱咽管瘤室管膜瘤松果體瘤成血管細(xì)胞瘤聽神經(jīng)瘤少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤menangioma成神經(jīng)細(xì)胞瘤成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤在具體實(shí)施方案中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓或任何神經(jīng)組織中治療或預(yù)防惡性腫瘤或增殖障礙(dysproliferative)變化(例如組織轉(zhuǎn)化和發(fā)育異常)或高增生性(hyperproliferative)疾病。
5.8.1.2惡化前病癥也可以給予促進(jìn)Nogo活性的本發(fā)明治療劑，以治療惡化前病癥和防止進(jìn)行至腫瘤或惡性腫瘤狀態(tài)，包括但不限于表1所列的疾病。這種預(yù)防或治療應(yīng)用適用于已知或懷疑在腫瘤狀態(tài)或癌癥之前的進(jìn)程的病癥，特別是，其中已經(jīng)發(fā)生非腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)包括增生、組織轉(zhuǎn)化，或最特別是已經(jīng)發(fā)生發(fā)育異常(關(guān)于這種異常生長(zhǎng)病癥的綜述，請(qǐng)參見Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79頁)。增生是一種形式的受控細(xì)胞增殖，涉及在組織或器官中細(xì)胞數(shù)目增加，而其結(jié)構(gòu)或功能沒有顯著改變。組織轉(zhuǎn)化是一種形式的受控細(xì)胞生長(zhǎng)，其中一種類型的成熟或全分化的細(xì)胞取代另一種類型的成熟細(xì)胞。組織轉(zhuǎn)化可以發(fā)生在表皮細(xì)胞或結(jié)締組織細(xì)胞中。非典型組織轉(zhuǎn)化涉及略微無序的(disorderly)組織轉(zhuǎn)化表皮。發(fā)育異常通常是癌的前兆，并且主要發(fā)現(xiàn)于表皮中；它是非腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的最無序的形式，涉及單個(gè)細(xì)胞一致性的降低和細(xì)胞構(gòu)筑定向的降低。發(fā)育異常的細(xì)胞通常具有異常大的、深染色的細(xì)胞核，表現(xiàn)出復(fù)型現(xiàn)象。發(fā)育異常特征性地發(fā)生在存在慢性刺激或炎癥的地方。
或者或除存在特征為增生、組織轉(zhuǎn)化或發(fā)育異常的異常細(xì)胞生長(zhǎng)外，得自患者的細(xì)胞樣品體內(nèi)表現(xiàn)出或體外表現(xiàn)出的存在一種或多種轉(zhuǎn)化表型或惡性腫瘤表型特征，可能表明預(yù)防性/治療性給予促進(jìn)Nogo功能的治療劑是合乎需要的。如上所述，這種轉(zhuǎn)化表型特征包括形態(tài)改變、基質(zhì)粘附更松散、接觸抑制喪失、貼壁依賴性喪失、蛋白酶釋放、糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加、血清需求減少、胎兒抗原表達(dá)、250,000道爾頓細(xì)胞表面蛋白消失等。(關(guān)于與轉(zhuǎn)化表型或惡性腫瘤表型相關(guān)的特征，也參見文獻(xiàn)同上，第84-90頁)。
在其它實(shí)施方案中，通過給予有效量的治療劑治療表現(xiàn)出一種或多種以下惡性腫瘤的誘因因素的患者Von Recklinghausen或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的神經(jīng)纖維瘤病；參見Robbins和Angell，1976，BasicPathology，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第112-113頁)等)。
在另一具體實(shí)施方案中，將本發(fā)明的治療劑給予病人以防止進(jìn)行至腎、軟骨(胸骨的)、皮膚、骨骼肌、肺或脾的癌癥、黑素瘤或肉瘤。
5.8.1.3高增生性疾病和增殖障礙性疾病在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，促進(jìn)Nogo活性的治療劑用來治療或預(yù)防高增生性疾病或良性增殖障礙性疾病。具體實(shí)施方案涉及治療或預(yù)防肝硬化(瘢痕形成已經(jīng)超過正常肝再生過程的病癥)、治療瘢痕瘤(肥大性瘢痕)形成(在瘢痕形成過程干擾正常更新的皮膚毀損)、銀屑病(一種常見皮膚病，特征為皮膚過度增生和正確細(xì)胞命運(yùn)決定延遲)、良性腫瘤、纖維性囊腫病和組織肥大(例如前列腺增生)。
5.8.1.4基因治療在一個(gè)具體實(shí)施方案中，給予包含編碼Nogo蛋白或其功能衍生物的序列的核酸，通過基因治療促進(jìn)Nogo功能?；蛑委熓侵竿ㄟ^給予受治療者核酸進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，所述核酸產(chǎn)生其編碼蛋白，所述蛋白通過促進(jìn)Nogo功能介導(dǎo)治療效應(yīng)。
本領(lǐng)域中任何可利用的基因治療方法均可以按照本發(fā)明使用。以下描述典型的方法。
關(guān)于基因治療方法的一般綜述，請(qǐng)參見Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy 12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 387-95；Tolstoshev，1993，Ann，Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science 260926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；1993年5月，TIBTECH 11(5)155-215)。在Ausubel等(編碼)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；和Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY中，描述了可以使用的重組DNA技術(shù)的本領(lǐng)域通常已知的方法。
在一個(gè)優(yōu)選方面，所述治療劑包括作為表達(dá)載體部分的Nogo核酸，所述表達(dá)載體在合適宿主中表達(dá)Nogo蛋白或其片段或嵌合蛋白。特別是，這種核酸具有有效連接于Nogo編碼區(qū)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型或組成型，以及任選地可以為組織特異性的啟動(dòng)子。在另一具體實(shí)施方案中，在使用的核酸分子中Nogo編碼序列和任何其它所需序列鄰接促進(jìn)于基因組中所需位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的區(qū)域，因此可供用于染色體內(nèi)表達(dá)Nogo核酸(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342435-438)。
將所核酸傳遞至患者可以或者是直接的，或者是間接的，在直接傳遞的情況下，所述患者直接暴露于所述核酸或攜帶核酸的載體，在間接傳遞的情況下，細(xì)胞首先用所述核酸體外轉(zhuǎn)化，然后移植到所述患者中。這兩種方法是分別稱為活體內(nèi)或活體外基因治療。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將所述核酸直接體內(nèi)給予，其中所述核酸表達(dá)產(chǎn)生所編碼產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種完成，例如通過將其作為合適核酸表達(dá)載體的部分來構(gòu)建，并將其給予以使其稱為細(xì)胞內(nèi)的，例如通過采用缺陷型或減毒反轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體進(jìn)行感染(參見美國(guó)專利第4,980,286號(hào))；或通過直接注射裸露DNA或利用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)；或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被、在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z囊中包膠囊；或通過給予其連接已知進(jìn)入細(xì)胞核的肽的形式，通過給予其連接經(jīng)受受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體的形式(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)(它可以用來導(dǎo)向特異性表達(dá)所述受體的細(xì)胞類型)等。在另一實(shí)施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中所述配體包含基因融合病毒肽，以破壞核內(nèi)體，使得所述核酸能夠避免溶酶體的降解作用。在再一實(shí)施方案中，所述核酸通過導(dǎo)向特異性受體，可以在體內(nèi)定向，以進(jìn)行細(xì)胞特異性吸收和表達(dá)(參見例如PCT公告WO92/06180，公告日為1992年4月16日(Wu等)；WO92/22635，公告日為1992年12月23日(Wilson等)；WO92/20316，公告日為1992年11月26日(Findeis等)；WO93/14188，公告日為1993年7月22日(Clarke等)；WO93/20221，公告日為1993年10月14日(Young))?；蛘撸梢詫⑺龊怂峒?xì)胞內(nèi)引入，并通過同源重組摻入到宿主細(xì)胞DNA中以進(jìn)行表達(dá)(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342435-438)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用含有Nogo核酸的病毒載體。例如，可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller等，1993，Meth.Enzymol.217581-599)。這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)經(jīng)過修飾，以缺失病毒基因組包裝和整合到宿主細(xì)胞DNA中不需要的反轉(zhuǎn)錄病毒序列。將待用于基因治療的Nogo核酸克隆到該載體中，這有利于將所述基因傳遞到患者體內(nèi)。在Boesen等，1994，Biotherapy 6291-302中可以找到關(guān)于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的更詳細(xì)的資料，所述文獻(xiàn)描述了利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdrl基因傳遞至造血干細(xì)胞，以便產(chǎn)生對(duì)化療更具抗性的干細(xì)胞。描述在基因治療中應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的其它參考文獻(xiàn)是Clowes等，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Kierm等，1994，Blood831467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4129-141；和Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3110-114。
腺病毒是可以用于基因治療的其它病毒載體。腺病毒是用于將基因傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的尤其有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸上皮，在此它們引起輕度疾病。基于腺病毒的傳遞系統(tǒng)的其它靶是肝、呼吸上皮、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development3499-503介紹了基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout等，1994，Human Gene Therapy 53-10證明了應(yīng)用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至恒河猴的呼吸上皮。在Rosenfeld等，1991，Science 252431-434；Rosenfeld等，1992，Cell 68143-155；和Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91225-234中，可以找到在基因治療中應(yīng)用腺病毒的其它情況。
除腺病毒外，也已經(jīng)提出將腺伴隨病毒(AAV)用于基因治療(Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300)。
基因治療的另一途徑涉及通過諸如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法，將基因轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)物的細(xì)胞中。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移至所述細(xì)胞。然后將所述細(xì)胞置于選擇之下，以分離已經(jīng)攝入并正表達(dá)所轉(zhuǎn)移基因的那些細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞傳遞至患者。
在該實(shí)施方案中，將所述核酸引入細(xì)胞中，然后體內(nèi)給予所產(chǎn)生的重組細(xì)胞。這樣的引入可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、用含有所述核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等。本領(lǐng)域已知用于將外源基因引入細(xì)胞的多種技術(shù)(參見例如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618；Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.2969-92)，所述多種技術(shù)可以按照本發(fā)明使用，前提是不破壞所述受體細(xì)胞必需的發(fā)育功能和生理功能。所述技術(shù)應(yīng)該可供用于將所述核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至所述細(xì)胞，以使所述核酸可由所述細(xì)胞表達(dá)，而且最好是可遺傳的并且可由其細(xì)胞后代表達(dá)。
可以將所產(chǎn)生的重組細(xì)胞通過本領(lǐng)域已知的各種方法傳遞至患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，例如皮下注射上皮細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，可以將重組皮膚細(xì)胞用作所述患者的皮膚移植物。最好是靜脈內(nèi)給予重組血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)。設(shè)想的細(xì)胞用量取決于所需的效應(yīng)、患者狀態(tài)等，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
可以引入核酸用于基因治療的細(xì)胞包括任何所需的、可利用的細(xì)胞類型，包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞，例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如得自骨髓、臍帶血、外周血、胎肝的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞等等。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是所述患者自體的。
在一個(gè)將重組細(xì)胞用于基因治療的實(shí)施方案中，將一種Nogo核酸引入所述細(xì)胞，以使所述核酸可由所述細(xì)胞或其后代表達(dá)，然后體內(nèi)給予所述重組細(xì)胞以產(chǎn)生治療效應(yīng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞?？梢苑蛛x并在體外維持的任何干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞均可以潛在地按照本發(fā)明的該實(shí)施方案使用。這樣的干細(xì)胞包括但不限于神經(jīng)干細(xì)胞(Stemple和Anderson，1992，Cell 71973-985)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，待引入用于基因治療的核酸包含一個(gè)有效連接于所述編碼區(qū)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以致于通過控制轉(zhuǎn)錄的合適誘導(dǎo)物的存在或不存在可控制所述核酸的表達(dá)。
可以使用其它方法以用于傳遞編碼Nogo蛋白或功能衍生物的核酸。
5.8.2其中Nogo阻斷再生的疾病的治療和預(yù)防通過給予拮抗(抑制)Nogo功能的治療劑，治療其中需要神經(jīng)突延伸、生長(zhǎng)或再生的疾病或障礙。最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害的疾病、障礙或損害包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)創(chuàng)傷(例如脊髓損傷或腦損傷)、梗塞、感染、惡性腫瘤、暴露于毒性因子、營(yíng)養(yǎng)缺乏、副腫瘤性綜合征和退行性神經(jīng)病(包括但不限于早老性癡呆、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化和進(jìn)行性supra-nuclearpalsy)；通過給予干擾Nogo活性的化合物(例如顯性陰性Nogo衍生物；抗Nogo抗體；編碼Nogo的反義核酸；Nogo核酶或結(jié)合Nogo活性位點(diǎn)的化學(xué)基團(tuán))。
可以使用的治療劑包括但不限于Nogo反義核酸和功能障礙的(例如因異源(非Nogo序列)插入Nogo編碼序列中引起的)、可以通過同源重組用來“剔除”內(nèi)源的Nogo功能(參見例如Capecchi，1989，Science2441288-1292)的Nogo核酸?？筃ogo抗體(以及含有其結(jié)合區(qū)的其片段和衍生物)可以用作Nogo的拮抗劑。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將含有Nogo基因的一部分、其中Nogo序列連接(位于其5’和3’)不同基因序列的核酸用作Nogo拮抗劑，以通過同源重組促進(jìn)Nogo失活(也參見Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342435-438)。利用已知的便利的體外測(cè)定，例如根據(jù)其抑制Nogo結(jié)合另一蛋白或抑制任何已知Nogo功能的能力，最好是在體外或細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行分析，可以鑒定出抑制Nogo功能的其它治療劑，盡管也可以使用基因測(cè)定。最好利用合適的體外或體內(nèi)測(cè)定，來測(cè)定特定治療劑的效應(yīng)以及是否其給予指示出受影響組織的治療。
在具體實(shí)施方案中，在下述疾病中治療性地(包括預(yù)防性地)給予抑制Nogo功能的治療劑(1)涉及Nogo蛋白水平或功能提高(相對(duì)于正?；蛩璧?的疾病或障礙，例如在Nogo蛋白活性過多或超量表達(dá)的患者中；或(2)在體外(或體內(nèi))測(cè)定(參見下文)表明給予Nogo拮抗劑效用的疾病或障礙。例如通過定量測(cè)定蛋白和/或RNA，通過獲得患者組織樣品(例如得自活組織檢查組織)并體外分析其RNA或蛋白水平、所表達(dá)的Nogo RNA或蛋白的結(jié)構(gòu)和/或活性，可以容易地檢測(cè)出Nogo蛋白或功能水平的提高。因而可以使用本領(lǐng)域的許多標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于激酶測(cè)定、免疫測(cè)定，以檢測(cè)和/或顯現(xiàn)Nogo蛋白(例如蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀繼之以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細(xì)胞化學(xué)等)和/或雜交測(cè)定，分別通過檢測(cè)和/或顯現(xiàn)Nogo mRNA(例如RNA印跡測(cè)定、斑點(diǎn)印跡、原位雜交等)檢測(cè)Nogo的表達(dá)等。
5.8.2.1 Nogo表達(dá)的反義調(diào)節(jié)在一個(gè)具體實(shí)施方案中，利用Nogo反義核酸抑制Nogo功能。本發(fā)明提供下述核酸的治療或預(yù)防應(yīng)用，所述核酸具有至少6個(gè)與編碼Nogo的基因或cDNA或其部分反義的核苷酸。本文使用的Nogo“反義”核酸是指借助某些序列互補(bǔ)性能夠與Nogo RNA(最好是mRNA)的部分雜交的核酸。所述反義核酸可以與Nogo mRNA的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)互補(bǔ)。這樣的反義核酸具有作為抑制Nogo功能的治療劑的用途，并且可以用于上文描述的疾病的治療或預(yù)防。
本發(fā)明的反義核酸可以是雙鏈或單鏈的RNA或DNA或其修飾物或衍生物的寡核苷酸，可以將它們直接給予細(xì)胞，或可以通過外源的所引入序列的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所述寡核苷酸。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的Nogo反義核酸可以用來促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元再生，特別是包括皮質(zhì)脊髓束的再生、恢復(fù)期間的可塑性、神經(jīng)元的再生長(zhǎng)以及創(chuàng)傷性損傷相關(guān)性損傷、中風(fēng)和神經(jīng)變性性疾病的治愈。
本發(fā)明還提供藥用組合物，所述藥用組合物包含有效量的藥學(xué)上可接受載體中的本發(fā)明Nogo反義核酸，如下文所述。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中Nogo核酸序列表達(dá)的方法，所述方法包括為所述細(xì)胞提供有效量包含本發(fā)明Nogo反義核酸的組合物。
下面詳細(xì)描述Nogo反義核酸及其應(yīng)用。
5.8.2.1.1 Nogo反義核酸所述Nogo反義核酸至少有6個(gè)核苷酸，最好是寡核苷酸(范圍是6個(gè)至約50個(gè)寡核苷酸)。在具體方面，所述寡核苷酸至少為10個(gè)寡核苷酸、至少15個(gè)寡核苷酸、至少100個(gè)寡核苷酸或至少200個(gè)寡核苷酸。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修飾形式，可以是單鏈或雙鏈?？梢栽趬A基部分、糖部分或磷酸酯骨架修飾所述寡核苷酸。所述寡核苷酸可以包括其它附加基團(tuán)，例如肽、或促進(jìn)跨越細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的因子(參見例如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84648-652；PCT公布號(hào)WO88/09810，公布于1988年12月15日)或血腦屏障(參見例如PCT公布號(hào)WO89/10134，公布于1988年4月25日)、雜交觸發(fā)的切割因子(參見例如Krol等，1988，BioTechniques 6958-976)或嵌入劑(參見例如Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，提供一種Nogo反義寡核苷酸，最好是單鏈DNA。在一個(gè)最優(yōu)選方面，這樣一種寡核苷酸包含所述Nogo基因的兩個(gè)啟動(dòng)子序列之一的附近序列的反義序列、或編碼所述Nogo基因的羧基末端部分的序列的反義序列?？赡茏詈眠x擇性地抑制其中一種Nogo同種型的表達(dá)?？梢杂帽绢I(lǐng)域一般已知的取代基在所述寡核苷酸結(jié)構(gòu)上的任何位置進(jìn)行修飾所述寡核苷酸。
所述Nogo反義寡核苷酸可以包含至少一個(gè)修飾的堿基部分，所述部分選自但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二-甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤。
在另一實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含至少一個(gè)選自以下組的經(jīng)修飾的糖部分，所述組包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在再一實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包括至少一種選自下述組的修飾的磷酸酯主鏈，所述組包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、酰胺基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯(alkylphosphotriester)、以及其formacetal或其類似物。
在再一實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是α-端基異構(gòu)寡核苷酸。α-端基異構(gòu)寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特異性雙鏈雜交體，在所述雙鏈雜交體中，與通常的β-單位相反，鏈相互之間平行(參見Gautier等，1987，Nucl.Acids Res.156625-6641)。
可以將所述寡核苷酸與另一分子綴合，所述另一分子例如為肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)因子、雜交觸發(fā)的切割因子等。
可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成本發(fā)明的寡核苷酸；例如，通過用自動(dòng)化DNA合成儀(例如商業(yè)上可從Biosearch、AppliedBiosystems等公司買到的DNA合成儀)來合成。作為實(shí)例，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.Acids Res.163209)合成硫代磷酸寡核苷酸；通過用控制孔的玻璃聚合物載體(Sarin等，1988，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.857448-7451)，可以制備甲基膦酸寡核苷酸，等等。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述Nogo反義寡核苷酸包含催化性RNA或核酶(參見例如PCT國(guó)際公布WO90/11364，公布于1990年10月4日；Sarver等，1990，Science 2471222-1225)。在另一實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是2’-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，F(xiàn)EBS Lett.215327-330)。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Nogo反義核酸通過從外源序列轉(zhuǎn)錄而在胞內(nèi)產(chǎn)生。例如，可以將載體體內(nèi)引入，以使所述載體被細(xì)胞攝入，在所述細(xì)胞中所述載體或其部分被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸(RNA)。這樣一種載體應(yīng)該含有編碼所述Nogo反義核酸的序列。這種載體可以保持為附加型，或變?yōu)檎先肴旧w，只要它可以被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生所需的反義RNA。這樣的載體可以通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)方法來構(gòu)建。載體可以是質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的其它載體。
由本領(lǐng)域已知在哺乳動(dòng)物(最好是人類)細(xì)胞中起作用的任何啟動(dòng)子進(jìn)行編碼Nogo反義RNA的序列的表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。這樣的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、勞斯肉瘤病毒3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列中含有的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)等。
本發(fā)明的反義核酸包含與Nogo基因、最好是人Nogo基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分的互補(bǔ)的序列。然而，不需要絕對(duì)互補(bǔ)，盡管最好是絕對(duì)互補(bǔ)。本文涉及的“與RNA的至少一部分互補(bǔ)”的序列是指具有足夠的互補(bǔ)性以能夠與所述RNA雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的序列；在雙鏈Nogo反義核酸的情況下，可以因此測(cè)試所述雙鏈體DNA的一條單鏈，或可以分析三鏈體形成。雜交能力將取決于所述反義核酸的互補(bǔ)性的程度和長(zhǎng)度。一般而言，雜交核酸越長(zhǎng)，則它可以含有越多的與Nogo RNA錯(cuò)配的堿基，但仍可形成穩(wěn)定的雙鏈體(或當(dāng)情況可以時(shí)形成三鏈體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用測(cè)定雜交復(fù)合物的解鏈溫度的標(biāo)準(zhǔn)方法，來確定可耐受的錯(cuò)配程度。
5.8.2.1.2 Nogo反義核酸的治療應(yīng)用可以用所述Nogo反義核酸來治療(或預(yù)防)表達(dá)或最好是超量表達(dá)Nogo的細(xì)胞類型的疾病。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這樣的疾病是生長(zhǎng)增生性疾病。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用單鏈DNA反義Nogo寡核苷酸。
采用本領(lǐng)域已知的各種方法，可以鑒定出表達(dá)或超量表達(dá)NogoRNA的細(xì)胞類型。這樣的方法包括但不限于與Nogo特異性核酸雜交(例如通過RNA印跡雜交、斑點(diǎn)印跡雜交、原位雜交)，觀察來自所述細(xì)胞類型的RNA在體外翻譯為Nogo的能力；免疫測(cè)定等。在一個(gè)優(yōu)選方面，例如通過免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交，在治療之前可以分析來自患者的原代組織的Nogo表達(dá)。
可以將包含有效量藥學(xué)上可接受載體中的Nogo反義核酸的本發(fā)明藥用組合物，給予具有表達(dá)或超量表達(dá)Nogo RNA或蛋白的類型的疾病或障礙的患者。
治療特定疾病或病癥的Nogo反義核酸的有效量將取決于所述疾病或病癥的性質(zhì)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定?？赡軙r(shí)，在測(cè)試并用于人類之前，最好體外測(cè)定所述反義物對(duì)待治療腫瘤類型的細(xì)胞毒性，然后在有用的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)定所述細(xì)胞毒性。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，包含Nogo反義核酸的藥用組合物通過脂質(zhì)體、微粒或微膠囊給予。在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，采用這樣的組合物來達(dá)到持續(xù)釋放所述Nogo反義核酸可能是有用的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可能最好利用通過抗特定可鑒定腫瘤抗原的抗體定向的脂質(zhì)體(Leonetti等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872448-2451；Renneisen等，1990，J.Biol.Chem.26516337-16342)。
5.9 治療用途或預(yù)防用途的證明在用于人類之前，最好在體外，然后在體內(nèi)，測(cè)試本發(fā)明治療劑的所需治療活性或預(yù)防活性。例如，可以用來確定給予特定治療劑是否適合的體外測(cè)定中，包括體外細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定，其中患者組織樣品在培養(yǎng)物中培養(yǎng)并暴露于治療劑或者給予其治療劑，并且觀察這種治療劑對(duì)所述組織樣品的效應(yīng)。例如，通過測(cè)定所述患者中神經(jīng)突再生長(zhǎng)或運(yùn)動(dòng)控制的功能恢復(fù)，可以分析作為Nogo功能抑制劑的治療劑。
在不同的具體實(shí)施方案中，可以用涉及患者疾病的細(xì)胞類型的典型細(xì)胞來進(jìn)行體外測(cè)定，以確定治療劑是否具有對(duì)這種細(xì)胞類型的所需效應(yīng)。
在人類中測(cè)試之前，可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試用于治療的化合物，所述動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔等。對(duì)于體內(nèi)測(cè)試，在給予人類之前，可以使用本領(lǐng)域已知的任何動(dòng)物模型系統(tǒng)。
5.10治療性/預(yù)防性給予和組合物本發(fā)明提供通過給予受治療者有效量的本發(fā)明治療劑進(jìn)行治療(和預(yù)防)的方法。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述治療劑是基本上純化的。所述受治療者最好是動(dòng)物，包括但不限于牛、豬、馬、雞、貓、狗等，最好是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人類。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，非人類哺乳動(dòng)物是所述受治療者。
當(dāng)所述治療劑包含核酸時(shí)，可以使用的制劑和給藥方法是上述制劑和方法；可以從下文描述中選擇另外合適的制劑和給藥途徑。
各種傳遞系統(tǒng)是已知的，并且可以用來給予本發(fā)明的治療劑，例如在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊中包膠囊、能夠表達(dá)所述治療劑的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)、構(gòu)建作為反轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它載體一部分的治療核酸等。引入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和經(jīng)口途徑。所述化合物可以通過任何方便的途徑給予，例如通過輸注或大劑量注射、通過經(jīng)上皮或粘膜內(nèi)襯(例如口腔粘膜、直腸粘膜和腸粘膜等)吸收，并且可以與其它生物活性劑一起給予。可以系統(tǒng)給予或局部給予。另外，可能最好將本發(fā)明的藥用組合物通過合適的途徑引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所述合適的途徑包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；用心室內(nèi)導(dǎo)管，例如連接于貯液器(例如Ommaya貯液器)的心室內(nèi)導(dǎo)管，可以促進(jìn)心室內(nèi)注射。也可以利用肺部給藥，例如使用吸入器或噴霧器和具有霧化劑的制劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可能最好將本發(fā)明的藥用組合物局部給予需要治療的區(qū)域；通過例如但不限于手術(shù)期間局部輸注、表面應(yīng)用例如結(jié)合手術(shù)后的傷口敷劑、通過注射、利用導(dǎo)管或利用植入物，所述植入物是多孔、非多孔或膠狀材料，包括膜例如sialastic膜，或纖維，可以達(dá)到這種給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在惡性腫瘤或腫瘤性或前腫瘤性組織部位(或形成者部位)直接注射進(jìn)行給藥。
在另一實(shí)施方案中，所述治療劑可以在小泡中、特別是在脂質(zhì)體中傳遞(參見Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等，Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein andFidler(編輯)，Liss，New York，第353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327頁，一般參見同上的文獻(xiàn))。
在再一實(shí)施方案中，所述治療劑在控釋系統(tǒng)中傳遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用一個(gè)泵(參見Langer，參見上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可以使用聚合材料(參見Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編輯)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavaibility，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(編輯)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也參見Levy等，Science 228190(1985)；During等，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。在再一實(shí)施方案中，可以將控釋系統(tǒng)置于治療靶附近，即腦附近，因此僅需要系統(tǒng)劑量的一部分(參見例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138頁(1984))。
在Langer的綜述(Science 2491527-1533(1990))中討論了其它控釋系統(tǒng)。
在所述治療劑是編碼蛋白治療劑的核酸的具體實(shí)施方案中，可以通過以下方式體內(nèi)給予所述核酸，以促進(jìn)其編碼蛋白的表達(dá)，所述方式為通過將其作為合適核酸表達(dá)載體的一部分構(gòu)建，并將其例如利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體給予，以使它成為胞內(nèi)的(參見美國(guó)專利第4,980,286號(hào))，或通過直接注射，或利用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)，或通過用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，或通過給予其連接已知進(jìn)入細(xì)胞核的同源框樣肽的形式(參見例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)等?；蛘撸梢詫⒑怂嶂委焺┰诎麅?nèi)引入并通過同源重組摻入到宿主細(xì)胞DNA中進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明也提供藥用組合物。這樣的組合物包含治療有效量的治療劑和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦政府或州政府管理局批準(zhǔn)或列于美國(guó)藥典中或其它普遍接受的藥典用于動(dòng)物，更特別是用于人類的。術(shù)語“載體”是指與所述治療劑一起給予的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或載體。這種藥用載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油醚、動(dòng)物、植物或合成來源的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)給予所述藥用組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于注射液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油一硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙醇、甘醇、水、乙醇等。如有需要，所述組合物也可以含有少量潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑形式等等。口服制劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)載體，例如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥用載體的實(shí)例描述于E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。這樣的組合物將含有治療有效量的所述治療劑與適量的載體，最好是純化形式的治療劑，以便提供用于適合給予所述患者的形式。所述制劑應(yīng)該適合所述給藥途徑。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照常規(guī)方法，將所述組合物配制為適合于靜脈內(nèi)給予人類的藥用組合物。通常，用于靜脈內(nèi)給藥的組合物是無菌等滲水性緩沖液形式的溶液。必要時(shí)，所述組合物也可以包含增溶劑和局部麻醉藥例如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。一般而言，所述組分或者分別供應(yīng)，或者一起混合為單位劑型，例如作為密封容器(例如安瓿或指示活性劑量的sachette)中的凍干粉或無水濃縮物。當(dāng)所述組合物將通過輸注給予時(shí)，可以將其用含有無菌藥用級(jí)水或鹽水的輸注瓶配藥。當(dāng)通過注射給予所述組合物時(shí)，可以提供一個(gè)安瓿的無菌注射用水或鹽水，以使在給予前可以將所述組分混合。
本發(fā)明的治療劑可以配制為中性形式或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離氨基形成的鹽，例如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽；以及與游離羧基形成的鹽，例如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
將在治療特定疾病或病癥方面是有效的本發(fā)明的治療劑的量，將取決于所述疾病或病癥的性質(zhì)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定。另外，任選地利用體外測(cè)定來幫助鑒定最適劑量范圍。所述制劑中使用的準(zhǔn)確的劑量也將取決于給藥途徑以及所述疾病或障礙的嚴(yán)重程度，并且應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師和每個(gè)患者的情況而定。然而，用于靜脈內(nèi)給藥的合適劑量范圍一般為約20-500微克活性化合物/公斤體重。用于鼻內(nèi)給藥的合適劑量范圍一般為約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。可以根據(jù)得自體外或動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線來外推有效劑量。
本發(fā)明也提供藥用包裝或試劑盒，其包含一個(gè)或多個(gè)裝有本發(fā)明藥用組合物的一個(gè)或多個(gè)組分的容器。這樣的容器任選地附有由管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)開具的通知，所述通知反映出所述機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)生產(chǎn)、使用或銷售用于人類給藥。
5.11診斷和篩選Nogo蛋白、其類似物、衍生物和亞序列、Nogo核酸(和其互補(bǔ)序列)、抗Nogo抗體已經(jīng)用于診斷。這類分析可以用于分子，例如免疫測(cè)定，以檢測(cè)、預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)影響Nogo表達(dá)的各種病癥、疾病和障礙，或監(jiān)測(cè)其治療。特別是，采用包括下述步驟的方法進(jìn)行這樣的免疫測(cè)定在使得免疫特異性結(jié)合可以發(fā)生的條件下使得自患者的樣品與抗Nogo抗體接觸，并且檢測(cè)或測(cè)定所述抗體的任何免疫特異性結(jié)合的量。在一個(gè)具體方面，在組織切片中這種抗體結(jié)合可以用來檢測(cè)異常的Nogo定位或異常(例如低水平或沒有)的Nogo水平。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)Nogo的異常水平是病癥的指示時(shí)，抗Nogo抗體可以用來分析患者組織或血清樣品中Nogo的存在。所謂“異常水平”是指相對(duì)于得自沒有所述疾病的機(jī)體的一部分或受治療者類似樣品中存在的水平、或代表存在的標(biāo)準(zhǔn)水平而言，升高或降低的水平。
可以使用的免疫測(cè)定包括但不限于采用免疫組織化學(xué)的技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)、病理學(xué)、蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾層”免疫測(cè)定、免疫沉淀分析、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體固定測(cè)定、免疫放射分析、熒光免疫測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定、A蛋白免疫測(cè)定，這僅是少數(shù)實(shí)例。
Nogo基因和相關(guān)核酸序列和亞序列包括互補(bǔ)序列也可以用于雜交測(cè)定。Nogo核酸序列或其包含至少約8個(gè)核苷酸的亞序列可以用作雜交探針。雜交測(cè)定可以用來檢測(cè)、預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)與Nogo表達(dá)和/或活性的異常改變相關(guān)的病癥、障礙或疾病狀態(tài)，如上文所述。特別是，通過包括以下步驟的方法在使得雜交可以發(fā)生的條件下使含核酸的樣品與能夠與Nogo DNA或RNA雜交的核酸探針接觸，并檢測(cè)或測(cè)定任何所產(chǎn)生的雜交，進(jìn)行這樣的雜交測(cè)定。
在具體實(shí)施方案中，通過檢測(cè)證明生長(zhǎng)抑制的Nogo蛋白、NogoRNA或Nogo功能活性水平的降低，或通過檢測(cè)引起Nogo表達(dá)或活性降低的Nogo RNA、DNA或蛋白中的突變(例如Nogo核酸中的易位、Nogo基因或蛋白的截短、相對(duì)于野生型Nogo核苷酸序列或氨基酸序列的改變)，可以診斷涉及細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育障礙的疾病和障礙，或可以篩選其可疑的存在，或可以檢測(cè)發(fā)生這種障礙的誘因。這樣的疾病和障礙包括但不限于第3節(jié)和第5.8.1.1節(jié)中描述的那些疾病和障礙。作為實(shí)例，通過免疫測(cè)定可以檢測(cè)Nogo蛋白的水平，通過雜交分析(例如RNA印跡、斑點(diǎn)印跡)可以檢測(cè)出Nogo RNA的水平，通過本領(lǐng)域通常已知的結(jié)合測(cè)定可以進(jìn)行Nogo與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑蛋白受體的結(jié)合，通過DNA印跡、RFLP分析、采用最好產(chǎn)生跨越至少Nogo基因大部分的片段的引物進(jìn)行PCR、對(duì)得自所述患者的Nogo基因組DNA或cDNA測(cè)序等，可以檢測(cè)出Nogo核酸中的易位和點(diǎn)突變。
也提供于診斷用途的試劑盒，所述試劑盒在一個(gè)或多個(gè)容器中包含一種抗Nogo抗體和任選的一種所述抗體的標(biāo)記結(jié)合配偶體。或者，可以標(biāo)記(用可檢測(cè)標(biāo)記，例如化學(xué)發(fā)光部分、酶部分、熒光部分或放射性部分)所述抗Nogo抗體。也提供在一個(gè)或多個(gè)容器中包含能夠與Nogo RNA雜交的核酸的試劑盒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，試劑盒可以在一個(gè)或多個(gè)容器中包含一種引物對(duì)(例如每種引物在大小范圍為6-30個(gè)核苷酸)，所述引物對(duì)在合適的反應(yīng)條件下能夠引發(fā)Nogo核酸的至少一部分?jǐn)U增[例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見例如Innis等，1990，PCR Protocols，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見EP320,308)、應(yīng)用Qβ復(fù)制酶、環(huán)狀探針反應(yīng)或本領(lǐng)域已知的其它方法]。試劑盒可以任選地還包括在一個(gè)容器中的預(yù)定量的純化Nogo蛋白或核酸，例如用作標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ铡?br> 5.12篩選Nogo激動(dòng)劑和拮抗劑Nogo核酸、蛋白和衍生物也已經(jīng)用于篩選測(cè)定，以檢測(cè)與Nogo核酸、蛋白或衍生物特異性結(jié)合的分子，因此具有作為Nogo的激動(dòng)劑或拮抗劑的潛在用途，特別是因此影響細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，進(jìn)行這樣的測(cè)定，以篩選具有作為神經(jīng)生長(zhǎng)促進(jìn)劑的潛在用途的分子，以用于藥物開發(fā)。本發(fā)明因此提供一些測(cè)定，以檢測(cè)與Nogo核酸、蛋白或衍生物特異性結(jié)合的分子。例如，可以用表達(dá)Nogo核酸的重組細(xì)胞，重組產(chǎn)生這些測(cè)定中的Nogo蛋白，以篩選與Nogo蛋白結(jié)合的分子。在有助于結(jié)合的條件下使分子(例如推定的Nogo結(jié)合配偶體)與所述Nogo蛋白(或其片段)接觸，然后鑒定出與所述Nogo蛋白特異性結(jié)合的分子。可以用相似的方法來篩選結(jié)合Nogo衍生物或核酸的分子?？梢杂脕磉M(jìn)行上述測(cè)定的方法是本領(lǐng)域通常已知的。
作為實(shí)例，可以對(duì)多樣性的文庫(kù)例如隨機(jī)或組合肽或非肽文庫(kù)，篩選特異性結(jié)合Nogo的分子。可以使用的許多文庫(kù)是本領(lǐng)域已知的，例如化學(xué)合成文庫(kù)、重組(例如噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù))和體外基于翻譯的文庫(kù)。
化學(xué)合成文庫(kù)的實(shí)例描述于Fodor等，1991，Science 251767-773；Houghten等，1991，Nature 35484-86；Lam等，1991，Nature 35482-84；Medynski，1994，Bio/Technology 12709-710；Gallop等，1994，J.Medicinal Chemistry 37(9)1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques 13412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011708-11712；PCT公布號(hào)WO93/20242；和Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895381-5383。
噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù)的實(shí)例描述于Scott和Smith，1990，Science249386-390；Devlin等，1990，Science 249404-406；Christian，R.B.等，1992，J.Mol.Biol.227711-718)；Lenstra，1992，J.Immunol.Meth.152149-157；Kay等，1993，Gene 12859-65；和PCT公布號(hào)WO94/18318，公布日為1994年8月18日。
體外基于翻譯的文庫(kù)包括但不限于描述于以下文獻(xiàn)的文庫(kù)PCT公布號(hào)WO91/05058，公布日為1991年4月18日；和Mattheakis等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919022-9026。
作為非肽文庫(kù)的實(shí)例，苯并二氮雜卓文庫(kù)(參見例如Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712)可以適合于使用。類肽(peptoid)文庫(kù)(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899367-9371)也可以使用。Ostresh等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111138-11142)描述了可以使用的文庫(kù)的另一實(shí)例，其中已經(jīng)將肽中的酰胺官能全甲基化，以產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)化的組合文庫(kù)。
采用通常已知的多種方法中的任一種，可以完成文庫(kù)的篩選。參見例如以下參考文獻(xiàn)，所述參考文獻(xiàn)公開了肽文庫(kù)的篩選Parmley和Smith，1989，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218；Scott和Smith，1990，Science 249386-390；Fowlkes等，1992；BioTechniques 13422-427；Oldenburg等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895393-5397；Yu等，1994，Cell 76933-945；Staudt等，1988，Science 241577-580；Bock等，1992，Nature 355564-566；Tuerk等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896988-6992；Ellington等，1992，Nature 355850-852；Ladner等的美國(guó)專利第5,096,815號(hào)、美國(guó)專利第5,223,409號(hào)和美國(guó)專利第5,198,346號(hào)；Rebar和Pabo，1993，Science 263671-673；和PCT公布號(hào)WO94/18318。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過使文庫(kù)成員與在固相上固定化的Nogo蛋白(或核酸或衍生物)接觸，并且收獲結(jié)合所述蛋白(或核酸或衍生物)的文庫(kù)成員，可以進(jìn)行篩選。稱為“淘選”技術(shù)的這類篩選方法的實(shí)例例如描述于Parmley和Smith，1988，Gene 73305-318；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13422-427；PCT公布號(hào)WO94/18318；和上文引用的參考文獻(xiàn)。
在另一實(shí)施方案中，在酵母中選擇相互作用蛋白的雙雜種系統(tǒng)(Fields和Song，1989，Nature 340245-246；Chien等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889578-9582)可以用來鑒定特異性結(jié)合Nogo蛋白或衍生物的分子。
5.13動(dòng)物模型本發(fā)明也提供動(dòng)物模型，包括但不限于小鼠、倉(cāng)鼠、羊、豬、牛，最好是非人類哺乳動(dòng)物中的模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于涉及神經(jīng)突延伸、生長(zhǎng)和再生的疾病和障礙的動(dòng)物模型。通過促進(jìn)染色體中的Nogo基因和已經(jīng)使得無生物活性(最好通過插入異源序列，例如抗生素抗性基因)的外源Nogo基因之間的同源重組，可以最初產(chǎn)生這樣的動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選方面，通過用含有所述插入失活的Nogo基因的載體轉(zhuǎn)化胚衍生干(ES)細(xì)胞，使得發(fā)生同源重組，然后將所述ES細(xì)胞注射到胚泡中，并將所述胚泡植入到養(yǎng)母體內(nèi)，然后其中Nogo基因已被失活的所述嵌合動(dòng)物(“剔除動(dòng)物”)(參見Capecchi，1989，Science 2441288-1292)出生，進(jìn)行這種同源重組?？梢苑敝城逗蟿?dòng)物，以產(chǎn)生另外的剔除動(dòng)物。這種動(dòng)物可以是小鼠、倉(cāng)鼠、羊、豬、牛等，最好是非人類哺乳動(dòng)物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，產(chǎn)生剔除小鼠。
預(yù)期這種剔除動(dòng)物發(fā)生或預(yù)先處置使其發(fā)生涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或障礙，因此可能具有作為這種疾病和障礙的動(dòng)物模型的用途，例如以篩選或測(cè)試分子(例如潛在的神經(jīng)系統(tǒng)障礙治療劑)抑制神經(jīng)組織腫瘤以及因此治療或預(yù)防這類疾病或障礙的能力。
本發(fā)明不限于保藏的微生物或本文描述的具體實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，除本文描述的以外，根據(jù)以上描述和附圖，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這樣的修改計(jì)劃在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
本文引用的各種參考文獻(xiàn)，它們的公開內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。
6.實(shí)施例Nogo基因的核苷酸和蛋白產(chǎn)物的特征鑒定本文描述的實(shí)例證明所克隆的基因Nogo編碼一種蛋白，該蛋白為有效神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，并且也為Schwab等的美國(guó)專利第5,684,133號(hào)中描述的單克隆抗體所識(shí)別。
6.1材料和方法以下小節(jié)描述用于本發(fā)明的材料和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，這些材料和方法僅僅說明現(xiàn)在要求保護(hù)的發(fā)明，本發(fā)明人設(shè)想了各種修改。這些修改計(jì)劃屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
6.1.1從髓磷脂中純化牛Nogo所有純化步驟均于4℃進(jìn)行，通過NIH3T3散布和PC12神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定(6.1.10一節(jié))常規(guī)測(cè)定所獲得部分的抑制底物活性。通過剔除腦脊膜并切成小塊，小心地清洗牛脊髓組織。然后在提取緩沖液(60mM CHAPS，100mM Tris-Cl，pH8.0，10mM EDTA緩沖液pH8.0，2.5mM碘代乙酰胺，1mM苯基甲磺酰氟，0.1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A)中提取髓磷脂。
為了獲得脊髓提取物，直接在CHAPS提取緩沖液中以(1∶1；W∶v)的比率將所述組織勻漿。將勻漿于4℃以100,000×g離心1小時(shí)，離心兩次(Kontron K50.13型，固定角度)。將澄清的上清液(提取物)立即加樣于在緩沖液A(20mM Tris-Cl，pH8.0，0.5％(w/v)CHAPS)中平衡的Q-Sepharose柱(2.6×11.5cm)。用5倍床體積的0-1M NaCl的緩沖液A的線性梯度(在50分鐘內(nèi)100ml梯度)洗脫結(jié)合蛋白。含有牛NI220的活性部分在約0.4M NaCl下洗脫，將其合并(q-庫(kù)1)，用于隨后加樣于在緩沖液B(150mM NaCl，20mM Tris-Cl，pH8.0，0.5％(w/v)CHAPS)中平衡的Superdex 200(2.6×60cm)柱。
在凝膠過濾(s-庫(kù)1)后，通過6％SDS-PAGE在還原條件下和總共2500伏特-小時(shí)的低恒定功率(2瓦特/凝膠)下分離活性部分。在考馬斯藍(lán)染色(0.1％w/v R250的50％甲醇和10％乙酸溶液)后鑒定條帶和凝膠區(qū)域，將其切出，并于4℃在800μl凝膠洗脫緩沖液(0.5％(w/v)CHAPS，20mM Tris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，pH8.0，2.5mM碘代乙酰胺，1mM苯基甲磺酰氟，0.1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A)中提取至少48小時(shí)。
6.1.2純化Nogo的微量測(cè)序?qū)讉€(gè)凝膠的IN-1可中和活性凝膠洗脫材料在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上在還原條件下再電泳，并用0.1％(w/v)考馬斯藍(lán)R250的50％甲醇和10％乙酸溶液染色。切下220KDa的條帶，在凝膠中直接進(jìn)行內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化(1∶50摩爾比)。將樣品酸化并加樣于反向高效液相層析柱，用0.04％三氟乙酸和80％乙腈的線性梯度(0-100％)分離肽，將含單一肽種類的部分進(jìn)行自動(dòng)化Edman降解。
6.1.3純化Nogo的電泳采用6％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(10×24×0.01cm)，在還原條件(100mM二硫蘇糖醇)下進(jìn)行高分辨SDS-PAGE。在20mM Tris堿，192mM甘氨酸pH8.3，0.037％(w/v)SDS，20％甲醇中，用半干轉(zhuǎn)移裝置(Bio-Rad，Trans Blot SD)轉(zhuǎn)移至Immobilon-P膜(Millipore)上。轉(zhuǎn)移時(shí)間于0.8mA/cm2下為2小時(shí)。封閉試劑(于室溫下1小時(shí))為3％明膠的PBS(磷酸緩沖鹽溶液，pH7.2，8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.8gNa2HPO4·12H2O和0.2g KCl，溶于1升水中)溶液，而洗滌液含有20mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl和0.4％吐溫(3×10分鐘，于室溫下)。第一抗體(對(duì)于用1％明膠的PBS溶液稀釋)的溫育時(shí)間通常是于4℃過夜。辣根過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG第二抗體(1∶2000)于室溫下溫育1小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)用于檢測(cè)(Amersham PharmaciaBiotech)。
6.1.4 cDNA文庫(kù)的探測(cè)從牛脊髓中新鮮解剖出白質(zhì)，并用FastTrack試劑盒(Invitrogen)提取poly(a)+RNA。用Uni-ZAP試劑盒(Stratagene)，按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。所述文庫(kù)的復(fù)雜性高于總共4×106噬菌斑形成單位，插入片段的平均大小約為1.8千堿基。
根據(jù)bNI220肽1序列設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并寡核苷酸MSC5-8(MSC5TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC(SEQ ID NO47)；MSC6TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC(SEQ ID NO48)；MSC7TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC(SEQ ID NO49)；MSC8TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC(SEQ ID NO50)，而根據(jù)bNI220肽2序列設(shè)計(jì)了MSC9(GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA(SEQID NO51))。寡核苷酸由MWG Biotech(Munchenstein，瑞士)合成，并用DIG DNA3’端標(biāo)記試劑盒標(biāo)記。采用DIG RNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim)合成核糖核酸探針(Riboprobe)。
探針雜交和洗滌條件如生產(chǎn)商所述(MSC5-8和MSC9于57℃的雜交和洗滌溫度下使用)。采用CDP-star系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)進(jìn)行探針檢測(cè)。cDNA文庫(kù)標(biāo)記和篩選按照λZap cDNA文庫(kù)(Stratagene)的方案進(jìn)行。Genescreen(DuPont)尼龍膜用于噬菌斑復(fù)印。
6.1.5 DNA測(cè)序用Microsynth(Balgach，瑞士)的Perkin Elmer AB1377系統(tǒng)對(duì)CWP1-3、Oli18、Oli3和R1-3U21的兩條鏈測(cè)序。通過DNASIS程序(Hitachi)分析DNA序列。用BLAST程序(NCBI)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。
6.1.6 RNA分析采用RNAgent(Promega)或FastTrack試劑盒(Invitrogen)，分別從組織中提取總RNA和poly(A)+RNA。通過在1％甲醛凝膠上電泳分離RNA，并將其轉(zhuǎn)移至Genescreen膜上。將印跡與用DIG RNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim)從相關(guān)質(zhì)粒產(chǎn)生的反義核糖核酸探針雜交。印跡雜交、洗滌和CDP star檢測(cè)條件如生產(chǎn)商所描述。“共同”探針EST111410(TIGR，ATCC，Rockville，MD，USA)含有核苷酸2535-4678之間的轉(zhuǎn)錄物A序列，外顯子1特異性探針含有核苷酸65-769之間的轉(zhuǎn)錄物A序列，而外顯子2特異性探針含有核苷酸815-3183之間的轉(zhuǎn)錄物A序列。
6.1.7抗血清的產(chǎn)生抗血清472(AS472)由Research Genetics，Inc.(Huntsville AL；USA)針對(duì)合成肽P472-SYDSIKLEPENPPPYEEA(牛序列；SEQ IDNO33)而產(chǎn)生，所述合成肽對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的大鼠Nogo氨基酸序列623-640，具有3個(gè)錯(cuò)配。
抗血清Bruna(AS Bruna)針對(duì)在大腸桿菌中作為融合蛋白表達(dá)的重組Nogo蛋白的片段而產(chǎn)生。具體地說，SEQ ID NO2的大鼠NogoA核苷酸序列編碼氨基酸762-1，163的羧基末端(采用Novagen pET系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá))用來產(chǎn)生AS Bruna抗Nogo抗血清。
6.1.8電泳和蛋白質(zhì)印跡采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。抗體如下稀釋AS Bruna 1∶7,500；AS472 1∶2,000；抗myc(9E10)1∶5,000(Invitrogen)；抗BiP 2μg/ml(Stressgen)；mAb IN-1雜交瘤上清液未稀釋而使用。第二抗體是HRP綴合的抗兔(Pierce；1∶20,000)；抗小鼠IgM(1∶50,000)；和堿性磷酸酶綴合的抗小鼠(MilanAnalytica AG，La Roche，瑞士；1∶5,000)。
6.1.9免疫組織化學(xué)快速解剖成年大鼠脊髓或小腦，將其包埋在OTC化合物中并于-40℃冷凍。切20個(gè)死后切片，并于40℃在乙醇/乙酸中固定。如Rubin等，1994，J.Neurocyto1.23209-217中所述進(jìn)行免疫染色，只是不用猝滅步驟?；蛘?，組織切片用甲醇固定(于-20℃下2分鐘)，而免疫染色按照Rubin等的上述文獻(xiàn)進(jìn)行。所用的第一抗體是(抗體(稀釋度))IN-1的雜交瘤上清液(未稀釋)；AS Bruna(1∶5000)；或親和純化的AS472(1∶50)。
6.1.10 NIH3T3成纖維細(xì)胞散布測(cè)定將NIH3T3成纖維細(xì)胞接種到用5μg/孔(＝1cm2)q-庫(kù)預(yù)包被的培養(yǎng)皿上。q-庫(kù)是在Q sepharose柱上分離的牛脊髓提取物的合并活性部分。IN-1作為未稀釋的培養(yǎng)上清液使用(1-10μg/ml)，AS Bruna和免疫前血清在PBS中稀釋1∶1000，而AS472和免疫前血清在PBS以1∶500稀釋。為了補(bǔ)償不同q-庫(kù)制劑中的活性變異，將接種到q-庫(kù)上的受抑制的圓形細(xì)胞數(shù)相對(duì)于接種到緩沖液對(duì)照上標(biāo)準(zhǔn)化至100％和至0％(Spillman等，1998，J.Biol.Chem.27319283-93)。
6.1.11 DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定在Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中從E16胚雞中解剖出背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，將其分為兩個(gè)部分，并置于用q-庫(kù)預(yù)包被的培養(yǎng)皿上的具有10％(FCS)和1％甲基纖維素的100μl F12培養(yǎng)基中。在37℃溫育24小時(shí)后，采用0(無向外生長(zhǎng))至4(最大向外生長(zhǎng))的范圍，以半定量方式記錄來自單個(gè)DRG的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)。
6.1.12 DRG/視神經(jīng)共同培養(yǎng)測(cè)定從用5500 Gray輻射并注射或者AS472或者相應(yīng)的免疫前血清(1∶10稀釋度)的成年大鼠中解剖出視神經(jīng)。在3室培養(yǎng)物中培養(yǎng)多對(duì)神經(jīng)，以使每個(gè)神經(jīng)的一端通過硅潤(rùn)滑油/塔夫綸阻擋層達(dá)到中間室，在中間室放置來自P0大鼠的解離的培養(yǎng)原代DRG神經(jīng)元。培養(yǎng)2周后，采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)固定神經(jīng)，將其包埋用于電鏡分析(EM)，從DRG暴露的殘干以約3.5mm距離取超薄切片。采用Zeiss EM902，系統(tǒng)分析切片中再生長(zhǎng)軸突的存在。
6.1.13 COS細(xì)胞中的Nogo A表達(dá)采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)，將Nogo A可讀框亞克隆到pcDNA3.1 mychis載體(Invitrogen)中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒(Nogo-myc19)產(chǎn)生含有融合于myc-his標(biāo)記(21個(gè)氨基酸)的Nogo A序列的重組蛋白。采用superfect(Qiagen)按照生產(chǎn)商的方案將Nogo-myc19(2μg DNA/35mm平皿)，或?qū)φ召|(zhì)粒(pcDNAmychisLacZ)轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后36-48小時(shí)收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。根據(jù)用抗myc抗體的免疫熒光染色和酶促β-半乳糖苷酶顏色反應(yīng)，估計(jì)平均轉(zhuǎn)染率約為20％。轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞用95％乙醇/5％乙酸固定(4℃，25分鐘)，在PBS/10％FCS中封閉，并與AS Bruna(1∶200)或IN-1(1∶2)一起在PBS/1％FCS中于室溫下溫育2小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，并與熒光第二抗體(對(duì)于AS Bruna檢測(cè)為羊抗兔-FITC，而對(duì)于IN-1檢測(cè)為羊抗小鼠-TRITC，JacksonImmuno Research Lab.Inc.，West Grove，PA)反應(yīng)。
6.1.14少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物將從新生大鼠腦中分離的少突膠質(zhì)細(xì)胞接種至75cm2聚賴氨酸燒瓶(Sigma，St.Louis，MO)中，在補(bǔ)充5％FCS的DMEM中培養(yǎng)10-12天。通過在定軌搖床上以210rpm震搖過夜，從星形膠質(zhì)細(xì)胞單層釋放出少突膠質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞(progenitor)的富集混合群體。將細(xì)胞以1-2×106細(xì)胞的密度接種到聚賴氨酸包被的35cm2平皿上。讓祖細(xì)胞在化學(xué)成分已知的培養(yǎng)基(CDM)中分化3-4天。
6.1.15細(xì)胞表面生物素化如van der Haar等(1998，J.Neurosci.Res.51371-81)中所述，制備P4大鼠全腦培養(yǎng)物。在體外第7天，用細(xì)胞不透性EZ-LINK-Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)如所述的方法對(duì)其進(jìn)行生物素化，只是所有步驟均于15℃下進(jìn)行，將細(xì)胞在1ml裂解緩沖液(0.05M NaH2PO4pH8.0，0.15M NaCl，0.5％CHAPS(Sigma)，2.5mM碘代乙酰胺，1mM苯基甲磺酰氟，0.1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑酶肽、lμg/ml抑胃酶肽A)中裂解。生物素化蛋白用Dynabeads M-280鏈霉抗生物素(Dynal)免疫沉淀，經(jīng)過SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上，用AS472、α-BiP和α-β-微管蛋白探測(cè)。所述膜用Re-Blot蛋白質(zhì)印跡再循環(huán)試劑盒(Chemicon)提取(strip)。
6.1.16免疫細(xì)胞化學(xué)按照Schwab和Caroni所述(1988，J.Neurosci.82381-2393)，制備視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞。2日齡的培養(yǎng)物與AS472(1∶200)或mAb IN-1(1∶3)在培養(yǎng)基中于室溫(rt)下溫育25分鐘。洗滌培養(yǎng)物，用4％低聚甲醛/5％蔗糖的PBS溶液固定，并在0.1M馬來酸/2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)中封閉1小時(shí)。第二堿性磷酸酶綴合抗體(MilanAnalytica)以1∶7,500的0.1M馬來酸/1％封閉試劑溶液使用(1小時(shí)，rt)。轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞用95％乙醇/5％乙酸固定(4℃，25分鐘)，封閉，并與AS Bruna(1∶200)或mAbIN-1一起于室溫下溫育2小時(shí)。細(xì)胞與羊抗兔-FITC以及羊抗小鼠TRITC(Jackson Immuno Research Lab)反應(yīng)。
6.1.17視神經(jīng)室按照Schwab等所述(1988，J.Neurosci.82381-2393)，在三室培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多對(duì)視神經(jīng)，注射并暴露于或者AS 472或者相應(yīng)的免疫前血清(1∶10)。將視神經(jīng)包埋進(jìn)行電鏡分析(EM)，從DRG暴露的殘干以約3.5mm距離取超薄切片。采用Zeiss EM 902顯微鏡，系統(tǒng)分析切片中再生長(zhǎng)軸突的存在。
6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以下一節(jié)公開了得自6.1及其小節(jié)敘述的方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.2.1 Nogo cDNA的分離純化大鼠NI-250的牛同系物bNI220，通過蛋白酶消化產(chǎn)生所純化蛋白的肽。按照6個(gè)不同的bNI220肽序列，設(shè)計(jì)多種洋地黃毒苷標(biāo)記的簡(jiǎn)并寡核苷酸。根據(jù)用這些寡核苷酸篩選牛白質(zhì)文庫(kù)，分離出幾個(gè)cDNA文庫(kù)。用最大克隆的插入片段(CWP1-3，圖1a)合成探針，用于隨后大鼠cDNA文庫(kù)的篩選。來自這種篩選的所選擇的克隆示于圖1a。這些cDNA克隆的DNA序列分析表明，三種不同的轉(zhuǎn)錄物起源于一個(gè)基因，將該基因命名為Nogo。所述不同的轉(zhuǎn)錄物可能既產(chǎn)生于可變啟動(dòng)子用法又產(chǎn)生于可變剪接(Nogo A、Nogo B和Nogo C；圖1b)。從圖1A所示的克隆編譯DNA序列，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物A，其DNA序列示于圖2a。
這三種轉(zhuǎn)錄物的概念翻譯(conceptual translation)產(chǎn)生命名為Nogo A(1163個(gè)氨基酸)、Nogo B(360個(gè)氨基酸)和Nogo C(199個(gè)氨基酸)的蛋白產(chǎn)物。由于Nogo A含有得自純化bNI220的所有6種肽序列(圖2b)，因此它可能等同于純化的蛋白大鼠NI-250。Nogo A、B和C具有共同的188個(gè)氨基酸的羧基末端(共同結(jié)構(gòu)域)，Nogo A和B共享172氨基酸的氨基末端。由于可變剪接，Nogo A比Nogo B長(zhǎng)803個(gè)氨基酸。
Nogo同種型中沒有一個(gè)在N末端具有疏水氨基酸序列段，所述序列段可以用作常規(guī)信號(hào)肽。然而，已經(jīng)描述了缺乏常規(guī)信號(hào)肽、但仍通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Florkiewicz等，1995，J.Cell.Physiology 162388-399)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Sendtner等，1994，J.Neurobiology 251436-1353)和白介素-1(Rubartelli等，1990，EMBO J.91503-1510)。例如commissureless(Tear等，1996，Neuron 16501-514)的膜蛋白也缺乏常規(guī)信號(hào)肽，但仍插入膜。
盡管在推定5’非翻譯區(qū)沒有符合讀框的終止密碼子，這可能明確限定起始密碼子，但以下證據(jù)提示，圖2a中指出的甲硫氨酸是Nogo A和Nogo B的起始密碼子(1)該假定起始密碼子周圍的序列證明符合翻譯起始位點(diǎn)的共有序列(GCCGCC A/G CCATGG；SEQ ID NO39)；(2)進(jìn)行了大量的研究以通過文庫(kù)篩選以及5’-RAGE尋找更上游的序列。這些尋找中沒有一個(gè)已經(jīng)導(dǎo)致鑒定出更上游的序列；和(3)從上述甲硫氨酸表達(dá)真核重組Nogo A的表觀分子量約為200 kD，正如通過SDS-PACE所估計(jì)的，這不可與來自大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)源NogoA區(qū)別(圖11a)。
6.2.2 Nogo序列分析Nogo A含有7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，然后生物化學(xué)證據(jù)表明，Nogo A不具有主要的多糖組分。Nogo A也具有19個(gè)PKC識(shí)別位點(diǎn)和7個(gè)酪蛋白激酶II識(shí)別位點(diǎn)(圖2a)。所有三種Nogo均分別具有35個(gè)氨基酸和36個(gè)氨基酸的兩個(gè)共同羧基末端疏水結(jié)構(gòu)域。它們中的任一種或兩種可以用作跨膜結(jié)構(gòu)域或膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域，這與bNI220鑒定為膜內(nèi)在蛋白質(zhì)一致。Nogo A(以及Nogo B和C)不含有任何已知的細(xì)胞粘著分子、胞外基質(zhì)蛋白或其它引導(dǎo)分子的基序。
Nogo序列用來在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索同源基因，所述三種Nogo產(chǎn)物的羧基末端共同結(jié)構(gòu)域與鑒定的人基因nsp(大鼠中的cl13和s-rex，以及雞中的chs-rex)相似(62.5％)(圖3)。來自C.elegans的EST和黑尾果蠅(Drosophila melanogaster)EST在該同一區(qū)與Nogo和nsp也具有顯著的相似性(分別為16.6％和13.6％)。Nogo和Nsp的180個(gè)氨基酸羧基末端結(jié)構(gòu)域在哺乳動(dòng)物物種中均高度保守(分別為98.3％和97.3％)，這表明它們可以執(zhí)行相似和必需的功能。在該區(qū)之外，不同物種中特定蛋白的相似性也高(在大鼠和牛Nogo A之間為73％；在NSP-A和S-rexb之間為76.2％；在Chs-rexb和NSP-A或S-rexb之間為50％)。然而，NSP和Nogo之間的相似性限于其羧基末端疏水共同結(jié)構(gòu)域(圖3a)，以及限于所述蛋白該保守區(qū)之外的酸性性質(zhì)。NSP(NSP-A、NSP-B和NSP-C)先前被描述為功能未知的神經(jīng)內(nèi)分泌(neuro-endocrine)特異性產(chǎn)物。原位雜交和免疫組織學(xué)顯示出神經(jīng)系統(tǒng)中NSP的神經(jīng)元定位。最近鑒定出另一人基因nsp樣-1，它也具有與Nsp和Nogo具有50％相似性的一個(gè)羧基末端疏水區(qū)。
6.2.3. Nogo的組織表達(dá)通過RNA印跡和原位雜交檢查Nogo表達(dá)型式。當(dāng)使用“共同”探針(6.1.6一節(jié))時(shí)，在視神經(jīng)、脊髓和腦皮質(zhì)中檢測(cè)到三種主要的Nogo轉(zhuǎn)錄物(命名為A，4.6kb；B，2.6kb；和C，1.7kb)(圖4a)。在背根神經(jīng)節(jié)中，僅檢測(cè)到兩種較大的轉(zhuǎn)錄物。在PC12細(xì)胞中檢測(cè)到一種2.6kb的主要轉(zhuǎn)錄物，而在長(zhǎng)時(shí)間暴露后僅可以檢測(cè)到4.6kb條帶(圖4a)。在坐骨神經(jīng)中，檢測(cè)到較低水平的轉(zhuǎn)錄物，2.6kb條帶是主要的轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)脊髓和PC12細(xì)胞poly(A)+RNA與外顯子1特異性探針雜交時(shí)，僅檢測(cè)到4.6kb和2.6kb轉(zhuǎn)錄物；當(dāng)后腦和骨骼肌poly(A)+RNA與外顯子2特異性探針雜交時(shí)，在后腦中僅檢測(cè)到4.6kb轉(zhuǎn)錄物(圖4b)。這些結(jié)果證實(shí)了圖1B中顯示的轉(zhuǎn)錄物圖譜。然而，RNA印跡分析結(jié)果也證明，Nogo的表達(dá)不限于神經(jīng)系統(tǒng)(圖4c)；在骨骼肌(1.7kb)、腎(2.6kb和1.7kb)、軟骨(來自胸骨，1.7kb)、皮膚(1.7kb)、肺(2.6kb)和脾(2.6kb)中也檢測(cè)到Nogo轉(zhuǎn)錄物。除骨骼肌表達(dá)高水平的Nogo C轉(zhuǎn)錄物外，神經(jīng)系統(tǒng)之外的Nogo轉(zhuǎn)錄物水平低于神經(jīng)系統(tǒng)的水平。迄今為止，4.6kb Nogo A轉(zhuǎn)錄物看來只在神經(jīng)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄。
采用所述共同探針在成年大鼠CNS組織切片上進(jìn)行的原位雜交，表明在大腦和脊髓不同部分的白質(zhì)中多排胞體的中等標(biāo)記。這種排列是典型的束間少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖5a，d)。除少突膠質(zhì)細(xì)胞外，幾種類型的神經(jīng)元也表達(dá)高水平的Nogo轉(zhuǎn)錄物(圖5c，e)。在小腦中，用抗GFAP抗體雙重染色切片和原位雜交清楚地表明，由所述Nogo探針將浦肯野細(xì)胞強(qiáng)染色，而星形膠質(zhì)細(xì)胞不被標(biāo)記(圖5e，f)。在發(fā)育中的視神經(jīng)中，早至出生后當(dāng)天(P0)，即在可以檢測(cè)出主要髓磷脂蛋白蛋白磷脂蛋白(PLP)和髓磷脂堿性蛋白(MBP)的mRNA之前數(shù)天，檢測(cè)到Nogo轉(zhuǎn)錄物(圖6)。這種定時(shí)與第一個(gè)半乳糖腦苷脂陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)和神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制活性的表達(dá)一致，神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制活性可以被IN-1中和。
針對(duì)基于牛Nogo A特異性序列的合成肽產(chǎn)生抗血清(AS472)，而針對(duì)45kD重組的部分大鼠Nogo A(6.1.7一節(jié))產(chǎn)生抗血清(ASBruna)。在蛋白質(zhì)印跡上，AS472和AS Bruna每個(gè)都識(shí)別牛髓磷脂中的一種約200kD的蛋白，而AS Bruna還識(shí)別一種200kD大鼠髓磷脂蛋白(圖7)。成年大鼠脊髓和小腦的切片用AS472、AS Bruna和IN-1染色。當(dāng)切片用乙醇/乙酸固定時(shí)(較早時(shí)表明是IN-1抗原的保藏和可及性所需的步驟)，所有三種抗體觀察到白質(zhì)/髓磷脂的強(qiáng)染色(圖8)。用AS Bruna的少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體的染色特別清楚。新鮮冷凍的切片用甲醇處理，而不用乙醇/乙酸處理，消除了除少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體外的髓磷脂染色。
AS Bruna和AS472也將某些類型的神經(jīng)元包括脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及小腦中的粒層和分子層染色。浦肯野細(xì)胞用AS472和ASBruna強(qiáng)染色，但用IN-1沒有可檢測(cè)的染色。
6.2.4 Nogo抗體在體外抑制Nogo誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制半純化牛脊髓NI-220制劑(q-庫(kù))可以防止NIH3T3成纖維細(xì)胞散布和神經(jīng)突向外生長(zhǎng)。在存在Nogo抗血清AS Bruna、AS 472或IN-1中任一種時(shí)，q-庫(kù)抑制活性降低，即NIH 3T3成纖維細(xì)胞經(jīng)歷散布和胚雞背根神經(jīng)節(jié)(DRG)在包被q-庫(kù)的平皿上延伸神經(jīng)突(圖9)。通過加入用來產(chǎn)生AS472的肽P472(6.1.7一節(jié))證明了特異性。P472成功地阻斷AS472的抑制效應(yīng)，而對(duì)照肽對(duì)所述抑制沒有效應(yīng)。
此外，采用AS472，在免疫細(xì)胞化學(xué)上、功能和生物化學(xué)上，證明了在少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面上存在Nogo A。當(dāng)細(xì)胞為活細(xì)胞時(shí)，原代培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞用或者mAbIN-1或者AS472染色，在分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞上觀察到相對(duì)弱(與半乳糖腦苷脂的免疫細(xì)胞化學(xué)相比)但清楚的表面染色(圖15a，c)。加入AS472的競(jìng)爭(zhēng)肽(P472)或不加入第一抗體，消除了特異性染色(圖15b，d)。細(xì)胞表面生物素化和隨后用鏈霉抗生物素沉淀進(jìn)一步證明在少突膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜上存在Nogo A。在沉淀物中，AS472檢測(cè)到在所述胞內(nèi)可能的非加工和非糖基化AS472免疫陽性條帶之上約40kD的條帶。在生物素化部分中不能檢測(cè)出ER蛋白BiP(圖15e)。
也在功能上分析Nogo A作為少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞表面分子。少突膠質(zhì)細(xì)胞和NIH3T3成纖維細(xì)胞或者少突膠質(zhì)細(xì)胞和DRG神經(jīng)元的共同培養(yǎng)，清楚地表明成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的抑制特性。這些測(cè)定證明，NIH3T3成纖維細(xì)胞和DRG神經(jīng)突強(qiáng)烈地避開少突膠質(zhì)細(xì)胞的區(qū)域，這種效應(yīng)被mAb IN-1中和。在存在AS472的情況下，這種抑制同樣降低(圖16a、b和e、f)，而AS472與P472預(yù)溫育恢復(fù)了少突膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的抑制(圖16c、d和g、h)。定量分析揭示出在兩種類型的測(cè)定中mAb IN-1和AS472的高度顯著的中和能力(圖16i和j)。
測(cè)試由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的RecNogo-A(圖17a)對(duì)NIH3T3成纖維細(xì)胞散布和DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的活性。從穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系(CHO-LacZ)分離的重組產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶與recNogo-A平行富集，將其用作兩個(gè)測(cè)定中內(nèi)源CHO蛋白抑制活性的對(duì)照。在NIH3T3成纖維細(xì)胞散布測(cè)定中，含recNogo-A的CHO提取物(Nogo-A約1-5％總蛋白；圖9a)在10μg/cm2下表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞散布的明顯抑制效應(yīng)(圖17b)。這種效應(yīng)是劑量依賴性的在20μg/cm2下抑制活性較高，而5μg/cm2沒有抑制性(數(shù)據(jù)未顯示)。通過所述包被蛋白與mAb IN-1或AS Bruna預(yù)溫育，可以將所述抑制活性中和至背景水平，而針對(duì)半乳糖腦苷脂的對(duì)照抗體(mAb O1)或AS Bruna免疫前血清沒有效應(yīng)(圖17b)。
除了對(duì)NIH3T3成纖維細(xì)胞散布的強(qiáng)效應(yīng)外，含recNogo-A的CHO提取物而不是CHO-LacZ提取物，對(duì)來自原代培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)具有有效抑制效應(yīng)解離的DRG神經(jīng)元以劑量依賴形式被recNogo-A抑制(圖17c)。這種抑制活性可以被mAb IN-1中和，但不被對(duì)照mAb O1中和(圖17c-e)。分離自CHO-LacZ的重組蛋白在1μg和5μg下沒有抑制性，加入mAb O1或IN-1對(duì)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)沒有效應(yīng)。
6.2.5神經(jīng)突在體外的再生長(zhǎng)研究了新生大鼠DRG神經(jīng)突再生和通過成年CNS組織生長(zhǎng)的能力。從成年大鼠解剖出多對(duì)視神經(jīng)，在特殊室培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，以使DRG神經(jīng)突可及每根神經(jīng)的一端(圖10a)。在每個(gè)培養(yǎng)物中，給兩根神經(jīng)之一注射并暴露于免疫前兔血清，給第二根神經(jīng)注射AS472，AS472也存在于該神經(jīng)周圍的側(cè)室中。在NGF存在下在體外2周后，固定所述培養(yǎng)物，將其拆開并包埋用于電鏡分析(EM)。從所述神經(jīng)接觸DRG神經(jīng)元的一端取3.5mm的EM切片。注射免疫前血清的神經(jīng)不含或僅含有少數(shù)軸突(圖10b)。后者僅發(fā)現(xiàn)與基膜和所述神經(jīng)表面上的星形膠質(zhì)細(xì)胞相連。相反，注射AS472的大多數(shù)視神經(jīng)含有相當(dāng)大數(shù)目的軸突，通常多達(dá)數(shù)百個(gè)?？梢猿３Ｓ^察到與髓磷脂接觸(圖10c，d)。
6.2.6 IN-1識(shí)別重組Nogo A當(dāng)Nogo A作為轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中的羧基末端myc-his標(biāo)記的重組蛋白表達(dá)時(shí)，采用抗myc抗體和AS Bruna這兩者的蛋白質(zhì)印跡證明，重組Nogo A在變性SDS凝膠上的表觀分子量約為200kD(圖11a)。在同一印跡上，As Bruna在大鼠原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到相似遷移率的條帶，提示重組Nogo A的分子量與來自少突膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)源Nogo A的分子量幾乎相同(圖1a)。當(dāng)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞用IN-1和As Bruna免疫熒光染色時(shí)，IN-1和AS Bruna識(shí)別相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖11b，c)。大多數(shù)所述免疫反應(yīng)性位于細(xì)胞內(nèi)，并且僅在透化后可及。
6.2.7對(duì)Nogo活性區(qū)作圖產(chǎn)生一系列Nogo的缺失突變體，以便對(duì)Nogo的抑制結(jié)構(gòu)域或區(qū)作圖。通過采用內(nèi)部限制位點(diǎn)、綠豆內(nèi)切核酸酶III消化和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生所述Nogo基因的缺失構(gòu)成物。在圖18及其簡(jiǎn)述中提供了所述突變體的描述。所述大多數(shù)構(gòu)成物具有N末端T7標(biāo)記，以用抗T7單克隆抗體進(jìn)行鑒定；具有N末端或C末端六組氨酸標(biāo)記(“His標(biāo)記”)，用于采用固定化Co(II)-親和層析純化。Nogo缺失突變體NiG-D1、NiG-D2直至NiG-D20全都采用NIH3T3成纖維細(xì)胞散布測(cè)定測(cè)試，以測(cè)定抑制活性。在PC12神經(jīng)突向外生長(zhǎng)、解離的大鼠DRG神經(jīng)突向外生長(zhǎng)或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)剝離測(cè)定中測(cè)試某些突變體。結(jié)果示于以下表2中。
表2.Nogo缺失突變體的功能活性
當(dāng)成纖維細(xì)胞或PC12細(xì)胞被抑制以不能在包被得自缺失突變體的Nogo制劑的平板上散布時(shí)，記錄NIH3T3成纖維細(xì)胞測(cè)定(3T3)或PC12測(cè)定中的陽性結(jié)果。胚雞背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)測(cè)定(DRG)或神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)錐衰弱測(cè)定(RGC)中的陽性結(jié)果表明，在得自缺失突變體的Nogo制劑存在下，神經(jīng)突向外生長(zhǎng)受抑制，或引起生長(zhǎng)錐衰弱。
該數(shù)據(jù)表明，在來自氨基酸172-974、特別是氨基酸542-722的Nogo-A特異性區(qū)中鑒定出一個(gè)主要抑制結(jié)構(gòu)域。另外，Nogo-A和Nogo-B的N末端序列(氨基酸1-171)也抑制3T3散布。根據(jù)所述結(jié)果，來自氨基酸172-259的Nogo區(qū)和來自975-1162的Nogo區(qū)看來是非必需的，并且可以除去而不損失抑制活性。
7.實(shí)施例人Nogo核酸和蛋白、衍生物和片段本發(fā)明提供編碼人Nogo蛋白以及人Nogo蛋白片段的核苷酸序列，所述人Nogo蛋白片段包括與大鼠Nogo A、Nogo B和部分NogoC的人等同物。人Nogo氨基酸序列描述于圖13，并且已經(jīng)命名為SEQID NO30。
本發(fā)明也提供人Nogo基因片段的核苷酸序列。采用大鼠NogoA轉(zhuǎn)錄物作為輔助，以對(duì)同源于所述大鼠或牛cDNA序列的人已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)的人Nogo核苷酸序列進(jìn)行序列對(duì)比并將其剪接在一起，可以確定人Nogo核苷酸序列。
例如，EST AA081783和AA333267(5.1一節(jié))互相重疊，并且對(duì)應(yīng)于大鼠Nogo A(圖2a；SEQ ID NO1)核酸位置765-1272。ESTAA322592、AA092565和AA081525(5.1一節(jié))也互相重疊，并且所述重疊序列對(duì)應(yīng)于大鼠Nogo核酸1642-2131。不采用與本發(fā)明的大鼠或牛Nogo核苷酸序列進(jìn)行直接計(jì)算機(jī)比較，可能不能對(duì)這兩組獨(dú)立的重疊EST進(jìn)行序列對(duì)比，以得到所述人序列。對(duì)于原始計(jì)算機(jī)序列對(duì)比，最好使用ENTREZ Nucleotide QUERY。其它計(jì)算機(jī)序列對(duì)比程序列于5.1一節(jié)，作為替代實(shí)施例，不意味著限制可以使用的計(jì)算機(jī)程序的范圍。
8.討論8.1神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑Nogo的克隆Nogo A具有許多特性，支持它是先前所描述的大鼠NI-250，這是一種CNS髓磷脂的主要神經(jīng)突向外生長(zhǎng)抑制蛋白和IN-1的抗原。在分子水平上，Nogo A含有最初通過對(duì)bNI-220測(cè)序獲得的所有6種肽，bNI-220是牛脊髓髓磷脂的最具抑制性的組分。在表達(dá)水平上，少突膠質(zhì)細(xì)胞是成年CNS中的Nogo A表達(dá)的主要細(xì)胞類型，Nogo表達(dá)在視神經(jīng)中定時(shí)的符合先前對(duì)IN-1中和的對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的髓磷脂抑制活性的描述。此外，蛋白質(zhì)印跡揭示在活性q-庫(kù)部分中存在Nogo A，來自不同CNS區(qū)的白質(zhì)被AS Bruna以及AS472(對(duì)NogoA為特異性的)染色，其染色型式與IN-1的型式相同。這些事實(shí)均與Nogo A是NI-250的解釋一致。
針對(duì)Nogo A序列產(chǎn)生的兩種抗血清AS Bruna和AS472大大降低了部分純化的牛脊髓制劑(q-庫(kù))的抑制活性。AS472也使得數(shù)毫米范圍內(nèi)的許多背根神經(jīng)節(jié)軸突向內(nèi)生長(zhǎng)至成年視神經(jīng)外植體中，非常類似于NI-1。
盡管Nogo A的計(jì)算分子量為約140kD，但在變性SDS凝膠上其表觀分子量為約200kD，這在預(yù)先估計(jì)的約250kD的范圍內(nèi)。Nogo A在SDS凝膠中的異常遷移率可能是由其酸性性質(zhì)引起，而不是因?yàn)榉g后修飾引起的。對(duì)于其它高度酸性的蛋白例如生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43以及NSP-A，已經(jīng)假定蛋白在SDS-PAGE上異常遷移率。另外，細(xì)菌表達(dá)的重組Nogo A的表觀分子量與大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源Nogo A的表觀分子量相同。這反對(duì)通過例如糖基化的機(jī)制對(duì)Nogo A進(jìn)行主要修飾。
8.2 Nogo防止成年CNS的再生并限制其可塑性Nogo在來自P0的大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與較早的IN-1可中和性神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制活性的發(fā)現(xiàn)非常一致。有趣的是，這種表達(dá)比主要髓磷脂蛋白表達(dá)和致密髓磷脂形成早數(shù)天。Nogo的出現(xiàn)可能是對(duì)軸突信號(hào)的反應(yīng)，可以防止相應(yīng)的纖維束中的進(jìn)一步軸突生長(zhǎng)(在大鼠視神經(jīng)中軸突數(shù)目在E20為高峰)。Nogo也可能抑制側(cè)突形成，并由此穩(wěn)定分化CNS的一般結(jié)構(gòu)。在分化CNS區(qū)的灰質(zhì)中，髓磷脂含量和IN-1的免疫反應(yīng)性與GAP-43和所述特定區(qū)的可塑性的潛力負(fù)相關(guān)。事實(shí)上，應(yīng)用于成年CNS的IN-1抗體允許在腦干和脊髓中發(fā)生萌發(fā)和可塑性至先前已知的僅新生CNS的程度。與這種可塑性平行的大的功能恢復(fù)表明，萌發(fā)軸突能夠形成功能適當(dāng)?shù)倪B接。
先前已經(jīng)證明，神經(jīng)元對(duì)抑制性Nogo的反應(yīng)在不同年齡的神經(jīng)元之間不同。推定，這是由于受體的差別表達(dá)，所述受體將有希望很快被鑒定出。同Netrins和許多生長(zhǎng)因子一樣，仍有可能存在觸發(fā)不同反應(yīng)的不同Nogo受體。Nogo也在某些類型的神經(jīng)元中表達(dá)，這一事實(shí)表明在相同和/或不同Nogo同種型之間可能的相互作用。
8.3 Nogo屬于一個(gè)新的神經(jīng)突調(diào)節(jié)分子家族對(duì)Nogo的序列分析揭示，沒有已知的細(xì)胞表面蛋白或基質(zhì)蛋白的基序涉及軸突引導(dǎo)(排斥或吸引)；即不能鑒定出免疫球蛋白、纖連蛋白III型或EGF的結(jié)構(gòu)域。與所描述的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制劑Semaphorins、Netrins或Ephrins也沒有同源性。
Nogo形成一個(gè)新家族，根據(jù)其羧基末端180個(gè)氨基酸的相似性，所述家族具有一組新近描述的蛋白-NSP/s-rex和NSP-樣1蛋白。同Nogo的情況一樣，可變啟動(dòng)子用法(Nsp和Nsp-樣1基因)和可變剪接(僅Nsp)均負(fù)責(zé)具有共同羧基末端的可變蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生，所述共同羧基末端含有兩個(gè)疏水氨基酸序列段。正如名稱所表示，NSP(神經(jīng)內(nèi)分泌同特異性蛋白)主要在神經(jīng)元和幾種內(nèi)分泌細(xì)胞類型中表達(dá)。它們主要位于細(xì)胞內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連。NSP-樣1基因主要在腦和肌肉中表達(dá)。NSP家族和Nsp-樣1家族的功能均是未知的。潛在C.elegans和黑尾果蠅中均存在潛在的直向同源物，這一事實(shí)表明，Nogo與其神經(jīng)再生和萌發(fā)抑制活性，可能是新近進(jìn)化的，并因此是NSP家族的未描述過的成員。
8.4非神經(jīng)元組織中的NogoNogo C轉(zhuǎn)錄物在骨骼肌中的表達(dá)水平與神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)水平相當(dāng)。肌肉Nogo C的一個(gè)可想象的功能是排斥運(yùn)動(dòng)軸突，并將其限于運(yùn)動(dòng)終板區(qū)。低水平的Nogo表達(dá)也可以在其它非神經(jīng)組織中檢測(cè)到。觀察到的髓磷脂提取物和NI-250對(duì)成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞散布的抑制暗示在這些細(xì)胞中存在Nogo蛋白受體和反應(yīng)機(jī)制。這提示Nogo在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的接觸抑制方面的可能的一般功能。
本發(fā)明不限于本文描述的具體實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，根據(jù)上述描述和附圖，除本文描述的實(shí)施方案之外的本發(fā)明的各種修改，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這樣的修改計(jì)劃屬于所附的權(quán)利要求書范圍內(nèi)。
本文引用了各種參考文獻(xiàn)，其公開內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.Nogo蛋白，其無天然與其連接的所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的蛋白，選自NogoA和NogoB。
3.權(quán)利要求2的蛋白，其包含圖2a(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2的蛋白，其氨基酸序列由選自以下的氨基酸序列組成描述于圖2a(SEQ ID NO2)的殘基1-1163和描述于圖2(SEQ IDNO2)的與殘基975-1163融合的殘基1-172。
5.純化的NogoC蛋白。
6.權(quán)利要求5的蛋白，其包含描述于圖14的SEQ ID NO32的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5的蛋白，其氨基酸序列由描述于圖14的SEQ ID NO32組成。
8.權(quán)利要求2或5的蛋白，其為重組產(chǎn)生的。
9.權(quán)利要求2或5的蛋白，其具有哺乳動(dòng)物蛋白的序列。
10.權(quán)利要求1、2或5的蛋白，其具有人蛋白的序列。
11.一種蛋白，其包含的氨基酸序列在以下氨基酸序列中具有至少一個(gè)保守氨基酸取代圖2a中所述氨基酸序列(SEQ ID NO2)、圖13中所述氨基酸序列(SEQ ID NO30)或圖14中所述氨基酸序列(SEQID NO32)；并且所述蛋白能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合，所述Nogo蛋白具有選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO2的殘基1-1163、SEQ ID NO2的融合于殘基975-1163的殘基1-172、和SEQID NO32的殘基1-199。
12.權(quán)利要求1的蛋白，采用BLAST計(jì)算機(jī)算法測(cè)定，其包含的氨基酸序列顯示出與SEQ ID NO2的氨基酸序列的同源性高于50％。
13.權(quán)利要求1的蛋白，其由可與第二核酸雜交的第一核酸編碼，所述第二核酸具有圖2a中所述核苷酸序列(SEQ ID NO1)或圖12中所述核苷酸序列(SEQ ID NO28)。
14.權(quán)利要求1的蛋白的純化片段，其能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合，并且其中所述純化的片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
15.權(quán)利要求5或11的蛋白的純化片段，其能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合。
16.包含Nogo蛋白片段的純化蛋白，所述Nogo蛋白片段包含選自以下的氨基酸序列描述于圖2a(SEQ ID NO2)的殘基31-57、描述于圖14(SEQ ID NO32)的殘基11-191、描述于圖2a(SEQ ID NO2)的殘基988-1023和描述于圖2a(SEQ ID NO2)的殘基1090-1125、描述于圖13(SEQ ID NO30)的殘基994-1174、描述于圖13(SEQ ID NO30)的殘基977-1012和描述于圖13(SEQ ID NO30)的殘基1079-1114。
17.純化的未糖基化蛋白，其選自NogoA、NogoB和NogoC。
18.純化的蛋白，其無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)，并且由可與第二核酸雜交的第一核苷酸序列編碼，所述第二核酸具有圖2a中所述核苷酸序列(SEQ ID NO1)或圖12中所述核苷酸序列(SEQ ID NO28)，所述蛋白能夠被針對(duì)具有圖2a所述氨基酸序列(SEQ ID NO2)的第二蛋白的抗體結(jié)合。
19.包含權(quán)利要求2、5或11所述蛋白的片段的嵌合蛋白，其能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合，通過共價(jià)鍵融合于第二蛋白的至少一部分，所述第二蛋白不同于權(quán)利要求2、5或11的蛋白的所述片段。
20.包含權(quán)利要求1所述蛋白的片段的純化分子，其能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合，并且其中所述純化分子無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
21.包含權(quán)利要求5或11所述蛋白的片段的純化分子，其能夠被針對(duì)Nogo蛋白的抗體結(jié)合。
22.分離的核酸，其包含選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO33的核苷酸序列。
23.分離的核酸，其包含(a)核苷酸序列，其編碼的多肽具有選自以下的氨基酸序列描述于圖2a(SEQ ID NO2)的殘基1-1163、描述于圖2a(SEQID NO2)的融合于殘基975-1163的殘基1-172和描述于圖14(SEQ ID NO32)的殘基1-191；或(b)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。
24.能夠與第二核酸雜交的分離的第一核酸，所述第二核酸具有的核苷酸序列互補(bǔ)于編碼的多肽具有選自以下氨基酸序列的核苷酸序列描述于圖2a(SEQ ID NO2)的殘基1-1163、描述于圖2a(SEQ IDNO2)的融合于殘基975-1163的殘基1-172和描述于圖14(SEQ IDNO32)的殘基1-191；并且所述第一核苷酸編碼天然存在的能夠被針對(duì)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白的抗體結(jié)合。
25.權(quán)利要求24的分離的核酸，其編碼天然存在的人Nogo蛋白。
26.可與第二核酸雜交的分離的第一核酸，所述第二核酸具有描述于圖2a的核苷酸序列(SEQ ID NO2)或描述于圖12的核苷酸序列(SEQ ID NO28)，其中所述第一核酸編碼第一蛋白，所述第一蛋白能夠被針對(duì)具有圖2a所述氨基酸序列(SEQ ID NO2)的第二蛋白的抗體結(jié)合。
27.編碼天然存在的蛋白的分離的核酸，所述天然存在的蛋白能夠被針對(duì)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白的抗體結(jié)合，并且通過BLAST計(jì)算機(jī)算法測(cè)定，所述分離的核酸能夠與編碼多肽的核苷酸序列的核苷酸序列同源性高于70％，所述多肽具有選自以下氨基酸序列SEQ ID NO2的殘基1-1163、SEQ ID NO2的融合于殘基975-1163的殘基1-172和SEQ ID NO32的殘基1-191。
28.權(quán)利要求27的核酸，其中所述天然存在的蛋白是人蛋白。
29.分離的核酸，其包含的核苷酸序列編碼Nogo蛋白片段，所述Nogo蛋白片段表現(xiàn)出所述Nogo蛋白的一種或更多種功能活性，其中所述Nogo蛋白不是人Nogo蛋白、果蠅屬Nogo蛋白或Caenorhabditis elegans的Nogo蛋白。
30.分離的核酸，通過BLAST計(jì)算機(jī)算法測(cè)定，其包含的核苷酸序列編碼的蛋白包含的氨基酸序列與SEQ ID NO30的氨基酸序列高于50％的同源性。
31.分離的核酸，其編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的至少220個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
32.分離的核酸，其包含至少兩個(gè)選自以下的非重疊人已表達(dá)序列標(biāo)志的核苷酸序列AA158636(SEQ ID NO35)、AA333267(SEQID NO36)、AA081783(SEQ ID NO37)、AA167765(SEQ ID NO38)、AA322918(SEQ ID NO39)、AA092565(SEQ ID NO40)、AA081525(SEQ ID NO41)和AA081840(SEQ ID NO42)。
33.包含有效連接于非天然啟動(dòng)子的權(quán)利要求22、23、24和25中任一項(xiàng)的核酸的載體。
34.包含權(quán)利要求22、23、24和25中任一項(xiàng)的核酸的表達(dá)載體。
35.用權(quán)利要求22、23、24和25中任一項(xiàng)的核酸轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的重組細(xì)胞，其為原核重組細(xì)胞。
37.權(quán)利要求35的重組細(xì)胞，其為真核重組細(xì)胞。
38.產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)用權(quán)利要求22、23、24或25的核酸轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，以使由所述核酸編碼的蛋白由所述細(xì)胞表達(dá)；并且回收所述表達(dá)的蛋白。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述重組細(xì)胞是原核重組細(xì)胞。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述重組細(xì)胞為真核重組細(xì)胞。
41.治療患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的Nogo蛋白或其片段，所述Nogo蛋白或其片段沒有與所述Nogo蛋白天然連接的所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)，所述片段在抑制細(xì)胞增殖方面有活性。
42.權(quán)利要求42的方法，其中所述腫瘤疾病是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、menagioma、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述受治療者是人類。
44.治療患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的受治療者的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的抑制所述受治療者中Nogo產(chǎn)生的核酶或反義Nogo核酸。
45.誘導(dǎo)受治療者中神經(jīng)元再生或萌發(fā)的方法，所述方法包括給予所述受治療者治療有效量的抑制所述受治療者中Nogo產(chǎn)生的核酶或反義Nogo核酸。
46.促進(jìn)受治療者中中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可塑性的方法，所述方法包括給予需要中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可塑性的受治療者治療有效量的抑制所述受治療者中Nogo產(chǎn)生的核酶或反義Nogo核酸。
47.重組非人類動(dòng)物，其是包括將編碼至少Nogo蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸引入所述動(dòng)物或所述動(dòng)物后代基因組中的方法的產(chǎn)物。
48.重組非人類動(dòng)物，其中Nogo基因已經(jīng)被失活或缺失。
49.權(quán)利要求48的動(dòng)物，其中所述Nogo基因已經(jīng)通過包括將核酸引入所述動(dòng)物或其祖先的方法失活，所述核酸包含側(cè)翼為促進(jìn)同源重組的Nogo基因序列的非Nogo基因序列。
50.Nogo蛋白的純化片段，所述片段包含選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-171、172-974、259-542、542-722、172-259、722-974和975-1162的氨基酸序列，所述片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
51.Nogo蛋白的純化片段，所述片段缺乏SEQ ID NO2的氨基酸殘基172-259、氨基酸殘基974-1162或氨基酸殘基172-259和974-1162，但在其它部分包含SEQ ID NO2的其余部分，并且所述片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
52.Nogo蛋白的純化片段，所述片段包含選自SEQ ID NO30的氨基酸殘基1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939和940-1127的氨基酸序列，所述片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
53.Nogo蛋白的純化片段，所述片段缺乏SEQ ID NO30的氨基酸殘基132-206、氨基酸殘基939-1127或氨基酸殘基132-206和939-1127，但在其它部分包含SEQ ID NO30的其余部分，并且所述片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
54.包含Nogo蛋白片段的純化蛋白，所述蛋白(a)缺乏SEQ ID NO2的氨基酸殘基172-259、氨基酸殘基974-1162或氨基酸殘基172-259和974-1162；并且(b)表現(xiàn)出所述Nogo蛋白的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制活性，并且所述片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
55.包含Nogo蛋白片段的純化蛋白，所述蛋白(a)缺乏SEQ ID NO30的氨基酸殘基132-206、氨基酸殘基939-1127或氨基酸殘基132-206和939-1127；并且(b)表現(xiàn)出所述Nogo蛋白的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制活性，并且所述片段無所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂物質(zhì)。
56.分離的核酸，其編碼的蛋白包含選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-171、172-974、259-542、542-722、172-259、722-974和975-1162的氨基酸序列。
57.分離的核酸，其編碼的蛋白缺乏SEQ ID NO2的氨基酸殘基172-259、氨基酸殘基974-1162或氨基酸殘基172-259和974-1162，但在其它部分包含SEQ ID NO2的其余部分。
58.分離的核酸，其編碼的蛋白包含選自SEQ ID NO30的氨基酸殘基1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939和940-1127的氨基酸序列。
59.分離的核酸，其編碼的蛋白缺乏SEQ ID NO30的氨基酸殘基132-206、氨基酸殘基939-1127或氨基酸殘基132-206和939-1127，但在其它部分包含SEQ ID NO30的其余部分。
60.包含權(quán)利要求56、57、58和59中任一項(xiàng)的核酸的載體。
61.用權(quán)利要求56、57、58和59中任一項(xiàng)的核酸轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。
62.包含融合于非Nogo蛋白的氨基酸序列的權(quán)利要求52、53或55的片段的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因Nogo、其編碼的蛋白產(chǎn)物以及其衍生物和類似物。也提供Nogo蛋白、衍生物和抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及治療組合物以及診斷和治療方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1354755SQ99815348
公開日2002年6月19日 申請(qǐng)日期1999年11月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月6日
發(fā)明者馬丁E·施瓦布, 馬伊奧S·陳 申請(qǐng)人:馬丁E·施瓦布, 馬伊奧S·陳