通過酶解大豆蛋白制備大豆肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶解大豆蛋白的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及通過酶解大豆蛋白制 備大豆肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵法分離、酸法分解或酶法酶解，并經(jīng)過精制而 得到的多肽混合物，以小分子肽(分子量> 150Da且< 2000Da)為主，還含有少量大分子肽 (分子量大于2000Da)、分子量小于150Da的寡肽、游離氨基酸、糖類和無機鹽等成分，相對 分子質(zhì)量在5000Da以下。大豆肽的蛋白質(zhì)含量為85wt%左右(通過凱氏定氮法測定N含量 計算得出），其氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)相同，必需氨基酸的組成平衡良好且含量豐富。大 豆肽具有無豆腥味、不會發(fā)生蛋白變性、酸性條件下不發(fā)生沉淀、加熱時不凝固、易溶于水、 流動性好等良好的加工性能，是優(yōu)良的保健食品素材。
[0003] 目前，工業(yè)上一般采用酶解法制備大豆肽。但是，目前的酶解法所得到的酶解產(chǎn)物 由于疏水基團(tuán)暴露會帶有較強的苦澀味，而且所述酶解還會產(chǎn)生較多的游離氨基酸，使得 到的產(chǎn)物中肽含量相對較低。一般來講，將游離氨基酸的含量控制在10wt%之內(nèi)、優(yōu)選在 5wt%之內(nèi)是適當(dāng)?shù)?；并且根?jù)大豆肽粉中國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T22492-2008)的規(guī)定，一級大豆 肽粉中必須含有不少于80wt%的相對分子量不高于2000Da的肽段。因此，需要開發(fā)出將大 豆肽中的肽段的相對分子量盡可能控制在150-2000Da之間的新的酶解技術(shù)。
[0004] 日本專利JP2006-324372中公開了一種經(jīng)過兩步酶解以及植酸酶處理來獲得大 豆肽混合物的方法，所述方法包括如下步驟：從豆柏提取物中得到大豆分離蛋白液，先在堿 性至中性的條件下加入內(nèi)肽酶酶解,滅酶后將溶液調(diào)節(jié)至酸性,再加入外肽酶和植酸酶先 后進(jìn)行酶解、殺菌、噴霧干燥，最后得到大豆肽粉末。由該方法得到的終產(chǎn)物在冷藏狀態(tài)下 的酸溶液中也不會形成渣滓。然而，該發(fā)明中并沒有大豆肽的得率和感官評價的數(shù)據(jù)。并 且，該發(fā)明所述的方法總在使用外肽酶進(jìn)行酶解前，需要對溶液的PH進(jìn)行調(diào)整。因此，所述 方法在操作上更加復(fù)雜，不利于工業(yè)化使用。此外，由于該方法所得大豆肽混合物的平均分 子量優(yōu)選200-5000Da，也反映出了該方法所得大豆肽中的各肽段大小差異較大，而無法實 現(xiàn)使產(chǎn)物主要集中于合適的分子量范圍內(nèi)（如150Da-2000Da)。
[0005] 中國專利申請CN102578367A中公開了一種利用擠壓膨化預(yù)處理大豆片和超聲輔 助酶解所得高溫豆柏來生產(chǎn)大豆肽的方法。該發(fā)明優(yōu)選的酶解高溫豆柏制備的大豆肽酶解 度為36. 88%，大豆肽得率為34. 56% (S卩，該方法中的大豆肽得率偏低)。并且，該專利申請 文獻(xiàn)中沒有感官評價及分子量分布的數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用內(nèi)肽酶(例如，作為內(nèi)肽酶使用的堿性蛋白酶與中性蛋白酶)、外肽酶 (例如，作為外肽酶使用的風(fēng)味蛋白酶)聯(lián)合酶解的方法。相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的方 法不僅在程序上更加簡單(如，在使用外肽酶進(jìn)行酶解前無需調(diào)節(jié)溶液的pH、無需植酸酶處 理的過程)，而且所制備得到的大豆肽苦澀味低，且得率較高。
[0007] 在本發(fā)明的方法中，首先將大豆分離蛋白加水配制成大豆分離蛋白液，并通過pH 調(diào)節(jié)劑對該蛋白液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，使之適合于后續(xù)內(nèi)肽酶發(fā)揮最佳酶活性。酶的加入順 序采用先加入內(nèi)肽酶、后加入外肽酶的方式，以避免外肽酶酶解時間過長而導(dǎo)致游離氨基 酸含量過高。酶解結(jié)束后，將PH調(diào)節(jié)到4. 0-5. 0,將酶滅活，促使未酶解的蛋白分子聚集沉 淀，使得大豆肽產(chǎn)品中分子量大于2000Da的肽段含量顯著降低。
[0008] 可通過如下段落[1]至段落[21]中所述的內(nèi)容對本發(fā)明的技術(shù)方案加以說明：
[0009] [1].-種通過酶解大豆蛋白制備大豆肽的方法，所述方法包括如下步驟：
[0010] (1)將大豆分離蛋白加水配制成4wt%-12wt%、優(yōu)選6wt%-10wt%的大豆分離蛋白 液，制備大豆分離蛋白液；
[0011] (2)向步驟（1)中制備的大豆分離蛋白液中滴加酸性調(diào)節(jié)劑或堿性調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié) pH至5. 0-9. 0,調(diào)節(jié)溫度至30-60°C，然后，加入作為內(nèi)肽酶使用的堿性蛋白酶和中性蛋白 酶，酶解l_3h，再加入作為外肽酶使用的風(fēng)味蛋白酶，酶解l-3h;
[0012] (3)酶解結(jié)束后，滴加酸性調(diào)節(jié)劑或堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)酶解液的pH至4. 0-5. 0,將酶 滅活，1000g-5000g離心10-30min，取上清液，置于100-18(TC、優(yōu)選130-160°C的溫度下殺 菌處理30-120s、優(yōu)選60-90s，之后噴霧干燥得到大豆肽。
[0013] [2].如段落[1]所述的方法，其中，所述步驟（1沖的水為自來水、去離子水、雙蒸 水和/或超純水，優(yōu)選去離子水。
[0014] [3].如段落[1]或[2]所述的方法，其中，所述步驟（2)中的pH為7. 0-8. 0。
[0015] [4].如段落[1]-[3]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2)中的溫度為 45-55。。。
[0016] [5].如段落[1]-[4]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2)和步驟（3)中的堿 性調(diào)節(jié)劑為NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氫鈉溶液、碳酸氫鉀溶液，優(yōu)選NaOH溶液。
[0017] [6].如段落[1]_[5]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2)和步驟（3)中的酸 性調(diào)節(jié)劑為磷酸溶液、鹽酸溶液、硫酸溶液、檸檬酸溶液、乙酸溶液以及它們相對應(yīng)的食品 領(lǐng)域中常用的酸性鹽，優(yōu)選磷酸溶液或鹽酸溶液。
[0018] [7].如段落[1]_[6]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2)中的堿性蛋白酶 為堿性絲氨酸蛋白酶、堿性天冬氨酸蛋白酶和堿性金屬蛋白酶，優(yōu)選Alkalineprotease、 Alcalase2. 4LFG0
[0019] [8].如段落[1]-[7]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2沖的中性蛋白酶為 霉菌中性蛋白酶和細(xì)菌中性蛋白酶，優(yōu)選Alphalase、NeutraseO. 8L。
[0020] [9].如段落[1]_[8]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2沖的風(fēng)味蛋白酶為 Foodpro51FP、Flavourzyme0
[0021] [10].如段落[1]-[9]中任一段所述的方法，其中，相對于大豆分離蛋白的干重而 言，所述步驟（2)中的堿性蛋白酶的添加量為0. 5wt%-5wt%、優(yōu)選0. 5wt%-2wt%。
[0022] [11].如段落[1]_[10]中任一段所述的方法，其中，相對于大豆分離蛋白的干重 而言，所述步驟（2)中的中性蛋白酶的添加量為0. 5wt%-5wt%、優(yōu)選0. 5wt%-2wt%。
[0023] [12].如段落[1]_[11]中任一段所述的方法，其中，相對于大豆分離蛋白的干重 而言，所述步驟（2)中的風(fēng)味蛋白酶的添加量為0.lwt%_3wt%、優(yōu)選0. 2wt%_lwt%。
[0024] [13].如段落[1]-[12]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2)中的酶解在水浴 鍋、恒溫箱、烘箱或恒溫加熱器中進(jìn)行。
[0025] [14].如段落[1]_[13]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（2)進(jìn)一步包括在加 入堿性蛋白酶之前或之后，向大豆分離蛋白液中加入含有Ca2+的溶液。
[0026] [15].如段落[1]-[14]中任一段所述的方法，其中，在所述步驟（3)中，通過加熱、 超聲、微波處理或加入蛋白酶抑制劑，優(yōu)選通過加熱將酶滅活。
[0027] [16].如段落[15]所述的方法，其中，所述加熱在75_95°C、優(yōu)選85°C的溫度下進(jìn) 行。
[0028] [17].如段落[15]或[16]所述的方法，其中，所述加熱進(jìn)行10_30min、優(yōu)選 20min〇
[0029] [18].如段落[1]_[17]中任一段所述的方法，其中，在所述步驟（3)中，將所述 離心得到的上清液置于噴射蒸煮器中，在100-180°C、優(yōu)選130_160°C的溫度下進(jìn)行殺菌處 理。
[0030] [19].如段落[1]-[18]中任一段所述的方法，其中，所述步驟（3)中的噴霧干燥溫 度為：進(jìn)口溫度150-200°C，出口溫度50-KKTC。
[0031] [20].如段落[19]所述的方法，其中，所述進(jìn)口溫度為170-190°c。
[0032] [21].如段落[19]或[20]所述的方法，其中，所述出口溫度為70_90°C。
[0033] 該方法所得大豆肽苦澀味低，大豆肽得率高，其中的游離氨基酸的含量以及分子 量小于150Da或分子量大于2000Da的肽段含量均較低，分子量介于150Da和2000Da之間 的肽段含量高。
【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明涉及一種通過酶解大豆蛋白制備大豆肽的生產(chǎn)方法。該方法所得的大豆 肽苦澀味低，大豆肽得率高，其中的游離氨基酸的含量及分子量小于150Da或分子量大于 2000Da的肽段含量均較低，分子量介于150Da和2000Da之間的肽段含量高。
[0035] 本發(fā)明所述的方法包括如下步驟：
[0036] (1)將大豆分離蛋白加水配制成4wt%_12wt%、優(yōu)選6wt%_10wt%的大豆分離蛋白 液，制備大豆分離蛋白液；
[0037] (2)向步驟（1)中制備的大豆分離蛋白液中滴加酸性調(diào)節(jié)劑或堿性調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié) pH至5. 0-9. 0、優(yōu)選7. 0-8. 0,調(diào)節(jié)溫度至30-60°C、優(yōu)選45-55°C，然后，加入作為內(nèi)肽酶 使用的堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解I_3h，再加入作為外肽酶使用的風(fēng)味蛋白酶，酶解 l-3h；
[0038] (3)酶解結(jié)束后，調(diào)節(jié)酶解液的pH至4.0-5.0，將酶滅活，100(^-500(^離心 10-30min，取上清液，置于100-180°C、優(yōu)選130-160°C的溫度下殺菌處理30-120S、優(yōu)選 60-90s，之后噴霧干燥得到大豆肽。
[0039] 本發(fā)明中的術(shù)語"堿性調(diào)節(jié)劑"是指能夠在溶液中提供OH-的任意堿或其相應(yīng)的 堿性鹽，例如NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氫鈉溶液、碳酸氫鉀溶液等。
[0040]本發(fā)明中的術(shù)語"酸性調(diào)節(jié)劑"是指能夠在溶液中提供H+的任意無機酸、有機酸或 它們相應(yīng)的酸性鹽，例如鹽酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液、檸檬酸溶液、乙酸溶液以及與它們 相對應(yīng)的食品領(lǐng)域中常用的酸性鹽等。
[0041] 本發(fā)明中所提及的堿性蛋白酶是指在堿性pH環(huán)境下(如，pH> 7.0、優(yōu)選pH為 7. 0~8. 0)作用于多肽鏈內(nèi)部的肽鍵從而發(fā)揮內(nèi)肽酶活性的一類蛋白酶，例如堿性絲氨 酸蛋白酶、堿性天冬氨酸蛋白酶和堿性金屬蛋白酶，優(yōu)選Alkalineprotease(丹尼斯克)、 Alcalase2.4LFG(諾維信）。
[0042] 本發(fā)明中所提及的中性蛋白酶是指在中性pH環(huán)境下(如，pH為6.0~7. 5、優(yōu)選 7. 0)作用于多肽鏈內(nèi)部的肽鍵從而發(fā)揮內(nèi)肽酶活性的一類蛋白酶，包括霉菌中性蛋白酶和 細(xì)菌中性蛋白酶，優(yōu)選Alphalase(丹尼斯克)、NeutraseO. 8L(諾維信)。
[0043] 本發(fā)明中所提及的風(fēng)味蛋白酶是指作用于多肽鏈氨基端或羧基端的肽鍵從而催 化底物形成特定食品風(fēng)味的一類復(fù)合蛋白酶，例如分離自果蔬中的風(fēng)味蛋白酶、米曲霉發(fā) 酵所得風(fēng)味蛋白酶，優(yōu)選Foodpro51FP(丹尼斯克)、Flavourzyme(諾維信)。
[0044] 其中，所述步驟（1)中的水為自來水、去離子水、雙蒸水和/或超純水等，優(yōu)選去離 子水。
[0045] 所述步驟（2)和步驟（3)中的堿性調(diào)節(jié)劑優(yōu)選為NaOH溶液，酸性調(diào)節(jié)劑優(yōu)選為磷 酸溶液或鹽酸溶液。
[0046] 所述步驟（2)中的酶解在水浴鍋、恒溫箱、烘箱或恒溫加熱器等能夠提供恒定溫度 (如30_60°C)的裝置