一種在玉米-豆粕型日糧中添加魚溶漿的發(fā)酵物及其發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于畜牧飼料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在玉米-豆柏型日糧中添加魚溶漿 的發(fā)酵物及其發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國畜禽是以玉米-豆柏型飼料為主，其中玉米是畜禽主要的能量來源，豆柏是 畜禽日糧中蛋白質(zhì)的主要來源。
[0003] 玉米在所有谷物中能值最高，是動(dòng)物主要的能量來源，淀粉的消化率很高，但是纖 維素和非淀粉多糖是影響玉米消化率的主要因素。
[0004] 豆柏是飼料生產(chǎn)中應(yīng)用最多的植物蛋白質(zhì)原料。由于大豆品種和加工條件的不 同，其養(yǎng)分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量有較大差異。豆柏中抗?fàn)I養(yǎng)因子主要有蛋白酶抑制劑、植物 凝集素、單寧、大豆抗原蛋白和不良寡糖等因素，其中大豆抗原蛋白和寡糖有良好的熱穩(wěn)定 性，它們會(huì)引起腹瀉、脹氣等不良癥狀，是豆柏在飼料應(yīng)用中的主要影響因素。
[0005] 魚粉具有必需氨基酸和脂肪酸高，碳水化合物含量低，適口性好，抗?fàn)I養(yǎng)因子少以 及能夠被畜禽動(dòng)物有很好的吸收等特點(diǎn)。但是現(xiàn)在水體的富營養(yǎng)化和集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的 發(fā)展，魚用人工配合飼料的應(yīng)用也日漸廣泛，魚粉的需求量巨大；另外海洋環(huán)境的不斷惡化 和人類的無序捕撈，致使魚粉的產(chǎn)量急劇下降。魚溶漿蛋白是有新鮮魚類在制作魚粉的過 程中壓榨出的魚溶漿的液體，經(jīng)濃縮、酶解后干燥而成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種在玉米-豆柏型日糧中添加魚溶漿的發(fā)酵物及其發(fā)酵方法，在 現(xiàn)今主要的畜禽日糧玉米一豆柏型日糧中加入魚溶漿后進(jìn)行發(fā)酵，利用該方法發(fā)酵玉米一 ?柏型日糧，具有魚腫氣味，能調(diào)尚伺料的適口性，富含大量益生菌及其代謝廣物，抑制有 害菌生長，增加動(dòng)物的免疫力，高小肽含量，能有效提高飼料的利用率。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了在玉米-豆柏型基礎(chǔ)日糧中添加魚溶漿的發(fā)酵方法，它包括以下步驟： (1) 在玉米-豆柏型基礎(chǔ)日糧中添加以下組分：布拉酵母含量不低于2 X IO9個(gè)/g ;解 淀粉芽孢桿菌HFJ-7含量不低于4 X IO9個(gè)/g ;植物乳桿菌含量不低于5 X 10 9個(gè)/g ; α -淀 粉酶不低于20U/g ;纖維素酶酶不低于10U/g ;NSP復(fù)合酶不低于10U/g ;蛋白酶添加量不低 于100U/g ;按照占所述基礎(chǔ)日糧總質(zhì)量的質(zhì)量比為20%-50%添加魚溶漿； (2) 加水調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1:0. 7-1:1，控制溫度在30°C -50°C密封發(fā)酵； (3) 發(fā)酵完成采用低溫60°C烘干。
[0008] 所述解淀粉芽孢桿菌HFJ-7為解淀粉芽孢桿菌其 保藏編號(hào)為CGMCC No. 10011。
[0009] 含有所述解淀粉芽孢桿菌HFJ-7的解淀粉芽孢桿菌HFJ-7菌粉的制備過程如下： (1) 將解淀粉芽孢桿菌HFJ-7接種到裝有種子培養(yǎng)基的滅菌種子罐中，37°C培養(yǎng)10h， 形成種子培養(yǎng)液，所述種子培養(yǎng)基組分包括：糖蜜，24. 5~25. 0 g/L ;蛋白胨，13. 5~13. 7 g/ L;磷酸二氫鉀，1·7~1·8 g/L;朽1檬酸鈉，L5~L6 g/L;硝酸按，L5~L6 g/L;硫酸鎂， 0· 5~0· 52 g/L ;調(diào)節(jié)起始 pH 至 7. 2 ; (2) 將所述種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)24h， 當(dāng)孢子率超過95%時(shí)，停罐，獲得發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成包括：豆柏粉，25. 0~25. 5 g/ L ;玉米漿干粉，18. 5~19· 4 g/L ;氯化鈉，4· 0~4· 2 g/L ;磷酸二氫鈉，2· 8~2· 9 g/L ;磷酸氫 二鉀，I. 2~L 3 g/L ;氯化鎂，0· 55~0· 58 g/L ;硫酸錳，0· 15~0· 16 g/L ;中性蛋白酶，2· 0~2· 1 g/L;糖化酶，1.5~1. 6 g/L;消泡劑，1.3~1. 4 g/L;調(diào)節(jié)起始pH至7. 4,所述解淀粉芽孢桿 菌 HFJ-7 發(fā)酵液的菌量達(dá)到 450X IO8 CFU/g~500X IO8 CFU/g ; (3) 將所述發(fā)酵液添加載體后進(jìn)行噴霧干燥，獲得含菌量2000X 108 ~2200X 108 CFU/ g的解淀粉芽孢桿菌HFJ-7菌粉，所述載體為輕質(zhì)碳酸鈣，添加載體的量占發(fā)酵液的質(zhì)量比 例為：10%-15%。
[0010] 對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述玉米-豆柏型基礎(chǔ)日糧中玉米和豆柏的質(zhì)量 比為 4:1-3:2。
[0011] 對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（1)中添加的蛋白酶是按酶添加量堿性 蛋白酶：中性蛋白酶：酸性蛋白酶=2:5:3的三種組分的混合物。
[0012] 對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（2)中密封發(fā)酵48h，密封發(fā)酵中好氧發(fā) 酵12h，厭氧發(fā)酵36h。
[0013] 對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（3)中噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度為 145°C _150°C，出風(fēng)溫度為 65°C -70°C。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述的發(fā)酵方法制得的發(fā)酵物。所述發(fā)酵物的PH3-5,乳酸含量 10-20%，小肽含量 20-30%，活菌數(shù)高達(dá) 9 X 101Qcfu/g~3· 8 X 1012cfu/g。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下創(chuàng)新和有效功效； 1、 本發(fā)明中的發(fā)酵方法于60°c下低溫烘干，可以保留大量有益活菌，同時(shí)抑制有害菌 生長，增加動(dòng)物腸道的健康，提高動(dòng)物免疫力； 2、 發(fā)酵過程中難消化的蛋白可被降解為易吸收的小肽，含量高達(dá)20%，易于動(dòng)物吸收， 可以顯著提高飼料利用率。
[0016] 3、本發(fā)明制得的發(fā)酵物中乳酸含量豐富，含量高達(dá)10%-15%，提高了動(dòng)物對(duì)飼料的 采食量。
[0017] 4、本發(fā)明添加低成本的魚溶漿進(jìn)行發(fā)酵，能有效改善飼料的氣味，提高動(dòng)物的采 食量，同時(shí)還能減少飼料中魚粉的用量。
【附圖說明】
[0018] 圖1是解淀粉芽孢桿菌HFJ-7菌粉的生產(chǎn)工藝流程圖； 圖2是發(fā)酵和未發(fā)酵玉米一豆柏型日糧的大分子蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖3是發(fā)酵和未發(fā)酵玉米一豆柏型日糧的不良寡糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖4是發(fā)酵和未發(fā)酵玉米一豆柏型日糧的大腸桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明結(jié)合以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0020] 實(shí)施例1 一、HFJ-7的分離篩選 2012年1月至2012年3月，從山東省濰坊市壽光市上口鎮(zhèn)10家辣椒蔬菜大棚取30 個(gè)辣椒根際土樣本。土樣分別充分研磨，于75°C水浴內(nèi)加熱處理20min，然后用無菌生理鹽 水中1000倍稀釋，于營養(yǎng)瓊脂NA平板上稀釋涂布，挑取單菌落劃線純化，共篩選出68株純 菌，經(jīng)鏡檢均為芽孢桿菌，其中包括菌株HFJ-7。
[0021] 采用平板對(duì)峙的方法，以立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、根腐病病原菌、黃瓜枯萎病病 原菌、辣椒疫霉等土傳病害病原真菌為靶標(biāo)病原真菌，考察68株芽孢桿菌之間病原真菌拮 抗特性的差異。先用打孔器獲得6mm直徑的病原菌菌塊，接于PDA平板中央，在平皿四周， 垂直據(jù)中心約3cm出，接種靶標(biāo)菌菌線，長度約為lcm?？紤]到不同病原真菌生長速度不同， 立枯絲核菌預(yù)培養(yǎng)8h、尖孢鐮刀菌、根腐病病原菌、黃瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌預(yù) 培養(yǎng)24h，然后每平皿接種4株待試菌株，28 °C培養(yǎng)4d后，考察解淀粉芽孢桿菌HFJ-7與其 他芽孢桿菌相比，對(duì)多種土傳病害病原真菌的詰抗特性。記錄抑菌帶寬度，即兩種菌平行生 長之間的無菌區(qū)域?qū)挾取８鶕?jù)拮抗帶的寬窄，選取對(duì)病原真菌有較強(qiáng)拮抗能力的菌株。
[0022] 篩選結(jié)果顯示，15株菌對(duì)立枯絲核菌有較強(qiáng)拮抗作用，13株菌對(duì)尖孢鐮刀菌有較 強(qiáng)拮抗作用，10株菌對(duì)根腐菌有較強(qiáng)拮抗作用，9株菌對(duì)黃瓜枯萎病病原菌有較強(qiáng)拮抗作 用，7株菌對(duì)辣椒疫霉病原菌有較強(qiáng)拮抗作用。僅有4株菌同時(shí)對(duì)5種病原真菌靶標(biāo)菌均具 有拮抗作用，分別為：解淀粉芽孢桿菌HFJ-7、枯草芽孢桿菌G4和G11、地衣芽孢桿菌D2。其 中，解淀粉芽孢桿菌HFJ-7與枯草、地衣、側(cè)孢等芽孢桿菌相比，可對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀 菌、根腐病病原菌、黃瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多種土傳病害病原真菌，產(chǎn)生明 顯的抑菌帶，均大于等于5_，其中對(duì)黃瓜枯萎病病原菌的抗性最強(qiáng)，抑菌帶寬度高達(dá)8_。
[0023] 經(jīng)細(xì)菌生理生化方法初步鑒定，菌株HFJ-7為芽孢桿菌屬，其生物學(xué)特性：革蘭氏 染色陽性，在營養(yǎng)瓊脂平板上形成的菌落直徑約3-3. 5_，邊緣不整齊，中間褶皺，淡黃色。 菌體形態(tài)呈桿狀，芽孢橢圓形，端生，〇. 84X0. 52 μ m。
[0024] 二、HFJ-7的分子遺傳學(xué)分類鑒定 首先提取菌株HFJ-7的DNA，以該DNA為模板，16S rRNA通用引物為引物，對(duì)16S rRNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果用Blast軟件與GenBank中相關(guān)屬種的 16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株16S rRNA序列與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬中 的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率達(dá)到99%。通過DNAMAN6. 0對(duì) Genbank中已有的芽孢桿菌屬的16S rRNA序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，菌株S3 16S rRNA與同源性最高，判定該菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽 孢桿菌。
[0025] 將篩選到的解淀粉芽孢桿菌HFJ-7進(jìn)行菌種保藏，保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC);地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國科學(xué)院微生物研宄所；保藏日期：2014年11月19日；解淀粉芽孢桿菌 的保藏編號(hào)為 CGMCC No. IOOll0
[0026] 三、解淀粉芽孢桿菌菌粉的制備 本發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌菌粉是由自主分離篩選的菌株，解淀粉芽孢桿菌HFJ-7發(fā) 酵后噴霧而成，其制備過程如圖1所示，具體步驟如下： (1)種子罐培養(yǎng) 所述的解淀粉芽孢桿菌HFJ-7菌株，以NA培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)24h，保證孢 子率>99%的，作為一級(jí)種子。將一級(jí)種子，接種到裝有種子培養(yǎng)基的滅菌種子罐中，37°C培 養(yǎng)10h，形成大量營養(yǎng)體，作為二級(jí)種子培養(yǎng)液；活化為100%孢子率的種子后，接種到裝有 種子培養(yǎng)基的滅菌種子罐中，37°C培養(yǎng)10h，形成大量營養(yǎng)體，作為種子培養(yǎng)液。種子培養(yǎng) 基組成（g/L):糖蜜，24. 5 ;蛋白胨，13. 5 ;磷酸二氫鉀，1. 7 ;檸檬酸鈉，1. 5 ;硝酸銨，1. 5 ;硫 酸鎂，〇. 5 ;用50%氫氧化鈉流加，調(diào)節(jié)起始pH至7. 2 ;種子罐體積為500L，培養(yǎng)基定容至 300L，實(shí)消條件：恒溫121°C保持30min ;培養(yǎng)條件：恒溫37°C±1°C，罐壓0. 05Mpa，轉(zhuǎn)速0-6h 130rpm、6_10h 160rpm ;通風(fēng)量 0_6h 5. I m3/h、6-10h 8. 8 m3/h。
[0027] (2)發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子罐中種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的30噸生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37°C培 養(yǎng)24h，當(dāng)孢子率超過95%時(shí)，停罐，獲得發(fā)酵液。