動物飼料酶的制作方法【專利說明】動物飼料酶[0001]對序列表的引用[0002]本申請包含一個計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。[0003]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域[0004]本發(fā)明涉及控制動物以及動物飼料中微生物的生長的方法。具體地而言，本發(fā)明涉及用抗微生物組合物控制動物中微生物的生長、用抗微生物添加劑和抗微生物組合物對動物飼料進(jìn)行處理的方法。[0005]發(fā)明背景[0006]在現(xiàn)代動物養(yǎng)殖業(yè)中，已經(jīng)探索了各種方法，以提高動物的健康和生長性能。這些包括較好的飼養(yǎng)管理、較好的營養(yǎng)和飼料添加劑的使用。所使用的最普遍的飼料添加劑是抗生素、益生菌、酶和有機(jī)酸（博納都（Bernardeau)，M.，J.P.弗農(nóng)（Vernoux)和M.蓋岡（Gueguen)，（2002)，"益生乳酸桿菌在促進(jìn)斷奶后的瑞士小鼠生長上的安全性和療效（Safetyandefficacyofprobioticlactobacilliinpromotinggrowthinpost-weaningSwissmice)"，國際食品微生物學(xué)雜志（IntJ.FoodMicrobiol.)77:19-27)〇[0007]然而，飼料中抗生素的廣泛應(yīng)用可能導(dǎo)致動物對用于治療動物和人類的細(xì)菌感染的抗生素產(chǎn)生抗藥性（米克爾森（Mikkelsen)L.L.，延森（JenserOB.B.，（2000)，"發(fā)酵液體飼料對豬腸中微生物的活性和組合物的作用（Effectsoffermentedliquidfeedontheactivityandcompositionofthemicrobiodatainthegutofpigs)'，，豬新聞與信息(PigNewsInform.)21:59N-66N)。這導(dǎo)致歐洲委員會于2006年1月1日禁止?fàn)I銷和使用抗生素作為飼料中的生長促進(jìn)劑。在其他國家例如美國來自消費(fèi)者方面的壓力推動動物生產(chǎn)逐步結(jié)束使用抗生素作為生長促進(jìn)劑。從動物飼料中去除抗微生物生長促進(jìn)劑已經(jīng)激起了對鑒別具有微生物生長調(diào)節(jié)作用以便維持健康的動物腸道菌群的新的非治療性替代品的興趣（海格巴特（Huyghebart)，杜卡特（Ducatelle)和伊梅席爾（Immerseel)，（2011)，獸醫(yī)雜志（VeterinaryJ.)，187:182-188)〇[0008]動物產(chǎn)品中的病原性細(xì)菌的一個來源是被污染的動物飼料。通常將動物飼料進(jìn)行熱處理，以殺死有害的細(xì)菌和病原體。然而，不完全熱處理可導(dǎo)致10%-15%的沙門氏菌的殘留，和/或動物飼料的不正確貯存可進(jìn)一步導(dǎo)致飼料被細(xì)菌污染（參見F.T.瓊斯(Jones)，2011，家禽學(xué)（Poult.Sci.)83:384-391的一般性綜述）。當(dāng)動物吃被污染的飼料時(shí)，該動物可能被細(xì)菌感染，這最終可能會導(dǎo)致消費(fèi)者在超市買進(jìn)被污染的食品。已經(jīng)使用通?；煊屑兹┑挠袡C(jī)酸在壓丸過程之后控制飼料中的沙門氏菌的數(shù)量。然而，甲醛可能給出監(jiān)管問題并且有機(jī)酸單獨(dú)往往需要幾天以1%的包合率來破壞現(xiàn)有的細(xì)菌。這些高水平的酸可能是昂貴的，對制粉及進(jìn)料設(shè)備有腐蝕性并且對飼料適口性和動物對維生素的可獲得性具有不良作用。[0009]相關(guān)技術(shù)說明[0010]US4320116描述了抗細(xì)菌系統(tǒng)能夠激活動物胃腸道的用途，該抗細(xì)菌系統(tǒng)包括乳過氧化物酶、硫氰酸和水溶性過氧化物供體，例如堿性過碳酸鹽或堿性過氧化物。US5389369描述了鹵代過氧化物酶和抗微生物活性增強(qiáng)劑（例如a-氨基酸）用于在人類或動物受試者的治療和體外消毒應(yīng)用中殺滅或抑制孢子微生物的酵母的生長的用途。[0011]W000/21381描述了兩種抗微生物酶（例如溶菌酶和氧化酶）與增強(qiáng)劑（例如多不飽和脂肪酸）一起改善例如家禽、豬和母牛的生長和飼料轉(zhuǎn)化率（FCR)的用途。[0012]US5747078描述了一種用于長期保存食品例如乳酪的方法，包括從底物和乳過氧化物酶產(chǎn)生過氧化氫的氧化還原酶。US5310541描述了包含一種氧化還原酶和相應(yīng)的底物（例如葡萄糖氧化酶和葡萄糖）的一種動物咀嚼物，該動物咀嚼物在被咀嚼時(shí)產(chǎn)生幫助預(yù)防例如動物中的腔疾病和牙周疾病的一種抗微生物劑。[0013]US2002/0119136描述了一種殺滅或抑制例如所洗的衣物中的、硬面上的、人類皮膚上的或口腔護(hù)理中的微生物的方法，該方法包括將所述微生物與包含過氧化物酶、過氧化氫或過氧化氫的來源（例如葡萄糖氧化酶/葡萄糖）和增強(qiáng)劑（例如吩噻嗪衍生物或丁香酸衍生物）的組合物接觸。US4726948描述了一種能夠激活哺乳動物胃腸道（GItract)的抗細(xì)菌組合物，該抗細(xì)菌組合物包括乳鐵蛋白、乳過氧化物酶和激活系統(tǒng)例如葡萄糖/葡萄糖氧化酶。[0014]US2011/229598描述了一種用于喂養(yǎng)小牛的抗微生物乳制品，該抗微生物乳制品包括乳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和可氧化試劑。EP1068871描述了一種小?？刮⑸镲暳涎a(bǔ)充物或?qū)櫸镅栏?，其包括乳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、硫氰酸、乳鐵蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白和生長因子。EP2510944描述了一種母牛抗微生物飼料補(bǔ)充物，其包括乳過氧化物酶或氯過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碘化物、和葡萄糖抑或0_半乳糖苷酶。[0015]發(fā)明概述[0016]在一方面，本發(fā)明涉及一種控制動物中微生物的生長的方法，該方法包括用抗微生物組合物喂養(yǎng)該動物，該微生物組合物包括一種乳糖氧化酶和一種釩鹵代過氧化物酶。在第二方面，本發(fā)明涉及一種用于處理動物飼料的方法，該方法包括將該動物飼料與一種或多種乳糖氧化酶和一種或多種釩鹵代過氧化物酶混合。在第三方面，本發(fā)明涉及一種組合物用以控制動物中微生物的生長的用途，該組合物包括乳糖氧化酶和釩鹵代過氧化物酶。在第四方面，本發(fā)明涉及一種用以控制動物中微生物的生長的抗微生物組合物，該抗微生物組合物包括一種或多種乳糖氧化酶和一種或多種釩鹵代過氧化物酶，連同一種或多種維生素和/或一種或多種礦物質(zhì)。在第五方面中，本發(fā)明涉及一種用于制備動物飼料組合物的方法。[0017]序列表綜述[0018]SEQIDN0:1是來自雪霉微座孢（Microdochiumnivale)CBS100236的乳糖氧化酶的氨基酸序列。[0019]3￡010繼:2是來自統(tǒng)枝彎抱（(^11^111&1^&￥61'1'11(3111〇8&)〇33147.63的|凡鹵代過氧化物酶的氨基酸序列。[0020]SEQIDN0:3是來自不等彎抱（Curvulariainequalis)CBS102.42的f凡鹵代過氧化物酶的氨基酸序列。[0021]SEQIDNO:4是來自哈茨木霉（Trichodermaharzianum)CBS223.93的氨基酸氧化酶的氨基酸序列。[0022]SEQIDN0:5是來自Dreschlerahartlebii的f凡鹵代過氧化物酶的氨基酸序列。[0023]5￡(>)101'10:6是來自鹽沼小樹狀霉（〇611(^5^1116113831;[仙）的|凡鹵代過氧化物酶的氨基酸序列。[0024]SEQIDN0:7是來自Phaeotrichoconiscrotalariae的f凡鹵代過氧化物酶的氨基酸序列。[0025]SEQIDN0:8是來自Geniculosporiumsp?的f凡鹵代過氧化物酶的氨基酸序列。[0026]附圖簡要說明[0027]圖1顯示了在pH3或pH6下用乳糖氧化酶（C0X)、釩鹵代過氧化物酶（HAP)和/或氨基酸氧化酶（AA0)處理后大腸桿菌K12存活數(shù)。[0028]定義[0029]氨基酸氧化酶活性：術(shù)語'氨基酸氧化酶活性'在此定義為催化氨基酸、水和氧生反應(yīng)得到相應(yīng)的a-酮酸、過氧化物和銨離子的酶活性。出于本發(fā)明的目的，氨基酸氧化酶活性可以如下進(jìn)行確定。將沃辛頓過氧化物酶（WorthingtonPeroxidase)(0.01ml的10mg/ml水溶液）和pH7.6的包含0?1%L-亮氨酸和0?0065%〇-聯(lián)茴香胺的0?2M三乙醇胺緩沖液（2.9ml)移液至比色皿中。在分光光度計(jì)中在25°C下孵育4-5分鐘以達(dá)到溫度平衡并且記錄空白。添加0.05-0.2單位/毫升濃度的0.lml酶并且在436nm下持續(xù)4-5分鐘記錄吸光度上的增長。從斜率的最初線性部分計(jì)算AA436?；钚?單位/mg=(AA436x3.Ox稀釋）/(8.lx0?lx(mg/ml))。[0030]動物：術(shù)語"動物"包括所有動物。在一個實(shí)施例中，術(shù)語"動物"包括人類。動物的實(shí)例為非反芻動物和反芻動物。反芻動物包括例如綿羊、山羊、和牛（例如母牛，例如肉牛和奶牛）等動物。在具體實(shí)施例中，動物為非反芻動物。非反芻動物包括寵物動物，例如馬、貓和狗；單胃動物，例如豬（pig或swine)(包括但是不限于仔豬、生長豬（growingpig)、和母豬）；家禽，例如火雞、鴨和雞（包括但是不限于肉雞、蛋雞）；魚（包括但是不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚）；和甲殼動物（包括但是不限于蝦和對蝦），小牛（不具有功能性瘤胃或具有發(fā)育中的瘤胃的年幼反芻動物）。優(yōu)選的動物是單胃動物，優(yōu)選地是家禽和豬（如在此所定義的）。[0031]抗微生物組合物：術(shù)語"抗微生物組合物"意指具有抗微生物活性的多肽或化學(xué)品組合物。[0032]抗微生物活性或抗微生物作用：術(shù)語"抗微生物活性"或"抗微生物作用"意指殺滅和/或抑制微生物細(xì)胞的生長的能力。微生物細(xì)胞的實(shí)例是微生物的細(xì)胞。抗微生物活性可以是，例如，殺細(xì)菌的和/或抑制細(xì)菌的和/或殺真菌的和/或抑制真菌的和/或殺病毒的。[0033]殺細(xì)菌的：術(shù)語"殺細(xì)菌的"是指能夠殺滅細(xì)菌細(xì)胞的試劑。殺細(xì)菌活性被測量為活細(xì)胞或集落形成單位/ml(CFU/mL)的數(shù)量的對數(shù)減少（log減少），例如，llog減少對應(yīng)大腸桿菌K12或奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)DSM2570的活細(xì)胞數(shù)量從Yx10xCFU/M(CFU:集落形成單位；M:ml或g)至Yx10xtFU/M的減少，其中X可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，并且Y可以是從0至10的任何數(shù)?；罴?xì)胞的數(shù)量被分別確定為可以在胰胨大豆瓊脂（#CM129,0xoid，英格蘭）板上在30°C下生長的大腸桿菌或糞腸球菌的數(shù)量。[0034]抑制細(xì)菌的：術(shù)語"抑制細(xì)菌的"意指能夠抑制細(xì)菌生長，即，抑制細(xì)菌細(xì)胞的生長。[0035]碳水化合物氧化酶活性：術(shù)語"碳水化合物氧化酶活性"在此被定義為催化各種單糖或低聚糖中的伯醇的氧化連同分子氧向過氧化氫的還原的酶活性。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)布萊克（Blake)等人，（1989)分析生物化學(xué)（AnalyticalBiochemistry)177:156-160所描述的程序測定碳水化合物氧化酶活性。一個單位的碳水化合物氧化酶活性等于，在pH6.0、25攝氏度下，每分鐘能夠釋放1微摩爾的過氧化氫的酶的量。還可以使用此方法來確定乳糖氧化酶活性，但是其中乳糖被用作底物。[0036]控制微生物的生長：術(shù)語"控制微生物的生長"意指該微生物被殺滅或被抑制，這樣使得該微生物處于非生長狀態(tài)，即，它們不能繁殖?？刂莆⑸锏纳L進(jìn)一步意指在動物的腸道微生物群落組成上存在向?qū)υ搫游镉幸妗游镄阅苡幸?、對飼料利用有益（例如FCR)和/或限制該動物消化系統(tǒng)中病原體的生長的微生物群落組成的變化。[0037]殺真菌的：術(shù)語"殺真菌的"意指能夠殺滅真菌細(xì)胞。[0038]抑制真菌的：術(shù)語"抑制真菌的"意指能夠抑制真菌生長，即，抑制真菌細(xì)胞的生長。[0039]胃內(nèi)穩(wěn)定的：術(shù)語"胃內(nèi)穩(wěn)定的（gastricstable)"意指該一種或多種酶在動物胃腸道中所發(fā)現(xiàn)的條件或如在此所定義的代表性體外條件下是穩(wěn)定的，這樣使得該一種或多種酶在此類處理后可以減少至少10倍CFU計(jì)數(shù)，例如至少100倍、至少500倍或至少1000倍。出于本發(fā)明的目的，如在實(shí)例2中所描述的，使用模擬胃液確定胃內(nèi)穩(wěn)定性?？傊?，將該一種或多種酶用〇.001MHCl、35nMNaCl和1.1單位胃蛋白酶/mL在40°C下孵育15分鐘，并且然后測試抗微生物活性。相比于對照試樣（其中該一種或多種酶沒有經(jīng)歷用模擬胃液進(jìn)行的孵育），如果該一種或多種酶在此類處理后減少至少10倍CFU計(jì)數(shù)，那么該一種或多種酶被分類為胃內(nèi)穩(wěn)定的。[0040]腸：術(shù)語"腸"意指動物的胃腸道或消化道（還稱為消化管（alimentarycanal))，并且是指器官系統(tǒng)，該器官系統(tǒng)在多細(xì)胞動當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5 6