氨酸及甲硫氨酸）。一般不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取代是本領(lǐng) 域已知的并且例如由H.諾伊拉特（H.Neurath)和R. L.希爾（R. L.Hill)，1979,在蛋白質(zhì) (The Proteins)，學(xué)術(shù)出版社，紐約中描述。常見取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/ Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 以及 Asp/Gly。
[0153] 必需氨基酸和多肽中的活性位點(diǎn)可以如之前所描述的進(jìn)行確認(rèn)?？梢宰龀鰡蝹€(gè)或 多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用如以上所描述的已知的方法進(jìn)行。當(dāng)如在此所 定義的進(jìn)行計(jì)算，SEQ ID N0:2、3、5、6、7和8的序列一致性顯示出了該序列非常保守這樣 使得所有序列至少75%是彼此相同的。
[0154] 釩鹵代過氧化物酶的濃度典型地是在0. 0l-10000ppm酶蛋白的范圍，優(yōu)選地 是0? l-2500ppm，更優(yōu)選地是0? 5-1000ppm，甚至更優(yōu)選地是l-400ppm，并且最優(yōu)選地是 2-200ppmm酶蛋白，其對(duì)應(yīng)2-200mg/kg飼料。
[0155] 過氧化氫來源
[0156] 該釩鹵代過氧化物酶所需的過氧化氫可被提供為過氧化氫的一種水性溶液或用 于原位生產(chǎn)過氧化氫的一種過氧化氫前體。任何在溶解時(shí)釋放釩鹵代過氧化物酶可用的過 氧化物的固體實(shí)體都可充當(dāng)過氧化氫的一個(gè)來源。在水或一種合適的基于水的介質(zhì)中溶解 時(shí)產(chǎn)生過氧化氫的化合物包括但不限于金屬過氧化物、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過 氧酸、烷基過氧化物、?；^氧化物、過氧酯、過氧化脲、過硼酸鹽和過氧羧酸或其鹽。
[0157] 過氧化氫的另一個(gè)來源是一種過氧化氫生成酶系統(tǒng)，例如一種乳糖氧化酶與該氧 化酶的一種底物一起。與乳糖氧化酶一起作用的底物的實(shí)例是維二糖、乳糖、麥芽糖、棉子 糖、葡萄糖、乳果糖和/或木糖，優(yōu)選地是纖維二糖、乳糖、麥芽糖、和/或棉子糖。
[0158] 因?yàn)檫@種來源在生物相關(guān)的條件下導(dǎo)致相對(duì)低濃度的過氧化氫，使用酶學(xué)上產(chǎn)生 的過氧化氫可能是有利的。低濃度的過氧化氫導(dǎo)致鹵代過氧化物酶催化反應(yīng)的速率上的增 長(zhǎng)。
[0159] 鹵化物來源
[0160] 一般來說，與釩鹵代過氧化物酶反應(yīng)所需的鹵化物在飼料組合物中可獲得足夠的 量（例如，作為該預(yù)混料中的一種化合物的氯鹽）。然而，必要的話，可以將鹵素離子的來 源添加至該組合物中，例如通過添加鹵鹽。該一種或多種鹵鹽可以是一種或多種氯鹽例 如氯化鈉（NaCl)、氯化鉀（KC1)、或氯化銨（NH 4C1)，一種或多種溴鹽例如溴化鈉（NaBr)、 溴化鉀（KBr)、或溴化銨（NH4Br)，一種或多種碘鹽例如碘化鈉（Nal)、碘化鉀（KI)、或碘 化銨（NH 4I)，一種或多種硫氰酸鹽例如硫氰酸鈉（NaSCN)、硫氰酸鉀（KSCN)、或硫氰酸銨 (NH4SCN)，或其任何組合物。
[0161] 該氯根離子、溴根離子、碘根離子、和/或硫氰酸根離子的濃度共同或個(gè)別在 0.l-10000ppm氯化物、溴化物、碘化物、和/或硫氰酸/kg飼料的范圍內(nèi)，優(yōu)選地是在 從l-5000ppm氯化物、溴化物、碘化物、和/或硫氰酸/kg飼料的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地是在 10-2000ppm氯化物、溴化物、碘化物、和/或硫氰酸/kg飼料的范圍內(nèi)。
[0162] 通過以下實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。 [0163] 實(shí)例
[0164] 實(shí)例1 :包括乳糖氧化酶和釩鹵代過氧化物酶的組合物的抗微生物活性
[0165] 以15mg酶蛋白/mL的濃度所使用的乳糖氧化酶（C0X)是從雪霉微座孢 (Microdochium nivale)CBS 100236 中分離出來的，并且詳細(xì)描述于 TO 99/31990(TO 99/31990的SEQ ID N0:2 ;還如本申請(qǐng)的SEQ ID N0:1所示）中。
[0166] 以33mg酶蛋白/mL的濃度所使用的f凡鹵代過氧化物酶（HAP)是從疏枝彎孢 (Curvularia verruculosa)CBS 147.63 中分離出來的，如在 TO 97/04102 中所描述的（參 見TO 97/04102的SEQ ID N0:2 ;還如本申請(qǐng)的SEQ ID N0:2所示）。
[0167] 該氨基酸氧化酶（AA0)是一種L-賴氨酸氧化酶并且是從哈茨木霉（Trichoderma harzianum) CBS 223. 93中分離出來的，如在US 6, 248, 575中所描述的（還如本申請(qǐng)的SEQ ID N0:4 所示）。
[0168] 研究抗大腸桿菌（Escherichia coli)的乳糖氧化酶（COX)、f凡鹵代過氧化物酶 (HAP)和氨基酸氧化酶（AA0)的抗菌活性。將大腸桿菌K12接種在10mL盧里亞肉湯（luria broth) (LB)中并且在37°C下過夜。將Tris緩沖液在MQ水中稀釋至10X。使用1M鹽酸將 稀釋過后的Tris緩沖液調(diào)節(jié)至pH 6. 3。稱重雞飼料（大豆粉和玉蜀黍粉的30:70重量比 共混物，2g)并且將其轉(zhuǎn)移至含有10mL在pH 3下的0. 1M乙酸鹽緩沖液或10mL在pH 6. 3 下的0. 1M Tris緩沖液的兩個(gè)50mL管的每個(gè)中。將100 y L來自過夜培養(yǎng)物的大腸桿菌轉(zhuǎn) 移至兩個(gè)飼料懸浮液中的每個(gè)。制作5x lmL的每個(gè)飼料懸浮液的等分試樣。分別相比于 兩個(gè)沒有酶的在pH 3和6下的對(duì)照，將酶、乳糖氧化酶、釩鹵代過氧化物酶和氨基酸氧化酶 添加至如表2中所示的等分試樣中。在40°C、300rpm下對(duì)飼料進(jìn)行一小時(shí)的酶處理。在處 理后，在滅菌的0. 9%氯化鈉溶液（100 y L至900 y L的在水中的氯化鈉）中進(jìn)行10 4的稀 釋范圍。將稀釋物點(diǎn)（dot-spotted)在LB瓊脂板（10 yL/斑點(diǎn)）上并且在37°C下孵育過 夜。以低于30個(gè)集落的斑點(diǎn)對(duì)集落形成單位（CFU)進(jìn)行計(jì)數(shù)。將結(jié)果在圖1和表3中給 出。
[0169] 表2 :所使用的乳糖氧化酶、釩鹵代過氧化物酶和氨基酸氧化酶的量
[0170]
[0172] 表3 :當(dāng)用乳糖氣化酶、釩鹵代討氣化物酶和/或氨基酸氣化酶處理時(shí)，在被污染 的飼料中存活的大腸桿菌K12
[0173]
[0174] 如在表3和圖1中可以看到的，用乳糖氧化酶和釩鹵代過氧化物酶處理被大腸桿 菌K12污染的飼料能夠在pH 3和pH 6二者下有效殺死被污染飼料肉湯中超過99. 99%的 大腸桿菌K12。然而，無論是乳糖氧化酶、釩鹵代過氧化物酶或是氨基酸氧化酶和釩鹵代過 氧化物酶都不能夠?qū)⒋竽c桿菌K12細(xì)胞的CFU減少超過一對(duì)數(shù)單位。
[0175] 實(shí)例2 :在模擬胃液中孵育后，包括乳糖氧化酶和釩鹵代過氧化物酶的組合物的 剩余抗微生物活性
[0176] 以15mg酶蛋白/mL的濃度所使用的乳糖氧化酶（C0X)是從雪霉微座孢 (Microdochium nivale)CBS 100236 中分離出來的，并且詳細(xì)描述于 TO 99/31990(TO 99/31990的SEQ ID N0:2 ;還如本申請(qǐng)的SEQ ID N0:1所示）中。
[0177] 以33mg酶蛋白/mL的濃度所使用的釩鹵代過氧化物酶（HAP)是從疣枝彎孢 (Curvularia verruculosa)CBS 147.63 中分離出來的，如在 TO 97/04102 中所描述的（參 見TO 97/04102的SEQ ID N0:2 ;還如本申請(qǐng)的SEQ ID N0:2所示）。
[0178] 研究在飼料漿的背景中，在模擬胃內(nèi)條件下孵育后，抗大腸桿菌（Escherichia coli)的乳糖氧化酶（COX)和釩鹵代過氧化物酶（HAP)的剩余抗微生物活性。將大腸桿菌 K12接種在10mL盧里亞肉湯（luria broth) (LB)中并且在37°C下過夜。
[0179] 模擬胃液組合物由0. 001M HCl、35nM NaCl和1. 1單位胃蛋白酶/mL組成。如表 4中所示，將不同體積的乳糖氧化酶和釩鹵代過氧化物酶添加至9mL預(yù)熱至40°C的模擬胃 液。通過在t = Omin時(shí)并且在添加酶之前添加lmL pH 6. 5檸檬酸-似2即04緩沖液將pH 提高至PH6. 5來停止無胃內(nèi)挑戰(zhàn)的對(duì)照孵育。通過在t = 15min時(shí)添加lmL pH 6. 5檸檬 酸-Na2HP0#l沖液來停止胃內(nèi)挑戰(zhàn)樣品。
[0180] 稱重雞飼料（大豆粉和玉蜀黍粉的30:70重量比共混物，2g)并且與來自過夜的 100 yL大腸桿菌一起轉(zhuǎn)移至每個(gè)孵育物中。在40 °C、300rpm下，用經(jīng)胃內(nèi)挑戰(zhàn)的酶、大腸桿 菌和飼料進(jìn)行孵育一小時(shí)。在處理后，在滅菌的0. 9%氯化鈉溶液（100 y L至900 y L的在 水中的氯化鈉）中進(jìn)行10 4的稀釋范圍。將稀釋物點(diǎn)（dot-spotted)在LB瓊脂板（10 yL/ 斑點(diǎn)）上并且在37°C下孵育過夜。以低于30個(gè)集落的斑點(diǎn)對(duì)集落形成單位（CFU)進(jìn)行計(jì) 數(shù)。結(jié)果在表5中給出。
[0181] 表4 :所伸用的乳糖氣化酶和釩鹵代討氣化物酶的量
[0182]
[0183] 表5 :與用經(jīng)胄內(nèi)祧戰(zhàn)的乳糖氣化酶和釩鹵代討氣化物酶處理時(shí),在被污染的飼 料中存活的大腸桿菌
[0184]
[0186] 如在表5中可以看到的，當(dāng)將被大腸桿菌K12所污染的飼料用乳糖氧化酶和釩鹵 代過氧化物酶處理時(shí)，在所污染的飼料肉湯中大腸桿菌K12的數(shù)量減少超過使用與1或 10 y L釩鹵代過氧化物酶相結(jié)合的100 y L乳糖氧化酶的情況的10000倍。此外，甚至在將 酶用模擬胃液處理后，該乳糖氧化酶和釩鹵代過氧化物酶仍然將被污染的飼料肉湯中大腸 桿菌K12細(xì)胞的數(shù)量減少超過使用100 y L與10 y L釩鹵代過氧化物酶相結(jié)合的乳糖氧化 酶的情況的10000倍，并且超過當(dāng)添加l〇〇yL與liiL釩鹵代過氧化物酶相結(jié)合的乳糖氧 化酶時(shí)的1000倍。這表明該釩鹵代過氧化物酶和乳糖氧化酶在模擬胃液挑戰(zhàn)下是穩(wěn)定的， 并且因此，可以預(yù)見這些酶將在通過動(dòng)物胃腸道過程中存活。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種控制動(dòng)物中微生物的生長(zhǎng)的方法，該方法包括用一種抗微生物組合物喂養(yǎng)該動(dòng) 物，該微生物組合物包括一種乳糖氧化酶和一種釩鹵代過氧化物酶。2. -種用于處理動(dòng)物飼料的方法，該方法包括將該動(dòng)物飼料與一種或多種乳糖氧化酶 和一種或多種釩鹵代過氧化物酶混合。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中該釩鹵代過氧化物酶和該乳糖氧化 酶是胃內(nèi)穩(wěn)定的。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中該乳糖氧化酶的濃度是在 0? 01-200ppm酶蛋白/Kg飼料的范圍內(nèi)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中該乳糖氧化酶的濃度是在 0? 01-200ppm酶蛋白/kg飼料的范圍內(nèi)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或5中任一項(xiàng)所述的方法，其中該抗微生物組合物是動(dòng)物飼料 的一個(gè)組分。7. 根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或5中任一項(xiàng)所述的方法，其中控制微生物的生長(zhǎng)發(fā)生在該動(dòng) 物的腸中。8. 根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或5中任一項(xiàng)所述的方法，其中該微生物是一種類型的細(xì)菌，例 如來自沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、彎曲桿菌屬、利斯特菌屬或梭菌屬。9. 一種組合物用以控制動(dòng)物中微生物的生長(zhǎng)的用途，該組合物包括一種乳糖氧化酶和 一種銀鹵代過氧化物酶。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中該釩鹵代過氧化物酶和該乳糖氧化酶是胃內(nèi)穩(wěn) 定的。11. 一種抗微生物組合物，該抗微生物組合物包括一種或多種乳糖氧化酶和一種或多 種隹凡鹵代過氧化物酶。12. 如權(quán)利要求11所述的組合物，其中該釩鹵代過氧化物酶和該乳糖氧化酶是胃內(nèi)穩(wěn) 定的。13. 如權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)中所述的組合物，其中該組合物進(jìn)一步包括一種或多 種選自下表的附加化合物，該表由以下各項(xiàng)組成：草料、濃縮物、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、酶 和其他飼料成分。14. 如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)中所述的組合物，其中該組合物控制動(dòng)物中微生物的 生長(zhǎng)。15. -種用于制備動(dòng)物飼料組合物的方法，該方法包括將一種乳糖氧化酶、一種釩鹵 素過氧化物酶、和一種或多種選自下表的動(dòng)物飼料成分進(jìn)行混合，該表由以下各項(xiàng)組成：草 料、濃縮物、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、和動(dòng)物飼料酶。
【專利摘要】本發(fā)明涉及控制動(dòng)物以及動(dòng)物飼料中微生物的生長(zhǎng)的方法。具體地，本發(fā)明涉及用抗微生物組合物控制動(dòng)物中微生物的生長(zhǎng)、用抗微生物添加劑和抗微生物組合物對(duì)動(dòng)物飼料進(jìn)行處理的方法。
【IPC分類】A61K38/44, A23K1/18, A61P1/12, A23K1/165
【公開號(hào)】CN105120681
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480021865
【發(fā)明人】M·克勞森, K·S·拉森
【申請(qǐng)人】諾維信公司
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2014年5月8日
【公告號(hào)】WO2014180953A1