一種復合型抗氧化肽及制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及功能性食品加工技術領域，具體涉及一種復合型抗氧化肽及其制備方法。
【背景技術】
[0002]玉米醇溶蛋白是玉米中的主要蛋白質，具有獨特的溶解特性、耐熱性、成膜性和抗氧化性，可用于防潮隔氧、抗紫外線、保鮮、防靜電等，還有一定的抑菌作用，其含有高比例的亮氨酸、丙氨酸和異亮氨酸等疏水性脂肪族氨基酸，在其多肽鏈中存在抗氧化、抗高血壓，促酒精代謝等的功能序列區(qū)，采用必要的改性方法，可以使其功能特性釋放出來，用于開發(fā)功能食品。
[0003]大豆蛋白是一種營養(yǎng)豐富的優(yōu)質植物蛋白，主要由伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)組成，經(jīng)過水解后可以得到一定功能性質的肽段，一方面具備易消化、抗疲勞、增強體力等特性，還具備一定的生理活性物質，在機體內有多種生理功能，使大豆肽在保健食品中的應用具有廣泛的前景。特別經(jīng)過生物酶改性，是一種新興、無毒副作用、安全可行的改性方式，具有重要的應用意義。
[0004]啤酒糟歷來被認為是有價值的飼料，它的蛋白質含量高達25%~30%。經(jīng)啤酒糟超聲堿提的麥芽蛋白具有較高的營養(yǎng)價值和較好的功能性質，但不很理想，其功能特性尚不能滿足現(xiàn)代食品加工的要求，尤其是溶解性較差的問題，限制了麥芽蛋白在食品工業(yè)上的應用，有必要對其進行改性和修飾，從而使麥芽蛋白的功能性質得以改善。
[0005]生物活性復合肽是多種原料綜合利用的新型研究成果，可有效的提高和拓展生物活性肽的生理功能，實現(xiàn)各種特性的優(yōu)勢互補，同時其抗氧化活性與加工特性均有了較強的改善，在保健品的開發(fā)上有著廣闊的前景。
[0006]目前生物活性肽的常用制備方法有化學合成法、酶解法和微生物發(fā)酵法?；瘜W法存在成本高，有殘留化合物等問題，僅用于生產(chǎn)高價的藥理級肽。酶解法由于其生產(chǎn)條件溫和、反應過程易于控制，已被廣泛應用到生物活性肽的工業(yè)生產(chǎn)上，然而大多數(shù)商品酶制劑價格昂貴，微生物發(fā)酵法制備的抗氧化肽苦味較低，芳香味較濃，然而微生物發(fā)酵法結合酶解法在抗氧化肽的制備方面還略有欠缺，仍多處于實驗室廣泛探究中。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了得到一種具備玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白以及麥芽蛋白多種功能特性的發(fā)酵型、速溶抗氧化肽產(chǎn)品，具備降壓、抗疲勞、醒酒、抗氧化以及優(yōu)質加工特性的功能性。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是解決單一品種抗氧化肽功能性不足的問題。
[0009]本發(fā)明是一種利用枯草芽孢桿菌種子菌懸液液態(tài)發(fā)酵玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麥芽蛋白混合蛋白制備復合抗氧化肽的方法，是通過以下步驟實現(xiàn)的:
一、一種復合型抗氧化肽發(fā)酵底物包括下述重量比的原料: 玉米醇溶蛋白 70~85%;
大豆水解蛋白 10~20% ;
麥芽蛋白5~10%;
二、其制備方法如下:
1、制備玉米醇溶蛋白:
取玉米蛋白粉，經(jīng)二氧化碳超臨界脫色工藝，反應溫度45~50°C，出口閥溫度90~100°C，反應壓力300~400bar，提取時間120min，流體流量6L/h進行脫色除雜處理。依微波-超聲聯(lián)合浸提，經(jīng)脫色的玉米蛋白粉按1:20的料液比(m/v)加入70%的乙醇溶液，以440W輸出功率的微波反應器提取三次，每次60s，4000r/min離心30min取上清液備用；將去上清液后的蛋白粉按1:10的料液比(m/v)加入70%的乙醇，用超聲波復提，萃取溫度45~50°C，超聲作用時間20~25min，合并兩次離心上清液，減壓濃縮，控制乙醇濃度不高于50%。將減壓濃縮液加入冷水稀釋，同時調pH6.0-6.2，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以純凈水反復沖洗，得沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱-60~-80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制備大?水解蛋白:
取低溫豆柏，加入豆柏20倍的純凈水，用2 mol/L NaOH調pH至80~8.1，攪拌2.5h后，在4°C條件下4000r/min離心30min，離心后將上清液以2 mol/L HC1調pH至4.2-4.5。在4°C條件下8000r/min離心20min。用純凈水洗滌沉淀三次，加入一定比例的純凈水用乳化機使沉淀形成分散體系，并用2 mol/LNaOH調pH至7.0~7.2。真空冷凍干燥備用。將得到的大豆分離蛋白用PH6.2的磷酸鹽緩沖溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低頻低溫超聲，超聲時間20min對大豆分離蛋白進行改性。改性后的大豆蛋白采用超靜壓兩步酶水解反應生成大豆水解蛋白，第一步:胃蛋白酶在超靜壓200MPa，pH2.0，溫度37°C，添加量5%，酶解15min ;第二步，迅速調節(jié)pH 8.5，溫度60 °C，添加6%堿性蛋白酶(2.0X104 U/g)，在恒定pH條件下反應12h，置于100°C水浴滅酶15min，冷卻室溫后4000r/min離心20min取上清液，調節(jié)pH至等電點，8000r/min離心30min取沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱_60~-80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制備麥芽蛋白:
取啤酒糟，按1:12的料液比(m/v)加入0.lmol/L的氫氧化鈉溶液，在50~60°C，功率為180~200W的超聲提取器中提取1~1.5h，4000r/min離心20min，取上清液，調節(jié)pH為4.0-4.5，再8000r/min冷凍離心分離，沉淀置超低溫冰箱-60~_80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得麥芽蛋白成品；
4、按照配方比例合并前三步得到的玉米醇溶蛋白，大豆水解蛋白以及麥芽蛋白，按1:20的料液比(m/v)加入純凈水，攪拌均勻成懸濁液的分散體系；
5、將上述均勻的分散體系調節(jié)pH至7.8~8.0，用高壓蒸氣滅菌鍋在121°C殺菌20min，取出冷卻至室溫，加入5% (mL / mL)酶活力為2000 U/mL的枯草芽孢桿菌種子菌懸液，混勻，于37 °C、150~180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，置沸水浴中加熱15 min，然后迅速冷卻至室溫，以4000 r/min離心20 min獲取上清液，調節(jié)等電點至4.5，沉降離心，以純凈水洗滌后，再離心，取沉淀物；
6、將上述沉淀物置超低溫-60~-80°C冰箱冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥，冷阱溫度_75~-80°C，真空度1.0Pa，冷凍干燥10h得復合型抗氧化肽成品。
[0010]本發(fā)明以枯草芽孢桿菌種子菌懸液為發(fā)酵菌，以玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麥芽蛋白混合分散體系為發(fā)酵底物，進行液態(tài)發(fā)酵，將枯草芽孢桿菌種子發(fā)酵法和酶水解底物結合起來，在發(fā)酵過程中可以分解、改性大量的功能性抗氧化蛋白肽。本發(fā)明具有簡化工藝流程，降低制備成本，使產(chǎn)物多樣性等優(yōu)點，制備的復合型抗氧化肽，功能突出，速溶性強及加工特性顯著等優(yōu)勢，適用于降壓、抗疲勞、醒酒、抗氧化等功能性蛋白肽產(chǎn)品的開發(fā)。該發(fā)明以發(fā)酵法改性醇溶蛋白使其研究階段進入高潮期，解決單一品種抗氧化肽功能性不足的問題。
【具體實施方式】
[0011]實施例1按照下列步驟制備本發(fā)明的復合型抗氧化肽:
1、制備玉米醇溶蛋白:取500g濕法生產(chǎn)玉米淀粉的主要副產(chǎn)物玉米蛋白粉，要求蛋白含量70%以上，經(jīng)二氧化碳超臨界脫色工藝，反應溫度45°C，出口閥溫度100°C，反應壓力400bar，提取時間120min，流體流量6L/h進行脫色除雜處理。依微波_超聲聯(lián)合浸提，經(jīng)脫色的玉米蛋白粉加入70%的乙醇lOOOOmL，以440W輸出功率的微波反應器提取三次，每次60s，4000r/min離心30min取上清液備用；將去上清液后的蛋白粉加入70%的乙醇5000mL,用超聲波復提，萃取溫度45°C，超聲處理20min，合并兩次離心上清液，減壓濃縮，控制乙醇濃度不高于50%。將減壓濃縮液加入冷水稀釋，同時調pH6.0，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以純凈水反復沖洗，得沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱_80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制備大豆水解蛋白:取低溫豆柏500g加入10000g的純凈水，用2mol/L NaOH調pH至8.1，攪拌2.5h后，在4°C條件下4000r/min離心30min，離心后將上清液以2 mol/L HC1調pH至4.5。在4°C條件下8000r/min離心20min。用純凈水洗滌沉淀三次，加入一定比例的純凈水用乳化機使沉淀形成分散體系，并用2 mol/LNaOH調pH至7.0。真空冷凍干燥備用。取得到的大豆分離蛋白100g用pH6.2的磷酸鹽緩沖溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低頻低溫超聲(20KHz，0°C水浴循環(huán)，400W)條件下超聲時間20min對大豆分離蛋白進行改性。改性后的大豆蛋白采用超靜壓兩步酶水解反應生成大豆水解蛋白，胃蛋白酶先在超靜壓200MPa，pH2.0，溫度37°C，酶添加量5g，酶解15min ;然后迅速調節(jié)pH 8.5，溫度60 °C，添加6g堿性蛋白酶(2.0X104 U/g)在恒定pH條件下反應12h，置于100°C水浴滅酶15min，冷卻室溫后4000r/min離心20min取上清液，調節(jié)pH至等電點，8000r/min離心30min取沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱_80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制備麥芽蛋白:啤酒廠生產(chǎn)啤酒的副產(chǎn)物啤酒糟500g，要求蛋白含量28%以上，加入6000 mL 0.lmol/L的氫氧化