專利名稱：一種生物非整倍體的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物非整倍體的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
生物學(xué)中的整倍體是指體細(xì)胞中的染色體數(shù)目是正常單倍體配子中染色體數(shù)N的整倍數(shù)。大多數(shù)的真核生物為二倍體，即一個(gè)正常體細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)為2N，如人類正常體細(xì)胞中有2*23條染色體。非整倍體為任何不是整倍體的染色體數(shù)目，可見(jiàn)于低等真核生物、哺乳動(dòng)物和人類。但人類明顯較其它生物更容易發(fā)生非整倍體，并且多為染色體的三體性。后者通常引起自發(fā)性流產(chǎn)、胎兒死亡和多種先天性畸形綜合征，是人類生殖生物學(xué)中的重要問(wèn)題。目前，人類還沒(méi)有有效的措施防止染色體的異常分離，消除非整倍體發(fā)生給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)的負(fù)擔(dān)，因此，提高生物非整倍體的檢測(cè)水平尤為重要。
對(duì)胎兒細(xì)胞進(jìn)行核型分析是已有的生物非整倍體檢測(cè)方法，這個(gè)過(guò)程包括胎兒細(xì)胞的體外培養(yǎng)和中期胎兒細(xì)胞的核型分析。細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要一定數(shù)量的存活細(xì)胞和相當(dāng)?shù)膶I(yè)技術(shù)知識(shí)，在下列幾種情況下都可能無(wú)法實(shí)施核型分析1、細(xì)胞培養(yǎng)失敗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，細(xì)胞培養(yǎng)失敗的發(fā)生率約為1-2％；2、收集的細(xì)胞數(shù)目有限，不能得出明確的結(jié)論。因此，為確保足夠的培養(yǎng)物用于核型分析，必須獲得大于5ml的羊水。當(dāng)一次羊水穿刺抽出的羊水量少于5ml時(shí)，就不得不進(jìn)行反復(fù)的羊水穿刺，從而增加了感染和損傷的風(fēng)險(xiǎn)。3、培養(yǎng)物被污染。有文獻(xiàn)報(bào)道，即使在經(jīng)驗(yàn)豐富的試驗(yàn)室，母體細(xì)胞的污染率也可達(dá)10-14％。4、由于細(xì)胞培養(yǎng)僅限于存活細(xì)胞，因此某些特殊的樣本無(wú)法進(jìn)行核型分析，如一些妊娠產(chǎn)物以及福爾馬林固定或石蠟包埋樣本。此外，傳統(tǒng)的生物非整倍體的檢測(cè)方法最為顯著的缺點(diǎn)是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程耗時(shí)太長(zhǎng)，大致需要兩周左右的時(shí)間，這就易于造成處理上的延誤。因此，迅速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)非常有價(jià)值。
近年來(lái)，熒光原位雜交(fluorecent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和定量熒光PCR(quantitative fluorecent polymerase chain reaction，QF-PCR)已經(jīng)應(yīng)用于生物非整倍體的檢測(cè)。就熒光原位雜交檢測(cè)生物非整倍體的方法而言，間期細(xì)胞的熒光原位雜交可不必進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，大大縮短了診斷所需的時(shí)間；商業(yè)化探針的應(yīng)用提高了FISH的敏感性和特異性。但另一方面，這頂診斷技術(shù)仍然具有一定的局限性1、在未培養(yǎng)的羊水中，熒光標(biāo)記的探針會(huì)與細(xì)胞骨架非特異性地結(jié)合，使背景不清晰，F(xiàn)ISH的有效性大大降低。2、必須要有完整的細(xì)胞用于分析。3、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能要求較高。4、母體細(xì)胞的污染會(huì)導(dǎo)致對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。5、相較QF-PCR，F(xiàn)ISH分析耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，限制了其對(duì)樣本的高通量檢測(cè)。
定量熒光PCR方法利用了基因組中廣泛分布的短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandem repeats，以下簡(jiǎn)稱STR)。STR通常由2～6bp的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，具有高度的多態(tài)性，易于采用復(fù)合擴(kuò)增方式進(jìn)行擴(kuò)增。而熒光復(fù)合擴(kuò)增是目前世界上應(yīng)用最普遍的復(fù)合擴(kuò)增方法，通常是在各個(gè)靶序列其中一條引物的一端標(biāo)記上熒光物質(zhì)，利用自動(dòng)激光熒光遺傳分析儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。STR的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳時(shí)按片段大小分離，根據(jù)熒光峰的數(shù)目和強(qiáng)度確定每個(gè)等位基因的拷貝數(shù)，從而反映特定染色體的拷貝數(shù)。正常的雜合子個(gè)體會(huì)產(chǎn)生高度相近的兩個(gè)峰，純合子則表現(xiàn)為單獨(dú)的一個(gè)STR峰。由于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增方法和熒光檢測(cè)的應(yīng)用，這種檢測(cè)方法非常靈敏，可用于少量樣本的檢測(cè)，如母體血液中收集的胎兒細(xì)胞或胎兒DNA，也可確定母體細(xì)胞的污染。尤為重要的是，這種方法非常迅速，DNA的提取和擴(kuò)增僅需5個(gè)小時(shí)左右，每個(gè)熒光產(chǎn)物的分析會(huì)在半小時(shí)內(nèi)完成。加之易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，有可能對(duì)36～96個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，因此幾十個(gè)，甚至幾百個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果可在一天內(nèi)得到。對(duì)于定量熒光PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果的認(rèn)定目前還很有爭(zhēng)議，因?yàn)檫@種方法本身尚存在一些問(wèn)題。首先，目前的定量熒光PCR檢測(cè)方法僅選取了每條染色體上的2-4個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。對(duì)一個(gè)特定的染色體來(lái)說(shuō)，僅由2-4個(gè)STR位點(diǎn)構(gòu)成的檢測(cè)系統(tǒng)通常不能保證檢測(cè)出所有的非整倍體，尤其當(dāng)STR位點(diǎn)的雜合度不高時(shí)。在許多運(yùn)用定量熒光PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)中，總有部分樣本不能提供信息，即一條染色體上的幾個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為一個(gè)STR峰，無(wú)法分辨是正常還是非整倍體的純合子。尤為重要的是，定量熒光PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)到兩個(gè)峰時(shí)，將峰高或峰面積的比值與事先建立的正常參考值范圍對(duì)照，作為判斷是否是非整倍體的依據(jù)之一，這使該方法的有效性大大降低。PCR是個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程，擴(kuò)增產(chǎn)物量和模板量并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，當(dāng)出現(xiàn)兩個(gè)等位基因峰時(shí)，對(duì)結(jié)果的判斷在實(shí)際操作中比較復(fù)雜。若兩個(gè)峰的高度或面積的比值接近正常參考值范圍的界值，對(duì)結(jié)果的判斷就會(huì)模棱兩可；多個(gè)靶位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增，由于熒光峰的重疊，其位置和強(qiáng)度有時(shí)也難以解釋；某些位點(diǎn)存在優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增現(xiàn)象，很容易導(dǎo)致誤診，尤其是在模板量少時(shí)。當(dāng)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增時(shí)，或是由于片段小的等位基因過(guò)度擴(kuò)增而將染色體的非整倍體誤判為正常的二倍體，或是由于正常二倍體個(gè)體的一個(gè)等位基因擴(kuò)增效率低而被誤判為非整倍體。在實(shí)踐中，定量熒光PCR通常是作為一種輔助的檢測(cè)方法而與傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法聯(lián)合使用，最后的檢測(cè)結(jié)果仍需通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)的方法獲得。由此看來(lái)，利用短串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行非整倍體的檢測(cè)要真正成為一種更準(zhǔn)確、快速的生物非整倍體的檢測(cè)技術(shù)，取代傳統(tǒng)的核型分析，還有待于作更進(jìn)一步的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是改進(jìn)上述現(xiàn)有的定量熒光PCR檢測(cè)方法，提供一種能夠迅速、準(zhǔn)確地對(duì)一種特定的染色體進(jìn)行生物非整倍體檢測(cè)的方法。
本發(fā)明的生物非整倍體的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行a、從胎兒細(xì)胞樣本中提取樣本DNA；b、采用熒光復(fù)合擴(kuò)增方式對(duì)樣本DNA中的特定STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，所述特定STR位點(diǎn)的雜合度大于0.6，在同一染色體上至少選取6個(gè)STR位點(diǎn)作為所述特定STR位點(diǎn)，所述特定STR位點(diǎn)為四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)；c、對(duì)等位基因峰的數(shù)目進(jìn)行辯認(rèn)，當(dāng)觀察到同一染色體上的兩個(gè)以上的特定STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí)，認(rèn)定該染色體為非整倍體在本發(fā)明的步驟a中，胎兒細(xì)胞樣本可來(lái)自羊水、絨毛膜、母體的外周血，甚至福爾馬林固定或石蠟包埋的組織，可以采用常規(guī)的酚-氯仿法或Chelex法提取樣本DNA。
在本發(fā)明的步驟b中，特定STR位點(diǎn)的選取是基于以下考慮1、選擇多態(tài)性好的STR位點(diǎn)。所謂多態(tài)性是指同一群體中一個(gè)基因座存在兩個(gè)或兩個(gè)以上等位基因的現(xiàn)象。一個(gè)基因座的多態(tài)性程度越高，應(yīng)用該基因座進(jìn)行進(jìn)行遺傳學(xué)分析的效能就越高。多數(shù)STR位點(diǎn)都具有高度的多態(tài)性，其多態(tài)性源于核心序列重復(fù)次數(shù)的個(gè)體差異。通常認(rèn)為復(fù)制滑脫是這種差異形成的機(jī)制。多態(tài)性好的STR位點(diǎn)會(huì)在正常群體的大部分個(gè)體中產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即對(duì)每個(gè)多態(tài)性好的位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，大部分的正常個(gè)體都會(huì)是雜合子，因此PCR產(chǎn)物的熒光定量分析會(huì)表現(xiàn)為兩個(gè)熒光峰，相應(yīng)于該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因。在染色體的非整倍體中，額外的染色體多來(lái)自母體，位點(diǎn)多態(tài)性越好，母體具有不同等位基因的可能性就越大。同時(shí)，與父體等位基因不同的可能性也大，染色體的非整倍體在該位點(diǎn)表現(xiàn)為三個(gè)熒光峰的可能性也就越大。在群體遺傳學(xué)中常用雜合度對(duì)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行定量評(píng)估。因此，在建立檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)選用雜合度大于0.6的STR位點(diǎn)。2、增加所選用的STR位點(diǎn)個(gè)數(shù)。對(duì)特定染色體三體的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，其效能不僅取決于STR位點(diǎn)的多態(tài)性，也與STR位點(diǎn)的數(shù)目有關(guān)。毫無(wú)疑問(wèn)，當(dāng)分析的STR位點(diǎn)數(shù)目增多時(shí)，系統(tǒng)的效能就會(huì)增加，因此在兩個(gè)以上的STR位點(diǎn)觀察到染色體的非整倍體具有三個(gè)不同等位基因的可能性就會(huì)增加，對(duì)非整倍體的確定也就更有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。根據(jù)我們的研究，至少應(yīng)選用6個(gè)以上的STR位點(diǎn)。3、選擇四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)，即位點(diǎn)的核心序列由4bp或5bp核苷酸構(gòu)成。這兩類微衛(wèi)星不僅具有高度的多態(tài)性，而且擴(kuò)增更忠實(shí)，分型也更準(zhǔn)確。
在本發(fā)明中，采用了熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可以直接沿用本申請(qǐng)人的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)03135377.0號(hào)中所公開(kāi)內(nèi)容。采用該技術(shù)之后，在一個(gè)反應(yīng)體系中有多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列，從而大幅度地簡(jiǎn)化了操作程序，節(jié)省了時(shí)間，達(dá)到了用少量檢材對(duì)生物非整倍體進(jìn)行檢測(cè)的目的。
與前述現(xiàn)有同類方法相比，本發(fā)明對(duì)用于復(fù)合擴(kuò)增的STR位點(diǎn)進(jìn)行了選取，嚴(yán)格選擇多態(tài)性好的四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)，增加了位點(diǎn)個(gè)數(shù)，保證了檢測(cè)系統(tǒng)的效能，使檢測(cè)更有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，同時(shí)，采用了特定的檢測(cè)判定方法，使檢測(cè)結(jié)果的判定更加直觀而明確，能真正實(shí)現(xiàn)快速、高通量地進(jìn)行生物非整倍體檢測(cè)的目的。因此，本發(fā)明有望取代傳統(tǒng)的核型分析，具有更高的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本實(shí)施例的生物非整倍體的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行a、采用酚-氯仿法從胎兒細(xì)胞樣本中提取樣本DNA。本實(shí)施例中的胎兒細(xì)胞樣本來(lái)自母體的羊水。
b、采用熒光復(fù)合擴(kuò)增方式對(duì)樣本DNA中的特定STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。在本實(shí)施例中，按以下原則選擇特定的STR位點(diǎn)所述特定STR位點(diǎn)的雜合度大于0.6，在同一染色體上至少選取6個(gè)STR位點(diǎn)作為所述特定STR位點(diǎn)，所述特定STR位點(diǎn)為四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)。綜合考慮上述選用STR基因座的各個(gè)因素，我們選擇了位于18號(hào)染色體上的九個(gè)STR基因座作為擴(kuò)增位點(diǎn)D18S1362、D18S866、GATA173A03、GATA166D05、GATA41G05、GATA177C03、D18S977、D18S1364、D18S877。
這些基因座均查自互聯(lián)網(wǎng)上的GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)，各基因座的引物序列分別為D18S1362基因座F5 ′--CAGAATTCCTAGATTCCTATCTCT-3′R5 ′--CCACCATACTAGCATGAGCC-3′D18S866基因座F5′--TAACTATGTTGATGGATGAATGG-3′R5′--TGAATAGGTTGGAAAAATTTCC-3′GATA173A03基因座F5′--GAAAAAGCCAGCGAGTACTG-3′R5′--TCATGCCTGTATCTATCACTGC-3′GATA166D05基因座F5′--TTAAGAATGAAATGTTCTAATTCCG-3′R5′--TTGTCACAGAAAGGGATGGT-3′
GATA41G05基因座F5′--TGTTTATTTGTTTGACTCAATGG-3′R5′--GAGTGAATGCTGTACAAACAGC-3′GATA177C03基因座F5′--CTCTCTTCATCCACCATTGG-3′R5′--GCTGTCAGAGACCTGTGTTG-3′D18S977基因座F5′--CAGTGCTTTGGCTATATCTATCT-3′R5′--TAACCTAGAAAAGGGCACTAGC-3′D18S1364基因座F5′--TCAAATTTTTAAGTCTCACCAGG-3′R5′--GCCTGTAGAAAGCAACAACC-3′D18S877基因座F5′--GATGATAGAGATGGCACATGA-3′R5 ′--TCTTCATACATGCTTTATCATGC-3′采用本申請(qǐng)人在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)03135377.0號(hào)中公開(kāi)的多色熒光物復(fù)合擴(kuò)增STR引物設(shè)計(jì)方法，對(duì)這九個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。D18S1362、D18S866、GATA173A03為一組，標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短引物對(duì)為PA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3 ′)PB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)在PB1′中，熒光物質(zhì)F1為市售的藍(lán)色熒光標(biāo)記物FAM。
這對(duì)短引物分別與該組三個(gè)基因座的原始引物構(gòu)成了復(fù)合擴(kuò)增體系中各基因座的長(zhǎng)引物。
D18S1362基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CAGAATTCCTAGATTCCTATCTCT-3′R5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-CCACCATACTAGCATGAGCC-3 ′
D18S866基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC--TAACTATGTTGATGGATGAATGG-3′R5 ′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-TGAATAGGTTGGAAAAATTTCC-3′GATA173A03基因座的長(zhǎng)引物F5 ′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GAAAAAGCCAGCGAGTACTG-3′R5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-TCATGCCTGTATCTATCACTGC-3′GATA166D05、GATA41G05、GATA177C03為一組，標(biāo)記另一種不同顏色的熒光。非人類基因組的短引物對(duì)為PA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3 ′)PB2 ′(5′--F2-TAATACGACTCAGTAT AGGGACAG-3′)在PB2′中，熒光標(biāo)記物F2為市售的現(xiàn)有黃色熒光標(biāo)記物NED。
這對(duì)短引物分別與該組三個(gè)基因座的原始引物構(gòu)成了復(fù)合擴(kuò)增體系中各基因座的長(zhǎng)引物。
GATA166D05基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTAAGAATGAAATGTTCTAATTCCG-3′R5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-TTGTCACAGAAAGGGATGGT-3′GATA4 1G05基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGTTTATTTGTTTGACTCAATGG-3′R5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GAGTGAATGCTGTACAAACAGC-3′GATA177C03基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC
-CTCTCTTCATCCACCATTGG-3′R5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GCTGTCAGAGACCTGTGTTG-3′D18S977、D18S1364、D18S877為一組，標(biāo)記另一種不同顏色的熒光。非人類基因組的短引物對(duì)為PA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)PB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)在PB3′中，熒光標(biāo)記物F3為市售的現(xiàn)有綠色熒光標(biāo)記物JOE。
這對(duì)短引物分別與該組三個(gè)基因座的原始引物構(gòu)成了復(fù)合擴(kuò)增體系中各基因座的長(zhǎng)引物。
D18S977基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CAGTGCTTTGGCTATATCTATCT-3′R5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-TAACCTAGAAAAGGGCACTAGC-3′D18S1364基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCAAATTTTTAAGTCTCACCAGG-3′R5 ′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GCCTGTAGAAAGCAACAACC-3′D18S877基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GATGATAGAGATGGCACATGA-3′R5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-TCTTCATACATGCTTTATCATGC-3′復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)在PE-9600擴(kuò)增儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系中的成份主要有模板DNA(人類基因組序列)、長(zhǎng)引物對(duì)、短引物對(duì)、耐熱DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、1×Buffer(緩沖液)和雙蒸水DDH20。其中，DNA耐熱聚合酶、Mg12和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為華美，品名為耐熱TaqDNA聚合酶)提供。
PCR反應(yīng)體系中各成分的濃度如下DDH2O 12.3μLdNTP 7.5μl(200μM)10Xbuffer3.75μL、各短引物 0.3μl(400nM)各長(zhǎng)引物 0.3μl(40nM)Taq酶1μl(3u)BSA 3.75μLMgCl23μl(2.25mM)DNA模板2.5μL(約3ng)總體積 37.5μL復(fù)合擴(kuò)增采用熱啟動(dòng)技術(shù)，共循環(huán)28輪，循環(huán)參數(shù)如下預(yù)變性94℃ 3分鐘變性 94℃ 50秒復(fù)性 56℃ 50秒延伸 72℃ 30秒 4個(gè)循環(huán)變性 94℃ 50秒復(fù)性 56℃ 30秒延伸 72℃ 30秒 24個(gè)循環(huán)延伸 72℃ 10分鐘c、對(duì)等位基因相應(yīng)熒光峰的數(shù)目進(jìn)行辯認(rèn)，當(dāng)觀察到同一染色體上兩個(gè)以上的特定STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí)，認(rèn)定該染色體中存在非整倍體。在本實(shí)施例中，利用ABI310遺傳分析儀(PE，美國(guó))對(duì)上述復(fù)合擴(kuò)增過(guò)程所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。用PCR產(chǎn)物0.4μl與分型標(biāo)準(zhǔn)物GS500 ROX size standard 0.2μl、變性劑Hi-DiTMformamide 13μl混勻編號(hào)，放入自動(dòng)進(jìn)樣盤。電進(jìn)樣15000V、5s.電泳15000V，24分鐘。用DateCollection軟件收集數(shù)據(jù)，Genescan3.7軟件分析數(shù)據(jù)，用修改過(guò)的AmpFISTR PLUS kit Kazam macro文件在Genetype3.7軟件自動(dòng)分型。等位基因的辨認(rèn)通過(guò)與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物比較來(lái)確認(rèn)，窗口范圍+/-0.5bp.這樣，通過(guò)直接觀察是否有兩個(gè)以上的STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰，我們可以檢測(cè)到染色體中是否存在生物非整倍體。
實(shí)施例2本實(shí)施例中的檢測(cè)方法與實(shí)施例1相似。所不同的是，在本實(shí)施例中，選擇了位于X號(hào)染色體上的六個(gè)STR基因座DXS6805、DXS9894、DXS9896、GATA192D07、DXS7132、GATA160B08，以及Y染色體的兩個(gè)位點(diǎn)DYS434、DYS438作為復(fù)合擴(kuò)增的位點(diǎn)。
這些基因座均查自互聯(lián)網(wǎng)上的CHLC數(shù)據(jù)庫(kù)，各基因座的引物序列分別為DXS6805基因座F5′--ACAGCAAGAAGATGGCTGTC-3′R5′--AGCAGCATGACTCCAGAATC-3′DXS9894基因座F5′--TGCACTTAATATCTGGTGATGG-3′R5′--ATTTCTTTCCCTCTGCAACC-3′DXS9896基因座F5′--CCAGCCTGGCTGTTAGAGTA-3′R5′--ATATTCTTATATTCCATATGGCACA-3′GATA192D07基因座F5′--TCTACTACCGTACCCATAATCTATC-3′R5′--AGGAATGCTTTAAAAGTGATGC-3′DXS7132基因座F5′--AGCCCATTTTCATAATAAATCC-3′R5′--AATCAGTGCTTTCTGTACTATTGG-3′GATA160B08基因座F5′--GAGCCCAGACACACATATCC-3′R5′--TGAGCACTGAATATACAGGTGG-3′DYS438基因座F5 ′--TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3 ′
R5 ′--GTGGCAGACGCCTATAATCC-3′DYS434基因座F5′--CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′R5′--GGAGATGAATGAATGGATGGA-3′采用本申請(qǐng)人在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)03135377.0號(hào)中公開(kāi)的多色熒光物復(fù)合擴(kuò)增STR引物設(shè)計(jì)方法，對(duì)這八個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。DXS6805、DXS9894、DXS9896、GATA192D07為一組，標(biāo)記一種顏色的熒光。非人類基因組的短引物對(duì)為PA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)PB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)在PB1′中，熒光物質(zhì)F1為市售的藍(lán)色熒光標(biāo)記物FAM。
這對(duì)短引物分別與該組三個(gè)基因座的原始引物構(gòu)成了復(fù)合擴(kuò)增體系中各基因座的長(zhǎng)引物。
DXS6805基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-ACAGCAAGAAGATGGCTGTC-3′R5′--F1-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-AGCAGCATGACTCCAGAATC-3′DXS9896基因座基因座的長(zhǎng)引物F5 ′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-CCAGCCTGGCTGTTAGAGTA-3′R5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-ATATTCTTATATTCCATATGGCACA-3′DXS9894基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-TGCACTTAATATCTGGTGATGG-3′R5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-ATTTCTTTCCCTCTGCAACC-3 ′
GATA192D07基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-TCTACTACCGTACCCATAATCTATC-3′R5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-AGGAATGCTTTAAAAGTGATGC-3′以DXS7132、GATA160B08、DYS434、DYS438為一組，標(biāo)記另一種不同顏色的熒光。非人類基因組的短引物對(duì)為PA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)PB2′(5′--F1-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)在PB1′中，熒光物質(zhì)F1為市售的紅色熒光標(biāo)記物ROX。
這對(duì)短引物分別與該組三個(gè)基因座的原始引物構(gòu)成了復(fù)合擴(kuò)增體系中各基因座的長(zhǎng)引物。
DXS7132基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-AGCCCATTTTCATAATAAATCC-3′R5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-AATCAGTGCTTTCTGTACTATTGG-3′GATA160B08基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-GAGCCCAGACACACATATCC-3′R5′--F1-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-TGAGCACTGAATA TACAGGTGG-3′DYS438基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3′R5 ′--F1-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3′DYS434基因座的長(zhǎng)引物F5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATA
-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′R5′--F1-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3′本實(shí)施例中的檢測(cè)系統(tǒng)其具體操作過(guò)程與實(shí)施例1相類似，故從略。這樣，根據(jù)樣本是否能擴(kuò)增出Y染色體上的等位基因，在X染色體上是否有兩個(gè)以上的STR位點(diǎn)表現(xiàn)為三個(gè)峰，即可快速檢測(cè)到染色體中是否存在生物非整倍體。
需要說(shuō)明的是，參照實(shí)施例1和實(shí)施例2，選取其它染色體上一定數(shù)量的適當(dāng)STR位點(diǎn)，同樣可構(gòu)建有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)其它的生物非整倍體進(jìn)行快速的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種生物非整倍體的檢測(cè)方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行a、從胎兒細(xì)胞樣本中提取樣本DNA；b、采用熒光復(fù)合擴(kuò)增方式對(duì)樣本DNA中的特定STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，所述特定STR位點(diǎn)的雜合度大于0.6，在同一染色體上至少選取6個(gè)STR位點(diǎn)作為所述特定STR位點(diǎn)，所述特定STR位點(diǎn)為四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)；c、對(duì)等位基因峰的數(shù)目進(jìn)行辯認(rèn)，當(dāng)觀察到同一染色體上的兩個(gè)以上的特定STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí)，認(rèn)定該染色體為非整倍體。
全文摘要
一種生物非整倍體的檢測(cè)方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行a.從胎兒細(xì)胞樣本中提取樣本DNA；b.采用熒光復(fù)合擴(kuò)增方式對(duì)樣本DNA中的特定STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，所述特定STR位點(diǎn)的雜合度大于0.6，在同一染色體上至少選取6個(gè)STR位點(diǎn)作為所述特定STR位點(diǎn)，所述特定STR位點(diǎn)為四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)；c.對(duì)等位基因峰的數(shù)目進(jìn)行辯認(rèn)，當(dāng)觀察到同一染色體上的兩個(gè)以上的特定STR位點(diǎn)具有三個(gè)等位基因峰時(shí)，認(rèn)定該染色體為非整倍體。本發(fā)明對(duì)用于復(fù)合擴(kuò)增的STR位點(diǎn)進(jìn)行了選取，嚴(yán)格選擇多態(tài)性好的四核苷酸或五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)，增加了位點(diǎn)個(gè)數(shù)，采用了特定的檢測(cè)判定方法，使檢測(cè)結(jié)果的判定更加直觀而明確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1590563SQ200410021619
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2004年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月7日
發(fā)明者侯一平, 李英碧, 顏靜, 張, 應(yīng)斌武, 鄧建強(qiáng) 申請(qǐng)人:四川大學(xué)