專利名稱：增強(qiáng)藥物功效的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物功效的增強(qiáng)，特別是同時(shí)克服了細(xì)胞或生物體的耐藥性。
背景技術(shù)：
細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)可能嚴(yán)重影響化療劑或藥物的臨床有效性。因此，人們進(jìn)行了大量研究，試圖闡釋細(xì)胞耐藥性的機(jī)理并尋找克服這種耐藥性的方法，迄今已提出了許多推定的細(xì)胞耐藥性機(jī)理，包括(i)藥物的改變的代謝作用，其可能包括降低的激活作用和增加的滅活作用；(ii)靶細(xì)胞或生物體對(duì)活性化合物的不滲透性；(iii)受抑制的酶的改變的特異性；(iv)靶分子的增加的生成；(v)細(xì)胞毒性損傷的增強(qiáng)的修復(fù)；(vi)通過其它生化途徑避開受抑制的反應(yīng)。
細(xì)胞耐藥性機(jī)理是復(fù)雜的，因此，在開發(fā)克服耐藥性問題的普遍適用的方法方面，鮮有進(jìn)展。另外一個(gè)復(fù)雜的因素是耐藥性是一個(gè)幾乎與所有的化療使用都相關(guān)的問題，而對(duì)那些需要用大量共存的藥物進(jìn)行長期治療的疾病來說，耐藥性更經(jīng)常與之相關(guān)。
例如，在癌癥的治療中，經(jīng)常觀察到癌細(xì)胞對(duì)活性化合物的不滲透性。此外，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)對(duì)一種藥物的耐藥性可以引發(fā)對(duì)其它生化上不同的藥物的耐藥性。這被稱為多藥耐藥性。通常受多藥耐藥性問題影響的藥物包括多柔比星、長春新堿、長春堿、秋水仙堿和放線菌素D。至少在一些情況下，多藥耐藥性是復(fù)雜表型，該表型已聯(lián)系到被稱為MdrI蛋白或P-糖蛋白的細(xì)胞膜藥物溢出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高水平的表達(dá)。這種膜“泵”具有寬的特異性，其發(fā)揮作用而從細(xì)胞中除去多種在化學(xué)上不相關(guān)的毒素(參見Endicott等，1989)。
最近，報(bào)道了某些微生物的廣譜耐藥性的類似的機(jī)理。這些結(jié)果表明具有非常廣泛的底物特異性的細(xì)菌溢出系統(tǒng)的存在，其與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多藥耐藥性相似(參見Nikaido，1993)。
逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的物質(zhì)被稱作耐藥性修飾劑(RMA)，其在增強(qiáng)那些人的癌細(xì)胞已對(duì)之產(chǎn)生耐藥性的化療劑的細(xì)胞毒性方面具有重要性。盡管許多試劑在體外已被鑒定為RMA，但因?yàn)樵谀孓D(zhuǎn)多藥耐藥性的劑量下，具有高的體內(nèi)毒性，所以這些試劑大部分沒有或僅有很小的治療潛力。例如，代謝毒物如疊氮化物能在體外逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性，但在體內(nèi)卻毫無作用。大多數(shù)其它的高效RMA，如PSC833，看來是MdrI蛋白的藥物結(jié)合位點(diǎn)的競爭性拮抗劑。這些試劑的許多具有毒性，這限制了它們?cè)隗w內(nèi)的有效性。因此，需要開發(fā)替代的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的藥理學(xué)策略。
在克服腫瘤對(duì)抗腫瘤藥物的不良吸收并降低全身毒性的試驗(yàn)中(Singh等，1991)，研究者試圖將抗腫瘤藥物如甲氨蝶呤(MTX)靶向于惡性組織的位置。幾項(xiàng)研究已經(jīng)試圖通過將藥物連接到因它們對(duì)腫瘤的親和力而被選擇的聚合物上，從而使化療劑靶向于腫瘤(Hudecz等，1993；Klein等，1994；Akima等，1996)。然而，盡管這些聚合物可以幫助將活性試劑轉(zhuǎn)運(yùn)到靶組織上，它們卻并不一定克服耐藥性問題。
已提出作為腫瘤靶向試劑的一種聚合物是透明質(zhì)酸(HA)。HA是自然界存在的包含直鏈聚合物的多糖，其在動(dòng)物界無所不在。HA是高度水溶性的，使其成為生物系統(tǒng)的理想的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
本申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)HA顯示獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)不僅增強(qiáng)其作為藥物載體的有效性，而且?guī)椭朔退幮?。在約1克/升的高濃度時(shí)，HA采取剛性的隨機(jī)卷曲構(gòu)象，這種構(gòu)象占據(jù)相對(duì)于分子量而言異常的體積(Laurent，1970)，而且在這樣的濃度或低于其的濃度時(shí)，它形成松散的連接以形成大分子網(wǎng)絡(luò)(

圖1)。雖然我們不希望被任何特定的理論所束縛，根據(jù)HA的物理性質(zhì)，我們認(rèn)為多糖與藥物如甲氨蝶呤相互作用的機(jī)理可能采取以下一種或兩種形式(i)化學(xué)相互作用(圖2)在MTX的氨基與HA的羧基間形成離子鍵，但這種相互作用可能導(dǎo)致沉淀。另一種可能的相互作用是通過藥物上的氨基與HA上的羥基形成的氫鍵，但由于甲氨蝶呤在水中相對(duì)不溶，這種情況也不大可能；因此如果其存在它也將是非常弱的相互作用。MTX與HA間最可能的結(jié)合是通過MTX中大量的疏水基團(tuán)與HA二級(jí)結(jié)構(gòu)中的疏水片段之間的疏水相互作用(Scott等，1989)。
(ii)分子締合當(dāng)MTX只是“混合”在HA凝膠中(圖2B)，而沒有特定化學(xué)鍵的形成時(shí)，MTX能在高濃度HA形成的三維網(wǎng)絡(luò)中被俘獲(Mikelsaar和Scott，1994)，以便藥物在給予后簡單地從HA中擴(kuò)散出來。如果HA被特定的細(xì)胞受體快速吸收并結(jié)合，藥物將在這些位點(diǎn)，例如具有HA受體的淋巴結(jié)、肝臟、骨髓、腫瘤細(xì)胞以高濃度被釋放。
同樣雖然不希望被任何特定的理論所束縛，HA幫助靶向活性試劑的一種機(jī)理可能是通過HA受體在幾種類型的腫瘤中特征性的過度表達(dá)(Stamenkovic等，1991；Wang等，1998)。HA受體CD44、透明質(zhì)酸介導(dǎo)的細(xì)胞游動(dòng)性的受體(RHAMM)和ICAM-1已被同腫瘤起源(Bartolazzi等，1994)和生長(Gunthert 1993；Arch等，1992)連系起來。RHAMM是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞游動(dòng)性和入侵的主要因素(Hardwick等，1992)。已經(jīng)證明RHAMM是成纖維細(xì)胞的H-ras轉(zhuǎn)化所需要的(Hall等，1995)，其使得該受體成為腫瘤形成和生長潛在的參與者。ICAM-1是試驗(yàn)性地與HA代謝相關(guān)的受體(McCourt等，1994)，其在被轉(zhuǎn)化的組織，如小鼠肥大細(xì)胞瘤(Gustafson等，1995a)和人乳腺癌腫瘤細(xì)胞簇和間質(zhì)中被高度表達(dá)(Ogawa等，1998)。
HA受體在腫瘤細(xì)胞上的增加的表達(dá)為試圖將HA引入化療治療方案中提供了理論基礎(chǔ)。但是，迄今已獲得的十分有限的數(shù)據(jù)實(shí)際上不是本申請(qǐng)要求保護(hù)的方法。例如，通過將HA化學(xué)絡(luò)合到絲裂霉素C和表柔比星上而獲得有限的成功；研究者能夠抑制0.8-25％的結(jié)腸癌生長(Akimq等，1996)。Klein及其同事(1994)報(bào)道僅通過將HA與5-FU混合而實(shí)現(xiàn)植入的大鼠乳腺癌和Fischer膀胱癌對(duì)藥物的增加的吸收。小鼠肥大細(xì)胞瘤也被證明與靜脈注射的HA有親和力(Gustafson等，1995b)。
但是，雖然一些對(duì)HA的研究已經(jīng)表明HA能被用作藥物載體，但是這些研究還沒有顯示HA能克服細(xì)胞耐藥性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供增強(qiáng)細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥的功效的方法，該方法包含將所述藥物與透明質(zhì)酸聯(lián)合給予的步驟，其中同透明質(zhì)酸聯(lián)合給予增強(qiáng)了藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力。
通常，細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥與透明質(zhì)酸的聯(lián)合給予增強(qiáng)其對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力。也就是說通常耐藥的癌細(xì)胞變得對(duì)藥物敏感了。
優(yōu)選的藥物是甲氨蝶呤、紫杉醇或5-氟尿嘧啶(5-FU)。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物組合物，該組合物包含透明質(zhì)酸和細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥。任選地，該藥物組合物中可以包含常規(guī)的藥物添加劑。
通常所述藥物在透明質(zhì)酸中被攜帶或與透明質(zhì)酸結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供增強(qiáng)細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥的功效的方法，該方法包含給予含有透明質(zhì)酸與所述藥物的藥物組合物的步驟。
雖然不希望被任何理論所束縛，據(jù)信克服耐藥性的可能機(jī)理是1.透明質(zhì)酸與耐藥細(xì)胞上的受體結(jié)合或通過整體胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致所攜帶或結(jié)合的藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，使之成為治療活性的。
2.透明質(zhì)酸結(jié)合到耐藥細(xì)胞的表面，在那里所攜帶或結(jié)合的藥物從透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)中擴(kuò)散入細(xì)胞，導(dǎo)致藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)入耐藥細(xì)胞中。
3.透明質(zhì)酸和其它粘多糖采取卷曲構(gòu)象攜帶藥物，并且也可以結(jié)合多種藥物。
根據(jù)第四個(gè)方面，本發(fā)明提供降低或克服耐藥性的方法。該方法包含將細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥和粘多糖聯(lián)合給予的步驟，該粘多糖能夠攜帶和/或結(jié)合所述藥物，而且能與耐藥細(xì)胞上的受體結(jié)合或通過整體胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其中所述藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中，從而使之成為治療活性的。
雖然不希望被理論所束縛，可能是透明質(zhì)酸與藥物的組合導(dǎo)致藥物在細(xì)胞存留更長的時(shí)間，從而允許延長的釋放并使藥物更長時(shí)間地發(fā)揮其藥理作用。
根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供增強(qiáng)藥物功效的方法，該方法包含將所述藥物和粘多糖聯(lián)合給予的步驟，該粘多糖與所述藥物締合，締合方式使所述藥物在細(xì)胞內(nèi)存留的時(shí)間長于如果所述藥物被單獨(dú)給予時(shí)其在細(xì)胞內(nèi)的存留時(shí)間。例如，當(dāng)藥物是細(xì)胞毒性藥物時(shí)，那么藥物將在細(xì)胞內(nèi)存留更長的時(shí)間，使得藥物有延長的釋放并更長時(shí)間地發(fā)揮其毒性作用。
根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供治療耐藥性疾病的方法，該方法包含給需要這種治療的患者聯(lián)合給予透明質(zhì)酸和藥物的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的這個(gè)方面提供了治療耐藥性疾病的方法，該方法包含給予需要這種治療的患者包含透明質(zhì)酸和藥物的組合物的步驟。
特別地，治療耐藥性疾病的方法適用于患有耐藥性癌癥的患者。優(yōu)選地，癌癥是耐甲氨蝶呤或5-FU的。
更優(yōu)選地，所述耐藥性是多藥耐藥性。
根據(jù)本發(fā)明的第七個(gè)方面，提供治療癌癥的方法，該方法包含將藥物和粘多糖聯(lián)合給予的步驟，該粘多糖能夠攜帶或結(jié)合所述藥物和/或與所述藥物締合，締合方式使所述藥物在癌細(xì)胞內(nèi)存留時(shí)間長于如果單獨(dú)給予所述藥物時(shí)其在細(xì)胞內(nèi)存留時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的第八個(gè)方面，提供降低藥物胃腸毒性的方法，該方法包含將所述藥物與粘多糖聯(lián)合給予的步驟，該粘多糖能夠攜帶或結(jié)合所述藥物和/或與所述藥物締合，締合方式使所述藥物具有降低的胃腸毒性。
縱觀本發(fā)明的說明書與權(quán)利要求書，單詞“包含”意指“包含但不局限于”，其不試圖排除其它添加劑、組份、整數(shù)或步驟。
附圖的簡要說明圖1顯示高濃度HA形成三維網(wǎng)絡(luò)，其能攜帶小分子如甲氨蝶呤。通過HA快速結(jié)合到特定細(xì)胞受體上，隨后藥物從HA擴(kuò)散出，和/或通過HA和/或藥物受體細(xì)胞將HA和藥物共同內(nèi)在化而實(shí)現(xiàn)HA/藥物對(duì)病理位點(diǎn)的靶向。
圖2A顯示甲氨蝶呤和HA之間的可能相互作用。其包括(i)離子鍵、(ii)氫鍵或(iii)疏水鍵。
圖2B是甲氨蝶呤在HA中纏結(jié)的示意圖。在高濃度下，HA形成三維網(wǎng)絡(luò)，其由大的卷曲分子表示。(*)代表分子量僅為454D的甲氨蝶呤，其易于在400-900KD的HA分子中被攜帶。
圖3顯示人乳腺癌腫瘤在裸鼠內(nèi)生長的一般病理學(xué)。畫面A表示II-III級(jí)人類腫瘤的一般形態(tài)學(xué)；畫面B表示在圖3A中所示腫瘤的另一切片的顯微圖。該切片顯示了周圍小鼠肌肉(M)、腫瘤被膜(C)、腫瘤的壞死區(qū)(N)和浸潤性腫瘤(T)。(→)表示被稱為“一路縱隊(duì)”的常見現(xiàn)象，其中腫瘤細(xì)胞依次排列，其通常與浸潤性癌癥相關(guān)(Carter，1990)。
圖4顯示惡性乳腺腫瘤的典型的病理特征。畫面A所示為帶有大面積壞死區(qū)(N)的特征性的浸潤性管癌的切片，顯示了腫瘤更強(qiáng)的侵入性的病程；畫面B顯示了血細(xì)胞的存在(→)，證明腫瘤血管形成因而是能生存的。在很接近血管的地方可以觀察到少量導(dǎo)管(D)；畫面C表示被標(biāo)記為A的細(xì)胞，其正經(jīng)歷被核碎裂表明的編程性細(xì)胞死亡。
圖5顯示生長在裸鼠中的人乳腺癌腫瘤上的HA受體的免疫組織化學(xué)識(shí)別。畫面A顯示腫瘤中癌胚抗原(CEA)的位置；畫面B顯示RHAMM在人乳腺癌上的表達(dá)；畫面C顯示ICAM-1在人乳腺癌上的表達(dá)。HA受體，ICAM-1的位置主要在內(nèi)皮組織周圍(→)；畫面D顯示CD44在人乳腺癌上的表達(dá)。CD44在大約95％的腫瘤細(xì)胞被檢測(cè)到。H人源細(xì)胞，M鼠源細(xì)胞。
圖6顯示用作靶向于腫瘤的甲氨蝶呤的載體的透明質(zhì)酸的分子量分析結(jié)果。
圖7顯示用HA作載體，甲氨蝶呤對(duì)人乳腺癌腫瘤的靶向。
圖8顯示在HA存在下，肝臟中甲氨蝶呤的增強(qiáng)的吸收。
圖9顯示當(dāng)藥物與HA聯(lián)合給予時(shí)，胃腸道中甲氨蝶呤的降低的吸收。
圖10為MTX/HA之間可能的物理相互作用，以及作為結(jié)果的藥物/HA組合治療的腫瘤靶向能力的示意圖。
圖11顯示將HA與5-FU組合的體外細(xì)胞毒性協(xié)同作用。
圖12顯示用HA作載體，5-FU對(duì)人乳腺癌的靶向。
圖13顯示HA在人體中的消除途徑。
圖14顯示5-FU在胃、腦及肺中的增加的吸收。
圖15顯示HA對(duì)血漿5-FU的藥代動(dòng)力學(xué)消除的影響。
圖16顯示定義試驗(yàn)終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。顯示了標(biāo)準(zhǔn)2(畫面A)和標(biāo)準(zhǔn)3(畫面B)。
圖17顯示5-FU/HA輔助治療的功效(6周治療方案)對(duì)原發(fā)腫瘤體積的影響。
圖18顯示5-FU/HA輔助治療的功效(6周治療方案)對(duì)體重的影響。
圖19顯示5-FU/HA輔助治療的功效(6周治療方案)對(duì)淋巴結(jié)癌的擴(kuò)散和新腫瘤形成的影響。
圖20顯示6月功效研究的腫瘤的一般外觀。
圖21顯示HA/5-FU輔助治療對(duì)患者存活的影響。
圖22顯示CMF/HA治療6周后的小鼠體重變化百分?jǐn)?shù)。
圖23顯示CMF/HA治療6周后的小鼠腫瘤體積變化百分?jǐn)?shù)。
圖24顯示溶于水中的MTX的1HNMR譜圖。該譜圖中很容易識(shí)別MTX的每組氫。
圖25顯示MTX與HA的可能相互作用。
圖26顯示透明質(zhì)酸在298K和600MHz時(shí)的600MHz譜圖。
圖27顯示在298K時(shí)，MTX獨(dú)自的600MHz1H NMR譜圖以及逐漸添加2納摩爾、10納摩爾、20納摩爾和80納摩爾HA(50KDa)的MTX的600MHz1H NMR譜圖。
圖28顯示在298K時(shí)，在70.0到8.5ppm之間的5-FU的600MHz1H NMR譜圖以及5-FU(1.25毫克/毫升、1.6毫克/毫升和6.4毫克/毫升)HA(750KDa，3毫克/毫升)的600MHz1HNMR譜圖?？s寫B(tài)SA牛血清白蛋白Ci 居里CMF環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶Cyc環(huán)磷酰胺DNA脫氧核糖核酸Dpm每分鐘衰變DTTP 脫氧胸苷三磷酸ECM細(xì)胞外基質(zhì)EDTA 乙二胺四乙酸ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定FCS胎牛血清5-FU 5-氟尿嘧啶GAG葡糖胺聚糖GlcNAc N-乙酰葡糖胺GlcUA 葡糖醛酸HA 透明質(zhì)酸HABP 透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白HAase 透明質(zhì)酸酶HBSS 漢克氏平衡鹽溶液HRP辣根過氧化物酶h 小時(shí)Kav凝膠內(nèi)可利用的分配體積l 升min分鐘PBS 磷酸鹽緩沖鹽水PM 質(zhì)膜RHAMMHA介導(dǎo)的細(xì)胞游動(dòng)性的受體RMCa 大鼠乳腺癌RNA 核糖核酸RT 室溫S-期 合成期S.D. 標(biāo)準(zhǔn)偏差SEM 平均標(biāo)準(zhǔn)誤差Ve洗脫體積Vo空隙體積Vt總體積TGD 腫瘤生長延遲TDT 腫瘤加倍時(shí)間發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明現(xiàn)在將僅通過參考以下非限制性實(shí)施例而被進(jìn)一步描述。然而，應(yīng)該理解以下實(shí)施例僅是說明性的，而不應(yīng)在任何方面被認(rèn)為是對(duì)上述本發(fā)明的的概述的限制。尤其是，當(dāng)本發(fā)明涉及到癌癥而被詳細(xì)描述時(shí)，應(yīng)清楚地理解本文的發(fā)現(xiàn)不局限于癌癥的治療。例如，細(xì)胞毒性藥可以被用于其它癥狀的治療；甲氨蝶呤廣泛用于治療嚴(yán)重的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。實(shí)施例1裸鼠中人類乳腺腫瘤的確認(rèn)與乳腺腫瘤上透明質(zhì)酸受體的原位鑒定要建立人乳腺癌的合適的動(dòng)物模型，需要進(jìn)行病理學(xué)試驗(yàn)。腫瘤要是生理上能生存的，新血管形成是必需的，因?yàn)槊?xì)血管網(wǎng)絡(luò)給腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)。血管形成、導(dǎo)管入侵、壞死、編程性細(xì)胞死亡的存在，高有絲分裂指數(shù)和核異常都是乳腺癌的特征。
人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468(美國組織培養(yǎng)物保藏中心，羅克維爾，美國)基于其HA受體，CD44、RHAMM和ICAM-1的表達(dá)而被選擇。細(xì)胞常規(guī)生長并在175厘米2培養(yǎng)瓶中在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FCS)和10微克/毫升慶大霉素的Leibovitz L-15培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)成單細(xì)胞層。為了注射入小鼠體內(nèi)，細(xì)胞生長到100％鋪滿，在0.05％胰蛋白酶/0.01％EDTA溶液中受胰蛋白酶作用，通過在Beckman TJ-6臺(tái)式離心機(jī)(Beckman，澳大利亞)中，在400gav下離心10min而洗滌2次，用ZM Coulter型計(jì)數(shù)器(CoulterElectronics，英國)計(jì)數(shù)，并在無血清的Leibovitz L-15培養(yǎng)基中以1×108細(xì)胞/毫升重懸浮。
85只無胸腺6到8周大的Balb/c/WEHI雌性裸鼠(Walter andEliza Hall Institute of Medical Research，墨爾本，澳大利亞)養(yǎng)在無特定病原的條件下，提供無限制的無菌食物與水。如上述方法準(zhǔn)備一千萬個(gè)MDA-MB 468細(xì)胞，并直接注射入小鼠乳頭下的脂墊。在96％的小鼠中觀察到腫瘤生長。當(dāng)腫瘤生長到肉眼可測(cè)時(shí)，通過每周測(cè)定腫瘤的體積監(jiān)測(cè)腫瘤的進(jìn)展。腫瘤體積使用以下公式由3個(gè)垂直的直徑計(jì)算V＝(1/6)p(d1d2d3)其中V是腫瘤體積(單位毫米3)，d1是腫瘤的第一直徑(單位毫米)，d2是腫瘤的第二直徑(單位毫米)，以及d3是腫瘤的第三直徑(單位毫米)(Lamszus等，1997)。腫瘤接種8周后，平均腫瘤大小為482.2毫米3(SEM，39.8毫米3)。
腫瘤誘導(dǎo)大約8周后，兩只帶有腫瘤的小鼠被給予致死劑量的戊巴比妥。在3min內(nèi)處死小鼠，腫瘤經(jīng)外科手術(shù)轉(zhuǎn)移并立即在10％緩沖的福爾馬林中固定12小時(shí)。固定的腫瘤在一系列70-100％乙醇中洗滌液中過夜脫水，接著用石蠟包埋，并由其切下2-4微米的切片。將切片置于載玻片上，脫蠟，并放到水中。載玻片在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌3×5min。嗜異性蛋白通過和10％胎牛血清保溫10min，接著用PBS沖洗而被封閉。在室溫(RT)下應(yīng)用檢測(cè)抗體60min?？刂瓶寡寤蚩贵w對(duì)抗RHAMM(Applied BioligandsCorporation(馬尼托巴，加拿大)、ICAM-1、CD44v6、CD44v10、總CD44H和CAE。所有其它檢測(cè)抗體均購自Zymed(加利福尼亞，美國)。載玻片在PBS中洗滌3×5min，內(nèi)源過氧化物酶活性通過浸入0.3％H2O2/甲醇20min而被阻斷。在進(jìn)一步用PBS洗滌之后，過氧化物酶接合的豬抗兔二級(jí)抗血清(達(dá)科，丹麥)在室溫下應(yīng)用60min，接著在PBS中洗滌3×5min。Sigma快DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺，Sigma，圣路易斯，美國)片劑根據(jù)生產(chǎn)商的說明書被制備，并且DAB溶液在RT下應(yīng)用5-10min。載玻片在自來水中洗滌10min，用蘇木精復(fù)染色，脫水并制成標(biāo)本。
蘇木精和曙紅染色的乳腺癌切片的檢查顯示所有與能生存的腫瘤相關(guān)的一般特征，如圖3和圖4所示，這確證了動(dòng)物主體成功地保留了II級(jí)人乳腺癌。有幾個(gè)特征是惡性腫瘤特征性性的。標(biāo)記為(B)的載玻片的切片顯示了這些特征。在切片(B)中觀察到惡性腫瘤的所有病理特征，即i)高的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比率ii)角形的染色質(zhì)和核仁iii)不規(guī)則的核膜推定II-III級(jí)腫瘤能被裸鼠模型支持。II-III級(jí)腫瘤一般給出約47％的預(yù)后生存率(Bloom和Richardson，1957)。II-III級(jí)腫瘤的特征在于
i)中等的細(xì)胞核復(fù)型現(xiàn)象、深色染色質(zhì)，與有絲分裂活性，在所有顯示的腫瘤切片中觀察到的特征；以及ii)很少或沒有導(dǎo)管形成。
大面積壞死(N)可能與腫瘤擴(kuò)散有關(guān)，這意味著更有侵入性的入侵病程(Carter，1990)。腫瘤的浸潤性邊緣用()表示。
本試驗(yàn)的主要目的是確認(rèn)在這些小鼠中建立的腫瘤的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)行為與這種腫瘤在它們的自然人主體中的行為類似。在實(shí)現(xiàn)這一目的的同時(shí)，我們還顯示了小鼠中的腫瘤細(xì)胞是人源的，并且它們高度表達(dá)相關(guān)的HA受體如RHAMM、CD44和推定的ICAM-1。由于假定腫瘤靶向可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)在化或結(jié)合而發(fā)生，因此有必要確證HA受體，ICAM-1、CD44和RHAMM的表達(dá)。圖5B-D證明了所有這些受體都存在。表1列出了在兩種所測(cè)試的腫瘤上受體的表達(dá)程度。
表1在人類乳腺腫瘤異種移植物上透明質(zhì)酸受體的表達(dá)在腫瘤上表位表達(dá)百分率的等級(jí)指數(shù)定量如下0％-1-25％ +26-50％++51-75％+++76-100％ ++++
腫瘤細(xì)胞的人源通過用人類特定的癌標(biāo)記物將腫瘤和周圍組織染色而得到確證。CEA的存在清楚地證明了腫瘤是人類的，而由鼠主體的心血管系統(tǒng)供養(yǎng)(圖5A)。選擇多克隆CEA抗血清，因?yàn)樗潘缘嘏c人類CEA反應(yīng)。這一顯微圖證明了腫瘤完全是人源的(H)，如棕色染色所顯示。周圍腫瘤被膜和脂肪組織一定是鼠源的，這通過沒有抗血清(M)染色而表明。棕色染色證明了RHAMM在腫瘤細(xì)胞上的高度表達(dá)。在組織壞死和腫瘤浸潤的周圍區(qū)域可以觀察到最強(qiáng)的染色強(qiáng)度。實(shí)施例2甲氨蝶呤/透明質(zhì)酸藥物組合物的制備和注射建立了裸鼠模型的有效性后，它現(xiàn)在能被用來試驗(yàn)HA/MTX制劑的有效性。
MTX儲(chǔ)備溶液通過將MTX粉末溶解在0.5％w/v的碳酸鈉(pH9)中而制備，并用0.9％w/v氯化鈉將其濃度調(diào)到24.5毫克/毫升。儲(chǔ)備溶液在加入[3H]甲氨蝶呤并用注射級(jí)氯化鈉稀釋到注射濃度前通過0.22微米濾器過濾以確保其無菌。關(guān)于裸鼠和人類的MTX藥代動(dòng)力學(xué)的比較數(shù)據(jù)已經(jīng)出版(Inaba等，1988)，并且被應(yīng)用在本研究設(shè)計(jì)中，從而盡可能接近地模擬人的治療劑量。根據(jù)各小鼠的體重制備各注射液，以實(shí)現(xiàn)在50微升中注射藥量為15毫克/千克MTX(相當(dāng)于人治療劑量對(duì)平均體重60千克的人來說是0.42毫克/千克；Inaba等，1988)的目的。
干燥的HA(Mr8.9×105kDa型)加到一份24.5毫克/毫升的MTX儲(chǔ)備溶液中并渦旋過夜而溶解，得到濃度為21毫克/毫升。為了確保無菌，加入慶大霉素至濃度達(dá)50微克/毫升并在4℃保溫過夜。在[3H]甲氨蝶呤加入后，HA/MTX儲(chǔ)備混合液用注射級(jí)氯化鈉稀釋到注射濃度。根據(jù)各小鼠的體重單獨(dú)制備注射液，使在50微升中注射15毫克/千克MTX和12.5毫克/千克HA。當(dāng)這一數(shù)量的HA注射到體內(nèi)后，在試驗(yàn)期間觀察飽和動(dòng)力學(xué)(Fraser等，1983)。
為確保HA在甲氨蝶呤/HA注射混合液制備過程中保持其分子量，注射溶液用Sephacryl S-1000大小排阻凝膠(Pharmacia，烏普薩拉，瑞典)分析，柱規(guī)格為1.6厘米×70厘米，樣品體積為2毫升，流速為18毫升/h，流份為2毫升。圖6顯示了在混合期間HA保持它的分子量不變。
小鼠被隨機(jī)分成2組，每組40只。組1只接受MTX治療，組2接受MTX/HA組合治療。動(dòng)物被單獨(dú)放在注射箱中，通過尾靜脈給予注射液。包含在15毫克/千克MTX±12.5毫克/千克HA內(nèi)的氚代甲氨蝶呤(平均注射的每分鐘衰變(dpm)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)19159146±1336819)在各注射液中轉(zhuǎn)運(yùn)。小鼠被單獨(dú)放在柔軟、不可濕潤的塑料圍欄中以收集尿樣。在注射30min、1h、2h、4h或8h后，腹膜內(nèi)注射0.1毫升戊巴比妥(Glaxo，Australia Pty.Ltd.，墨爾本，澳大利亞)將小鼠麻醉，并從心臟或大血管用針和注射器采集血樣。采集血樣后的動(dòng)物通過頸部扭斷處死。
血樣轉(zhuǎn)移到涂有EDTA的玻璃試管中，血漿通過在14000gav下離心10min制備。在用100微升30％v/v過氧化氫脫色并加入3毫升HiSafeII閃爍體后計(jì)算50微升等分試樣的放射性。為了克服化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光，根據(jù)樣品來源在3、7或20天的時(shí)間內(nèi)，在Wallac1410β計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)2min。在計(jì)數(shù)之間的時(shí)間中，樣品儲(chǔ)存在室溫黑暗中。所有計(jì)算都在除去化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光的穩(wěn)定的樣品上進(jìn)行。
為了測(cè)定注射的MTX在血漿中的百分比，需要使用以下標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算各小鼠的總血漿體積(毫升)小鼠質(zhì)量(g)×小鼠血液體積(0.07)×血液的血漿比例(0.59)然后計(jì)算血漿中注射的MTX的百分比 ＝％血漿中注射的MTX。
為確保轉(zhuǎn)運(yùn)入血流中的MTX量的精確定量，切開尾靜脈上的注射位點(diǎn)，定量MTX。殘留在注射位點(diǎn)的MTX注射液的平均百分比為3.78％(SEM0.57％)。轉(zhuǎn)運(yùn)入血流中的MTX量(用于分布到組織和腫瘤中去的MTX)計(jì)算如下 轉(zhuǎn)運(yùn)入血流中的MTX量此后將被稱為“注射劑量”。
為了進(jìn)行樣品群間的精確比較并歸一化器官及腫瘤質(zhì)量的輕微偏差，在身體器官和腫瘤以及體液中MTX的濃度表示為注射劑量/克組織的％。
殘留在注射位點(diǎn)的MTX注射液的平均百分比為3.78％(SEM0.57％)。為了歸一化該偏差，在腫瘤和組織中發(fā)現(xiàn)的dpm百分比被計(jì)算為注射的dpm百分比減去殘留在注射位點(diǎn)的dpm百分比。該量此后被稱為可利用的dpm或可利用的甲氨蝶呤。結(jié)果列于表2中。表2小鼠腫瘤、器官和體液中的甲氨蝶呤吸收數(shù)值是中值+sEM，其中n＝8*和 代表當(dāng)使用Mann-Whitney佚和檢驗(yàn)時(shí)統(tǒng)計(jì)意義上顯著的數(shù)字#代表MTX在小鼠血漿總體積中的Dmp。數(shù)值代表用％表示的注射MTX劑量的Dmp@代表MTX在小鼠尿總體積中的Dmp。數(shù)值代表用％表示的注射劑量。N＝3-8ID代表數(shù)據(jù)不足以分析
當(dāng)藥物與HA聯(lián)合注射時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)MTX的血漿濃度有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異。MTX的總藥代動(dòng)力學(xué)保持不變，在靜脈給予后0.5至2h內(nèi)血漿的MTX水平達(dá)到最高(MIMS，1997)。
當(dāng)可能時(shí)，用注射器和針從不可濕潤的塑料圍欄中采集尿樣。通過在14000gav下離心10min使尿樣澄清。在向8-30微升樣品中加入3毫升HiSafeII閃爍體后測(cè)定其放射性含量。盡管精確定量每只小鼠產(chǎn)生的尿的體積有技術(shù)困難，我們通過以下公式計(jì)算尿中注射的MTX劑量的百分比 ＝尿中注射的MTX的％。
因?yàn)榕拍蛩俾实淖兓?，不可能從每只小鼠收集尿樣。?dāng)在每個(gè)治療的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有3個(gè)或3個(gè)以上的尿樣時(shí)，則在那些時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。在給藥后一小時(shí)，在接受MTX/HA的小鼠的尿中有50％(p＝0.043)以上的MTX(見表2)。
在處死小鼠后，立即將腫瘤、肝臟、心臟、脾臟、膀胱、左腎和右腎、子宮、肺、胃、腸、腦和淋巴結(jié)切除并分析其總放射性。各組織的總放射性通過將100-400毫克組織在22℃下溶解在3-6毫升OptiSolv(ACC，墨爾本，澳大利亞)36h而被測(cè)定。溶解完成后，組織中的放射性在加入10毫升的HiSafeIII閃爍體后被計(jì)數(shù)。同樣為了克服化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光，根據(jù)樣品來源在3、7或20天的時(shí)間內(nèi)在Wallac1410β-計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)2min。在計(jì)數(shù)之間的時(shí)間中，樣品儲(chǔ)存在室溫黑暗中。所有計(jì)算都在除去所有化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光的穩(wěn)定的樣品上進(jìn)行。數(shù)字表示中值±SEM(n＝8)。
確定代謝活性器官如肝臟、脾臟和腎臟不經(jīng)歷高水平的藥物靶向很重要，這些器官的高水平的藥物靶向能抵銷增加的腫瘤靶向的任何積極方面。表2列出了在各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)上各組織的甲氨蝶呤的吸收。
利用Mann-Whitney佚和檢驗(yàn)和斯氏t-檢驗(yàn)，當(dāng)MTX和HA聯(lián)合注射時(shí)，MTX濃度/克組織沒有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異。由于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物數(shù)目少，所以如果有一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)重疊，Mann-Whitney檢驗(yàn)就在統(tǒng)計(jì)意義上變得無效，但在肝臟、子宮和腸中可以觀察到明確的趨勢(shì)。
在肝臟中，當(dāng)MTX與HA組合時(shí)，MTX的吸收看來有短期增加，如圖7所示。
在30min和1h，肝臟分別含有MTX濃度中值的65％和26％的增加。在2h時(shí)，與治療無關(guān)，沒有觀察到肝臟中的MTX的量的差別。在4h后，令人感興趣的趨勢(shì)變得明顯，當(dāng)MTX與HA聯(lián)合注射時(shí)，在肝臟中發(fā)現(xiàn)更少的MTX(4h68％以下的MTX以及8h75％以下的MTX)，如圖8所示。
在腸中具有明確的趨勢(shì)，HA和MTX的組合導(dǎo)致每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上降低的藥物吸收，如圖9所示。
將腸充分勻漿，接著將約400毫克組織在22℃下在3-6毫升OptiSolv中溶解24h，接著加入10毫升Hisafe-3閃爍體。為了克服化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光，根據(jù)樣品來源在3、7或20天的時(shí)間內(nèi)在Wallac 1410β-計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)2min。在計(jì)數(shù)之間的時(shí)間中，樣品儲(chǔ)存在室溫黑暗中。所有計(jì)算都在除去所有化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光的穩(wěn)定的樣品上進(jìn)行。
數(shù)字表示中值±SEM(n＝8)。匹配對(duì)用非參數(shù)隨機(jī)化檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)證明HA的聯(lián)合給予顯著降低藥物排泄到胃腸道中(p＝0.031，一尾檢驗(yàn))。
MTX濃度的下降在43-67％的范圍內(nèi)。匹配對(duì)非參數(shù)隨機(jī)化檢驗(yàn)顯示HA的聯(lián)合給予顯著降低藥物排泄到胃腸道中(p＝0.031，一尾檢驗(yàn))。
在肺中，當(dāng)與HA聯(lián)合給予時(shí)，在4h MTX顯著地較少存在，其中值下降52％(p＝0.014)。然而，在其它時(shí)間點(diǎn)上沒有顯示差別，因此這一觀察的意義仍不確定。
在脾臟、子宮、腦、心臟、淋巴結(jié)、胃和腎沒有測(cè)到可觀察的變化趨勢(shì)。
甲氨蝶呤的HA靶向于腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)理有2個(gè)(圖10)。
當(dāng)HA和MTX組合時(shí)有顯著的靶向作用(圖7)。腫瘤中藥物的存留的最大相對(duì)增加在0.5h(平均增加24％)、1h(平均增加30％)、2h(平均增加119％)時(shí)觀察到，而在4h和8h增加可忽略不計(jì)。由于樣品數(shù)量小以及數(shù)據(jù)的非參數(shù)分布，使用Mann-Whitney佚和檢驗(yàn)，顯示當(dāng)HA被聯(lián)合注射時(shí)腫瘤中藥物吸收的顯著增加。在1h統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性是p＝0.021，在2h時(shí)，p＝0.050。其它時(shí)間點(diǎn)上不顯示統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異，但是當(dāng)與HA聯(lián)合給予時(shí)，MTX濃度/克腫瘤的趨勢(shì)一致地更大。
圖7所示的數(shù)據(jù)明確表明與HA聯(lián)合給予在注射后30min內(nèi)顯著增加腫瘤對(duì)MTX的吸收。而且，在隨后的腫瘤中藥物濃度的下降期間，聯(lián)合給予也使得腫瘤中藥物濃度維持在顯著較高的水平。通過非參數(shù)檢驗(yàn)，在1h，差異在p＝0.021(n1＝8，n2＝8)顯著，在2h，p＝0.05(n1＝8，n2＝8)差異顯著。
含有俘獲的MTX的HA與受體結(jié)合(CD44和/或I-CAM-1)并通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而被內(nèi)在化，從而將藥物釋放到腫瘤細(xì)胞中。
HA分子網(wǎng)絡(luò)將作為向外擴(kuò)散的障礙物，這樣在HA結(jié)合到受體(CD44、RHAMM和/或ICAM-1)上后，所攜帶的MTX能夠擴(kuò)散到腫瘤細(xì)胞中。因?yàn)楸籋A基質(zhì)保留在分子表面上，MTX具有比通常用于將MTX轉(zhuǎn)運(yùn)到在下面的細(xì)胞中增加的有效性。
副作用和藥物分布在所期望的活性位點(diǎn)之外也可被其與HA締合影響。例如，HA一般通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞吸收和肝臟(80-90％)、腎(10％)、脾臟和骨髓中的分解代謝而從血流中清除，其中在后兩個(gè)位置具有一些小的變異。正如所預(yù)期的，HA至少在很短的時(shí)間內(nèi)似乎增加藥物的肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)。在30min和1h，肝臟的MTX濃度分別表現(xiàn)出中值增加65％和26％。在2h，不管治療與否，在肝臟中沒有觀察到MTX的量的差別。在4h后，令人感興趣的趨勢(shì)變得明顯，即當(dāng)MTX與HA聯(lián)合注射時(shí)在肝臟中發(fā)現(xiàn)較少的MTX(4h68％以下的MTX，8h75％以下的MTX)。靜脈注射給后，MTX廣泛分布在體液中，并能在肝臟中存留數(shù)月(McEvoy，1988)；因此當(dāng)與HA聯(lián)合注射時(shí)在4和8h肝臟中下降的MTX濃度中值表明在藥代動(dòng)力學(xué)清除途徑中改變的平衡?？紤]到HA在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)中快速代謝，必然的結(jié)果是與HA共同內(nèi)在化的MTX將在肝臟竇狀腺襯細(xì)胞內(nèi)釋放，在那里它或者擴(kuò)散入肝細(xì)胞以被分泌入膽汁中并接著進(jìn)入胃腸道，或者返回到循環(huán)體系進(jìn)一步分布到體液中并泌尿排泄，或者兩者均采用。
短期肝臟靶向可能具有治療優(yōu)勢(shì)。在肝轉(zhuǎn)移的情況中快速高度暴露于MTX可能是有益的，并且由于觀察到靶向僅有1h，這將抵銷任何長期毒性問題。肝臟靶向可以和需要生物活化的藥物一起使用，例如絲裂霉素C、多柔比星，其中藥物/HA混合物將靶向于LEC。當(dāng)無活性的藥物濃縮在LEC中，它將能夠擴(kuò)散到肝細(xì)胞中而被活化，這樣為活化靶向機(jī)理。
MTX毒性的主要位點(diǎn)之一是胃腸道。MTX和HA聯(lián)合給予顯著減少了轉(zhuǎn)運(yùn)到胃腸道中的藥物?？赡苡袔追N機(jī)理與腸中MTX濃度的下降有關(guān)。
甲氨蝶呤是非常小的分子，預(yù)期它將正常地穿過多數(shù)毛細(xì)血管壁，而與HA締合將大大地降低它這一途徑的通過。
HA在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞中的快速降解導(dǎo)致MTX快速釋放到肝臟并回到血流中，這樣它將經(jīng)歷增加的腎臟清除，如在1h所示，50％以上的MTX在MTX/HA制劑的小鼠泌尿排泄。
從身體中最終清除MTX的主要途徑是泌尿排泄。帶有HA的藥物在腎中的含量似乎很少增加，但我們根據(jù)其它證據(jù)相信HA被腎臟很快吸收并分解代謝，這樣它的存留時(shí)間將很短，并且所締合的藥物將很快釋放到尿中。結(jié)論這里報(bào)告的結(jié)果代表臨床前研究的第一個(gè)階段，檢驗(yàn)以下論題與透明質(zhì)酸聯(lián)合給予治療藥物將能夠?qū)崿F(xiàn)它們的選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)到所期望的病理組織靶上；這樣在那個(gè)位點(diǎn)上獲得更高更有效的濃度。在這一情況中，甲氨蝶呤，一種廣泛用于目前人乳腺癌和其它人惡性腫瘤以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方案中的細(xì)胞毒性藥，已經(jīng)通過和透明質(zhì)酸一起或不和透明質(zhì)酸一起靜脈注射的途徑被研究。
我們已發(fā)現(xiàn)裸鼠模型是研究在活的主體中人乳腺癌的特別合適的模型，并解決了在使用HA來引導(dǎo)治療藥物到疾病組織的位置的一些基本問題，這樣加強(qiáng)了它們的有益作用。我們已獲得了用小分子量藥物的結(jié)果，該藥物沒有與HA締合的特定形式，表明當(dāng)HA注射到血流中時(shí)，它仍能轉(zhuǎn)運(yùn)更多量的這樣的藥物到病理組織去。該研究表明在體內(nèi)條件下，MTX被HA充分保留以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)到人乳腺癌的顯著增強(qiáng)，同時(shí)也可能地降低了不期望的胃腸道毒性的副作用。實(shí)施例3紫杉醇/透明質(zhì)酸藥物組合物的制備和注射已經(jīng)建立了用于HA/紫杉醇的裸鼠模型的有效性后，現(xiàn)在它可被用來測(cè)試其它化療的有效性。由于紫杉醇(也稱他克唑)的治療意義，決定使用紫杉醇。
紫杉醇從短葉紫杉Taxus brevifolia中分離而得(Wani等，1971)，它對(duì)于晚期卵巢癌和乳腺癌有臨床活性(Rownisky等，1990；McGuire等，1989)，現(xiàn)在它正進(jìn)行治療多種其它癌癥的臨床試驗(yàn)。然而與紫杉醇相關(guān)的主要問題是它的特別高的親脂性和作為結(jié)果的差的水溶性。解決該問題的嘗試是紫杉醇類似物和前藥的合成以及設(shè)計(jì)安全和生物相容的配方的廣泛的嘗試。至今沒有任何前藥表現(xiàn)出能進(jìn)行臨床開發(fā)的充分的穩(wěn)定性、溶解性或活性(Mathew等，1992；Vyas等，1993)。然而，半合成紫杉烷比紫杉醇表現(xiàn)出更大的溶解性和效力(Bissery等，1991)，并且一種形式泰索帝已進(jìn)入人體試驗(yàn)(Bisset等，1993)。
用于靜脈注射的紫杉醇的目前的臨床配方使用1∶1(v/v)比例的乙醇和聚乙二醇類化合物EL，其藥量為6毫克/毫升。聚乙二醇類化合物EL實(shí)際上是聚乙氧基化蓖麻油，一種澄清、油狀粘性的黃色表面活性劑。穩(wěn)定性研究表明原始配方在4℃時(shí)保存期為5年。制劑在使用前用0.9％鹽水或5％葡萄糖稀釋至濃度為0.3-1.2毫克/毫升，在這些條件下該物質(zhì)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性約為27h。然而，載體稀釋到這些水平可能產(chǎn)生過飽和溶液(Adams等，1993)，如果不按照所給的指導(dǎo)使用，其可能傾向于產(chǎn)生沉淀。因此在給予時(shí)需要內(nèi)嵌的濾器作為阻止顆粒物進(jìn)入的安全措施。還推薦稀釋的紫杉醇溶液在制備24h內(nèi)使用?；谏鲜鲆蛩赜绊?，也觀察到溶液輕微渾濁，并被歸因于聚乙二醇類化合物從輸注袋和管中萃取增塑劑(Waugh等，1991)。
除了前面提到的物理不穩(wěn)定性問題，聚乙二醇類化合物的最顯著的問題是它被報(bào)道具有藥理活性。多種藥物使用聚乙二醇類化合物EL給予，包括環(huán)孢菌素、他克莫司和替尼泊苷。然而，和紫杉醇聯(lián)合給予的聚乙二醇類化合物EL的劑量比和任何其它市售藥物聯(lián)合給予的都要高。聚乙二醇類化合物已被觀察到引起嚴(yán)重的或致死的超敏反應(yīng)事件。載體毒性也很大程度對(duì)在將紫杉醇快速輸注到動(dòng)物或人體中時(shí)觀察到的致死的或威脅生命的過敏反應(yīng)負(fù)有責(zé)任。(Dye和Watkins，1980；Lorenz等，1977；Weiss等，1990)。
制備紫杉醇的儲(chǔ)備溶液并根據(jù)每只小鼠的體重制備單獨(dú)的注射液。
將干燥的HA(Mr8.9×105k Da型)加入到一份24.5毫克/毫升的紫杉醇儲(chǔ)備溶液中并渦旋過夜溶解，得到最終濃度為21毫克/毫升。為了確定無菌，加入慶大霉素至濃度為50微克/毫升并在4℃保溫過夜。在加入[3H]紫杉醇后，HA/紫杉醇儲(chǔ)備混合物用注射級(jí)氯化鈉稀釋到注射濃度。根據(jù)小鼠體重單獨(dú)地制備注射液，以在50微升中注入15毫克/千克紫杉醇和12.5毫克/千克HA。當(dāng)這種量的HA注入身體后，在試驗(yàn)期間觀察飽和動(dòng)力學(xué)(Fraser等，1983)。
為了確保HA在制備紫杉醇/HA注射混合物中保持其分子量，注射溶液在ephacryl S-1000大小排阻凝膠(Pharmacia，烏普薩拉，瑞典)上分析，柱規(guī)格為1.6厘米×70厘米，樣品量為2毫升，流速為18毫升/h，流份為2毫升。圖4顯示在混合過程中HA保持其分子量。
小鼠被隨機(jī)分成2組，每組40只。組1只接受紫杉醇，組2接受紫杉醇/HA組合治療。動(dòng)物被單獨(dú)放到注射箱中，經(jīng)尾靜脈給予注射液。氚代紫杉醇(平均注射的每分鐘衰變(dpm)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)19159146±1336819)在各注射液中被注入。小鼠單獨(dú)放在柔軟、不可濕潤的塑料圍欄中以收集尿樣。在注射30min、1h、2h、4h或8h后，腹膜內(nèi)注射0.1毫升戊巴比妥(Glaxo，Australia Pty.Ltd.，墨爾本，澳大利亞)將小鼠麻醉，并從心臟或大血管用針和注射器采集血樣。采集血樣后，通過頸部扭斷處死動(dòng)物。
血樣轉(zhuǎn)移到涂有EDTA的玻璃試管中，通過在14000gav下離心10min制備血漿。在用100微升30％v/v過氧化氫脫色并加入3毫升HiSafeII閃爍體后在50微升等份試樣中計(jì)數(shù)放射性。為了克服化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光，根據(jù)樣品來源在3、7或20天的時(shí)間內(nèi)，在Wallac 1410β計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)2min。在計(jì)數(shù)之間的時(shí)間中，樣品儲(chǔ)存在室溫黑暗中。所有計(jì)算都在除去化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光的穩(wěn)定的樣品上進(jìn)行。
為了測(cè)定注射的紫杉醇在血漿中的百分比，需要使用以下標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算每只小鼠的總血漿體積(毫升)小鼠質(zhì)量(g)×小鼠血液體積(0.07)×血液中的血漿比例(0.59)然后計(jì)算血漿中注射的紫杉醇的百分比 ＝％血漿中注射的紫杉醇為了確保注入到血流中的紫杉醇的精確定量，切開在尾靜脈上的注射位點(diǎn)并定量紫杉醇。殘留在注射位點(diǎn)的紫杉醇的平均百分比也被測(cè)定。注入血流中的紫杉醇量(可分布到組織和腫瘤中的紫杉醇)可如下計(jì)算 注入血液中的紫杉醇量此后將被稱為“注射劑量”。
為了進(jìn)行樣品群間的精確比較并歸一化器官及腫瘤質(zhì)量的輕微偏差，在身體器官、腫瘤和體液中的MTX濃度被表示為注射劑量/克組織的％。
計(jì)算殘留在注射位點(diǎn)的紫杉醇注射液的平均百分比。為了歸一化這種偏差，在腫瘤和組織中發(fā)現(xiàn)的dpm百分?jǐn)?shù)被計(jì)算作注射的dpm減去殘留在注射位點(diǎn)的dpm。該量被稱為可利用的dpm或可利用的紫杉醇。
當(dāng)可能時(shí)，用注射器和針從不可濕潤的塑料圍欄中采集尿樣。通過在14000gav下離心10min使尿樣澄清。在向8-30微升樣品中加入3毫升HiSafeII閃爍體到后測(cè)定其放射性含量。
在處死小鼠后，立即將腫瘤、肝臟、心臟、脾臟、膀胱、左腎和右腎、子宮、肺、胃、腸、腦和淋巴結(jié)切除并分析總放射性。各組織的總放射性通過將100-400毫克組織在22℃下溶解在3-6毫升OptiSolv(ACC，墨爾本，澳大利亞)36h而被測(cè)定。溶解完成后，組織中的放射性在加入10毫升HiSafeIII閃爍體后而被測(cè)定。同樣為了克服化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光，根據(jù)樣品來源在3、7或20天的時(shí)間內(nèi)在Wallac1410β-計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)2min。在計(jì)數(shù)之間的時(shí)間中，樣品儲(chǔ)存在室溫黑暗中。所有計(jì)算都在除去所有化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光的穩(wěn)定的樣品上進(jìn)行。實(shí)施例4 5-氟尿嘧啶和HA的使用介紹5-氟尿嘧啶(5-FU)是常用于治療乳腺癌和胃腸道癌的抗代謝物(Piper和Fox，1982)。5-FU在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成其核苷活性形式，在細(xì)胞內(nèi)干擾DNA和RNA的合成。藥物在體內(nèi)通過兩種機(jī)理作用(i)FdUMP緊密結(jié)合到胸苷酸合成酶，阻止胸苷酸形成，而胸苷酸是脫氧胸苷三磷酸(dTTP)的必需前體，dTTP是DNA合成所需的四種脫氧核糖核苷之一。由這種抑制引起的胸腺嘧啶較少狀態(tài)對(duì)活性的分裂細(xì)胞是毒性的(Pinedo和Peters，1988)。
(ii)在第二種方式中5-FU的功能是將FUTP引入到RNA干擾RNA功能。將Fdurd和5-FU引入到RNA而導(dǎo)致的胸苷酸合成酶的抑制能夠引起對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。5-FU暴露的濃度和時(shí)間都是細(xì)胞毒性的重要決定因素。RNA指導(dǎo)的作用可能對(duì)延長暴露時(shí)間起主要作用，而DNA指導(dǎo)的作用可能在S期的細(xì)胞短期暴露期間更為重要。
幾項(xiàng)研究已檢驗(yàn)了HA作為抗癌藥物的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的用途。Coradini等(1999)將丁酸鈉共價(jià)結(jié)合到HA上來測(cè)定該HA/丁酸鈉組合是否增加體外乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的吸收。該研究表明HA作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體的作用機(jī)理可能涉及HA-丁酸鹽-酯衍生物被帶到CD44受體上。HA/藥物復(fù)合物被內(nèi)在化，接著HA/藥物復(fù)合物發(fā)生細(xì)胞質(zhì)水解，而后釋放丁酸鹽，丁酸鹽發(fā)揮抗增殖作用。進(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)研究，此研究將絲裂霉素C共價(jià)結(jié)合到HA上，作為治療鼠的Lewis肺異種移植物的手段(Akima等，1996)。發(fā)現(xiàn)HA-MMC復(fù)合物在0.01毫克/千克的低劑量下導(dǎo)致抗腫瘤活性，其中唯一的藥物絲裂霉素C并不顯示抗腫瘤活性。實(shí)施例5在人乳腺癌細(xì)胞中5-FU和HA協(xié)同作用的研究人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468、MDA-MB-435和MDA-MB-231根據(jù)HA結(jié)和親合力(Culty等，1994)和HA受體CD44和RHAMM的表達(dá)(Wang等，1996)而被選擇。該細(xì)胞系的特點(diǎn)概述列于表3。表3透明質(zhì)酸結(jié)合和人乳腺癌細(xì)胞系的受體表達(dá)
aCulty等，1994bWang等，1996細(xì)胞系MDA-MB-468，MDA-MB-435和MDA-MB-231如實(shí)施例1所述常規(guī)培養(yǎng)。
從表4可見當(dāng)與未治療的細(xì)胞相比時(shí)，生長在含有0納摩爾/升5-FU+100納摩爾/升HA的培養(yǎng)基中的乳腺癌細(xì)胞并不顯示具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性的增殖或細(xì)胞毒性作用。表4透明質(zhì)酸對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)通過使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)和參數(shù)斯氏t-檢驗(yàn)進(jìn)行。因此所有結(jié)果都以0納摩爾/升5-FU/0納摩爾/升HA細(xì)胞數(shù)的百分比表示。在細(xì)胞系間發(fā)現(xiàn)了生長模式的顯著性差異，例如MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞表現(xiàn)很差的平板效率，其中在施加試驗(yàn)培養(yǎng)基前存在許多懸浮的細(xì)胞。MDA-MB-435細(xì)胞系表現(xiàn)高的平板效率和很快的生長速率。
當(dāng)HA與5-FU組合時(shí)，在MDA-MB-468細(xì)胞系中觀察到了協(xié)同細(xì)胞毒性作用，但在MDA-MB-231或MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系中沒有。如圖11所示。單獨(dú)的5-FU的IC50大于50微摩爾/升，但當(dāng)與HA組合時(shí)，IC50為40納摩爾/升，藥物劑量下降1250倍。
體外試驗(yàn)的結(jié)果證明當(dāng)在HA存在下將5-FU施加到乳腺癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞殺傷力增強(qiáng)。MDA-MB-468細(xì)胞對(duì)5-FU/HA治療最為敏感，其IC50從＞50微摩爾/升下降到40納摩爾/升，而MDA-MB-231和MDA-MB-435均不被5-FU/HA組合顯著影響。所有乳腺癌細(xì)胞系都表達(dá)高水平的CD44受體，其中MDA-MB-468(60-80％)，MDA-MB-231(40-60％)以及MDA-MB-435(40-60％)，如Culty等所測(cè)定(1994)。已證明用于這些試驗(yàn)的三種細(xì)胞系能夠降解HA，這暗示著腫瘤細(xì)胞中CD44的功能可能是介導(dǎo)HA的降解(Culty等，1994)。
要考慮的另-個(gè)因素是細(xì)胞在前的暴露于化療劑。在癌細(xì)胞系從患者分離前，癌癥患者經(jīng)常經(jīng)過了化療或放療，這可導(dǎo)致腫瘤含有治療抗性細(xì)胞。在MDA-MB-435和MDA-MB-231的情況中，細(xì)胞系來自其的患者以前都曾接受過5-FU治療(Cailleau等，1974)。由于癌細(xì)胞含有幾種適用的機(jī)理來克服藥物的細(xì)胞毒性，很有可能在治療后仍存活的腫瘤物質(zhì)是耐5-FU的，因而改變細(xì)胞對(duì)藥物的體外敏感性。
為了從小鼠的體外治療數(shù)據(jù)推知相應(yīng)的人的數(shù)據(jù)，仔細(xì)地開發(fā)試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮O(shè)計(jì)。為了明確表明5-FU/HA輔助治療對(duì)人乳腺癌異種移植物的靶向和治療功效，測(cè)定了以下因素人乳腺癌腫瘤在良好認(rèn)證的Walter和Eliza Hall Institute的裸鼠系上建立，該裸鼠系是這種研究的被廣泛接受的模型，它避免了對(duì)同種異體細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
在裸鼠和人體上的5-FU的藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)比數(shù)據(jù)已經(jīng)出版(Inaba等，1988)，它們用于本研究的設(shè)計(jì)，以盡可能近似地模擬人的治療劑量。
主要目的是確證建立在這些小鼠中的腫瘤的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)行為與在它們的天然人主體上腫瘤的行為類似。在實(shí)現(xiàn)該目的的同時(shí)，我們還表明小鼠中的腫瘤細(xì)胞是人源的，并且它們表現(xiàn)與HA受體如RHAMM和CD44的高度相關(guān)性。實(shí)施例6HA和5-FU溶液的制備HA儲(chǔ)備溶液(10微摩爾/升，7毫克/毫升)通過將干燥的HA(Mr7×105kDa型)溶解在0.9％w/v無熱原注射級(jí)氯化鈉中而制備。為確保溶液的均一性，HA在4℃過夜溶解，接著徹底渦旋。為確保在儲(chǔ)備溶液制備過程中HA保持其分子量，溶液在Sephacryl S-1000大小排阻凝膠上分析，柱規(guī)格為1.6厘米×70厘米，樣品體積為2毫升，流速為18毫升/h，流份為2毫升。HA最終使用濃度為100納摩爾/升，所有稀釋均在合適的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行。
5-FU的儲(chǔ)備溶液通過將5-FU溶解在0.1摩爾/升氫氧化鈉中并且其濃度用0.9％w/v無熱原注射級(jí)氯化鈉調(diào)至20毫克/毫升而制備。儲(chǔ)備溶液在加入[3H]-FU并用注射級(jí)氯化鈉稀釋到注射濃度前用0.22微米濾器過濾以確保無菌。根據(jù)各小鼠的體重制備單獨(dú)的注射液，目的是在50微升中注入30毫克/千克的5-FU(相當(dāng)于平均體重為60千克的人的治療劑量為10.5毫克/千克；Inaba等，1988)。將無熱原的HA儲(chǔ)備溶液(10毫克/毫升；Mr7×105Da型)加入到20毫克/毫升5-FU儲(chǔ)備溶液中并渦旋保溫過夜，到HA最終濃度相當(dāng)于12.5毫克/千克小鼠質(zhì)量。根據(jù)小鼠體重單獨(dú)制備注射液，以在50微升中注入30毫克/千克5-FU和12.5毫克/千克HA。當(dāng)這樣量的HA注入體內(nèi)后，在試驗(yàn)期間觀察飽和動(dòng)力學(xué)(Fraser等，1983)。為確保在注射混合物制備期間HA維持其分子量，注射溶液在SephacrylS-1000大小排阻凝膠上分析，柱規(guī)格為1.6厘米×70厘米，樣品體積為2毫升，流速為18毫升/h，流份為2毫升。透明質(zhì)酸在柱流份中通過糖醛酸分析而被測(cè)定。
糖醛酸分析用于定量測(cè)定從凝膠過濾色譜過程中收集的流份中的透明質(zhì)酸。接著轉(zhuǎn)移各流份的25微升等份試樣到96孔板上。然后向這些流份中加入250微升咔唑試劑(3M咔唑/0.025摩爾/升硼酸鹽的H2SO4溶液)。96孔板在80℃保溫45-60min。使用帶有550納米濾光片的Dynatech MR7000平板讀數(shù)器來讀96孔板。當(dāng)吸光度大于3倍背景吸收值的標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)，吸光度被認(rèn)為是顯著性的。背景通過在V0和Vt前后取相同數(shù)目的樣品點(diǎn)來計(jì)算，其中所取的平均數(shù)目為16(Fraser等，1988)。
HA和5-FU的配方(在0.5％氯化鈉中的10毫克/毫升HA和20毫克/毫升5-FU，pH8.9)并未顯示HA分子量的降解效應(yīng)。大小排阻凝膠色譜分析表明保持700000Da的模態(tài)分子量。實(shí)施例7藥物細(xì)胞毒性分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)體外藥物滴定試驗(yàn)中，合乎需要的是使用與經(jīng)靜脈給予后血漿中達(dá)到的濃度相似的濃度。當(dāng)5-FU以10.5毫克/千克(400毫克/米2)通過靜脈內(nèi)途徑(iv)治療給予時(shí)，在30min內(nèi)血漿濃度峰值達(dá)到8克/毫升(61微摩爾/升，Kubo，1990)。根據(jù)這些體內(nèi)血漿濃度，選擇以下藥物濃度0、1、5、10、20、50、100微摩爾/升5-FU±100納摩爾/升HA。細(xì)胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-435如實(shí)施例4到5中所述生長。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到鋪滿時(shí)，從瓶中的0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA中移出細(xì)胞。單細(xì)胞懸浮液用Coulter計(jì)數(shù)器(ZM1型)計(jì)數(shù)并且將細(xì)胞重懸浮到細(xì)胞特異性培養(yǎng)基中，至100000細(xì)胞/毫升。通過向每個(gè)孔加入0.5毫升細(xì)胞懸浮液將細(xì)胞涂到24孔板上(2厘米2表面積)，結(jié)果是50000細(xì)胞/孔。使培養(yǎng)物附著24h，在培養(yǎng)基被移出前，用HBSS洗滌單層細(xì)胞并施加測(cè)試培養(yǎng)基(5-FU+HA)。在測(cè)試培養(yǎng)基中生長4天后，培養(yǎng)物用HBSS洗滌，細(xì)胞通過用0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA而受胰蛋白酶作用被移出，并且用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。實(shí)施例8HA作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)與腫瘤靶向載體的確認(rèn)根據(jù)如實(shí)施例5到7所描述的體外試驗(yàn)中藥物敏感性的結(jié)果和HA受體CD44與RHAMM的表達(dá)，選擇人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468作為癌細(xì)胞接種體來產(chǎn)生任何裸鼠人體腫瘤異種移植物。細(xì)胞常規(guī)生長并如前面實(shí)施例5中所述而傳代培養(yǎng)。為了注射到小鼠體內(nèi)，細(xì)胞生長到100％鋪滿，在0.025％胰蛋白酶/0.01％EDTA溶液中受胰蛋白酶作用，在Beckman TJ-6臺(tái)式離心機(jī)中在400gav下離心10min來洗滌兩次，用ZM型Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并在無血清Leibovitz L-15培養(yǎng)基中重懸浮至1×108細(xì)胞/毫升。
6到8周大的無胸腺CBA/WEHI雌性裸鼠養(yǎng)在無特定病原的條件下，供給不受限制的無菌食物和水。每只小鼠接受50微升含有5×106個(gè)細(xì)胞的注射液。細(xì)胞用26規(guī)針注射到在第一個(gè)乳頭正下的乳脂墊中(Lamszus等，1997)。每周通過測(cè)定三個(gè)垂直直徑(d1d2d3)而進(jìn)行腫瘤測(cè)定。腫瘤體積用以下公式估算(1/6)π(d1d2d3)用5-FU±HA的治療在癌細(xì)胞接種約4-8周后開始。在各項(xiàng)研究中使用的小鼠的平均腫瘤大小列于表5中。表5 在各項(xiàng)研究開始時(shí)人乳腺癌腫瘤的概要
要建立乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468的腫瘤發(fā)生及其在注射入合適的動(dòng)物主體后產(chǎn)生腫瘤的能力，需要進(jìn)行病理學(xué)試驗(yàn)。腫瘤要是生理上有活力，新血管形成時(shí)必須的，其中毛細(xì)血管網(wǎng)為腫瘤提供營養(yǎng)物。血管形成、導(dǎo)管入侵、壞死、編程性細(xì)胞死亡的存在，高有絲分裂指數(shù)和核異常都是乳腺癌的特征。檢測(cè)蘇木精和曙紅染色的乳腺癌切片表明了所有這些特征，從而證實(shí)了動(dòng)物主體成功地保持了II級(jí)人乳腺癌。
在腫瘤引入后約8周，給予兩只帶有腫瘤的小鼠致死量的戊巴比妥。在處死小鼠的3min內(nèi)，手術(shù)移出腫瘤并立刻在10％緩沖的福爾馬林中固定12h。固定的腫瘤在一系列70-100％乙醇中過夜脫水，接著石蠟包埋，從其切下2-4微米的切片。將切片置于載玻片上，脫蠟，并放到水中。載玻片在PBS中洗滌×5min。嗜異性蛋白通過和10％胎牛血清保溫10min而被封閉，接著用PBS洗滌。在RT應(yīng)用檢測(cè)抗體60min。檢測(cè)抗血清或抗體是抗RHAMM、CD44H和CAE的。載玻片在PBS中洗滌3×5min，內(nèi)源過氧化物酶活性通過浸入0.3％H2O2的甲醇溶液20min而被阻斷。進(jìn)一步用PBS洗滌之后，過氧化物酶接合的豬抗兔二級(jí)抗血清在室溫下應(yīng)用60min，接著在PBS中洗滌3×5min。Sigma快3，3′-二氨基聯(lián)苯胺片劑(DAB)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書而被制備，并且在RT下應(yīng)用DAB溶液5-10min。這些載玻片在自來水中洗滌10min，用蘇木精復(fù)染色，脫水并制成標(biāo)本。
腫瘤的人源通過用人特異性的標(biāo)記物將腫瘤和周圍組織染色得到證實(shí)。CEA的存在清除地證明了腫瘤是人的，而由鼠主體的心血管系統(tǒng)供養(yǎng)。由于我們假設(shè)腫瘤靶向可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)在化或結(jié)合而發(fā)生，因此有必要建立HA受體，CD44和RHAMM的表達(dá)。表6列出了在人乳腺癌異種移植物上受體的表達(dá)程度。表6在生長在裸鼠中的人乳腺癌腫瘤上的HA受體的分布
腫瘤上表位表達(dá)的級(jí)別指數(shù)0％ -1-25％+26-50％ ++51-75％ +++76-100％ ++++實(shí)施例9 5-FU和HA在裸鼠模型中的使用將小鼠隨機(jī)分成兩組，每組25只。組1只接受[3H]5-FU，組2接受[3H]5-FU/HA的組合。經(jīng)尾靜脈定量注入藥物，注射器在注射前后被稱重。包含在30毫克/千克5-FU±12.5毫克/千克HA中的氚代5-FU(平均注射的dpm±SEM31313002±131348)在每次注射中注入。
為了確保注入血流中的[3H]5-FU的準(zhǔn)確定量，切開尾靜脈的注射位點(diǎn)并測(cè)定其中的[3H]5-FU含量。注入血流中的5-FU量(用于分布到組織和腫瘤的5-FU)如下計(jì)算 注入血流中的5-FU被稱為“注射劑量”。
為了在樣品群間進(jìn)行精確的比較并歸一化器官和腫瘤質(zhì)量的輕微偏差，身體器官、腫瘤和體液中的5-FU濃度以注射劑量/克組織的％表示。
小鼠單獨(dú)養(yǎng)在柔軟，不可濕潤的塑料圍欄中以收集尿樣。在注射后10min、20min、30min、1h或2h后，腹膜注射0.1毫升戊巴比妥將小鼠麻醉。
麻醉動(dòng)物后，從心臟或大血管用針和注射器采集血樣。血液收集到EDTA玻璃試管中，通過在14000gav下離心10min而制備血漿。在用100微升30％v/v過氧化氫脫色并加入3毫升HiSafeII閃爍體脫色后在50微升等份試樣中計(jì)數(shù)放射性。為了克服化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光，根據(jù)樣品來源，在3、7或20天的時(shí)間內(nèi)，在Wallac1410β計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)2min。在計(jì)數(shù)之間的時(shí)間中，樣品儲(chǔ)存在室溫黑暗中。所有計(jì)算都在化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光已消失的穩(wěn)定的樣品上進(jìn)行。為了測(cè)在血漿中注入的5-FU的百分比，需要計(jì)算每只小鼠的總血漿體積(毫升)。標(biāo)準(zhǔn)公式為小鼠質(zhì)量(g)×小鼠血液體積(0.07)×血液中血漿的比例(0.59)1血漿中注入的5-FU的百分比可通過下式計(jì)算
當(dāng)可能時(shí)，用注射器和針從不可濕潤的塑料圍欄中采集尿樣。通過在14000gav下離心10min使尿樣澄清。在向8-30微升樣品中加入3毫升HiSafeII閃爍體后測(cè)定其放射性含量。盡管精確定量每只小鼠產(chǎn)生的尿體積有技術(shù)困難，通過以下公式計(jì)算尿中注射的5-FU劑量的百分比 一旦血液采集后，小鼠就被頸部扭斷處死。小鼠處死后，立即將腫瘤、肝臟、心臟、脾臟、膀胱、左腎和右腎、子宮、肺、胃、腸、腦和淋巴結(jié)切除并分析總放射性。每個(gè)組織的總放射性通過將100-400毫克組織在22℃下溶解在3-6毫升OptiSolv 36h而被測(cè)定。溶解完成后，在加入10毫升HiSafeIII閃爍體后計(jì)數(shù)組織。樣品如前所述計(jì)數(shù)以避免化學(xué)發(fā)光。
如圖12所示，當(dāng)將HA和5-FU組合時(shí)，有顯著的靶向作用。藥物在腫瘤的保留的中最大相對(duì)增加在10min時(shí)觀察到，其中HA增強(qiáng)藥物吸收的系數(shù)是2.42(p＝0.001，斯氏t-檢驗(yàn))。在給予HA/5-FU 20min和30min后，也觀察到了腫瘤對(duì)5-FU的實(shí)現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)意義上顯著的增加，藥物吸收的增加分別為1.5和2倍(p＜0.001，斯氏t-檢驗(yàn))。其它時(shí)間點(diǎn)沒有表現(xiàn)單獨(dú)給予5-FU和將其與HA聯(lián)合注射間有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異。
確定代謝器官如肝臟、脾臟和腎臟并不經(jīng)歷高水平的藥物靶向很重要，這種藥物靶向能抵銷增加的腫瘤靶向的任何積極方面。表7列出了各組織在測(cè)試的不同時(shí)間點(diǎn)的[3H]5-FU的吸收。表7在帶有人乳腺癌異種移植物的裸鼠中透明質(zhì)酸對(duì)[3H]5-氟尿嘧啶的生物分布的影響 12點(diǎn)黑體代表HA的聯(lián)合給予顯著降低5-FU濃度的測(cè)量(斯氏t-檢驗(yàn))代表HA的聯(lián)合給予顯著升高5-FU濃度的測(cè)量(斯氏t-檢驗(yàn))圖13顯示HA的主要代謝器官是肝臟、淋巴結(jié)和脾臟，而5-FU大部分在肝臟中被代謝。
當(dāng)5-FU與HA聯(lián)合注射時(shí)，這些器官在5-FU吸收方面并不表現(xiàn)出顯著增加。然而，在與HA聯(lián)合給予后10min腎臟確實(shí)表現(xiàn)5-FU靶向的顯著增加(增加1.8倍，p＝0.004)。在這一點(diǎn)后，即使不是統(tǒng)計(jì)意義上顯著性的，該藥物吸收增加的趨勢(shì)一直持續(xù)到采樣階段結(jié)束。
膀胱、腸和骨髓并不顯示5-FU的吸收增加。在如子宮的組織中，在10min時(shí)有短期藥物吸收增加(增加1.8倍，p＝0.032)，但在其它時(shí)間點(diǎn)上沒有顯示差別，所以這一觀察的意義仍不確定。
在一個(gè)或兩個(gè)采樣點(diǎn)上，胃、腦和肺沒有顯示5-FU吸收的增加。然而，由于在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上動(dòng)物數(shù)目少(n＝5)，不可能證實(shí)統(tǒng)計(jì)意義的顯著性，即使如圖14A-C中所示可觀察到明確的趨勢(shì)。
在后來的取樣點(diǎn)1h和2h，觀察到心臟的5-FU的顯著下降，其中與HA聯(lián)合給予分別導(dǎo)致59％(p＝0.003)和53％(p＝0.021)的下降。
由于排尿速率的變化，不可能從每只小鼠上收集到尿樣；因此沒有收集到充足的尿樣來實(shí)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析。
當(dāng)5-FU和HA聯(lián)合注射時(shí)，5-FU在循環(huán)系統(tǒng)水平有早期下降(表7)。透明質(zhì)酸降低血漿中的5-FU55％(p＝0.001)。接受5-FU/HA的小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)血漿半衰期從28min改變?yōu)?6min，如圖15所示。實(shí)施例10小鼠治療方案的給藥人乳腺癌的最常用的治療方案是環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶，它們?cè)?8天循環(huán)中的第1天和第8天給予。在人乳腺癌中，初始治療方案是6個(gè)循環(huán)，其后重新評(píng)估患者的癥狀，因此我們通過對(duì)小鼠進(jìn)行6個(gè)循環(huán)(6個(gè)月)的長期療效研究和6個(gè)循環(huán)(6周)的短期療效研究來盡可能近似地模擬人治療方案?？紤]到小鼠的生命周期大約為2年，我們同時(shí)開始短期和長期治療方案，如表8所示。表8治療給藥方案
短期研究的小鼠被隨機(jī)分成7組，每組8只，長期研究的小鼠被隨機(jī)分成5組，每組8只(參考表8中的劑量和治療給藥方案)。
治療不超過6個(gè)月，因?yàn)橐炎C明化療超過6個(gè)月一般不會(huì)有更大的好處(Harris等，1992)。
在進(jìn)行長期研究的那天，如實(shí)施例8中所描述，稱重動(dòng)物并測(cè)定腫瘤體積。在6周研究中，每天稱重動(dòng)物并測(cè)定腫瘤體積。動(dòng)物單獨(dú)放在注射箱中，注射液經(jīng)尾靜脈給予。試驗(yàn)已證明緊張是患者對(duì)化療的反應(yīng)的主要因素(Shackney等，1978)，因此我們確保在每個(gè)籠中分配相同數(shù)目的小鼠，每個(gè)籠中動(dòng)物的數(shù)目根據(jù)試驗(yàn)階段在5到8的范圍內(nèi)變化。
當(dāng)動(dòng)物因疾病進(jìn)展程度加重而必須被處死或當(dāng)6個(gè)月(長期)或6周(短期)治療結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)終點(diǎn)出現(xiàn)。由于動(dòng)物倫理準(zhǔn)則，動(dòng)物由評(píng)估疾病進(jìn)展程度的獨(dú)立的動(dòng)物倫理官員每兩周監(jiān)測(cè)一次。如圖16所示，以下的標(biāo)準(zhǔn)用來決定動(dòng)物是否已經(jīng)到達(dá)必須死亡的試驗(yàn)終點(diǎn)1).動(dòng)物不吃或喝，并且體重急劇下降；2).腫瘤尺寸大于10％體重(畫面A)；3).腫瘤質(zhì)量大到動(dòng)物不能行動(dòng)(畫面B)。
在試驗(yàn)終點(diǎn)，動(dòng)物通過腹膜注射0.1毫升戊巴比妥(60毫克/毫升)麻醉，采集血液，接著扭斷脖頸處死動(dòng)物。
在6周研究結(jié)束時(shí)，測(cè)定腫瘤質(zhì)量，5-FU和5-FU/HA治療均比鹽水治療組有明顯小的腫瘤(p＝0.005)，如圖17。在5-FU和HA/5-FU治療組間腫瘤體積沒有顯著性差異，表明兩種治療表現(xiàn)出對(duì)原發(fā)腫瘤的相同功效。在鹽水組和HA組原發(fā)腫瘤體積間沒有觀察到統(tǒng)計(jì)意義上的差異。
處死小鼠后，立刻切除腫瘤、肝臟、脾臟、膀胱、左腎和右腎、子宮、肺、胃、腸、腦和淋巴結(jié)并放入4％用0.06摩爾/升，pH7.5的磷酸鹽緩沖的福爾馬林和1.0％w/v氯化十六烷基吡啶鎓中。組織在組織學(xué)分析前固定16-24h。固定的組織逐級(jí)脫水到100％乙醇，并在石蠟中包埋，從其取2-4微米切片放到玻璃顯微載玻片上。組織切片用蘇木精細(xì)胞核染色并用曙紅細(xì)胞質(zhì)染色，突出能表明治療毒性的病理特征。
采集每只小鼠的9到11個(gè)淋巴結(jié)，確保采集所有給腫瘤區(qū)導(dǎo)液的淋巴結(jié)。目前有兩種方法用來測(cè)定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移i)總器官結(jié)構(gòu)的常規(guī)蘇木精和曙紅染色ii)使用癌癥標(biāo)記物如癌胚抗原的免疫組織化學(xué)兩種轉(zhuǎn)移測(cè)定方法在本研究中都被使用。并非所有市售CEA抗體都與人乳腺癌細(xì)胞反應(yīng)，所以我們測(cè)試了5種不同抗體(DAKO，Amersham和KPL)的反應(yīng)性。
蘇木精和曙紅染色的淋巴結(jié)由P.Allen博士(有授權(quán)證書的病理學(xué)家)檢測(cè)，其中每個(gè)淋巴結(jié)都經(jīng)顯微檢測(cè)是否存在腫瘤細(xì)胞。CEA免疫染色的淋巴結(jié)被顯微檢測(cè)，其中任何正染色的淋巴結(jié)被計(jì)數(shù)并被認(rèn)為是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的。
腫瘤體積每天或每周通過卡鉗測(cè)量而被監(jiān)測(cè)，并且腫瘤體積如前面實(shí)施例8所述而計(jì)算。
5-FU最常規(guī)的毒性之一是在胃腸道中，在那里可能發(fā)生出血性腸炎和腸穿孔(Martindale，1993)。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物胃腸道紊亂如腹瀉，并且每周監(jiān)測(cè)更嚴(yán)重的毒性表現(xiàn)如體重減輕。體重減輕通過減去腫瘤重量而估算的凈體重來監(jiān)測(cè)，腫瘤重量以1克×腫瘤體積(厘米3)來計(jì)算，如Shibamoto等，1996中所述。為了表明動(dòng)物體重的任何變化，將動(dòng)物體重歸一化至治療開始時(shí)的體重 無論何種治療方案，沒有在任何小鼠上觀察到每日胃腸道紊亂如腹瀉。每種治療方案的嚴(yán)重的胃腸道毒性通過使用體重(不包括腫瘤重量)減輕作為指標(biāo)而被估計(jì)。在每只動(dòng)物死亡時(shí)，體重變化的百分比如前所述計(jì)算。鹽水、HA、5-FU治療組與5-FU/HA治療組相比時(shí)，歸一化的體重有統(tǒng)計(jì)意義的顯著性差異(圖18)。接受5-FU/HA輔助治療的小鼠在整個(gè)治療過程中，與未治療組相比，顯示體重有16％的增加(斯氏t-檢驗(yàn)，p＝0.025)，未治療組的體重凈增加為2％。
癌胚抗原(CEA)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)與傳統(tǒng)的診斷病理學(xué)的組合提供淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的極佳的定量方法。小鼠平均含有15-19個(gè)淋巴結(jié)(Lamszus等，1997)，因此本研究檢測(cè)了動(dòng)物大約60-70％的淋巴結(jié)。接著進(jìn)行仔細(xì)的過程以確保所有給乳脂墊和胸部導(dǎo)液的淋巴結(jié)都被切除并測(cè)定。如表9A中所示，所有動(dòng)物都表現(xiàn)出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。表9A 5-FU/HA輔助治療對(duì)裸鼠中人乳腺癌異種移植物的生長和轉(zhuǎn)移的影響6周研究
圖19A顯示淋巴結(jié)累及(每只動(dòng)物轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)的數(shù)目)的百分比受到5-FU、5-FU/HA和HA治療的很大影響，而鹽水組顯示淋巴結(jié)累及數(shù)目增加6倍。HA再-次證明它具有治療價(jià)值。
當(dāng)在研究結(jié)束解剖動(dòng)物時(shí)，每一組織都經(jīng)顯微鏡和肉眼檢查其腫瘤小結(jié)。除了接受HA/5-FU或HA治療的小鼠外，在頸部周圍和鄰近原發(fā)腫瘤的腋下區(qū)觀察到了新的腫瘤。將HA引入到治療方案中抑制新腫瘤的形成，如圖19B所示。
無論何種治療，在患者總體存活上沒有顯著性差異(表9A)，其中所有組的動(dòng)物均完成了治療方案。
與5-FU治療有關(guān)的主要毒性之一是骨髓抑制以及作為結(jié)果的白細(xì)胞下降，因而需要評(píng)估任何與治療相關(guān)的血液毒性。在將動(dòng)物麻醉后，用針和注射器從心臟或大血管采集血液。通過在小鼠韌度鹽水(mouse tenacity saline)(M)中稀釋小鼠血液1/10并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上來估計(jì)白細(xì)胞數(shù)目。通過計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞而進(jìn)行不同的血液計(jì)數(shù)。血細(xì)胞部分總體的總估算與出版的小鼠血液數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
為確保治療不誘導(dǎo)器官萎縮或增大，在死后檢查期間移出器官并稱重。計(jì)算各器官的質(zhì)量占總凈體重的百分比，并且與鹽水組(組1)的器官質(zhì)量比較。實(shí)施例11長期治療6月治療方案當(dāng)本研究仍在進(jìn)行中時(shí)，產(chǎn)生著有意義的數(shù)據(jù)。
TDT是腫瘤的質(zhì)量或細(xì)胞數(shù)目加倍所需的時(shí)間(天)，它是腫瘤生長的參數(shù)，它易于測(cè)定并能很容易地在理論上與臨床腫瘤行為相聯(lián)系(Shackney等，1978)。通過監(jiān)測(cè)腫瘤加倍時(shí)間，經(jīng)?？赡茉u(píng)估腫瘤化療的反應(yīng)，因?yàn)榫徛L的腫瘤傾向于對(duì)化療反應(yīng)差(Schabel，1975)。
每種治療的腫瘤加倍時(shí)間列于表9B。表9B 5-FU/HA輔助治療對(duì)裸鼠中人乳腺癌異種移植物的生長和轉(zhuǎn)移的影響6月研究
在5-FU/HA和5-FU治療間TDT沒有顯著性差異。如6周研究所示，給予HA也顯示對(duì)原發(fā)腫瘤的治療作用，其TDT為26±1.75天，而鹽水組為13±4天。在給予5-FU前24h給予HA看來抵消與腫瘤延遲生長有關(guān)的5-FU的任何治療價(jià)值。
在監(jiān)測(cè)腫瘤治療反應(yīng)和進(jìn)展中，腫瘤質(zhì)量和體積是有用的參數(shù)，但它們并不最終證明由治療產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用。我們希望確證HA/5-FU治療是否殺死更多的腫瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的位置。垂死的細(xì)胞可通過以下方法得到病理學(xué)顯示i).細(xì)胞核解體(編程性細(xì)胞死亡)ii).細(xì)胞溶胞(壞死)將整個(gè)腫瘤圖像掃描到計(jì)算總腫瘤面積的MCID計(jì)算機(jī)中定量計(jì)算垂死細(xì)胞的數(shù)目。具有碎裂細(xì)胞核的細(xì)胞或溶解的細(xì)胞被描繪和掃描，接著將這些面積數(shù)字化，從而計(jì)算垂死細(xì)胞的準(zhǔn)確面積。對(duì)垂死細(xì)胞有貢獻(xiàn)的腫瘤的百分比可如下計(jì)算 能生存的細(xì)胞比垂死或死細(xì)胞含有更多的水，因此通過測(cè)定干腫瘤質(zhì)量對(duì)濕腫瘤質(zhì)量的比率就有可能估計(jì)能生存的對(duì)不能生存的總面積。將腫瘤兩側(cè)地切開，其中一半進(jìn)行腫瘤病理學(xué)檢查，剩余一半在50℃干燥48h前后稱重。干質(zhì)量作為濕腫瘤質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)如下計(jì)算
患者總體存活時(shí)間以動(dòng)物在開始治療后存活的時(shí)間(天或周)來計(jì)算。
各治療的腫瘤加倍時(shí)間列于表9A。在用5-FU/HA和5-FU治療間TDT沒有顯著性差異。然而給予HA顯示對(duì)原發(fā)腫瘤的治療作用，其中TDT明顯大于鹽水組(p，0.05，多重比較Tukey檢驗(yàn))。在給予5-FU 24h前給予HA看來抵銷與延遲腫瘤生長有關(guān)的5-FU的任何治療價(jià)值。
所引用的5-FU的治愈率是26％(Inaba等，1989)，但是接受5-FU的動(dòng)物并不經(jīng)歷“治愈”。兩只接受HA/5-FU輔助治療的小鼠經(jīng)歷了“治愈”，其中腫瘤完全壞死并在治療約12周后脫落。圖20B顯示接受HA和HA/5-FU的小鼠上特征的小痂形成的出現(xiàn)，而圖20C顯示小面積壞死的出現(xiàn)，接著形成大面積痂。其中一只小鼠經(jīng)歷小結(jié)的再生長，但第二只小鼠在22周時(shí)仍無腫瘤。如圖20A所示，接受5-FU或鹽水的小鼠具有大腫瘤，最終以動(dòng)物因腫瘤質(zhì)量的負(fù)擔(dān)過重而死亡(表9B)，但是接受HA±5-FU的小鼠表現(xiàn)出特征性的腫瘤外觀，其中小面積腫瘤壞死，接著形成痂。
在第22周，37.5％的5-FU/HA小鼠仍然存活，5-FU/HA輔助治療的小鼠死亡的主要原因是體重減輕與代謝抑制(表9B)。
當(dāng)將HA±5-FU給予帶有人乳腺癌異種移植物的小鼠時(shí)，總患者生存看來有顯著性差異。在24周研究的第22周，唯一存活的組是5-FU/HA和HA組，圖21所示。結(jié)論來自5-FU靶向的數(shù)據(jù)顯示當(dāng)5-FU與HA聯(lián)合注射時(shí)，在時(shí)間點(diǎn)10、20和30分鐘時(shí)腫瘤對(duì)在5-FU的吸收有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性增加，它們分別為2.4、1.5和2倍增加(表7)。這表明5-FU通過HA靶向于腫瘤。HA將5-FU靶向于腫瘤細(xì)胞有兩種可能的機(jī)理含有締合的5-FU的HA結(jié)合到受體(CD44)上并通過受體介導(dǎo)的胞吞作用被內(nèi)在化，從而將藥物釋放到腫瘤細(xì)胞中。
HA分子網(wǎng)絡(luò)將起阻止向外擴(kuò)散的作用，這樣在HA結(jié)合到受體(CD44和RHAMM)上后，所攜帶的5-FU能夠擴(kuò)散到腫瘤細(xì)胞中。當(dāng)5-FU被HA基質(zhì)保留在細(xì)胞表面時(shí)，5-FU增加了通常用于5-FU轉(zhuǎn)運(yùn)到下面的細(xì)胞中的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的可用性。
HA的分解代謝主要發(fā)生在淋巴結(jié)(Fraser等，1988)和肝臟中(Laurent等，1986)。HA一般通過在肝臟(80-90％)、腎臟(10％)、脾臟(0.1％)和骨髓(0.1％)中受體介導(dǎo)的細(xì)胞吸收和分解代謝被從血流中清除(Fraser等，1983)。循環(huán)的HA被代謝受體吸收，代謝受體也稱為肝臟內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)受體(Eriksson等，1983)，而CD44受體看來與HA內(nèi)在化有關(guān)，HA內(nèi)在化與細(xì)胞過程而不是代謝分解有關(guān)，而RHAMM受體僅與細(xì)胞游動(dòng)性有關(guān)。HA與5-FU組合能導(dǎo)致高水平的5-FU靶向于HA或5-FU代謝位點(diǎn)上。來自靶向試驗(yàn)的數(shù)據(jù)(表6)顯示當(dāng)5-FU與HA聯(lián)合給予時(shí)，在5-FU靶向于肝臟上沒有顯著性增加。由于沒有觀察到靶向于肝臟的增加，她可能意味著在肝臟上的LEC受體與CD44受體相比具有對(duì)HA更低的親合力。另一可能性是表達(dá)在肝細(xì)胞上的CD44同種型(Stamenkovic等，1991)并不與HA以高親合力結(jié)合。與肝臟一樣，沒有觀察到在其它代謝器官，脾臟、骨髓和淋巴結(jié)上5-FU靶向的增加。
在10min時(shí)間范圍內(nèi)5-FU靶向腎臟有1.8倍的顯著增加。雖然在其它4個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，當(dāng)HA/5-FU聯(lián)合給予時(shí)腎臟并未表現(xiàn)出對(duì)5-FU吸收的顯著增加，但看來有一般趨勢(shì)出現(xiàn)，其中在與HA聯(lián)合給予時(shí)有更多的5-FU轉(zhuǎn)移到腎臟。5-FU從體內(nèi)最終消除的主要途徑是泌尿排泄。即使HA與藥物的腎臟含量看來只有很少的增加，但我們根據(jù)其它證據(jù)相信HA被腎臟吸收并很快分解代謝，這樣其存留時(shí)間將很短，并且所締合的藥物將很快釋放到尿液中。
在組織中如胃、腦、肺和子宮，短期靶向在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上被觀察到。沒有一致的藥代動(dòng)力學(xué)模型產(chǎn)生，這可能表明我們需要增加樣品數(shù)目，這能最終表明這些觀察是否真實(shí)。在10-30min時(shí)靶向于腦的增加的情況中，這可以通過以前的觀察得到解釋，即HA與增強(qiáng)藥物穿過血腦屏障的能力有關(guān)(Nelson和Falk，1994)。
當(dāng)5-FU與HA聯(lián)合給予時(shí)，在時(shí)間點(diǎn)30min和1h，肺中的5-FU水平顯著增加。已報(bào)道肺巨噬細(xì)胞含有高水平的HA-結(jié)合，CD44同種型(Underhill等，1993)，這可能是靶向增加的原因。這可能與在肺癌治療中的治療優(yōu)勢(shì)有關(guān)，其中小的和大的肺癌細(xì)胞已被報(bào)道含有CD44和RHAMM的過度表達(dá)(Horst等，1990)。
當(dāng)HA與5-FU聯(lián)合注射時(shí)，在時(shí)間點(diǎn)1和2h上，5-FU靶向于心臟顯著下降。由于給予5-FU能導(dǎo)致心臟毒性(MIMS，1997)，5-FU與HA聯(lián)合給予與單獨(dú)給予5-FU相比可能降低對(duì)心臟的毒性。
當(dāng)評(píng)估HA/5-FU輔助治療的治療功效時(shí)，在長期和短期治療方案中的幾種觀察均一致。
接受HA/5-FU或單獨(dú)的HA的小鼠看來具有更多的能量并維持或增加體重，在6月研究中HA/5-FU小鼠的存活時(shí)間增加支持這個(gè)觀察。
接受5-FU/HA或HA的小鼠的腫瘤發(fā)展外部壞死區(qū)，到兩個(gè)腫瘤脫落的程度。
將HA加入到5-FU中在治療6周后看來對(duì)原發(fā)腫瘤的體積沒有顯著影響，但是這可能是由于腫瘤的脈管系統(tǒng)所致。腫瘤由三個(gè)區(qū)組成。當(dāng)HA與或不與5-FU聯(lián)合給予時(shí)，它將到達(dá)腫瘤，通過損傷的血管的縫隙連接進(jìn)入良好血管化和半壞死的區(qū)域。由于HA的吸水能力，這可導(dǎo)致細(xì)胞外液流入腫瘤壞死區(qū)，從而增加腫瘤體積并引起腫瘤脈管系統(tǒng)的進(jìn)一步損傷。這一假設(shè)與以下觀察一致用HA±5-FU治療的腫瘤并不常規(guī)顯示壞死和腫瘤細(xì)胞內(nèi)液的滲漏。當(dāng)計(jì)算完壞死對(duì)能生存的細(xì)胞面積的比率和于質(zhì)量濕質(zhì)量比率時(shí)，我們將能證實(shí)這一假設(shè)。
長期功效研究顯示接受HA/5-FU治療的小鼠存活率增加，如圖21所示。這些小鼠的平均腫瘤體積與其它治療組相比也下降。還注意到在長期研究中HA/5-FU組的死亡原因主要是由于代謝抑制，而5-FU組的死亡原因更多是由于腫瘤體積太大而引起的行動(dòng)不便。所有僅HA治療的小鼠都死于腫瘤太大而引起的行動(dòng)不便，而不是由于毒性而死亡。因此給予HA看來并無任何毒性作用。從靶向結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)HA與5-FU組合時(shí)，5-FU靶向腫瘤增加(圖12)。通過HA結(jié)合到在腫瘤位點(diǎn)上存在增加的HA特定受體CD44和RHAMM(Culty等，1994；Wang等1996)，HA將5-FU靶向于腫瘤的能力可反映HA與5-FU及其它細(xì)胞毒性藥物的使用可能有助于克服沒有足夠的藥物到達(dá)腫瘤而沒有任何治療效果的問題。還發(fā)現(xiàn)在短期研究中5-FU/HA小鼠與所有其它組相比體重明顯增加(圖21)。因此，HA靶向腫瘤位點(diǎn)的能力可以降低進(jìn)入其它器官如腸中的5-FU的量，這樣減少與5-FU治療有關(guān)的副作用，尤其是胃腸道毒性。
與先前實(shí)施例1到3中公開的MTX/HA輔助治療的評(píng)估相比，我們注意到一些獨(dú)特的共同結(jié)果和差別，如表10中所列。表10MTX/HA和5-FU/HA輔助治療間的共有結(jié)果與差別
兩項(xiàng)研究的主要差別是腫瘤的起始質(zhì)量，其中在MTX/HA研究中平均腫瘤體積為175.13毫米3，而在5-FU/HA研究中平均腫瘤體積為61.63毫米3。通過質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)到腫瘤中的動(dòng)力學(xué)和患者對(duì)腫瘤體積的反應(yīng)，可解釋獲得的與TDT估計(jì)有關(guān)的不同結(jié)果。實(shí)施例12與透明質(zhì)酸組合治療的治療功效對(duì)人體原發(fā)和轉(zhuǎn)移乳腺癌，最常用的治療方案之一是環(huán)磷酰胺(Cyc)、MTX和55-FU的組合化療，它們?cè)?8天周期的第1天和第8天給予。通常稱為CMF的該組合治療通常進(jìn)行6個(gè)周期，之后患者的癥狀被重新評(píng)估。用CMF治療的抗腫瘤反應(yīng)率被報(bào)道約為50％(Bonadonna，1981；Bonadonna，1988)，但是該治療具有許多相關(guān)的副作用，例如疲勞、惡心、白細(xì)胞減少和嘔吐(Bonadonna，1976；Meyerowitz，1979)。由于成功地將HA用作MTX和5-FU的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體，我們?cè)u(píng)價(jià)了6周和6月的治療方案中HA/CMF輔助治療的功效和毒性。
MTX和-FU分別如前面實(shí)施例2和6中所述被制備。儲(chǔ)備濃度的Cyc通過將1克凍干藥物溶解在1毫升注射級(jí)無熱原蒸餾水中，并用注射級(jí)0.9％氯化鈉稀釋到50毫升而制備。儲(chǔ)備溶液等分成小體積并冷凍在-20℃，直到使用。
CMF注射液通過將適量藥物儲(chǔ)備溶液調(diào)至藥物最終濃度而獲得，藥物最終濃度為30毫克/千克5-FU (儲(chǔ)備溶液20毫克/毫升)15毫克/千克MTX (儲(chǔ)備溶液24.5毫克/毫升)26毫克/千克Cyc (儲(chǔ)備溶液20毫克/毫升)12.5毫克/千克HA (儲(chǔ)備溶液10毫克/毫升)為了確定CMF/HA輔助治療的療效和任何可能的毒性，使用在裸鼠中的人乳腺癌異種移植物。為了盡可能近似地模擬人治療方案，小鼠在長期療效研究中被治療6個(gè)周期(6個(gè)月)，在短期療效研究中被治療6個(gè)周期(6周)。小鼠被隨機(jī)分成7組，每組8只，用于短期研究，另5組，每組8只，用于長期研究。
小鼠在6周治療的7天治療方案的第1或2天或在6月治療的28天治療方案的第1或8天用30毫克/千克5-FU；15毫克/千克MTX；26毫克/千克Cyc±12.5毫克/千克治療。對(duì)照組包括給予鹽水、12.5毫克/千克HA的小鼠或第一天給予12.5毫克/千克HA，接著第二天給予CMF的小鼠。每天監(jiān)測(cè)小鼠的任何治療毒性，每天或每周測(cè)定腫瘤質(zhì)量(見表11)。表11治療給藥方案
如表12a和12b所示，在6周研究中觀察到以下現(xiàn)象1).接受含有HA治療方案(CMF/HA，HA接著是CMF或僅HA)的小鼠表現(xiàn)出比僅CMF組存活增加50％。CMF治療組的平均存活時(shí)間是40.4天，而所有其它組的為42天。2).用HA和CMF組合治療的動(dòng)物均顯示比僅用CMRF或僅用HA治療的動(dòng)物體重增加(t-檢驗(yàn)，p＜0.001)并顯示保持良好的狀態(tài)。(見圖22)。3).鹽水治療的小鼠(無治療對(duì)照組)的腫瘤加倍時(shí)間顯著小于其它治療組(t-檢驗(yàn)，p＜0.001)，但是其它治療組間沒有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異(見圖23)。4).關(guān)于原發(fā)腫瘤終點(diǎn)體積，CMF和CMF/HA治療組間存在顯著性差異(t-檢驗(yàn)，p＝＜0.001)，其中CMF導(dǎo)致7/8的動(dòng)物的腫瘤質(zhì)量的下降，而CMF/HA僅導(dǎo)致3/8的動(dòng)物原發(fā)腫瘤體積減小。5).當(dāng)小鼠用HA±CMF治療時(shí)沒有觀察到治療毒性，而僅用CMF治療的小鼠表現(xiàn)出疲勞、結(jié)膜炎、一般健康變差。
當(dāng)在28天周期中的第1天和第8天給予CMF/HA或HA治療時(shí)，能觀察到以下現(xiàn)象1).在治療組間沒有體重增加上的顯著性差異。2).接受HA±CMF治療的小鼠的原發(fā)腫瘤表現(xiàn)出小面積壞死和痂的形成。3).在原發(fā)腫瘤治療中，CMF作為單獨(dú)的藥物并不顯示治療功效高于鹽水和HA治療。將HA加入CMF導(dǎo)致顯著增大的原發(fā)腫瘤(t-檢驗(yàn)，p＝0.001)。表12ACMF/HA輔助治療對(duì)裸鼠中人乳腺癌異種移植物生長和轉(zhuǎn)移的影響6周研究
表12BCMF/HA輔助治療對(duì)裸鼠中人乳腺癌異種移植物生長和轉(zhuǎn)移的影響6月研究
由本研究可得到下列結(jié)論1).長期(6月)給予HA/CMF輔助治療并不顯示療效增加或治療副作用降低。2).短期(6周)給予HA/CMF輔助治療顯示比僅用CMF治療具有許多優(yōu)點(diǎn)。3).體重明顯增加。4).完成治療的動(dòng)物數(shù)目增加50％。5).消除副作用如疲勞、結(jié)膜炎、食欲喪失。6).接受HA的小鼠不表現(xiàn)出任何毒性現(xiàn)象。實(shí)施例13化療藥與HA相互作用性質(zhì)的NMR研究為了進(jìn)一步研究HA與化療藥間相互作用的性質(zhì)，使用1H核磁共振(NMR)譜。重水(2H2O(99.96％))得自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室。MTX來自Faulding Pharmaceuticals，5-FU和HA儲(chǔ)備溶液如前所述制備。
在298K下在用一個(gè)屏蔽的梯度元件(gradient unit)在600MHz下操作的Bruker DRX分光計(jì)上紀(jì)錄譜圖。2D試驗(yàn)在相敏模式下紀(jì)錄，用時(shí)間一比例相增量以在t1維中積分(Marion和Wuthrich，1983)。2D試驗(yàn)包括TOCSY序列，使用MLEV-17自旋鎖序列混合時(shí)間為120ms(Bax和Davis，1985)；混合時(shí)間為250和400ms的NOESY(Kumar等.，1980)和混合時(shí)間為250ms的ROESY譜。探針的溫度校正通過與乙二醇化學(xué)位移比較獲得。所有化學(xué)位移(ppm)都以4，4-二甲基-4-硅雜戊烷-1-磺酸鹽的甲基共振(DSS，0ppm)為對(duì)照。
用于NOESY、ROESY和T℃SY試驗(yàn)的水信號(hào)的溶劑抑制是通過使用改進(jìn)的WATERGATE序列(Piotto等，1992)獲得的，WATERGATE序列中1ms的二梯度脈沖被應(yīng)用于二項(xiàng)3-9-19脈沖的任一側(cè)。光譜在6024Hz下用4096綜合數(shù)據(jù)點(diǎn)在F2和F1維的512增量下常規(guī)獲得，TOCSY試驗(yàn)每一增量掃描32次，NOESY試驗(yàn)每一增量掃描80次。緩慢交換NH質(zhì)子通過得到一系列在16K數(shù)據(jù)點(diǎn)上用32掃描獲得的1維(1D)光譜測(cè)定。
NMR擴(kuò)散試驗(yàn)在裝有梯度控制元件并在500MHz下操作的Bruker AMX分光計(jì)上獲得。所有試驗(yàn)在298K下在16K數(shù)據(jù)點(diǎn)上和在7575Hz上用16或64掃描獲得。15.44G/厘米的梯度強(qiáng)度被用于擴(kuò)散試驗(yàn)。每一擴(kuò)散試驗(yàn)從一系列12 PFGLED光譜獲得，光譜中延遲(τ＝20ms，Δ＝50ms，T＝30ms及Te＝14ms)，其中G的量級(jí)保持不變，但在最終光譜中場(chǎng)梯度脈沖的長度(δ)以1ms步幅從0.2ms增加到12.2ms。
所有光譜都在Silicon Graphics Indigo工作站上用Xwinnmr(Bruker) 軟件處理。對(duì)于2D試驗(yàn)，t1維是零填充的2048真實(shí)數(shù)據(jù)點(diǎn)，90°相位移的正弦鐘形窗口(sine-bell window)功能在傅里葉轉(zhuǎn)換前得到使用。
NMR試驗(yàn)被設(shè)計(jì)用來監(jiān)測(cè)在加入HA時(shí)的MTX的1H NMR譜圖變化。通過監(jiān)測(cè)藥物MTX譜圖中的特定變化，如峰的加寬或移動(dòng)，也有可能觀察藥物分子的哪個(gè)區(qū)域與HA相互作用。圖24顯示了溶在H2O中的MTX的1H NMR譜圖。該譜圖很容易識(shí)別甲氨蝶呤中的各組氫。甲氨蝶呤甲氨蝶呤具有許多可能與透明質(zhì)酸分子相互作用的官能團(tuán)。在MTX的芳香環(huán)上2，4-氨基-喋啶的伯胺基團(tuán)能與透明質(zhì)酸分子的羧基形成離子締合。在甲氨蝶呤上的胺基與透明質(zhì)酸糖環(huán)的羥基間的氫鍵相互作用是另一種可能性。MTX的疏水芳環(huán)和折疊的透明質(zhì)酸聚合物的疏水塊間的疏水相互作用也是可能的。這些相互作用在圖25中說明。
為了解決在甲氨蝶呤和HA間是否有特異性的相互作用的問題，設(shè)計(jì)NMR試驗(yàn)來監(jiān)測(cè)在加入HA后MTX的1H NMR譜圖的變化。圖26顯示了透明質(zhì)酸在600MHz和298K下的600MHz譜圖。
圖27顯示了在298K下MTX單獨(dú)的600MHz1H NMR譜圖和逐漸加入HA(50kDa)的600MHz1H NMR譜圖，加入的HA為2納摩爾、10納摩爾、20納摩爾和80納摩爾。這些譜圖顯示甲氨蝶呤的任何峰的化學(xué)位移位置。另外的峰出現(xiàn)于譜圖，當(dāng)連續(xù)量的HA加入時(shí)，這些峰與因透明質(zhì)酸的共振完全一致。由于在這些光譜中MTX的任何共振的化學(xué)位移位置都沒有變化，看來沒有與HA分子相互作用的MTX分子的特定區(qū)域。
確定MTX的NH基團(tuán)和HA的酸基團(tuán)間是否有強(qiáng)的相互作用的一個(gè)方法是測(cè)定NH質(zhì)子的交換速率。這些氫是不穩(wěn)定的并能與大量溶劑快速交換。然而如果它們?cè)谂cHA分子強(qiáng)的相互作用中被涉及，那么它們將被保護(hù)，而免于與大量溶劑交換，并且它們的交換速率將下降。在該試驗(yàn)中，MTX的胺基氫與D2O的氘交換，交換率應(yīng)提供MTX和HA間相互作用強(qiáng)度的定性估計(jì)。通過將重水加入到MTX和HA溶于0.5％w/vNa2CO3(pH9)的溶液中制備的溶液的1H NMR分析表明在4分鐘內(nèi)MTX的所有胺基氫都與樣品中的氘交換。這一結(jié)果表明MTX中的胺基氫未被保護(hù)，而能與大量溶劑交換。
胺基氫的峰從1H NMR譜圖中消失的原因是因?yàn)殡葰渚哂蟹浅２煌墓舱耦l率，因此它在1H NMR譜圖中并不出現(xiàn)。類似的試驗(yàn)常規(guī)地用來測(cè)試在多肽和蛋白質(zhì)中主鏈酰胺氫原子是否得到保護(hù)不受溶劑影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的酰胺氫包含在穩(wěn)定α-螺旋和β-片二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵排列中時(shí)，這些氫的交換速率經(jīng)常急劇下降。在一些情況下，包含在這些相互作用中的氫信號(hào)能根據(jù)相互作用的強(qiáng)度和它被保護(hù)不受大量溶劑影響(例如在蛋白的疏水核心中)而持續(xù)數(shù)小時(shí)，數(shù)天，甚至數(shù)月。
擴(kuò)散試驗(yàn)在單獨(dú)的MTX下和有HA存在的MTX下進(jìn)行。這些試驗(yàn)?zāi)鼙砻鞅环@的MTX的擴(kuò)散是否被HA骨架的存在而延遲。雙重1H NMR擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果表明對(duì)于絕大多數(shù)MTX分子，MTX擴(kuò)散率沒有延遲，因?yàn)樵贛TX和在HA存在下的MTX的擴(kuò)散系數(shù)間幾乎不存在差別。這些發(fā)現(xiàn)表明在HA骨架中在HA分子間具有很大的溶劑空穴，它們?cè)试S藥物自由擴(kuò)散進(jìn)入介質(zhì)。
擴(kuò)散試驗(yàn)顯示大量MTX分子自由擴(kuò)散通過HA骨架。這一設(shè)想并未考慮是否小部分MTX(比方說5％的MTX分子)以非特異性方式與HA分子很弱地相互作用。
根據(jù)前面的試驗(yàn)，顯然MTX并不與HA強(qiáng)烈相互作用，即便存在的話，相互作用也是非特異性的。測(cè)試非特異性結(jié)合的弱結(jié)合配體(10-3-10-7M)的一種方法是進(jìn)行變換的(transferred)NOESY試驗(yàn)。在這些2D試驗(yàn)中，如果配體與大分子HA弱結(jié)合，交叉峰將會(huì)出現(xiàn)。MTX/HA的變換的NOESY譜圖表明由于MTX與HA的結(jié)合而沒有交叉峰，表明MTX和HA間相互作用可以忽略。
作為是否小部分MTX(比方說5％MTX分子)以非特異性方式與HA分子很弱地相互作用的進(jìn)一步檢查。在ROESY譜圖中的峰應(yīng)顯示是否甚至在化學(xué)交換方面有小部分MTX分子在自由和與HA結(jié)合狀態(tài)間。250ms ROESY譜圖并不顯示任何化學(xué)交換峰，這表示沒有甚至很小百分比的MTX與HA存在相互作用。5-氟尿嘧啶圖28顯示了在298K時(shí)在70.0和8.5ppm間5-FU和具有HA(750kDa，3毫克/毫升)的5-FU(1.25毫克/毫升、1.6毫克/毫升和6.4毫克/毫升)的600MHz1H NMR譜圖。要研究是否有相互作用的初始試驗(yàn)用50kDa透明質(zhì)酸進(jìn)行。在5-FU與HA間沒有觀察到相互作用(數(shù)據(jù)沒有顯示)。為了研究相互作用是否依賴于所用的HA的分子量，進(jìn)一步滴定試驗(yàn)用750kDa透明質(zhì)酸進(jìn)行。所用的5-FU的濃度等于HA/5-FU輔助治療Kings College London配方研究，該研究以瑞典臨床試驗(yàn)中的制劑進(jìn)行。這些濃度被設(shè)計(jì)來模擬用于HA/5-FU混合的濃度，輸注袋中的濃度和在血漿中估計(jì)的HA/5-FU濃度。遺憾的是，5-氟尿嘧啶的胺共振在這些配方的pH(8.8到9.1)下與大量溶劑水快速交換，因此這些共振在5-FU譜圖中看不見。在5-FU譜圖中只可看見一個(gè)CH共振。降低這些溶液的pH是不可行的，因?yàn)?-FU將在低pH值下從溶液中沉淀出來。這些譜圖顯示在5-FU的CH峰的化學(xué)位移位置沒有變化。這些譜圖表明5-FU看來并不與HA分子相互作用。
擴(kuò)散試驗(yàn)在5-FU單獨(dú)存在和與HA一同存在下進(jìn)行。列于表13的雙重1H NMR擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明5-FU擴(kuò)散并不因?yàn)镠A存在而被延遲，因?yàn)樵?-FU單獨(dú)存在和與HA一同存在的擴(kuò)散系數(shù)幾乎沒有差別。表4NMR擴(kuò)散系數(shù)
2D試驗(yàn)，NOESY和ROESY5-FU上的2D試驗(yàn)是不可能的，因?yàn)樵谒?H NMR譜圖上只有一個(gè)共振是可見的。
MTX和5-FU在HA存在下的NMR分析使用滴定試驗(yàn)、氘交換試驗(yàn)、擴(kuò)散試驗(yàn)和MTX的變換的NOESY試驗(yàn)，5-FU的滴定試驗(yàn)和擴(kuò)散試驗(yàn)顯示在化療劑和透明質(zhì)酸間沒有測(cè)到相互作用。這些結(jié)果表明化療劑被HA網(wǎng)絡(luò)俘獲足以增加轉(zhuǎn)運(yùn)到病理位點(diǎn)上的藥物的量。這些結(jié)果與以前使用凝膠過濾色譜、平衡透析和CD光譜的HA和MTX間分子相互作用的研究完全一致，它們也未檢測(cè)到相互作用。
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權(quán)利要求
1.增強(qiáng)細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物的有效性的方法，包含將所述藥物與透明質(zhì)酸聯(lián)合給予的步驟，其中與透明質(zhì)酸聯(lián)合給予增強(qiáng)所述藥物的癌細(xì)胞殺傷力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的藥物選自由甲氨蝶呤、紫杉醇(他克唑)、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺以及它們的組合組成的組。
3.細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物組合物，包含透明質(zhì)酸和細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物，其中所述組合物被全身給予。
4.增強(qiáng)細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物的有效性的方法，包含給予權(quán)利要求3的組合物的步驟。
5.降低或克服耐藥性的方法，包含將細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物與能夠攜帶和/或結(jié)合所述藥物的粘多糖聯(lián)合給予的步驟，所述粘多糖能夠與耐藥細(xì)胞上的受體結(jié)合或通過整體胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，其中所述藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，從而使其成為治療活性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的粘多糖能夠結(jié)合于耐藥細(xì)胞表面，其中所攜帶或結(jié)合的藥物從所述粘多糖擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。
7.增強(qiáng)藥物有效性的方法，包含將所述藥物和與所述藥物締合的粘多糖聯(lián)合給予的步驟，締合方式使與所述藥物被單獨(dú)給予相比，所述藥物在細(xì)胞內(nèi)存留更長的時(shí)間。
8.治療耐藥性疾病的方法，包含將透明質(zhì)酸與藥物聯(lián)合給予需要這種治療的患者。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的耐藥性疾病是耐藥性癌癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的癌癥對(duì)甲氨蝶呤、紫杉醇(他克唑)、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺或它們的組合中的一種或多種有耐藥性。
11.治療癌癥的方法，包含將藥物與能夠攜帶或結(jié)合所述藥物和/或與所述藥物締合的粘多糖聯(lián)合給予的步驟，締合方式使與所述藥物被單獨(dú)給予相比，所述藥物在細(xì)胞內(nèi)存留更長的時(shí)間。
12.減輕藥物的胃腸毒性的方法，包含將藥物與能夠攜帶或結(jié)合所述藥物和/或與所述藥物締合的粘多糖聯(lián)合給予的步驟，締合方式使所述藥物具有降低的胃腸毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物療效的增強(qiáng),特別是同時(shí)克服細(xì)胞或生物體的耐藥性。尤其是,本發(fā)明提供了增強(qiáng)細(xì)胞毒性或抗腫瘤藥物的有效性的方法,所述方法包含將所述藥物與透明質(zhì)酸聯(lián)合給予的步驟,其中與透明質(zhì)酸聯(lián)合給予增強(qiáng)藥物的癌細(xì)胞殺傷力。
文檔編號(hào)A61K31/519GK1336828SQ00802748
公開日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年1月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月13日
發(fā)明者特蕾西·布朗 申請(qǐng)人:美迪泰克研究有限公司