專利名稱：兩步免疫測(cè)定法診斷癌癥的制作方法
該項(xiàng)目的內(nèi)容是用抗體檢測(cè)癌癥具體方法。具體是對(duì)NDP-激酶/Nm23和雌激-受激亮氨酸氨太酶(es-LAPase)特異性抗體的研究及其在診斷乳腺癌以及轉(zhuǎn)移性方面的應(yīng)用。這兩種抗體也可用于檢測(cè)血清，血漿及活組織中NDP-激酶和LAPase水平。
背景技術(shù)：
對(duì)人類疾病如乳腺癌進(jìn)行有效檢測(cè)及設(shè)計(jì)治療藥物的關(guān)鍵在于能夠鑒別危險(xiǎn)因素和病理生理改變。對(duì)癌癥類別和程度的準(zhǔn)確診斷是選擇最佳治療方案的關(guān)鍵。而病情的程度取決于腫瘤組織學(xué)，血液成分測(cè)定及細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)等方面的綜合分析。
廣泛應(yīng)用的乳腺癌診斷方法有影像技術(shù)，如超聲，X射線法。但是這一技術(shù)受到影像分辨率的限制，只能診斷大到一定程度的腫瘤。此外，難以區(qū)分纖維瘤，囊腫與惡性腫瘤。Elmore和Goetz的最新研究明確強(qiáng)調(diào)了這一局限性。
活組織的組織學(xué)分析是診斷乳腺癌的另一常用方法。這一方法依賴于可見的細(xì)胞類型鑒別。雖然這種方法比較客觀，但要靠檢測(cè)者的技術(shù)水平。
活組織細(xì)胞中DNA流動(dòng)細(xì)胞學(xué)分析也常被用來測(cè)定與腫瘤有關(guān)的細(xì)胞DNA含量。但是此法需獲得活組織并且需要復(fù)雜的樣品處理過程和昂貴的儀器。
在各種與乳腺癌早期形成有關(guān)的危險(xiǎn)因素中，雌激素及與雌激素有相似活性的雌激素類似物仍是對(duì)乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的最重要的被檢物。在正常生理?xiàng)l件下，靠雌激素起關(guān)鍵作用的器官包括生殖系統(tǒng)和第二性器官如乳腺。此外，雌激素還可以通過促使靶細(xì)胞增殖來參與骨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，肝臟，心血管功能及激素代謝周期。這些組織對(duì)雌激素的反應(yīng)能解釋雌激素在不同人類腫瘤特別是乳腺腫瘤的發(fā)病和發(fā)展方面所起的活性作用。我們認(rèn)為雌激素是通過參與初期和早期細(xì)胞功能來調(diào)節(jié)各種生理功能。因此，有雌激素參與的細(xì)胞早期活動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞由G1期向S期發(fā)展的速率，從而縮短細(xì)胞周期。最近有報(bào)道，在相同濃度下雌激素可以通過共同激活細(xì)胞周期蛋白D1-CdK4和E-CdK2這兩個(gè)密切相關(guān)的關(guān)鍵的G1調(diào)節(jié)太來促進(jìn)細(xì)胞增殖。
以雌激素為基礎(chǔ)的分子診斷測(cè)定廣泛應(yīng)用于活組織細(xì)胞中雌激素和孕激素受體檢測(cè)，從而確定此種腫瘤是否對(duì)激素治療有效。但是，它無法估計(jì)腫瘤的發(fā)展程度及是否轉(zhuǎn)移。此外該法還需取活組織，并且需要待腫瘤長(zhǎng)到足以能夠觸及或用影像技術(shù)檢測(cè)的程度。
NDP-激酶活性與多種生理過程有關(guān)，包括DNA和RNA合成，AMP循環(huán)周期，超氧化物代謝及DNA修復(fù)酶活性。一般說來，NDP-激酶的活性與細(xì)胞增殖是平行的。例如，測(cè)定細(xì)胞液NDP-激酶活性是在細(xì)胞增殖過程中進(jìn)行的。另外可以降低具有高度轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細(xì)胞中RNA水平的Nm23基因與NDP-激酶基因非常相似。
NDP-激酶幫助細(xì)胞內(nèi)DNA與RNA轉(zhuǎn)換成磷酸化形式。多數(shù)NDP-激酶活性是在細(xì)胞液中。也存在于其它細(xì)胞成分中，例如微管蛋白環(huán)，人類及兔血小板分離的血漿膜，牛腦微粒物質(zhì)。NDP-激酶的廣泛分布表明其在核酸，超氧化物代謝，AMP的合成周期等細(xì)胞增殖和分化的基本細(xì)胞過程中所起的活性作用。
由于NDP-激酶參與細(xì)胞增殖和分化，使其成為診斷癌癥的一個(gè)細(xì)胞標(biāo)記。這一方法是通過腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析實(shí)現(xiàn)的。然而這一研究并未清楚說明NDP-激酶的存在與腫瘤細(xì)胞存在之間的相互關(guān)系。
已對(duì)與腫瘤特別是乳腺腫瘤有關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行了研究。其中LAPase與乳腺癌發(fā)病有關(guān)。血清LAPase水平的變化也與其他癌癥或疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，心肌梗塞和病毒感染有關(guān)。因此以這種血清酶測(cè)定為基礎(chǔ)的診斷不具特異性。這種非特異性可能與其它LAPase同工酶存在有關(guān)。
顯然，迫切需要一種快速，靈敏，較少侵害性的方法來對(duì)乳腺癌進(jìn)行診斷和分期，特別是能夠反映腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物和指示雌激素活性的標(biāo)記物。
目前的研究提供了這一方法。這一方法利用對(duì)NDP-Kinase和es-LAPase特異性單克隆抗體來檢測(cè)血液和組織中的這些標(biāo)記物。這些標(biāo)記物的酶活性水平與腫瘤特別是乳腺腫瘤的程度和轉(zhuǎn)移有關(guān)。這一免疫測(cè)定用血液或組織樣品。它的另一優(yōu)點(diǎn)是通過使用兩個(gè)標(biāo)記物使假陽性結(jié)果大大降低。如果只使用一個(gè)標(biāo)記物，由于這一標(biāo)記物的水平可能受其它生理?xiàng)l件影響而增加假陽性結(jié)果。
發(fā)明概述目前的嘗試是用抗體檢測(cè)癌癥。具體說是用對(duì)NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase特異性抗體診斷原位導(dǎo)管癌及乳腺癌的轉(zhuǎn)移。也可用于檢測(cè)血清，血漿或組織中的NDP-激酶和LAPase水平。
我們可以提供通過測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平來檢測(cè)乳腺癌的方法。
也可以通過測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平來檢測(cè)病人的轉(zhuǎn)移性癌癥。還能用NDP-Kinase抗體與模擬雌激素對(duì)es-LAPase特異性抗體檢測(cè)血清，血漿及組織中的NDP-Kinase和LAPase水平。
圖例說明以下用圖說明試驗(yàn)特點(diǎn)圖一說明含有未變性NDP-Kinase/Nm23的樣品的Western Blots中MAb4A12的反應(yīng)性。未變性PAGE之后的原細(xì)胞液(lane1)，HL60細(xì)胞中NDP-Kinase/Nm23的純制劑(lane2)，重組Nm23-H1(Lane3)與MAb 4A12的反應(yīng)。用MAb 4A12可鑒別出所有樣品中相同的蛋白組分具有同樣的電泳速度。
圖二說明非變性PAGE之后，抗-NDP-Kinase/Nm23 MAb 4A12單克隆抗體對(duì)原始細(xì)胞提取物的反應(yīng)。一個(gè)是經(jīng)染色的原始細(xì)胞提取物對(duì)NDP-Kinase/Nm23活性(lane1)。另一個(gè)是轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素上并和抗-NDP-Kinase/Nm23 Mab4A12單克隆抗體反應(yīng)(lane2)。
圖三表明抗CD19/抗-NDP-Kinase/Nm23雙重標(biāo)記的健康婦女的外周血細(xì)胞的雙變量點(diǎn)圖分析。雙點(diǎn)作圖分析是在雙重標(biāo)記的PBMC1s上用羊抗鼠FITC抗體檢測(cè)作為第二標(biāo)記物的MAb 4A12。對(duì)照樣品與預(yù)先免疫的控制免疫球蛋白IgG1反應(yīng)，然后再用羊抗鼠IgG-FITC聯(lián)合抗體。Section1全部外周血細(xì)胞雙變量作圖分析。Section1ACD19+標(biāo)記細(xì)胞〔LF2〕電控，然后分析它們對(duì)抗-NDP-Kinase/Nm23 Mab 4A12單克隆抗體的同時(shí)存在的活性。如Section1B所示，〔LF2〕抗-CD19+細(xì)胞對(duì)〔LF1〕抗-NDP-Kinase/Nm23 4A12單克隆抗體作圖表明，大約93％雙重標(biāo)記的B細(xì)胞對(duì)抗-CD19和抗-NDP-Kinase/Nm23 4A12單克隆抗體都有反應(yīng)。如Section2所示所有與對(duì)照IgG免疫球蛋白反應(yīng)的淋巴細(xì)胞都未起反應(yīng)，而只有那些與抗-CD19和抗NDP-Kinase都反應(yīng)的淋巴細(xì)胞有選擇性地與標(biāo)記的B細(xì)胞反應(yīng)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述此項(xiàng)發(fā)明是用抗體診斷癌癥。具體說，是對(duì)NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase的特異性抗體的研究及其在診斷乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)及其轉(zhuǎn)移。更進(jìn)一步，這一檢測(cè)系統(tǒng)包括用NDP-Kinase/Nm23特異性抗體檢測(cè)血清，血漿和組織中的NDP-Kinase水平，與es-LAPase特異性抗體聯(lián)用檢測(cè)血清，血漿和組織中的NDP-Kinase和LAPase。
早期研究顯示可能存在與NDP-Kinase具有相同等電點(diǎn)和分子量的同功酶。相反，對(duì)與細(xì)胞膜有關(guān)的NDP-Kinase和細(xì)胞液NDP-Kinase研究表明，兩種酶是完全一致NDP-Kinase單一酶形式。這一研究發(fā)現(xiàn)由HL60細(xì)胞提純的活性細(xì)胞液NDP-Kinase是一種大約67kDa的寡聚物，由兩個(gè)大約17kDa和33kDa的亞單位組成。細(xì)胞液NDP-Kinase是單一酶，所表現(xiàn)的同功酶性質(zhì)是蛋白磷酸化的答7b度不同所致，而不是NDP-Kinase蛋白水解產(chǎn)物。
在目前的發(fā)明中，我們從HL60細(xì)胞中制備出純細(xì)胞液NDP-Kinase單克隆抗體?？贵w之一Mab 4A12能選擇性與NDP-Kinase活性寡聚物反應(yīng)。該酶變性后的單體組分不能被識(shí)別。因此，還需確認(rèn)本身的NDP-Kinase與Mab4A12抗體的結(jié)合。NDP-Kinase既存在于細(xì)胞質(zhì)中又存在于與膜有關(guān)的復(fù)合物中。NDP-kinase在兩種狀態(tài)中具有完全相同的動(dòng)力學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)。
更進(jìn)一步，我們也提供對(duì)es-LAPase的特異性抗體。這一抗體的制備方法在同時(shí)申請(qǐng)的專利中詳細(xì)介紹。
目前單克隆抗體是根據(jù)Campbellde和Lietzke，R，Unsicker，K傳統(tǒng)方法制備的。該法將老鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)組織培養(yǎng)與抗體結(jié)合從免疫老鼠產(chǎn)生雜交細(xì)胞，這些細(xì)胞產(chǎn)生大量的單一抗體分子。即用抗原免疫動(dòng)物如小鼠，大鼠，兔，羊，馬或牛制備產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。免疫步驟及抗原濃度取決于能夠提供足夠量的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。這些產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以是脾細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞。
選擇適當(dāng)?shù)娜诤蠁?dòng)子，使這些產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，細(xì)胞系來源于各種動(dòng)物，如鼠，兔及人類。許多小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是已知并可從醫(yī)學(xué)科學(xué)團(tuán)體獲得，如美國(guó)分類培養(yǎng)收集機(jī)構(gòu)，Rockville，Maryland所用的這些骨髓瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基應(yīng)具有選擇性以使未融合的骨髓瘤細(xì)胞在選擇性介質(zhì)中不能存活，而雜交細(xì)胞則能存活。最常用的細(xì)胞系是抗8-氮鳥票呤系，它含有較少的次黃票呤-鳥票呤-磷酸核磷d轉(zhuǎn)移酶，因此不能在HAT培養(yǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)。一般說來，該細(xì)胞系應(yīng)是“非分泌”類，因而不產(chǎn)生抗體。所選的融合啟動(dòng)子是聚乙二醇，其分子量在1000到4000之間。也可用聚乙烯醇，病毒或電場(chǎng)作為融合啟動(dòng)子。
這些存活的細(xì)胞(雜交物)需經(jīng)篩選，找出能分泌特異性抗體的細(xì)胞。通常用ELASA進(jìn)行初選。進(jìn)一步，將這些雜交物培養(yǎng)上清液加到預(yù)先加好抗原的微滴定盤中或硝酸纖維膜上，這里所用的抗原是從HL60細(xì)胞提純的NDP-Kinase/Nm23。培養(yǎng)上清液的特異抗體可用第二標(biāo)記抗體檢測(cè)。最常用的第二抗體是用過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG。對(duì)NDP-Kinase抗原陽性的培養(yǎng)液用限制稀釋法克隆。第二雜交物培養(yǎng)液用上法進(jìn)行再篩選。通過測(cè)定抗體是否與抗原結(jié)合來評(píng)估培養(yǎng)液并測(cè)定抗體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)選擇的培養(yǎng)液再克隆直到培養(yǎng)液穩(wěn)定并獲得克隆。剛雜交之后的融合產(chǎn)物含有大約80個(gè)染色體。克隆過程是選擇那些仍保留抗體生產(chǎn)的染色體密碼的細(xì)胞。克隆過程一直重復(fù)到100％的亞群呈現(xiàn)特異性抗體的生產(chǎn)，這代表雜交物“穩(wěn)定”。此外雜交物培養(yǎng)皿可能含有多種克隆，其中有些可能不產(chǎn)生抗體?？寺∵^程允許選擇從單一細(xì)胞衍生的陽性雜交物。
我們的發(fā)現(xiàn)之一是用雜交細(xì)胞系4A12制備單克隆抗體4A12。這一單克隆抗體對(duì)NDP-Kinase/Nm23有特異性。這一細(xì)胞系在1994年5月27日存于美國(guó)分類培養(yǎng)收集處，序列好為CRL 11634.
4A12抗體是IgG2a亞型，能夠鑒別NDP-Kinase/Nm23膜及細(xì)胞液形式。這一抗體能和許多細(xì)胞類型結(jié)合，包括hemapoietic系。然而該抗體只對(duì)B淋巴細(xì)胞有特異性并不識(shí)別其它淋巴細(xì)胞。在這一方面具有轉(zhuǎn)移性的乳腺癌病人的NDP-Kinase陽性B細(xì)胞明顯降低。因此這一抗體在診斷轉(zhuǎn)移疾病方面的作用是顯而易見的。
另一例子是用雜交細(xì)胞系7B6制備7B6抗體。這一單克隆抗體對(duì)es-LAPase有特異性。這一雜交細(xì)胞于2000年3月23日儲(chǔ)存于加拿大國(guó)際存放機(jī)構(gòu)中。
此外，還包括任何具有抗體活性結(jié)合區(qū)域的片段，如Fab，F(xiàn)(ab)2和Fv片段。這些片段可用已知技術(shù)從7B6或4A12抗體獲得。
更具體的還有一些抗體和片段，它們能夠結(jié)合相同抗原測(cè)定物如7B6或4A12抗體。包括(但并不僅限于)與7A6和4A12抗體有相同抗原性卻來源不同或適于不同環(huán)境的或具不同結(jié)合親和力的抗體。顯然這一類及其抗體的變種可用重組類轉(zhuǎn)換和技術(shù)制備，這些技術(shù)可在“技術(shù)”里找到。
這些單克隆抗體可用生物反應(yīng)器或從腹水中生產(chǎn)，這兩種方法均來自“技術(shù)”里。
這些單克隆抗體可用于診斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移和程度及其它癌癥如glial origin腦癌。這一診斷是用免疫測(cè)定系統(tǒng)來測(cè)定血液和組織中NDP-Kinase/Nm23及es-LAPase水平。
這一發(fā)明的另一方面是免疫沉淀。用類似上皮細(xì)胞的母細(xì)胞的細(xì)胞組分中的MAb 4A12進(jìn)行免疫沉淀，這些細(xì)胞是乳腺腫瘤組織分離的。試驗(yàn)結(jié)果表明基質(zhì)層中NDP-Kinase活性降低，而細(xì)胞cytopholic層活性增強(qiáng)。更進(jìn)一步，用MAb 4A12進(jìn)行免疫沉淀表明，患DCIS并轉(zhuǎn)移的婦女的NDP-Kinase水平增高。
另一方面MAb 4A12可用于檢測(cè)與NDP-Kinase/Nm23相關(guān)的表面或膜細(xì)胞。特別是分析了人外周血中的MAb 4A12反應(yīng)性和分布。已發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均可與MAb 4A12反應(yīng)，但是只有淋巴細(xì)胞能和抗體反應(yīng)。進(jìn)一步分析證實(shí)只有B淋巴細(xì)胞，更確切地講是CD19+淋巴細(xì)胞與抗-NDP-Kinase/Nm23抗體反應(yīng)。而且，檢測(cè)出乳腺及腦腫瘤病人的CD19+B細(xì)胞中被MAb4A12所識(shí)別的抗原與轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)并增加腫瘤的侵害性。此外，還用MAb 7B6與MAb 4A12共同檢測(cè)細(xì)胞表面和膜的NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase.
免疫測(cè)定是將組織或血液樣品與抗體接觸并測(cè)定抗原-抗體加合物。也可將樣品進(jìn)行免疫沉淀來測(cè)定免疫沉淀酶活性和水平。
有些免疫測(cè)定使用雙重抗體檢測(cè)抗原的存在。這些技術(shù)在“抗原-抗體反應(yīng)基本原理”中有介紹。這些系統(tǒng)稱為快速形式系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈冞m用于快速檢測(cè)抗原的存在。這一系統(tǒng)要求抗原與抗體有很強(qiáng)的親和力。
目前試驗(yàn)顯示，用一對(duì)抗體檢測(cè)NDP-Kinase/Nm23的存在，每個(gè)抗體對(duì)NDP-Kinase都有特異性。這對(duì)抗體之一指的是“檢測(cè)抗體”，另一個(gè)是指“捕獲抗體”。我們所發(fā)明的單克隆抗體既可單獨(dú)用作捕獲抗體或檢測(cè)抗體，也可以在一個(gè)測(cè)定中同時(shí)用作兩者。另一方面可用雙抗體三明治法測(cè)定生物液體樣品中的NDP-Kinase。在此法中，抗原是夾在檢測(cè)抗體和捕獲抗體之間的，捕獲抗體被不可逆地固定在固體支持物上。檢測(cè)抗體含有可檢測(cè)的標(biāo)記以便測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物從而檢測(cè)抗原的存在。根據(jù)上述的雙重抗體三明治法，在各自檢測(cè)系統(tǒng)中用各自標(biāo)記的特異抗體測(cè)定NDP-Kinase和es-LAPase。
早期使用的固體支持物是在放射免疫學(xué)和酶免疫學(xué)領(lǐng)域里常用的盤，試管或聚苯乙烯珠。最近，許多多孔性材料如尼龍，硝酸纖維素，醋酸纖維素，玻璃纖維及其它多孔聚合物被用作固體支持物。
方法之一是使用流通免疫測(cè)定設(shè)備。Valkirs等發(fā)明了一種設(shè)備，包括對(duì)被檢抗原特異性抗體結(jié)合到多孔性膜或過濾器上，將液體樣品加入該膜。當(dāng)液體流過膜時(shí)，被檢物與抗體結(jié)合。加完樣品之后，再加標(biāo)記的抗體。對(duì)所標(biāo)記抗體的檢測(cè)能指示樣品中被檢物的存在。
另一使用流通設(shè)備的例子是Kromer等所描述的，一個(gè)試劑傳送系統(tǒng)包括一個(gè)基質(zhì)，用試劑或分散在水溶性聚合物中的組分來控制放在基質(zhì)下的傳遞到反應(yīng)基質(zhì)中的試劑的溶解速度。
在遷移類型測(cè)定中將膜浸在測(cè)定所用的試劑中，產(chǎn)生分析物測(cè)定帶，該帶結(jié)合了標(biāo)記分析物，因此可讀取檢測(cè)標(biāo)記。例如，見Tom等的專利和Zuk的專利。遷移測(cè)定裝置通常將試劑與有色標(biāo)記接觸，不需再加其他物質(zhì)就有可見的檢測(cè)分析結(jié)果。例子見Bernstein。我們所研究的單克隆抗體可用于所有類型的流通設(shè)備。這些流通設(shè)備也可用于檢測(cè)單一樣品中有多個(gè)被檢物時(shí)的測(cè)定。因此，這些流通設(shè)備可用于檢測(cè)es-LAPase和細(xì)胞液NDP-Kinase/Nm23.
根據(jù)目前的試驗(yàn)，直接標(biāo)記是目前所用的標(biāo)記方法之一。直接標(biāo)記被定義為一種實(shí)體，其在自然狀態(tài)下，可用肉眼或借助于光學(xué)濾片觀察到，或用UV激發(fā)產(chǎn)生熒光。在目前這些有色標(biāo)記例子中，包括金屬溶膠微粒，例如Leuvering所描述的金溶膠微粒；GribnauMay所描述的染料溶膠微粒；May，_supra，Snyde所描述的有色膠乳；或Cambell等提出的包膠的脂質(zhì)體染料。其它直接標(biāo)記有放射核甘太，熒光或發(fā)光。除了這些直接標(biāo)記方法外，也可用間接酶標(biāo)法。各種類型的免疫酶聯(lián)測(cè)定都是眾所周知的，如鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶，溶菌酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，乳酸脫氫酶，尿激酶等在酶免疫測(cè)定ELISA和EMIT文中有詳細(xì)介紹。
其它用單克隆抗體測(cè)定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase的生物診斷方法在G.Grenner等的專利中有介紹。
在診斷檢測(cè)試驗(yàn)中常用取樣試管從病人身上取血。試管內(nèi)壁起到單克隆或多克隆抗體載體作用，并且需要試劑或檢測(cè)方法產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。這一設(shè)計(jì)是將捕獲抗體固定在測(cè)定試管壁上。血樣從病人體內(nèi)取出后，只需震搖試管以使內(nèi)部的檢測(cè)抗體與血樣中的NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase反應(yīng)。這些單克隆抗體或是當(dāng)作捕獲抗體，或是作為檢測(cè)抗體。必需使用除去紅細(xì)胞的樣品以使紅細(xì)胞不影響分析結(jié)果。如果血樣中含有被檢物，就會(huì)夾在捕獲抗體和檢測(cè)抗體之間，這些抗體含有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記進(jìn)行直接檢測(cè)或和試劑反應(yīng)后進(jìn)行間接測(cè)定。然后清洗固體支持物(試管)以除去未結(jié)合的標(biāo)記物。許多物質(zhì)都可用作該法的固體支持物，如試管壁，塑料杯，玻璃珠，塑料球，量桶及微滴定盤，紙和玻璃纖維。
當(dāng)前有幾種自動(dòng)分析裝置可對(duì)許多樣品同時(shí)進(jìn)行快速分析。這些自動(dòng)裝置有連續(xù)/隨機(jī)測(cè)定裝置。例如PB診斷系統(tǒng)的OPUS及IMX分析儀。總之，樣品操作的全部過程，從吸取樣品到測(cè)定裝置，培養(yǎng)，及所得信號(hào)的讀取均是自動(dòng)控制。自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng)一般包括一系列工作站，每一個(gè)工作站完成檢測(cè)過程的一個(gè)步驟。這些檢測(cè)裝置可以用各種方式由一個(gè)工作站轉(zhuǎn)到下一個(gè)，使檢測(cè)步驟能夠按順序進(jìn)行。測(cè)定裝置還包括試劑儲(chǔ)存，液體混合，稀釋樣品槽。還應(yīng)有一個(gè)開口允許加入已知量的液體，如有必要把所需試劑加入多孔膜。還有一個(gè)窗口能夠讀取多孔膜中樣品的熒光或有色光變化例如分光光度計(jì)或熒光計(jì)。
PB診斷系統(tǒng)的自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)見US專利5051237；5138868；5141871和5147609。
關(guān)于IMX分析儀見“Abbott IMX自動(dòng)操作臺(tái)免疫化學(xué)分析儀系統(tǒng)”及US專利4956148題為“鎖架(Locking Rack)及一次性樣品盒”，它描述了用與AbbottIMX系統(tǒng)連接攜帶許多反應(yīng)細(xì)胞的演示。此技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展指定給Abbott實(shí)驗(yàn)室，在加拿大專利2069531中有說明，這一免疫化學(xué)分析儀系統(tǒng)能夠用現(xiàn)有的儀器一次分析三到四個(gè)樣品。用這一系統(tǒng)使用者把一組中三批樣品同時(shí)測(cè)定而不需分三次分析。單克隆抗體可用于自動(dòng)分析儀。
更進(jìn)一步，可用于我們發(fā)明的單克隆抗體的免疫化學(xué)分析儀系統(tǒng)有生物傳感器或光學(xué)免疫傳感器?？傊鈱W(xué)生物傳感器是使用光學(xué)原理定量把所需的化學(xué)和生物化學(xué)濃度或活性轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。這些系統(tǒng)可分為四類；光纖技術(shù)和相應(yīng)的光學(xué)設(shè)備；反射技術(shù)包括多組成反射光度計(jì)，及熒光毛細(xì)管填充裝置。光纖技術(shù)包括瞬間場(chǎng)熒光，光纖毛細(xì)管和光纖熒光敏感器。一體化光學(xué)設(shè)備包括計(jì)劃瞬間場(chǎng)熒光，輸入光珊連接免疫敏感器，Mach-Zehnder干涉儀，Hartman干涉儀，示差干涉儀敏感器。這些光學(xué)免疫敏感器在綜述文章中有概述。
另一免疫化學(xué)分析法是流動(dòng)細(xì)胞學(xué)分析。該法是用含有抗原的樣品與用熒光標(biāo)記的單克隆抗體反應(yīng)。樣品經(jīng)過具有一定波長(zhǎng)的激光束，該波長(zhǎng)能激發(fā)抗體的發(fā)色團(tuán)。每一個(gè)有抗體結(jié)合的微?；蚣?xì)胞會(huì)產(chǎn)生熒光因而可以測(cè)定。這一技術(shù)能夠分析特定的細(xì)胞類型尤其是特定的血細(xì)胞類型。因此，可用于測(cè)定帶有NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase抗原的B細(xì)胞。
NDP-Kinase和LAPase活性也可以用血漿免疫沉淀法測(cè)定，通過MAb4A12和MAb7B6與其共價(jià)結(jié)合到固體載體上進(jìn)行免疫沉淀。簡(jiǎn)言之，將血漿或其稀釋液加到共價(jià)鍵合的MAbs上，恒溫至確保樣品中的標(biāo)記完全與單克隆抗體結(jié)合。即可測(cè)定單個(gè)酶活性。
另一具體實(shí)驗(yàn)是用單克隆抗體檢測(cè)血液，血清，血漿或組織樣品。這一檢測(cè)是在具有檢測(cè)部分和捕獲部分的濾膜或固體支持物的裝置中進(jìn)行的。檢測(cè)部分含有檢測(cè)抗體，它將與NSP-Kinase/Nm23反應(yīng)。檢測(cè)抗體可逆性固定在固體支持物上，使用時(shí)將隨樣品一起移動(dòng)。最好標(biāo)記檢測(cè)抗體。例如用放射核甘太，酶，熒光組分，發(fā)光組分或如前所述的有色標(biāo)記。捕獲部分包括捕獲抗體，將其不可逆地固定在固體支持物上。這些捕獲和檢測(cè)抗體及必需試劑用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)固定在固體支持物上，如前所述的流通型免疫測(cè)定設(shè)備?？傊梅菢O性蛋白亞結(jié)構(gòu)與非極性支持材料之間的相互反應(yīng)將抗體吸附在固體支持物上。
在兩步測(cè)定中使用與NDP-Kinase/Nm23反應(yīng)的抗體和另一個(gè)對(duì)人體es-LAPase專屬抗體結(jié)合。乳腺癌病人的血清LAPase較高，有轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人的LAPase更高。進(jìn)一步，曾暴露在雌激素中的乳腺腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中的es-LAPase更高。因此，在兩步測(cè)定中同時(shí)應(yīng)用兩種抗體檢測(cè)血樣中NDP-Kinase/Nm23和血清e(cuò)s-LAPase水平。這一測(cè)定克服了以前舊技術(shù)的限制。在這一舊技術(shù)中用兩種對(duì)乳腺癌病人轉(zhuǎn)移都敏感的標(biāo)記物。因此，可以通過降低假陽性概率而增加對(duì)乳腺癌檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。兩步測(cè)定法也可用于檢查具有患乳腺癌危險(xiǎn)的病人。由于血清e(cuò)s-LAPase和NDP-Kinase/Nm23都受雌激素的影響，因此，危險(xiǎn)病人包括服用雌激素類避孕藥者，激素治療病人或具有不正常激素類型的人。在這方面，用雌激素治療的婦女其血清中的這兩種標(biāo)記可用于測(cè)定NDP-Kinase和es-LAPase水平是否增加。NDP-Kinase和es-LAPase水平增加與發(fā)展乳腺癌的危險(xiǎn)增加有關(guān)，這類婦女應(yīng)減少雌激素的服用量。
可見，NDP-Kinase/Nm23和LAPase的基線水平可由正常病人提供。因此，高于基線水平的NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase可以測(cè)定。這一測(cè)定既可用與正常結(jié)果比較的方法也可用調(diào)節(jié)免疫測(cè)定靈敏度以使高于特定限度的值呈陽性結(jié)果的方法。
以上的發(fā)明還需改進(jìn)以便區(qū)分細(xì)胞液和與膜相關(guān)的NDP-Kinase/Nm23。
為更好地理解我們的研究結(jié)果，特舉例說明。以下例子只幫助理解，并不說明我們的研究?jī)H限于此。
示例例一從HL60細(xì)胞中分離和提純細(xì)胞液NDP-Kinase從HL60細(xì)胞中提純細(xì)胞液NDP-Kinase的方法見Pulido-Cejudo等(FASEB J3608a，1989)。簡(jiǎn)言之，這一細(xì)胞提取成份來自用15g(濕重)PBS緩沖液洗滌HL60細(xì)胞微粒，將其加到磷酸葡萄糖柱上(P11)(1。6cm×28.0cm)，該柱預(yù)先用磷酸緩沖液(50mM磷酸鉀pH7.0，2mMMgCl2，1mMPMSF，，1mMDTT和10％glycerol)。平衡過。再用300ml同樣的緩沖液以0.1ml/min.的流速洗滌。未結(jié)合的蛋白質(zhì)經(jīng)高速離心濃縮成10ml，高速離心濃縮用YM5膜(5000M.W.cutoff，AmiconDiv.，Danvers，MA.，USA)。該濃縮物加到DEAE葡聚糖柱(2.6cm×28.5cm)上，該柱預(yù)先用Tris-緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5；2Mm MgCl2；1mM PMSF；1mM DTT和10％(v/v)glycerol)平衡并洗滌。用線性洗脫劑(含有0到1M NaCl的Tris緩沖液)洗脫NDP-Kinase/Nm23，洗脫速度為0.50ml/min.。用G.Pulido-Cejudo等所描述的方法(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)測(cè)定經(jīng)提純的NDP-Kinase/Nm23的活性。即通過測(cè)定以dADP作為磷酸鹽受體的dATP消耗量及一定量的酶來測(cè)定NDP-Kinase/Nm23活性。在NDP-Kinase/Nm23調(diào)節(jié)的磷酸鹽轉(zhuǎn)移到未標(biāo)記的dADP上之后，用DEAE離子交換試紙(DE81)從剩余的3HdADP中分離3HdATP。在使用之前所有的脫氧核甘酸和核甘酸需經(jīng)離子交換色譜純化。將23mM每一種核甘酸分別加到Partisil 10SAX分析柱上，該柱需用0.4M NH4H2PO4，pH3.9進(jìn)行平衡。兩個(gè)樣品的等度洗脫為1700至1800psi(Waters HPLC system Model 510)。純化后的樣品用氨調(diào)pH至7.0，用分光光度法在260nm測(cè)定最終濃度。將含有NDP-Kinase/Nm23活性的組分集中并用超速離心濃縮。將NDP-Kinase/Nm23濃縮物加到Sephacryl S-200柱(2.6×51cm)上，該預(yù)先柱用Ttris緩沖液平衡。經(jīng)這一純化步驟后便可得到所需的活性物質(zhì)。每一步提純后都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)的方法測(cè)定其濃度。簡(jiǎn)言之，100-200ul樣品用去離子水透析，然后把每個(gè)樣品2-20ul放入聚乙烯管中。樣品在110℃干燥60分鐘。接著用250ul冰醋酸中和。然后使樣品與500ul下列印三酮-還原印三酮溶液反應(yīng)，該溶液組成為2g印三酮，150mg還原印三酮(Sigma)溶于65ml 2-甲氧基乙醇，然后加入35ml 4M醋酸鈉(pH5.5)。將試管于110℃恒溫15分鐘。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然后在570nm測(cè)定其吸收度。蛋白質(zhì)含量可由吸收曲線得到，該曲線是由1-10ug BSA的樣品得到的。由HL60細(xì)胞提純細(xì)胞液NDP-Kinase/Nm23的摘要見表1。表1從HL60細(xì)胞中提純NDP-Kinase簡(jiǎn)介Total SpecificstepProtein1Activity2Activity2Fold Yield(mg) (nmol/min.) (nmol/min.) (％)Homogenate 875 125 0.141 100Supernatant 623 102 0.16 1.1581.60CellulosePhosphate135 100 0.74 5.1280.00CelluloseDEAE 1.18 1411.86 83.52 11.20SephacrylS-2000.006 6 1000 70.42 4.801.蛋白含量是在鹼性水解后測(cè)定的，對(duì)水解產(chǎn)物定量印三酮測(cè)定。
2.用first-order測(cè)定法檢測(cè)。
例2es-LAPase的分離和提純?nèi)祟惸[瘤組織的乳腺癌母細(xì)胞用100nm 17-B-Estradiol刺激24小時(shí)，或用培養(yǎng)介質(zhì)作對(duì)照。細(xì)胞介質(zhì)為RPMI 1640培養(yǎng)介質(zhì)+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素。經(jīng)在無縫葡聚糖試管(MV 12,400)中用PBS降解24小時(shí)(4℃)后收集上清液。然后用HPLC-凝膠滲透色譜與DEAE-纖維素和Bestatin-瓊脂糖凝膠親和色譜從降解的細(xì)胞上清液中純化LAP。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞上清液倒入Bio-Sil SEC-250柱(600×7.5mm)上，該柱子用含有100mM磷酸鈉(pH6.8)，100mMNa2SO4，1uM ZnCl2，和10％甘油緩沖液預(yù)先平衡。然后用300ml同樣的緩沖液以0.5ml/min.的流速洗滌柱子。用YM5膜高速離心將蛋白濃縮至10ml。濃縮液再經(jīng)DEAE纖維素柱(2.6×28.5cm)，此柱先用50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)；1uMZnCl2；和10％(v/v)甘油平衡并洗滌。Bestatin-親和柱的制備是根據(jù)廠家提供的方法，用Ultralink EDC/DADPA Amide結(jié)合基質(zhì)通過用100mg純Bestatin和EDC/DADPA基質(zhì)反應(yīng)制備的。在加入含LAP的洗滌液之前，將Bestatin親和柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)含1uM ZnCl2緩沖液平衡，再用300ml該結(jié)合緩沖液洗滌。LAPase用蠕動(dòng)pump以0.10ml/min.的流速通過這一系統(tǒng)進(jìn)行再循環(huán)兩小時(shí)。再循環(huán)后用八倍柱容量的結(jié)合緩沖液洗滌柱子。用線性洗脫液(0-0.5M NaCl)(含有1uM ZnCl2的10nM Tris-HCl pH 8.0)洗提Bestatin鍵合的LAPase。在280nm測(cè)定洗脫下來的鍵合LAP。提純的LAPase分裝成500ul儲(chǔ)存于50mM Tris-HCl pH 7.8和50uMZnCl2溶液中。每一步提純后都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)的方法測(cè)定其濃度。簡(jiǎn)言之，100-200ul樣品用去離子水透析，然后把每個(gè)樣品2-20ul放入聚乙烯管中。樣品在110℃干燥60分鐘。接著用250ul冰醋酸中和。然后使樣品與500ul下列印三酮-還原印三酮溶液反應(yīng)，該溶液組成為2g印三酮，150mg還原印三酮(Sigma)溶于65ml 2-甲氧基乙醇，然后加入35ml 4M醋酸鈉(pH5.5)。將試管于110℃恒溫15分鐘。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然后在570nm測(cè)定其吸收度。蛋白質(zhì)含量可由吸收曲線的到，該曲線是由1-10ug BSA的樣品測(cè)得的。
例3單克隆抗體MAb 7B6(抗-LAPase)和MAb 4A12(抗-NDP-Kinase)的生產(chǎn)和純化這一方案中的方法如免疫抗原的制備，免疫動(dòng)物脾細(xì)胞的制備，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，及融合細(xì)胞在選擇性HAT介質(zhì)中的涂鋪均來自Campbell所描述的及Lietzke和Unsicker所詳細(xì)描述的方法。與標(biāo)準(zhǔn)方法不同，我們用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法是用高純度的NDP-Kinase(7000倍純度-見表1)進(jìn)行第一免疫，而不是粗提物和部分提純的酶制劑。腹水液的制備是在注射3×106骨髓瘤細(xì)胞之前一周，通過用500l去甲植烷啟動(dòng)BALB/C小鼠而獲得的。20天之后收集腹水液。從腹水液中提純IgG免疫球蛋白是根據(jù)廠家的說明用3ml蛋白G瓊脂糖凝膠4FT柱上進(jìn)行親和色譜法。
對(duì)NDP-Kinase單克隆抗體的篩選是用在硝酸纖維素上的點(diǎn)圖免疫染色法。即將0.5-1ug NDP-Kinase(5ul)點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，在37C與PBS/3％BSA(固定溶液)干燥，并固定。在固定溶液中制備的鼠單克隆抗體(1/100和1/500倍稀釋)與固定的NDP-Kinase一起于37C恒溫17小時(shí)，然后用免疫過氧化物酶法測(cè)定。
單克隆抗體MAb 4A12于1994年5月27日存放在American Type CultureCollection，標(biāo)號(hào)為CRL 11634。
制備分泌對(duì)17-B-雌二醇-響應(yīng)物L(fēng)APase的鼠單克隆抗體，免疫抗原制備方法，免疫動(dòng)物脾細(xì)胞的制備，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，及融合細(xì)胞在選擇性HAT介質(zhì)中的涂鋪均來自Campbell所描述的及Lietzke和Unsicker所詳細(xì)描述的方法。
總之，基本的免疫反應(yīng)是用提純的es-LAPase經(jīng)脫鹽后進(jìn)行的。在14，35和56天用提純的es-LAPase進(jìn)行促進(jìn)。在24和45天篩選BALB/C小鼠。小鼠在第59天殺死，將最好的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過在硝酸纖維素上的點(diǎn)圖免疫染色進(jìn)行篩選。
用限制稀釋單細(xì)胞克隆獲得雜交瘤克隆7B6。準(zhǔn)備四個(gè)系列稀釋試管，其中含有雜交瘤細(xì)胞及20％FBS +2X OPI。將每個(gè)稀釋液100ul加到96孔的盤中，并在個(gè)孔中加入50ul脾喂養(yǎng)細(xì)胞，放于37℃ 5％ CO2恒溫箱。第七天，從個(gè)孔中取上清液并用在硝酸纖維素上的點(diǎn)圖免疫染色進(jìn)行篩選。
把雜交瘤克隆7B6細(xì)胞由96孔盤中轉(zhuǎn)移到0.5ml培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液含有20％FBS +1X OPI+ 1X HAT放于24孔的盤中。一旦細(xì)胞濃縮，將其5mls轉(zhuǎn)移至60mm盤，然后再成10ml轉(zhuǎn)移至100mm盤中。當(dāng)60mm盤中的細(xì)胞被認(rèn)為沒有次黃票呤，胸腺密定脫氧核甘，氨基票呤，7B6雜交瘤細(xì)胞將繼續(xù)生長(zhǎng)直到成指數(shù)級(jí)生長(zhǎng)?？?LAPase，MAb 7B6從收集的雜交瘤7B6細(xì)胞上清液中用免疫純的IgG親和色譜分離。用在硝酸纖維素上的點(diǎn)圖免疫染色進(jìn)行篩選。
MAb 4A12與MAb 7B6類型用Sigma的免疫分類試劑測(cè)定。即單克隆與預(yù)涂分類硝酸纖維膜結(jié)合，然后用靈敏的生物素-抗生物素蛋白-酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行免疫測(cè)定。MAb 4A12的類型是IgG2a，MAb 7B6為IgG1a。
例4雌激素對(duì)細(xì)胞液與乳腺癌母細(xì)胞系的Stromal細(xì)胞部分中NDP-Kinase/Nm23活性作用乳腺腫瘤細(xì)胞系母細(xì)胞與100nM 17-B-雌二醇一起恒溫24小時(shí)。用只與細(xì)胞培養(yǎng)液一起恒溫的細(xì)胞作對(duì)照。細(xì)胞液和基質(zhì)細(xì)胞組分用G.Pulido-Cejudo提出的方法分離。每種細(xì)胞組分的NDP-Kinase/Nm23活性用例子交換-HPLC測(cè)定。
分離的細(xì)胞液和stromal細(xì)胞及由HL60提純的NDP-KI-inase/Nm23，重組Nm23-H1在不變性條件下進(jìn)行電泳。將膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。膜與Tris緩沖液(TBS)在37℃反應(yīng)一小時(shí)，然后用1∶100倍稀釋(TBS)的NDP-Kinase/Nm23(MAb4A12)探針測(cè)定。用1∶500倍稀釋(TBS)的羊-抗0鼠-鹼性磷酸酶反應(yīng)，則有可見帶出現(xiàn)，然后用BCIP和NBT為底物的鹼性磷酸酶底物緩沖液進(jìn)行比色測(cè)定。
含有NDP-Kinase/Nm23的膠在不變性條件下進(jìn)行電泳，并用Lam和Packham的方法染色測(cè)定NDP-Kinase/Nm23活性。含有NDP-Kinase/Nm23的樣品用預(yù)先吸收在蛋白-A-瓊脂糖凝膠微珠上的MAb 4A12單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀。首先蛋白-A-瓊脂糖凝膠-MAb 4A12免疫親和系統(tǒng)用10％FCS-RPMI 1640反應(yīng)2小時(shí)，用10mMTris-HCl(pH8.0)洗滌。已知NDP-Kinase/Nm23活性的樣品(100pl)與未反應(yīng)的蛋白-A瓊脂糖凝膠-微珠或蛋白-A-瓊脂糖凝膠MAb 4A12系統(tǒng)一起在攪拌下于4℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后用Larn和Packham的方法測(cè)定上清液中的NDP-Kinase/Nm23活性。
如表2所示，經(jīng)雌激素刺激后的細(xì)胞液組分中的NDP-Kinase/Nm23活性幾乎是空白的40倍。然而，雌激素暴露可以增加細(xì)胞液中NDP-Kinase/Nm23活性，在膜結(jié)合的NDP-Kinase/Nm23活性則相反。
表2在stromal和細(xì)胞液的細(xì)胞組分中NDP-Kinase/Nm23活性NDP-Kinase/Nm23活性(umoles dATP/ug)Condition Stromal CytosolicControl 6.5±0.2×10-11.8±0.2Estrogen1.1±0.1×10-244.8±2.1(100nM)NDP-Kinase/Nm23酶活性用G.Pulido-Cejudo等的方法測(cè)定。
對(duì)未反應(yīng)的NDP-Kinase/Nm23的細(xì)胞表面分布進(jìn)行分析。如

圖1所示，對(duì)原細(xì)胞液制劑(lane1)和由HL60細(xì)胞提純的NDP-Kinase/Nm23(lane2)和重組Nm23-H1(lane3)在未變性PAGE上進(jìn)行Western Blots，結(jié)果表明用NDP-Kinase/Nm23MAb 4A12單克隆抗體，所有的樣品的電泳結(jié)果都有相同帶。
進(jìn)一步的試驗(yàn)來鑒別蛋白帶的一致性，用MAb 4A12對(duì)未變性PAGE的原細(xì)胞提取物進(jìn)行鑒定并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。如圖2所示，一個(gè)樣品對(duì)NDP-Kinase/Nm23活性染色(lane1)，第二個(gè)與抗-NDP-Kinase/Nm23 MAb 4A12單克隆抗體反應(yīng)(lane2)。含有NDP-Kinase/Nm23活性的蛋白帶(lane1)，與用MAb4A12單克隆抗體的Western blot(lane2)具有完全相同的位置。總的說來，這些結(jié)果證實(shí)了單克隆抗體MAb 4A12的專屬性，并提示后一抗體能夠識(shí)別活性NDP-Kinase/Nm23細(xì)胞液?jiǎn)尉畚?。最后，這一抗體用于研究NDP-Kinase/Nm23在外周血細(xì)胞中的分布，這些外周血細(xì)胞是從正常人和患有轉(zhuǎn)移性癌癥(肺和腦)的病人的到的。
例5正常人和患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌婦女病人外周血細(xì)胞中NDP-Kinase/Nm23的流動(dòng)細(xì)胞學(xué)細(xì)胞分布將正常婦女和患病婦女的全血在4℃以1500rmp速度離心10分鐘。吸去上清液，用等體積的PBS稀釋，加到FIcoll-Paque上。繼續(xù)以1500rmp速度離心30分鐘，在界面上收集PBMC。用PBS洗滌細(xì)胞三次。
用兩種免疫熒光方法將全血細(xì)胞染色。即，將20ul MAb 4A12抗體(200ug/ml)或?qū)φ誌gG1，加到100ul血樣中。恒溫30min.后用100ul冷PBS洗滌并溶解細(xì)胞，然后，加入羊-抗-屬IgG-FITC-結(jié)合抗體。將混合物恒溫20分鐘，再洗滌，用100ulPBS溶解細(xì)胞。血細(xì)胞進(jìn)一步和20ul下列phycoerthrin-結(jié)合的鼠抗體之一培養(yǎng)IgG-PE(對(duì)照)，Leullc-PE(anti-CD16)，Leu 19-PE(anti-CD56)。在恒溫15分鐘后，在自動(dòng)Q-prep工作站處理紅細(xì)胞，這一工作站能夠連續(xù)輸送紅細(xì)胞溶解試劑，一種白細(xì)胞穩(wěn)定劑和固定劑。在erythrocyte水解后再用PBS洗滌細(xì)胞兩次并用1ml 2％低聚甲醛固定。樣品用帶有空氣冷卻的氬離子激光(10mwatt)流動(dòng)細(xì)胞學(xué)分析儀分析。固定激發(fā)波長(zhǎng)在488nm同時(shí)得到了FITC和PE的激發(fā)光。依據(jù)在雙波長(zhǎng)顯示器上前光束(FAS)和側(cè)光束(SS)，淋巴細(xì)胞與單細(xì)胞和粒細(xì)胞有明顯區(qū)別。在細(xì)胞周圍有一個(gè)電子門用于分析，此電子門具有對(duì)粒細(xì)胞，單細(xì)胞，和淋巴細(xì)胞有光色散性質(zhì)。
在細(xì)胞周期中，提出膜鍵合的NDP-Kinase/Nm23可能調(diào)節(jié)腺甘酸循環(huán)酶活性，這一調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)G蛋白(Gs和Gl)活性所需要的GTP水平，而蛋白G又可調(diào)節(jié)腺甘酸循環(huán)酶的激和和抑制。這一觀察為我們提供了測(cè)定抗-NDP-Kinase抗體(MAb 4A12)對(duì)外周血細(xì)胞(PBMC)的反應(yīng)性。用MAb 4A12抗體，許多藻紅蛋白-結(jié)合單克隆抗體進(jìn)行兩個(gè)有色免疫熒光研究，認(rèn)識(shí)到了有不同的淋巴細(xì)胞亞種(subset)所表達(dá)的特征性epitopes。發(fā)現(xiàn)有健康婦女的PBMS能同時(shí)用抗-CD19(圖3，1A)和MAb 4A12單克隆抗體(圖3，1B)標(biāo)記，這些PSMC中只有淋巴細(xì)胞帶有B-細(xì)胞(CD19+B細(xì)胞)的CD19同一的膜糖蛋白特性。在這一方面，只有93％的CD19+B-淋巴細(xì)胞(圖3，1A)表達(dá)健康婦女PBMC中被MAb 4A12識(shí)別的抗原。相反，觀察到在患病婦女雙標(biāo)記的CD19+NDP-Kinase-B-淋巴細(xì)胞中明顯減少(見表3)。表3外周血循環(huán)B-細(xì)胞雙標(biāo)記抗-CD19/抗-NDP-Kinase的百分比％ of anti-CD19/anti-NDP-KinaseDouble labelled B-lymphocytes(B-gate)Normal Subjects 93.30±1.02Women with MetastaticDisease(lung/brain) 2.91±0.82沒有其他淋巴細(xì)胞能被對(duì)細(xì)胞液中NDP-Kinase的單克隆抗體有選擇性標(biāo)記?；谶@一分析，NDP-Kinase/Nm23單克隆抗體只標(biāo)記B-淋巴細(xì)胞，很可能通過與膜相關(guān)的NDP-Kinase/Nm23單聚體反應(yīng)而標(biāo)記。
例6人類乳腺癌母細(xì)胞的ELASA分析人類乳腺癌母細(xì)胞進(jìn)行ELASA分析說明MAb 4A12和7B6對(duì)NDP-Kinase和LAPase相應(yīng)的活性。簡(jiǎn)言之，在96孔的盤上，每孔加入在RPMI 1640培養(yǎng)液中的50000母細(xì)胞+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素，于37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)。除去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞，隨后用1％gluteraldehydrade的PBS溶液室溫下固定1小時(shí)。用PBS洗滌，然后用casein在37℃，5％CO2封閉一小時(shí)。用PBS洗滌后，在孔里加入MAb 4A12或MAb 7B6的系列稀釋液并在37℃，5％CO2培養(yǎng)2小時(shí)。在加入第二抗體，抗-(IgG+IgM)過氧化物酶結(jié)合的羊-抗-鼠IgG+IgM(H+L)和OPD之后，能夠顯示MAb 4A12和MAb7B6反應(yīng)性。用MAb 7B6對(duì)人LAP在490nm測(cè)得的讀數(shù)總結(jié)如下(表4)。表4MAb 7B6對(duì)人類乳腺癌母細(xì)胞LAP反應(yīng)性的總結(jié)MAb 7B6Cell Line 1 OD 490nm- Cell Line 2 OD 490nm-(ng/well)Blank OD490nm Blank OD490nm200 0.707-0.054＝0.653 0.6-0.005＝0.595100 0.57-0.021＝0.549 0.446-0.003＝0.4350 0.489-0.042＝0.447 0.327-0.003＝0.32425 0.38-0.047＝0.333 0.24-0＝0.2412.5 0.294-0.05＝0.244 0.165-0＝0.1656.25 0.225-0.05＝0.176 0.1-0.003＝0.0973.1250.155-0.044＝0.111 0.068-0.003＝0.0651.56 0.107-0.05＝0.057 0.043-0.002＝0.0410.78 0.094-0.005＝0.039 0.023-0.001＝0.0220.39 0.067-0.073＝0 0.015-0＝0.0150.2 0.061-0.052＝0.009 0.008-0＝0.0080.1 0.053-0.046＝0.007 0-0＝0例7初期乳腺癌婦女血漿中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性初期乳腺癌病人與相同年齡的健康婦女血漿中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性用HPLC測(cè)定進(jìn)行比較，用亮氨酸-B-奈氨作為底物用熒光光度法測(cè)定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性。在100℃煮沸10分鐘來終止反應(yīng)，然后在4℃以780Xg離心10分鐘。所得值代表每一試驗(yàn)組中16個(gè)病人三次測(cè)定的平均值。用血漿免疫沉淀法測(cè)定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性，免疫沉淀用的是共價(jià)MAb 4A12(IgG2a)-蛋白G和LAPaseMAb 7B6(IgG1a)-蛋白基質(zhì).簡(jiǎn)言之，將血漿在4℃，500xg離心10分鐘。吸出血漿，繼續(xù)在4℃，500xg離心5分鐘。最后，用PBS將血漿按1∶10稀釋，把800ul血漿稀釋液加到共價(jià)MAb 4A12(IgG2a)-蛋白G和LAPaseMAb 7B6(IgG1a)-蛋白基質(zhì)，其中含有5ug抗體在200ul預(yù)先用封閉緩沖液(50mMTris-HCl；0.5％非脂肪牛奶)培養(yǎng)過的珠粒上。樣品放在預(yù)涂0.5％BSA的Eppendorf試管中在不斷輕輕旋轉(zhuǎn)下，室溫下培養(yǎng)15分鐘。
經(jīng)培養(yǎng)后的樣品于250xg，室溫下用Eppendorf離心機(jī)離心，除去上清液。含有NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase活性的珠粒用PBS，0.5％NFDM洗滌兩次。最后用無鈣的Hank′s溶液再溶解使最終體積為600ul及182uM 1-亮氨酸-B-奈氨。用MAb4A12(IgG2a)-ProteinG和LAPase MAb 7B6(IgG1a)-PtoteinG-珠粒(涂有0.5％NFDM)作為相應(yīng)的空白。
用MAb 4A12(抗-NDP-Kinase/Nm23)和MAb 7B6(抗-LAPase)進(jìn)行血漿免疫沉淀結(jié)果顯示，患有非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和轉(zhuǎn)移癌的病人血液中的雌激素依賴性標(biāo)記水平高于正常健康婦女。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5和表6。
表5患乳腺癌婦女血漿中的es-LAPase水平Patient Population LAPase Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 5-10DCIS(non-invasive)450-600Metastatic(Lung/Brain)1200-3700表6患乳腺癌婦女血漿中的NDP-Kinase/Nm23水平Patient PopulationNDP-Kinase/Nm23 Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 0.2-0.8DCIS(non-invasive) 15-25Metastatic(Lung/Brain) 500-890例8流動(dòng)細(xì)胞學(xué)測(cè)定腫瘤組織的乳腺上皮癌母細(xì)胞中膜結(jié)合的es-LAPase和NDP-Kinase-Nm23腫瘤組織上皮細(xì)胞間接免疫熒光染色法是將吸附了MAb 4A12或MAb7B6抗體的人血清與附著細(xì)胞一起培養(yǎng)。即，用PBS洗滌融合的細(xì)胞，與20ul MAb 4A12或MAb 7B6抗體(200ug/ml)或?qū)φ招∈驣gG1于37℃培養(yǎng)，最終體積為2ml。經(jīng)20分鐘培養(yǎng)后，立即用PBS洗滌細(xì)胞。再與鼠-抗-IgG-PE或鼠-抗-IgG-FITC結(jié)合物一起培養(yǎng)15分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞三次，取一部分用夷蛋白酶處理并用流動(dòng)細(xì)胞儀分析，儀器備有氣體冷卻的氬離子激光，其操作功率為10mwatt。在激發(fā)波長(zhǎng)為488nm時(shí)，可同時(shí)測(cè)得FITC和PE結(jié)合物的激發(fā)。
用ELISA法使用單克隆抗體MAb4A12和MAb 7B6測(cè)定患早期乳腺癌婦女血漿中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase水平與相同年齡健康婦女比較。
在將單克隆抗體MAb4A12和MAb7B6提純后，其相應(yīng)的IgG2a(Anti-NDP-Kinase/Nm23)和IgG1(Anti-es-LAPase)通過DSS交叉連接系統(tǒng)固定，這一系統(tǒng)來自與Pierce(Rockford，IL，USA)。
MAb4A12和MAb 7B6蛋白G基質(zhì)用于由血漿或細(xì)胞膜鍵合組分(預(yù)先測(cè)定酶活性)中選擇性免疫沉淀NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase。結(jié)果見表7。
表7乳腺癌婦女腫瘤組織分離的上皮母細(xì)胞中NDP-Kinase/Nm23在stromal和細(xì)胞液部分的活性與患良性囊腫和纖維瘤病人的比較NDP-Kinase/Nm23活性(umole dATP/ug)Condition Stromal CytosolicFibroadenomas/cysts 80.24±1.22 3.18±DCIS(non-invasive)3.22±0.12 25.34±Metastatic(Ling/Brain) 0.15±0.04 102±2.3這里所用的參考文獻(xiàn)，專利及專利申請(qǐng)見本文的參考文獻(xiàn)。
我們以例子解釋我們的發(fā)明，但是我們的研究并不限制于這些解釋。對(duì)我們發(fā)明的全面解釋見下列說明。
權(quán)利要求
1.通過測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測(cè)乳腺癌的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測(cè)是從一組測(cè)定方法中選出的，這一組測(cè)定方法包括免疫測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平；免疫測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中NDP-Kinase的存在是用人HL60細(xì)胞的對(duì)細(xì)胞液和膜結(jié)合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定測(cè)得的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系4A12制備的，并存放在ATCC，序列號(hào)為CRL 11634。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中es-LAPase的存在是用對(duì)es-LAPase有特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定測(cè)得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系7B6制備的，并存放在加拿大國(guó)際存放機(jī)構(gòu)，序列號(hào)為。
7.用測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測(cè)轉(zhuǎn)移癌的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測(cè)是從一組測(cè)定方法中選出的。這一組測(cè)定方法包括免疫測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平；免疫測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase的存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中NDP-Kinase的存在是用人HL60細(xì)胞的對(duì)細(xì)胞液和膜結(jié)合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定測(cè)得的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系4A12制備的，并存放在ATCC，序列號(hào)為CRL 11634。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中es-LAPase的存在是用對(duì)es-LAPase有特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定測(cè)得的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系7B6制備的，并存放在加拿大國(guó)際存放機(jī)構(gòu)，序列號(hào)為。
13.用測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平來檢測(cè)乳腺癌發(fā)展的危險(xiǎn)性的方法。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測(cè)是從一組測(cè)定方法中選出的，這一組測(cè)定方法包括免疫測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平；免疫測(cè)定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase的存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中NDP-Kinase的存在是用人HL60細(xì)胞的對(duì)細(xì)胞液和膜結(jié)合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定測(cè)得的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系4A12制備的，并存放在ATCC，序列號(hào)為CRL 11634。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中es-LAPase的存在是用對(duì)es-LAPase有特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定測(cè)得的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系7B6制備的，并存放在加拿大國(guó)際存放機(jī)構(gòu)，序列號(hào)為。
19.用免疫測(cè)定法檢測(cè)樣品中NDP-Kinase和-LAPase的診斷系統(tǒng)，其包括用HL60細(xì)胞的對(duì)細(xì)胞液和膜結(jié)合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體作為第一抗體，用es-LAPase特異性單克隆抗體作為第二抗體測(cè)定一組分別患有乳腺癌，轉(zhuǎn)移癌，和具有乳腺癌發(fā)病危險(xiǎn)病人的狀況。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的診斷系統(tǒng)，其中第一單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系4A12制備的，并存放在ATCC，序列號(hào)為CRL 11634，第二單克隆抗體是用雜交瘤細(xì)胞系7B6制備的，并存放在加拿大國(guó)際存放機(jī)構(gòu)，序列號(hào)為。
全文摘要
對(duì)人類疾病如癌癥進(jìn)行有效檢測(cè)及設(shè)計(jì)治療藥物的關(guān)鍵在于能夠鑒別危險(xiǎn)因素和病理生理改變的分子聯(lián)系。在正常生理?xiàng)l件下,雌激素對(duì)多個(gè)器官起關(guān)鍵性的作用。這些組織對(duì)雌激素刺激的反應(yīng)能夠部分解釋其在各種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展中所起的活性作用,尤其是對(duì)乳腺癌。對(duì)早期乳腺癌腫瘤組織母細(xì)胞中能對(duì)雌激素響應(yīng)的細(xì)胞因子的研究,發(fā)現(xiàn)了兩種標(biāo)示物。一種是來自早期乳腺癌腫瘤組織母細(xì)胞的假定的LAPase的同功酶,另一種是來自HL60細(xì)胞的細(xì)胞液NDP－Kinase.Nm23。生產(chǎn)出了對(duì)每一種細(xì)胞標(biāo)記物的單克隆抗體。單獨(dú)或一起測(cè)定這兩種標(biāo)記物的存在,可用于檢測(cè)乳腺癌特別是與轉(zhuǎn)移有關(guān)的癌癥。因此,這一發(fā)明指的是LAPase和NDP－Kinase/Nm23兩個(gè)單克隆抗體在固體基質(zhì)中一起使用,來確認(rèn)對(duì)乳腺癌的血液測(cè)定的免疫測(cè)定方法。
文檔編號(hào)A61P31/18GK1351714SQ00807917
公開日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月30日
發(fā)明者卡布里耶·普利多－塞胡多 申請(qǐng)人:堪波瑞爾醫(yī)療診斷加拿大控股公司, 加拿大衛(wèi)生部