專利名稱：降膽固醇劑,膽酸次級(jí)產(chǎn)生抑制劑,以及食品和飲料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠降低血液或肝臟的膽固醇濃度并改善致動(dòng)脈粥樣化指標(biāo)的降膽固醇劑；涉及一種用于防治結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽石病等的膽酸次級(jí)產(chǎn)生抑制劑；以及涉及其在生產(chǎn)食品和飲料中的用途。
動(dòng)脈硬化由不同因素引起。在這些因素中，血脂濃度，特別是血漿膽固醇濃度被認(rèn)為是最危險(xiǎn)因素之一。
引起高血漿膽固醇濃度的一個(gè)原因是遺傳疾病。在這種情況下，對(duì)病重患者進(jìn)行飲食治療，同時(shí)使用藥物如膽固醇合成抑制劑、尼可莫爾(Nicomol)、氯貝特(Clofibrate)、一種離子交換樹脂和一種促蛋白合成類固醇。然而，這些藥物產(chǎn)生副作用如對(duì)肝臟的毒性、胃腸紊亂和致癌性。
引起高血漿膽固醇濃度的另一個(gè)重要原因是脂類的過量消耗，所述脂類的過量消耗是由于近期食用大量的雞蛋、黃油、肉等的飲食習(xí)慣而引起的，脂類的過量消耗已經(jīng)成為年輕人的普遍習(xí)慣。由脂類的過量消耗引起的營養(yǎng)性高膽固醇血一般不如由遺傳因素引起的高膽固醇血嚴(yán)重。但是營養(yǎng)性高膽固醇引起膽固醇從低齡期開始在血管壁上逐步積累并且可能在成人期引起動(dòng)脈硬化，而且它們與甘油三酯一起能引起心梗塞和腦梗塞。對(duì)于這些高脂血，采取包括將脂類消耗限制在適當(dāng)范圍在內(nèi)的飲食治療非常重要，而不采取出現(xiàn)問題如副作用的藥物治療。然而，受飲食限制的患者遭受精神痛苦并且必須放棄他們的正常飲食的享受。因此，進(jìn)行完全的飲食治療是非常困難的，并且其效果通常受到限制。
血漿中的過量膽固醇在血管的內(nèi)側(cè)積累，結(jié)果導(dǎo)致動(dòng)脈硬化。然而。如果膽固醇被肝臟吸收，膽固醇及其稱作膽酸的代謝物被分泌到腸道中而不在肝臟中積累，然后與糞便一起被排泄到體外，因而避免了通過上述機(jī)理引起的動(dòng)脈硬化。因此，需要一種具有降低肝臟膽固醇濃度和血漿膽固醇濃度作用的降膽固醇劑。
已經(jīng)公開了多種具有降膽固醇作用的微生物，這些微生物能引起輕微的副作用。然而，對(duì)酵母菌公開的數(shù)目驚人的少。很早以前，就已經(jīng)知道啤酒酵母是一種典型的酵母，并且在幾篇文獻(xiàn)中記載了它能改善脂類代謝的作用。例如，公開了以下幾種情況，一種情況是對(duì)年齡稍長的接受治療者進(jìn)行的8個(gè)星期的加鉻-釀酒微生物(9g/天)用藥從而降低了血清中的膽固醇濃度[Ester G.Offenbacher和F.Xavier Pi-Sunyer，富鉻酵母對(duì)年齡稍長的受治療者的葡萄糖耐受力和血脂的有利作用。糖尿病(Diabetes)，29，919，(1980)]；一種情況是對(duì)年齡稍長的接受治療者進(jìn)行的10個(gè)星期的氯化鉻和啤酒酵母用藥沒有對(duì)血清膽固醇濃度和甘油三酯濃度的作用[Caral J.Rinko，和F.Xavier Pi-Sunyer，無機(jī)鉻和啤酒酵母對(duì)年齡稍長的受治療者的葡萄糖耐受力，血脂和血漿鉻的作用.，Am.J.Clin.Nutr.，42，454，(1985)]；和一種情況是對(duì)接受治療的人進(jìn)行的未加鉻-啤酒酵母用藥沒有產(chǎn)生降低血清中膽固醇濃度的作用[Arne T.Hostmark，Einar Eilertsen，和Ole Gronnerod，大鼠對(duì)含或不含啤酒酵母的淀粉和蔗糖食物的血漿脂類和脂蛋白反應(yīng).，J.Nutri.，109，1073，(1978)]。另外，還公開了一種情況，其中食用添加了大豆蛋白的食物降低了大鼠的血清膽固醇濃度，但是當(dāng)50％的大豆蛋白被換成啤酒酵母時(shí)，所述濃度略有增加[Jorge DeAbreu和Nancy Millan，大豆蛋白和酪蛋白中加入啤酒酵母對(duì)兔血漿膽固醇濃度的作用.Archivos Latinoamericanos deNutricion.，44，18，(1994)]。
如上所述，目前仍存在關(guān)于啤酒酵母對(duì)改善脂類代謝作用的不同理論。
其它酵母的作用也被文獻(xiàn)公開。例如，據(jù)報(bào)道Sporobolomyces(擲孢酵母)ruberrinus的甲醇提取物以及葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的甲醇提取物略微降低了膽固醇-負(fù)荷大鼠的血清膽固醇濃度和甘油三酯濃度(Shuji CHO，Hisao FUJII，和Jun Shiraishi，納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的多糖或酵母的乙醇提取物對(duì)大鼠的脂類代謝的影響. Bulletin of the Faculty of Home Life Science，F(xiàn)ukuokaWomen’s University，16，65，(1984))。還公開了一種情況，其中啤酒糖酵母的培養(yǎng)上清液降低了小鼠的血清膽固醇濃度[Tadaaki Kishida，啤酒糖酵母的液體培養(yǎng)物對(duì)血清膽固醇濃度的降低作用.Jurnal ofJapanese Society of Food and Nutrition，26，371，(1973)]。
然而，只有少數(shù)幾篇報(bào)道表明除了啤酒酵母以外的酵母或其組分對(duì)改善脂類代謝的影響。
在人的肝臟中，初級(jí)膽酸如膽酸和鵝去氧膽酸由膽固醇來合成，并且與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合，因而產(chǎn)生結(jié)合甘氨酸的膽酸或結(jié)合牛磺酸的膽酸，所述膽酸通過膽汁管被分泌到消化道中。膽酸通過它的表面活性作用使得含在食品和飲料中的脂類進(jìn)行乳化和分散，并且促進(jìn)脂類的消化和吸收。膽酸從回腸再次被活化吸收，通過門靜脈返回到肝臟中，并且被再次分泌到消化道中。因此，膽酸重復(fù)進(jìn)行腸肝循環(huán)。
沒被回腸吸收的部分膽酸通過腸細(xì)菌進(jìn)行了改構(gòu)；例如，早期解離，7α-去羥基化，氧化，還原，或差向異構(gòu)化而轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽酸。通過所述過程產(chǎn)生的次級(jí)膽酸主要是通過初級(jí)膽酸(分別是膽酸和鵝去氧膽酸)的7α-去羥基化而形成的去氧膽酸和石膽酸。部分膽酸被大腸被動(dòng)吸收并且轉(zhuǎn)移到肝臟中，以與初級(jí)膽酸情況相似的方式重復(fù)腸肝循環(huán)。次級(jí)膽酸的剩余部分被排泄到糞便中。
近年來，由存在于大腸腸道中的腸細(xì)菌產(chǎn)生的次級(jí)膽酸如去氧膽酸和石膽酸被發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌等的發(fā)病密切相關(guān)。通常，觀察到的致癌過程包括其中一種基因被致癌物、放射或一種病毒所突變的起始步驟和其中由于長期暴露于促進(jìn)劑而導(dǎo)致生長和分化發(fā)生異常的步驟。至今，已公開了次級(jí)膽酸如去氧膽酸和石膽酸作為第二步驟中的促進(jìn)劑而促使結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌等的發(fā)病(Narisawa，T.，等，J.Natl.CancerInst.，53，1093-1097，1974；Tsuda，H.，等，Gann，75，871-5，1984；和Makino，T.，等，J.Natl.Cancer Inst.，76，967-75，1986)。還公開了次級(jí)膽酸的致癌物活性比初級(jí)膽酸強(qiáng)得多(Narisawa，T.，等，J.Natl.Cancer Inst.，53，1093-1097，1974；和Reddy，BS.，等，Cancer Res.，37，3238-3242，1977)。而且，最近已經(jīng)公開除了癌癥，去氧膽酸可能還與膽石病的發(fā)病有關(guān)(Marcus，SN.，Heaton，KW.，Gut，29，522-533，1988)。
因?yàn)橛纱嬖谟诖竽c腸道中的腸細(xì)菌產(chǎn)生的次級(jí)膽酸如去氧膽酸和膽石酸具有很強(qiáng)的致癌物活性并引發(fā)膽石病，如結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌這樣的疾病，因此膽石病能夠通過抑制次級(jí)膽酸的產(chǎn)生來得到防治。
至今，抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生的抑制劑已被公開，雖然抑制效果很弱。這些抑制劑是氨芐青霉素—一種青霉素的衍生物(Low-Beer，TS.，Nutter，S.，Lancet，2(8099)，1063-1065，1978)，3α，12β-二羥基-5β-膽烷-24-N-甲胺(Road，A.，等，J.Pharm.Sci.，81，237-240，1992)；乳果糖—一種寡聚糖(Magengast，F(xiàn)M.，Eur.J.Clin.Invest.，18，56-61，1988)；和小麥麩(Lampe，JW.，等，Gut，34，531-536，1993)。
氨芐青霉素和3α，12β-二羥基-5β-膽烷-24-N-甲胺通過去除大腸腸道中的能夠催化7α-脫羥基反應(yīng)的細(xì)菌而抑制次級(jí)膽酸的產(chǎn)生。然而，如果長期使用這些抑制劑，則出現(xiàn)一些問題如產(chǎn)生抗性細(xì)菌和不利的副作用。另外，通過利用抗生素選擇性地去除與次級(jí)膽酸的產(chǎn)生有關(guān)的細(xì)菌是不可能的，并且抗生素的使用也同時(shí)去除了在維持人體健康方面起著相當(dāng)重要作用的腸細(xì)菌；例如，乳桿菌和雙歧桿菌，這是非常嚴(yán)重的問題。
乳果糖和小麥麩被認(rèn)為能抑制7α-脫羥基酶的活性，它在中性區(qū)具有最佳pH，通過降低大腸腸道內(nèi)的pH起作用，從而降低次級(jí)膽酸的產(chǎn)生，然而這些物質(zhì)效果較差，不能達(dá)到防治疾病的水平。
鑒于上述內(nèi)容，本發(fā)明的目的是提供一種降膽固醇劑，該降膽固醇劑通過使用副作用較少較輕的安全酵母菌能夠有效降低血膽固醇濃度或肝膽固醇濃度。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種高效安全的次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑，該次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑用于防治疾病如結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌和膽石病。
本發(fā)明的公開本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)屬于以下特定組的酵母菌能夠有效地降低血膽固醇或肝膽固醇并且產(chǎn)生的副作用較小和較輕，并且發(fā)現(xiàn)所述酵母抑制初級(jí)膽酸向次級(jí)膽酸的轉(zhuǎn)化?；谶@些發(fā)現(xiàn)而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了含有至少一種作為活性成分的下述酵母的降膽固醇劑以及含有所述酵母的食品和飲料，所述酵母屬于假絲酵母屬(Candida)、伊氏酵母屬(Issatchenkia)、有孢漢遜氏酵母屬(Hanseniaspora)、克勒克氏酵母屬(Kloeckera)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)或有孢圓酵母屬(Torulaspora)。
本發(fā)明還提供了這些酵母在制備降膽固醇劑以及降膽固醇的食品和飲料中的用途。
而且，本發(fā)明提供了一種通過這些特定酵母菌的用藥來降低膽固醇的治療方法。
而且，本發(fā)明提供了一種次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑，該抑制劑含有作為活性成分的酵母菌，以及含有該酵母菌的食品和飲料。
而且，本發(fā)明提供了所述酵母菌在制備次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑以及用于抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生的食品和飲料中的用途。
而且，本發(fā)明提供了一種通過一種酵母菌的用藥來抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生的治療方法。
附圖的主要描述

圖1是表示服用添加膽固醇的食物的試驗(yàn)組和服用未添加膽固醇的食物的試驗(yàn)組的血漿濃度。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最好方式本發(fā)明的降膽固醇劑或食品和飲料中使用的酵母菌是屬于假絲酵母屬、伊氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、克勒克氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬或有孢圓酵母屬的酵母菌。這些酵母菌可以單獨(dú)使用或以兩種或多種菌種結(jié)合的方式使用。上述酵母菌可以是活細(xì)胞、加熱過的細(xì)胞、凍干產(chǎn)品、其碾磨產(chǎn)品，或其內(nèi)含物。
屬于上述組的優(yōu)選酵母菌實(shí)例包括乳酒假絲酵母(Candidakefyr)、東方伊氏酵母(Issatrchenlcia orientalis)、Hanseniaspora(有孢漢遜氏酵母)uvarum、非洲克勒克氏酵母(Kloeckera africana)、馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromycesmarxianns)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、粉狀畢赤氏酵母(Pichia fayinosa)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。這些酵母菌中，最優(yōu)選的酵母菌是下列酵母菌乳酒假絲酵母YIT 8237(FERM BP-7214，最初保藏日期為1999年，7月16日；保藏機(jī)構(gòu)，國際貿(mào)易和工業(yè)部，國立生命科學(xué)和人體-技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(地址1-3，Higashi1-chom，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本(下面都相同)))；Hanseniaspora uvarum YIT 8164(FERM BP-7212，最初保藏日期為1999年，7月16日)；東方伊氏酵母YIT 8266(FERM BP-7215，最初保藏日期為1999年，7月16日)；非洲克勒克氏酵母YIT 8165(FERMBP-7213，最初保藏日期為1999年，7月16日)；馬克斯克魯維氏酵母YIT 8292(FERM BP-7217，最初保藏日期為1999年，7月16日)；乳克魯維氏酵母YIT 8263(FERM BP-7216，最初保藏日期為1999年，7月16日)；粉狀畢赤氏酵母YIT 8058(FERM BP-7210，最初保藏日期為1999年，7月16日)；和戴爾凱氏有孢圓酵母YIT 8114(FERM BP-7211，最初保藏日期為1999年，7月16日)。
自古以來，已知這些微生物是用于生產(chǎn)食品(酒、奶液、乳酪)的酵母菌，并且是對(duì)人體非常安全的菌株。
上述菌株具有表1至表5中的所列特征。所述特征幾乎與“TheYeast(酵母菌)，第三版”(N.J.W.Kreger-Van Rij，Elsevier SciencePublishers B.V.，Amsterdam，1984)中的公開的相似微生物的特征相同。
表1菌株的特征

表2

表3

表4

表5

下面將描述在本發(fā)明次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑中使用的酵母。
對(duì)在本發(fā)明次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑中使用的酵母沒有特別的限定。所述酵母包括培養(yǎng)所述酵母產(chǎn)生的活細(xì)胞、加熱過的細(xì)胞、凍干產(chǎn)品、其碾磨產(chǎn)品，或其內(nèi)含物。
從來沒有關(guān)于本發(fā)明使用的酵母抑制膽酸或類似物質(zhì)的7α-羥基的去除，由此來抑制次級(jí)膽酸如去氧膽酸的形成的報(bào)道。由于本發(fā)明利用了所述酵母抑制由初級(jí)膽酸到次級(jí)膽酸的轉(zhuǎn)化，從強(qiáng)烈抑制7α-脫羥基化作用的角度看，對(duì)初級(jí)膽酸如特別是膽酸、?；悄懰?、甘氨膽酸和鵝去氧膽酸具有強(qiáng)吸附力以及對(duì)提高短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸的腸內(nèi)濃度具有很強(qiáng)作用力的酵母是優(yōu)選的。
在次級(jí)膽酸的產(chǎn)生抑制劑中優(yōu)選使用的酵母實(shí)例包括伊氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、糖酵母屬、絲狀畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、畢赤氏酵母屬和接合糖酵母屬。這些酵母可以單獨(dú)使用或以兩種或多種菌種結(jié)合的方式使用。
實(shí)例包括東方伊氏酵母、馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、耐熱(thermotolerans)克魯維氏酵母、Hanseniaspora uvarum、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大連(dairensis)糖酵母、微小(exiguus)糖酵母、單孢(unisporus)糖酵母、巴楊氏(bayanus)糖酵母、Hyphopichia burtonii、乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、Candida etchellsii、涎沫(zeylanoides)假絲酵母、馬鈴薯(solani)假絲酵母、麥芽糖(maltosa)假絲酵母、熱帶(tropicalis)假絲酵母、Candida cylindracea、產(chǎn)朊(utilis)假絲酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、Pichia anomala、Pichia holstii和Zygosaccharomyces rouxii。其中，最優(yōu)選的酵母是下列酵母東方伊氏酵母YIT 8266(FERM BP-7215)；馬克斯克魯維氏酵母YIT 8292(FERM BP-7217)；乳克魯維氏酵母YIT 8263(FERMBP-7216)；耐熱克魯維氏酵母YIT 8294(ATCC 20309)；Hanseniasporauvarum YIT 8164(FERM BP-7212)；啤酒糖酵母YIT 8116(ATCC 48554)；大連糖酵母YIT 8191(CBS 3007)；微小糖酵母YIT 8109(CBS 3019)；單孢糖酵母YIT 8226(FERM BP-7209，最初保藏日期為1999年，3月25日；保藏機(jī)構(gòu)，國際貿(mào)易和工業(yè)部，國立生命科學(xué)和人體-技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(地址1-3，Higashi1-chom，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本(下面都相同)))；巴楊氏糖酵母YIT 8128(CBS 380)；Hyphopichia burtonii YIT 8299(CBS 2352)；乳酒假絲酵母YIT 8237(FERM BP-7214)；Candidaetchellsii YIT 8278(ATCC 60119)；涎沫假絲酵母YIT 8018(IFO0719)；馬鈴薯假絲酵母YIT 8023(CBS 1908)；麥芽糖假絲酵母YIT 8283(ATCC 28140)；熱帶假絲酵母YIT 8286(CBS 94)；Candidacylindracea YIT 8276(ATCC 14830)；產(chǎn)朊假絲酵母YIT 8204(ATCC9950)；戴爾凱氏有孢圓酵母YIT 8313(JCM 2204)和YIT 8133(IFO1172)；Pichia anomala YIT 8298(JCM 3587)和YIT 8297(JCM3583)；Pichia holstii YIT 8038(ATCC 58048)和Zygosaccharomyces rouxii YIT 8129(CBS 732)。
自古以來，這些酵母被用來生產(chǎn)食品(酒，乳酪)，并且對(duì)人體來說這些酵母被認(rèn)為是安全微生物。其細(xì)胞是具有幾微米粒徑大小的微粒，與具有20μm或更大的微粒相比極易被吸收，后者被吸收時(shí)產(chǎn)生不舒服的感覺。上述酵母，例如東方伊氏酵母YIT 8266(FERMBP-7215)，具有如表6所示的特定特征。所述特征幾乎與“The yeast，第3版”(N.J.W.Kreger-Van，Rij，Elsevier Science PublishersB.V.，Amsterdam，1984)中公開的相似酵母的那些特征相同。
表6 東方伊氏酵母YIT 8266的特征

本發(fā)明的酵母菌可以通過常規(guī)方法來制備；在含有酵母抽提物和聚胨的復(fù)合培養(yǎng)基中或在主要含有一種無機(jī)鹽的合成培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
由此產(chǎn)生的酵母菌能夠以下面的形式進(jìn)行應(yīng)用活細(xì)胞、其凍干產(chǎn)物、通過加熱或類似處理獲得的死細(xì)胞、其碾磨產(chǎn)物或其內(nèi)含物，藥物組合物或食品和飲品。另外，還能使用通過商業(yè)途徑獲得的酵母。
通過常規(guī)方法和藥學(xué)上可接受的載體，上述酵母能夠形成多種藥物泡沫體的藥物組合物。如果制備口服的固體藥物，上述酵母菌就與一種載體和可選擇的添加劑如一種粘合劑、一種崩解劑、一種潤滑劑、一種著色劑、一種調(diào)味劑和一種芳香劑相混合，并且通過一種常規(guī)的方法將得到的所述混合物制成片劑、包衣片劑、粒劑、粉劑或膠囊。本領(lǐng)域中使用的添加劑可被用作上述添加劑。實(shí)例包括載體如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、微晶纖維素、和硅酸；粘合劑如水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡糖溶液、淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基淀粉、甲基纖維素、乙基纖維素、磷酸鈣和聚(乙烯吡咯烷酮)；崩解劑如干淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉、碳酸氫鈉、碳酸鈣、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸甘油單酯和乳糖；潤滑劑如純滑石粉、硬脂酸鹽、硼砂和聚乙二醇；和調(diào)味劑如白糖、桔皮、檸檬酸和酒石酸。
如果制備口服的液體藥物，上述酵母菌就與添加劑如一種調(diào)味劑，一種緩沖液，一種穩(wěn)定劑和一種芳香劑相混合，并且通過一種常規(guī)的方法將得到的所述混合物制成口服液體、糖漿和酏劑。也可以使用上述調(diào)味劑。緩沖液的實(shí)例包括檸檬酸鈉，以及穩(wěn)定劑的實(shí)例包括黃蓍膠、阿拉伯膠和明膠。
本發(fā)明的食品和飲料可以通過將上述酵母菌加到各種食品和飲料中來制備。優(yōu)選的食品和飲料的實(shí)例包括發(fā)酵奶、果汁混合飲料、湯、米粉糕和餅干。動(dòng)物飼料也被包括在食品和飲料中。
上述藥物中加入的酵母菌的量隨著藥物形式和用藥病人的狀況而變化。通常，藥物中的含量為1-100重量％是優(yōu)選的。上述藥物或食品和飲料的每日劑量隨著病人的狀況、體重、年齡、性別等而變化，而且不能被測定為固定值。通常，每個(gè)成人每日基于酵母的劑量大約是10mg至30g，優(yōu)選地大約1-5g。所述酵母的用藥優(yōu)選地是以等分的形式每日一次或每日2-4次。
實(shí)施例本發(fā)明將通過下面的實(shí)施例更加詳細(xì)地來進(jìn)行描述，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本文使用的“％”指的是“重量％”。
實(shí)施例1(A)酵母菌的制備將一鉑環(huán)保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中的每一種不同的酵母菌接種到裝在坂口燒瓶(500ml)中的表7中所示的培養(yǎng)基(100ml)中，該培養(yǎng)基在30℃下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)(120rpm)。
開始培養(yǎng)兩天后，所述培養(yǎng)物(相當(dāng)于兩個(gè)坂口燒瓶的量)被接種到10-升發(fā)酵罐(有效體積7L)中，并且在30℃下進(jìn)行兩天的有氧攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是0.5vvm的通氣速率，250rpm的攪拌速率和6.0的pH(通過5N的氫氧化鈉自動(dòng)調(diào)控)。
完成培養(yǎng)后，采用冷卻離心機(jī)分離上清液和細(xì)胞，并用蒸餾水將所分離的細(xì)胞洗滌兩次。經(jīng)洗滌的細(xì)胞被放置在2-L的錐形瓶中，并加入蒸餾水(1L)。在高壓消毒鍋中將所述混合物加熱到115℃保持10分鐘。將這種經(jīng)加熱的細(xì)胞凍干。
表7用于預(yù)培養(yǎng)和培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物

(B)試驗(yàn)食物的制備通過利用(A)中制備的酵母菌，按照常規(guī)方法混合各組分來制備含有表8所示各組分的食物。每一種食物含有膽固醇；即，膽固醇(0.5％)和膽酸鈉(0.25％)。為了制備含有酵母菌的食物，每一種類型的凍干酵母菌細(xì)胞的加入量為5％或10％。
表8食物組合物(％)

試驗(yàn)方法 降膽固醇的效果(1)試驗(yàn)食物使用實(shí)施例1(B)中制備的試驗(yàn)食物。
(2)動(dòng)物和飼養(yǎng)方法a)食用了含10％酵母菌的食物的動(dòng)物組用食物粉F-2(Oriental Yeast的產(chǎn)品)將雄性的、5周齡的Wistar大鼠(從日本的Clea獲得)預(yù)養(yǎng)7天。所述大鼠被分為若干組，每一組有8只大鼠。每一組大鼠連續(xù)7天食用如表8所示的含10％酵母菌的食物。所述大鼠以組被飼養(yǎng)在鐵籠中，并且允許隨意食用施用的食物和水。
b)食用了含5％酵母菌的食物的動(dòng)物組用食物粉F-2(Oriental Yeast的產(chǎn)品)將雄性的、5周齡的Wistar大鼠(從韓國的Nihon獲得)預(yù)養(yǎng)7天。所述大鼠被分為若干組，每一組有8只大鼠。每一組大鼠連續(xù)14天食用如表8所示的含5％酵母菌的食物。所述大鼠被分別飼養(yǎng)在鐵籠中，并且食用食物的量被限制在15g/天，但水是任意提供的。
(3)血脂的測量a)食用了含10％酵母菌的食物的動(dòng)物組開始食用后第7天，在采用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉的情況下(不禁食)，利用插管從每只大鼠的腹部主動(dòng)脈中采集血，從而測定血漿的膽固醇濃度和血漿的HDL濃度?？偰懝檀紳舛韧ㄟ^利用生化自動(dòng)分析儀(7170型，Hitachi)來測定。
通過采用Determiner HDL(Kyowa Medics的產(chǎn)品)沉淀不同于HDL的脂蛋白成分后，利用生化自動(dòng)分析儀(7170型，Hitachi)來測定HDL膽固醇濃度。
b)食用了含5％酵母菌的食物的動(dòng)物組開始食用后第7天，從每只大鼠的尾靜脈中采集血，從而測定血漿的膽固醇濃度和血漿的HDL濃度?？偰懝檀紳舛韧ㄟ^利用生化自動(dòng)分析儀(7170型，Hitachi)來測定。
通過采用Determiner HDL(Kyowa Medics的產(chǎn)品)沉淀不同于HDL的脂蛋白成分后，利用生化自動(dòng)分析儀(7170型，Hitachi)來測定HDL膽固醇濃度。
4)肝內(nèi)脂的測定利用生理鹽水灌注肝臟后，摘取肝臟并進(jìn)行凍干。利用氯仿∶甲醇(2∶1)按照Folch等的方法進(jìn)行脂類的提取。將獲得的下層氯仿濃縮成固體，并且通過稀釋用乙醇再次稀釋所述固體。對(duì)稀釋樣品進(jìn)行含在肝臟內(nèi)的脂類成分的測定。在肝脂中，用Determiner TC 555測定肝脂中的膽固醇的含量。
評(píng)估動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果的方法(1)統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Bartlett方法檢測差異的方差齊性。當(dāng)發(fā)現(xiàn)方差是方差齊性時(shí)，以單向布局方式和Dunnett的多項(xiàng)比較試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，而當(dāng)發(fā)現(xiàn)方差是異方差性時(shí)(通過Bartlett試驗(yàn)從中獲得顯著性差異的試驗(yàn)對(duì)象的顯著性水平低于5％)，通過Kruskal-Wallis試驗(yàn)和Dunnett的多項(xiàng)比較試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。在Dunnett的多項(xiàng)比較試驗(yàn)中，顯著性水平被設(shè)定為5％和1％，在每一顯著性水平上進(jìn)行所述試驗(yàn)。
(2)達(dá)到脂類百分含量降低的方法<血漿膽固醇百分含量的降低>
“血漿膽固醇100％的降低”的表達(dá)方式指的是一種血漿膽固醇的濃度被降低到屬于一組食用了一種常規(guī)食物(未添加膽固醇的)的大鼠的血漿膽固醇濃度。“血漿膽固醇0％降低”的表達(dá)方式指的是血漿膽固醇的濃度被提高到屬于一組食用了一種添加膽固醇食物(對(duì)照)的大鼠的血漿膽固醇濃度。
(3)致動(dòng)脈粥樣化指標(biāo)致動(dòng)脈粥樣化指標(biāo)(AI)通過下式表示AI＝(VLDL膽固醇+LDL膽固醇)/HDL膽固醇。
AI由總血漿膽固醇濃度和血漿HDL膽固醇計(jì)算得出；即，真實(shí)的血漿脂類測值，按照下式AI＝((總血漿膽固醇)-(血漿HDL膽固醇))/(血漿HDL膽固醇)。
致動(dòng)脈粥樣化指標(biāo)標(biāo)改善的百分率由每一含酵母菌食物的食用組的AI值和添加膽固醇食物的食用組(對(duì)照組)的AI值計(jì)算得出。“動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)100％的改善”的表達(dá)方式指的是AI值與未添加膽固醇食物的食用組的AI值相同。“動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)0％的改善”的表達(dá)方式指的是AI值與添加膽固醇食物的食用組(對(duì)照組)的AI值相同。
(4)體重測量對(duì)購買的大鼠進(jìn)行體重測量。將這些大鼠分成幾組以使各組間在體重方面不存在顯著差異，然后開始預(yù)飼養(yǎng)。開始試驗(yàn)前和完成試驗(yàn)后分別測量體重。
上述試驗(yàn)方法被下列預(yù)試驗(yàn)和實(shí)施例所采用。
預(yù)試驗(yàn)食用了添加膽固醇食物后，從大鼠的尾靜脈采集血；即，在第0天，第5天，和第8天。在第14天，在用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉的情況下，從腹部主動(dòng)脈中采集血。從每一采集的血樣中分離血漿，并通過酶法測定所述血漿中的脂類成分。
如圖1所示，添加膽固醇食物的食用組的血漿膽固醇濃度在第5天大約增加到最大值。此后，在第14天前都觀察到了微小的增加量，但沒有觀察到顯著的變化。未添加膽固醇食物(通過從添加膽固醇食物中除去膽固醇和膽酸鈉而制備的食物)的食用組的血漿膽固醇的濃度在試驗(yàn)期間沒有增加，并且觀察到了濃度略微降低的趨勢。
表9顯示了開始食用添加膽固醇食物后的第14天的血脂濃度。未添加膽固醇食物的食用組的血漿膽固醇濃度是72.5mg/dL，而添加膽固醇食物的食用組的血漿膽固醇濃度是325.3mg/dL，表明大約有4.5倍的濃度增加量。相反，添加膽固醇食物的食用組的血漿HDL膽固醇濃度是45.9mg/dL，明顯低于未添加膽固醇食物的食用組的血漿HDL膽固醇濃度(31.4 mg/dL)。
表9血脂濃度(第14)

**p＜0.01表10顯示了開始食用添加膽固醇食物后的第14天的肝脂質(zhì)含量。添加膽固醇食物的食用組的膽固醇濃度是未添加膽固醇食物的食用組的膽固醇濃度的20倍。
表10肝內(nèi)脂質(zhì)的含量(第14天)

**p＜0.01實(shí)施例2按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行罐培養(yǎng)，以便制備每種酵母菌的200g的凍干細(xì)胞(在110℃下加熱10分鐘)。每種細(xì)胞樣品以10％的含量被混合到添加膽固醇食物中(表8中的10％酵母菌組)。將得到的食物給每一個(gè)由8只大鼠組成的組食用，隨意食用7天。
表11至13顯示了基于高膽固醇食物食用對(duì)照組的血漿膽固醇濃度，膽固醇濃度的降低百分比和動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)改善的百分比(％)。在試驗(yàn)組間沒有觀察到體重的顯著變化。
表11血漿膽固醇的降低百分比和AI的改善百分比

表12血漿膽固醇的降低百分比和AI的改善百分比

表13血漿膽固醇的降低百分比和AI的改善百分比

實(shí)施例3按照實(shí)施例1(A)的方法進(jìn)行罐培養(yǎng)，以便制備每種酵母菌的200g的凍干細(xì)胞，每種細(xì)胞樣品以10％的含量被混合到添加膽固醇食物中(表8中的10％酵母菌組)。將得到的食物給每一個(gè)由8只大鼠組成的組食用，隨意食用7天。表14顯示了血脂測定結(jié)果。
表14血脂(10％的混合食用)

**p＜0.01通過食用添加膽固醇的高脂肪食物，對(duì)照組的總膽固醇濃度增加并且動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)增至7.97-9.62。然而，發(fā)現(xiàn)即使食用同樣的高脂肪食物，已經(jīng)食用了含有本發(fā)明的酵母菌細(xì)胞(10％)的試驗(yàn)組大鼠也顯著地抑制所有分析項(xiàng)目值的升高。因此，酵母菌，即馬克斯克魯維氏酵母YIT 8292、乳克魯維氏酵母YIT 8263、Hanseniasporauvarum YIT 8164、東方伊氏酵母YIT 8266、乳酒假絲酵母YIT 8237和粉狀畢赤氏酵母YIT 8058明顯地具有很高的血漿膽固醇降低百分率并且被發(fā)現(xiàn)能改善致動(dòng)脈粥樣化指標(biāo)。
實(shí)施例45％的添加酵母菌食物施用試驗(yàn)除將每一凍干細(xì)胞樣品以5％的含量混合到用于試驗(yàn)組的食物(5％的表8中的酵母菌組)中外，重復(fù)實(shí)施例3中采用雄性的、5周齡Wistard大鼠的過程；將所得的食物給由8只大鼠組成的每一個(gè)組食用；以限定量(15g/天)持續(xù)14天。
表15顯示了血脂的分析結(jié)果。食用高脂肪食物的結(jié)果是，對(duì)照組的總膽固醇的濃度和致動(dòng)脈粥樣化指標(biāo)增加了。然而，發(fā)現(xiàn)即使食用同樣的高脂肪食物，已經(jīng)食用了含有本發(fā)明的酵母菌細(xì)胞(5％)的試驗(yàn)組大鼠也顯著地抑制所有分析項(xiàng)目值的升高。
表15血脂

**p＜0.01表16顯示了肝脂的測定結(jié)果。在全部試驗(yàn)組中，與對(duì)照組相比，肝臟的總膽固醇濃度明顯地增加了。因此，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的酵母菌能夠作為抗膽固醇的有效物質(zhì)，所述酵母菌通過口服能夠有效降低血脂及肝脂。
表16

**p＜0.01實(shí)施例5 膽酸的吸附力試驗(yàn)方法；將膽酸(CA)，?；悄懰?TCA)，甘氨膽酸(GCA)，鵝去氧膽酸(CDCA)，去氧膽酸(DCA)，其每一種的鈉鹽(Sigma的產(chǎn)品)溶解在0.1M的磷酸緩沖液(pH6.7)或0.1M的磷酸緩沖液(pH7.5)中以使終濃度被調(diào)節(jié)到1mM。
將東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞(100mg)置于一支離心管(15mL)中，并加入上述配制的每一種膽酸溶液(3.5mL)。在37℃下振蕩該混合物(120spm)。1小時(shí)后，通過離心(12000rpm，10分鐘)使酵母菌沉淀，然后收集上清液。利用Enzabile II(DaiichiPure Chemical Co.，Ltd.的產(chǎn)品)定量分析含在上清液中的膽酸，膽酸吸附百分率按照下列公式計(jì)算。本文所采用的術(shù)語“膽酸吸附百分率”指的是被酵母吸附的膽酸的量與添加膽酸的總量的比值，并且該值作為酵母菌和膽酸間吸附強(qiáng)度的指標(biāo)。
膽酸吸附百分率(％)＝[{添加的膽酸(nmol)-上清中的膽酸(nmol)}/添加的膽酸(nmol)]×100表17顯示了膽酸吸附百分率。發(fā)現(xiàn)東方伊氏酵母YIT 8266吸附膽酸、?；悄懰?、甘氨膽酸或鵝去氧膽酸，對(duì)初級(jí)膽酸顯示出很高的吸附力。酵母菌對(duì)膽酸的吸附百分率不取決于反應(yīng)混合物的pH(6.7和7.2)。這些結(jié)果表明酵母菌緊密結(jié)合大腸腸道中的初級(jí)膽酸并且抑制由腸細(xì)菌引起的去結(jié)合和7α-去羥基化作用，因而抑制次級(jí)膽酸的產(chǎn)生。
另外，所述酵母菌緊密結(jié)合去氧膽酸-一種次級(jí)膽酸。這表明除了抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生外，所述酵母還吸附和固定形成的次級(jí)膽酸，因而降低其毒性。
表17東方伊氏酵母對(duì)膽酸的吸附百分率(％)

實(shí)施例6以與實(shí)施例5相類似的方式測定各種酵母菌對(duì)膽酸的吸附百分率。表18顯示了所述結(jié)果。所有酵母菌對(duì)膽酸，即鵝去氧膽酸(初級(jí)膽酸)和去氧膽酸(次級(jí)膽酸)具有很強(qiáng)的吸附力。
表18酵母菌對(duì)膽酸的吸附百分率

實(shí)施例7 東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞對(duì)次級(jí)膽酸產(chǎn)生的抑制初步試驗(yàn)用食物粉F-2(Oriental Yeast的產(chǎn)品)將雄性的、5周齡的Wistar大鼠(從Nihon Kruea獲得)飼養(yǎng)7天。所述大鼠被分為若干組，以使各組間不出現(xiàn)體重差異，每一組有8只大鼠。每一組大鼠連續(xù)14天食用如表19所示的食物。所述大鼠被分別飼養(yǎng)在鐵籠中，并且允許隨意食用食物和水。
表19食物組合物(％)成分 普通食物 高膽酸食物酪蛋白 22.30 22.30蔗糖 56.55 55.80無機(jī)鹽 4.00 4.00維生素 1.00 1.00黃豆油 1.00 1.00豬油 10.00 10.00酒石酸氫膽堿 0.15 0.15膽固醇 0.00 0.50膽酸鈉 0.00 0.25濾紙粉 5.00 5.00結(jié)束14天的飼養(yǎng)后，沒有觀察到普通食物食用組和高膽酸食物食用組之間食物消耗和體重增加的明顯差異。
膽酸濃度將凍干的糞便(第12天到第14天)稱重并放入螺帽試管中(15mL)，并加入內(nèi)標(biāo)物(5-β-孕烷-3α，17α，20α-三醇)(0.15μmol)和乙醇(5mL)。利用程序加熱器(block heater)將混合物在70℃下加熱兩小時(shí)。通過離心(3000rpm，15分鐘)沉淀產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中并在氮?dú)饬飨赂稍锍晒腆w。將提取物溶解到甲醇(0.5mL)中，利用濾器(0.45μm)(Nihon Millipore Ltd.的產(chǎn)品)除去所產(chǎn)生的不溶物質(zhì)。在下述條件下利用HPLC系統(tǒng)(Jasco的產(chǎn)品)分離分析樣品(10μL)。
表20分離膽酸的條件液體A乙腈/甲醇/30mM的乙酸銨(30∶30∶40)混合物液體B乙腈/甲醇/30mM的乙酸銨(20∶20∶60)混合物洗脫條件由100％的B+0％的A到0％的B+100％的A的成比例濃度梯度進(jìn)行32分鐘。然后利用100％的A洗脫13分鐘。流速1.0ml/分鐘柱溫度25℃Bilepak-II(4.6mm內(nèi)徑×250mm)(分離柱，Jasco的產(chǎn)品)由分離柱得到的洗脫物以1.0ML/分鐘的流速與反應(yīng)混合物(0.3mM的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD+)，1mM的乙二胺四乙酸和10mM的含0.05％的2-巰基乙醇的磷酸鉀緩沖液(pH7.8))混合。所述液體混合物被轉(zhuǎn)移到一只酶柱(Enzymepak(4.6mm內(nèi)徑×35mm，Jasco的產(chǎn)品))中，該柱填裝了3α-羥甾類脫氫酶，其中經(jīng)膽酸脫氧產(chǎn)生的NADH(還原形式的β-NAD+)通過熒光檢測儀進(jìn)行監(jiān)測(激發(fā)波長345nm，發(fā)射波長470nm)。
根據(jù)滯留時(shí)間參照標(biāo)準(zhǔn)來識(shí)別每種膽酸。由相應(yīng)的峰面積獲得膽酸濃度。在這種情況下，回收百分率通過內(nèi)標(biāo)物的峰面積進(jìn)行校正。
表21顯示了結(jié)果。這些結(jié)果表明膽酸的食用提高了初級(jí)膽酸到達(dá)大腸道的濃度，因而促進(jìn)了次級(jí)膽酸的產(chǎn)生。因此，能夠高靈敏度地提高次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑的效果。
表21排泄到糞便中的膽酸的濃度[μmol/天]普通食物 高膽酸食物初級(jí)膽酸α-鼠膽酸(Muricholic acid) 1.52±0.35 8.52±3.05**β-鼠膽酸0.20±0.09 8.48±1.55**豬膽酸 0.00±0.00 0.23±0.2*膽酸 0.00±0.00 29.20±7.44**鵝去氧膽酸 0.00±0.00 0.57±0.20**總初級(jí)膽酸 1.72±0.40 47.00±10.31**次級(jí)膽酸去氧膽酸 0.72±0.26 9.13±5.92**石膽酸 0.18±0.10 0.13±0.18n.s.豬去氧膽酸 0.01±0.03 1.06±0.54*總次級(jí)膽酸 0.90±0.35 10.32±5.84**注釋t檢驗(yàn)*顯著水平5％**顯著水平1％n.s.無顯著性東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞對(duì)次級(jí)膽酸產(chǎn)生的抑制將東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞加到高膽酸食物中，連續(xù)14天食用所得到的食物(5％的混合食物)(表22)。每一種食物的能量級(jí)數(shù)通過調(diào)控酪蛋白、蔗糖、脂類或纖維素的量來進(jìn)行平衡。在試驗(yàn)期間食用酵母菌細(xì)胞根本就沒有對(duì)食物的消耗產(chǎn)生影響并且對(duì)體重的增加也根本沒有產(chǎn)生影響(表23)。
表22食物組合物[％]成分 高膽酸食物添加酵母菌的高膽酸食物酪蛋22.30 20.56蔗糖55.80 54.15無機(jī)鹽 4.00 4.00維生素 1.00 1.00黃豆油 1.00 1.00豬油10.00 9.85酒石酸氫膽堿0.15 0.15膽固醇 0.50 0.50膽酸鈉 0.25 0.25濾紙粉 5.00 3.55加熱干燥的酵母菌*0.00 5.00*東方伊氏酵母YIT 8266表23試驗(yàn)期間的食物消耗和體重增加高膽酸食物 添加酵母菌的高膽酸食物食物消耗[g/14天]236.0±8.6 227.8±21.5n.s.體重增加[g/14天]95.9±4.0 93.6±11.9n.s.
注釋學(xué)生t檢驗(yàn)n.s.無顯著性如表24和25所示，通過東方伊氏酵母YIT 8266的食用，排泄到糞便中的次級(jí)膽酸濃度降低了大約82％，并且糞便中的次級(jí)膽酸濃度降低了大約84％。對(duì)于去氧膽酸和石膽酸觀察到的這一趨勢尤其明顯。通過相應(yīng)細(xì)胞的食用，排泄到糞便中的初級(jí)膽酸濃度和糞便中的初級(jí)膽酸濃度明顯地增加了。
因此，東方伊氏酵母YIT 8266對(duì)初級(jí)膽酸向次級(jí)膽酸轉(zhuǎn)化具有強(qiáng)烈的抑制作用。
表24排泄到糞便中的膽酸的量[μmol/天]高膽酸食物 添加酵母菌的高膽酸食物初級(jí)膽酸α-鼠膽酸(Muricholic acid)13.70±3.40 15.27±3.12n.s.β-鼠膽酸 7.32±2.07 11.60±2.48**豬膽酸0.12±0.17 0.29±0.15n.s.膽酸 24.37±5.86 35.30±2.55**鵝去氧膽酸1.10±0.41 1.34±0.27ns.總初級(jí)膽酸46.60±7.30 63.80±6.81**次級(jí)膽酸去氧膽酸 10.10±6.51 0.22±0.46**石膽酸0.35±0.31 0.00±0.00*豬去氧膽酸0.80±0.32 1.81±0.64n.s.總次級(jí)膽酸11.25±6.59 2.03±0.81**注釋學(xué)生t檢驗(yàn)*顯著水平5％**顯著水平1％n.s.無顯著性表25糞便中的膽酸組成[％]高膽酸食物添加酵母菌的高膽酸食物初級(jí)膽酸α-鼠膽酸(Muricholic acid)23.58±5.32 23.11±3.47n.s.β-鼠膽酸 12.59±3.07 17.50±2.51**豬膽酸0.19±0.27 0.43±0.22n.s.膽酸 42.47±11.42 53.87±3.01*鵝去氧膽酸1.89±0.65 2.06±0.50n.s.總初級(jí)膽酸80.72±11.55 96.97±0.98**次級(jí)膽酸去氧膽酸 17.30±11.46 0.30±0.67**石膽酸0.59±0.53 0.00±0.00*豬去氧膽酸1.39±0.59 2.73±0.89**總次級(jí)膽酸19.28±11.55 3.03±0.98**注釋學(xué)生t檢驗(yàn)*顯著水平5％**顯著水平1％n.s.無顯著性利用東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞降低盲腸中的pH將盲腸中的內(nèi)含物(第14天)(0.5g)懸浮在純水中(4.5mL)，并將10％的高氯酸水溶液(0.5mL)加到所述懸浮液中。將得到的懸浮液于4℃下保存過夜。該懸浮液進(jìn)行離心(9000rpm，10分鐘)，收集上清液并通過過濾器(0.45μm)(Nihon Millipore Ltd.)。如此制備的分析樣品進(jìn)行HPLC。
在下述條件下利用一種HPLC系統(tǒng)(Toa Dempa Kogyo的產(chǎn)品)進(jìn)行短鏈脂肪酸的分析。通過檢測器之前將pH緩沖液于洗脫物迅速混合。
表26短鏈脂肪酸的分析條件柱 KC-811 Shodex(Showa Denko)×2洗脫液(流量) 含有7％的乙腈的15mM的高氯酸溶液(1mL/分鐘)柱溫度 42℃pH-調(diào)節(jié)劑(液流)含有7％的乙腈和60mM的三(羥甲基)甲胺的15mM的高氯酸溶液(1mL/分鐘)檢測器 電導(dǎo)檢測器(Toa Denpa Kogyo)細(xì)胞溫度 45℃表27盲腸中的pH和短鏈脂肪酸內(nèi)含物高膽酸食物 添加酵母菌的高膽酸食物盲腸中的pH6.65±0.08 6.46±0.20*短鏈脂肪酸內(nèi)含物[mM]乙酸 26.6±8.4 37.5±4.0**丙酸 7.2±2.317.5±4.0**丁酸 2.2±1.43.9±0.8*乳酸 2.5±1.02.6±1.2n.s.琥珀酸15.5±7.3 21.8±7.4n.s.甲酸 1.1±0.61.8±1.3n.s.異丁酸0.7±0.60.4±0.4n.s.總短鏈脂肪酸 55.9±15.7 85.6±5.2**注釋學(xué)生t檢驗(yàn)*顯著水平5％**顯著水平1％n.s.無顯著性高膽酸食物組的盲腸中的pH是6.65并且短鏈脂肪酸的總含量是55.9mM，而添加酵母菌(東方伊氏酵母YIT 8266)的高膽酸食物組的盲腸中的pH是6.46(顯著性是5％)并且短鏈脂肪酸的總含量是85.6mM(顯著性是1％)，表明盲腸中的pH降低了。因此，大腸pH條件變得更加酸性，因而使腸細(xì)菌的7α-脫羥基酶失活。
東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞對(duì)膽固醇代謝的抑制作用將糞便(第14天)(25mg)稱重并放入螺帽試管中(15mL)，并加入內(nèi)標(biāo)物(5β膽甾烷)(0.1μmol)和含有1N的氫氧化鈉的90％乙醇溶液(1mL)。利用程序加熱器將混合物在80℃下加熱。1小時(shí)后，加入蒸餾水(0.5mL)，利用石油醚(2.5mL)通過兩次萃取得到中性甾醇。得到的萃取物用蒸餾水(7.5mL)沖洗，用硫酸鈉脫水，并在氮流下干燥成固體?；厥盏降闹行早薮急蝗坠柰榛?，并在下述條件下(表28)利用氣相色譜進(jìn)行分析。
表28色譜(GC)分析條件GC裝置 5890型(Yokogawa-Hewlett-Packard)柱 SPB-1 FS-涂層的毛細(xì)管玻璃柱(Supelco)0.32mm內(nèi)徑×30m柱溫 250℃，8分鐘→270℃，10℃/分鐘→270℃，15分鐘載體(氣流)氦(0.8mL/分鐘)加樣器Spilit，T＝230℃檢測器FID，T＝280℃加樣量1μL分析時(shí)間 25分鐘通過食用東方伊氏酵母YIT 8266，糞便中的糞醇和糞酮的濃縮物明顯降低了腸內(nèi)的膽固醇代謝物(表29)。由于大腸中的這些膽固醇代謝物與疾病如結(jié)腸直腸(colovectal)癌的發(fā)病有關(guān)(Suzuki，K.，等Cancer Lett.，33，307-316，1986)，東方伊氏酵母YIT 8266被認(rèn)為通過抑制膽固醇代謝物的產(chǎn)生能夠防治多種疾病。
表29糞便中的中性膽固醇的組成[％]高膽酸食物 添加酵母菌的高膽酸食物糞醇25.7±12.5 9.2±11.9*糞酮1.9±2.5 0.4±0.6n.s.膽固醇 72.3±14.2 90.5±12.4*糞醇+糞酮 27.7±14.2 9.5±12.4*注釋學(xué)生t檢驗(yàn)*顯著水平5％n.s.無顯著性實(shí)施例8 東方伊氏酵母YIT 8266的細(xì)胞內(nèi)含物對(duì)次級(jí)膽酸的抑制細(xì)胞內(nèi)含物的制備將東方伊氏酵母YIT 8266的凍干細(xì)胞懸浮在0.1M的磷酸緩沖液中(pH8.5)，該細(xì)胞用DYNO-MILL(Shinmaru Enterprises(企業(yè))的產(chǎn)品)進(jìn)行機(jī)械研磨。在研磨過程中，以0.45mm的玻璃株作為研磨劑，重復(fù)研磨操作直至通過顯微鏡觀察證實(shí)95％或更多的細(xì)胞得到了研磨。磨碎的細(xì)胞液體進(jìn)行離心(9000g，15分鐘)，從而在上清液中分離到細(xì)胞內(nèi)含物。收集并凍干該細(xì)胞內(nèi)含物。
東方伊氏酵母YIT 8266的細(xì)胞內(nèi)含物對(duì)次級(jí)膽酸產(chǎn)生的抑制以類似于實(shí)施例7中采用的方式，證實(shí)了由東方伊氏酵母YIT8266制備的細(xì)胞內(nèi)含物對(duì)次級(jí)膽酸產(chǎn)生的抑制作用。
表30顯示了試驗(yàn)中采用的食物組合物。在試驗(yàn)期間食用酵母菌細(xì)胞內(nèi)含物根本就沒有對(duì)食物的消耗產(chǎn)生影響并且對(duì)體重的增加也根本沒有產(chǎn)生影響(表31)。
表30食物組合物(％)成分 高膽酸食物 添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物酪蛋白 22.30 20.78蔗糖 55.80 53.12無機(jī)鹽 4.00 4.00維生素 1.00 1.00黃豆油 1.00 1.00豬油 10.00 9.77酒石酸氫膽堿 0.15 0.15膽固醇 0.50 0.50膽酸鈉 0.25 0.25濾紙粉 5.00 4.43細(xì)胞內(nèi)含物 0.00 5.00表31試驗(yàn)期間的食物消耗和體重增加高膽酸食物 添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物食物消耗[g/14天] 232.8±9.9 220.7±6.5n.s.體重增加[g/14天] 95.9±4.0 88.4±4.5n.s.
注釋學(xué)生t檢驗(yàn)n.s.無顯著性如表32和33所示，通過食用東方伊氏酵母YIT 8266的細(xì)胞內(nèi)含物，排泄到糞便中的次級(jí)膽酸濃度降低了大約76％，并且糞便中的次級(jí)膽酸濃度降低了大約70％。
因此，類似于凍干的東方伊氏酵母YIT 8266的情況，東方伊氏酵母YIT 8266的細(xì)胞內(nèi)含物對(duì)初級(jí)膽酸向次級(jí)膽酸轉(zhuǎn)化也具有強(qiáng)烈的抑制作用。
表32排泄到糞便中的膽酸的量[μmol/天]高膽酸食物 添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物初級(jí)膽酸α-鼠膽酸(Muricholic acid)8.56±1.85 6.80±2.04n.s.β-鼠膽酸 6.80±2.18 8.70±3.04n.s.豬膽酸0.20±0.15 0.25±0.06n.s.膽酸 28.96±11.9929.99±4.77n.s.鵝去氧膽酸0.44±0.29 0.64±0.35n.s.總初級(jí)膽酸44.96±13.1746.37±9.40n.s.次級(jí)膽酸去氧膽酸 9.87±5.46 2.01±2.26**石膽酸0.02±0.05 0.00±0.00n.s.豬去氧膽酸0.65±0.36 0.49±0.14n.s.總次級(jí)膽酸10.54±5.29 2.51±2.18**注釋學(xué)生t檢驗(yàn)**顯著水平1％n.s.無顯著性表33糞便中的膽酸的組成[％]高膽酸食物添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物初級(jí)膽酸α-鼠膽酸(Muricholic acid)16.01±4.33 13.75±1.82n.s.β-鼠膽酸 12.39±3.19 17.30±3.29**豬膽酸0.34±0.200.51±0.09n.s.膽酸 51.04±10.63 62.47±6.95**鵝去氧膽酸0.76±0.341.27±0.56n.s.總初級(jí)膽酸79.82±8.31 94.02±3.61**次級(jí)膽酸去氧膽酸 8.29±8.903.64±3.76n.s.石膽酸0.04±0.110.00±0.00n.s.豬去氧膽酸1.13±0.381.07±0.44n.s.總次級(jí)膽酸20.18±8.31 5.98±3.61**
注釋學(xué)生t檢驗(yàn)**顯著水平1％n.s.無顯著性高膽酸食物組的盲腸中的pH是6.65并且短鏈脂肪酸的總含量是54.0mM，而添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物組的盲腸中的pH是6.46(顯著性是5％)并且短鏈脂肪酸的總含量是68.3mM(顯著性是5％)。因此，酵母菌細(xì)胞內(nèi)含物通過增加短鏈脂肪酸的含量使得大腸的pH條件變得更加酸性，因而使腸細(xì)菌的7α-脫羥基酶失活。
表34盲腸中的pH和短鏈脂肪酸內(nèi)含物高膽酸食物 添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物盲腸中的pH 6.65±0.08 6.46±0.20*短鏈脂肪酸內(nèi)含物[mM]乙酸 26.2±9.0 30.2±7.1n.s.丙酸 7.2±2.514.3±2.2**丁酸 2.2±1.52.1±0.9n.s.乳酸 2.4±1.01.9±1.2n.s.琥珀酸 14.3±7.1 17.8±6.4n.s.甲酸 0.9±0.31.8±1.7n.s.異丁酸 0.7±0.70.2±0.2n.s.總短鏈脂肪酸 54.0±15.9 68.3±13.9*注釋學(xué)生t檢驗(yàn)*顯著水平5％**顯著水平1％n.s.無顯著性作為食用東方伊氏酵母YIT 8266的細(xì)胞內(nèi)含物的結(jié)果，糞便中的糞醇和糞酮的濃縮物明顯降低了腸內(nèi)的膽固醇代謝物(表29)。因此類似于凍干細(xì)胞的情況，東方伊氏酵母YIT 8266的細(xì)胞內(nèi)含物被認(rèn)為通過抑制膽固醇代謝物的產(chǎn)生能夠防治多種疾病。
表35糞便中的中性膽固醇的組成[％]高膽酸食物 添加細(xì)胞內(nèi)含物的高膽酸食物糞醇 21.1±8.210.0±9.9*糞酮 2.0±1.6 0.5±0.5**膽固醇 76.9±9.689.6±10.2*糞醇+糞酮23.1±9.612.1±10.7*注釋學(xué)生t檢驗(yàn)*顯著水平5％**顯著水平1％實(shí)施例9通過利用上述實(shí)施例中使用的酵母菌細(xì)胞，制備下列組成的食品和飲料。
1)保持和促進(jìn)健康的食品(片劑)含有下列添加劑的組合物被壓片后制成片劑。
表36保持和促進(jìn)健康的食品組合物(％)干酵母細(xì)胞 10植物提取粉 30蜂王漿粉5膠原粉 5乳糖25玉米淀粉20羥丙基纖維素4硬脂酸鎂12)保持和促進(jìn)健康的飲料按照下列配方制備保持和促進(jìn)健康的飲料。
表37 保持和促進(jìn)健康的飲料組合物(％)干酵母細(xì)胞 5蜂蜜 15檸檬酸 0.1dl-蘋果酸 0.1植物提取物(肉桂) 20D-Solbitol液體(70％)10苯甲酸鈉 0.05調(diào)味劑 適當(dāng)量純水平衡3)蘋果汁混合飲料按照下列配方制備該飲料。
表38蘋果汁混合飲料的組合物(％)葡萄糖液糖 33葡萄柚汁60干酵母細(xì)胞 5調(diào)味劑 適當(dāng)量酸性試劑適當(dāng)量4)發(fā)酵乳按照下列配方制備含有被加熱的酵母細(xì)胞的發(fā)酵乳。
將屬于乳酸桿菌的細(xì)菌接種到消毒過的10％的脫脂奶粉液體和5％的葡萄糖的混合物中來制備酸奶。將實(shí)施例1中得到的被加熱的酵母細(xì)胞以0.1-20％的量加到所述酸奶中來制備發(fā)酵乳。
5)奶液將屬于乳酸桿菌的細(xì)菌和實(shí)施例1中得到的被加熱的酵母細(xì)胞同時(shí)加到消毒過的10％的脫脂奶粉液體和5％的葡萄糖的混合物中。將該混合物在37℃下靜止培養(yǎng)48小時(shí)來制備奶液。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的含有上述酵母細(xì)胞或酵母細(xì)胞內(nèi)含物的降膽固醇劑能顯著地降低血漿膽固醇和肝臟膽固醇，因而對(duì)預(yù)防由于膽固醇積累引起的動(dòng)脈硬化和其它疾病十分有效。
本發(fā)明的次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑通過膽酸的吸收、大腸中的pH條件的酸性轉(zhuǎn)化等強(qiáng)烈地抑制了次級(jí)膽酸的產(chǎn)生，因而對(duì)防治結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽汁管癌、膽石病等十分有效。
另外，本發(fā)明中使用的不具有病原性的酵母菌被認(rèn)為是安全的，這一點(diǎn)可以通過自古以來這些酵母菌被用于生產(chǎn)乳酪、馬奶酒、葡萄酒等的事實(shí)來證明。本發(fā)明的含有上述酵母細(xì)胞或酵母細(xì)胞內(nèi)含物的降膽固醇劑被長期施用而不發(fā)生問題。這一點(diǎn)可通過以下發(fā)現(xiàn)來證實(shí)口服劑量為8g/kg的所述本發(fā)明降膽固醇劑的大鼠中沒有觀察到死亡情形。
因此，本發(fā)明的所述降膽固醇劑和次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑能被用作口服藥物，并且通過對(duì)含有所述降膽固醇劑和抑制劑的食品的持續(xù)消耗來十分有效地保持健康和預(yù)防動(dòng)脈硬化、結(jié)腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽汁管癌、膽石病等。
權(quán)利要求
1.一種降膽固醇劑，其含有至少一種作為活性成分的屬于假絲酵母屬、伊氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、克勒克氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬或有孢圓酵母屬的酵母菌。
2.一種降膽固醇劑，其含有至少一種作為活性成分的選自乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、東方伊氏酵母(Issatchenkia orientalis)、Hanseniaspora(有孢漢遜氏酵母)uvarum、非洲克勒克氏酵母(Kloeckera africana)、馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、粉狀畢赤氏酵母(Pichia farinosa)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)的酵母菌。
3.一種用于降低膽固醇的食品和飲料，其含有一種如權(quán)利要求1或2中所列舉的酵母菌。
4.一種次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑，其含有一種作為活性成分的酵母菌。
5.一種如權(quán)利要求4所述的次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑，其中所述酵母菌是至少一種選自伊氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、糖酵母屬、絲狀畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、畢赤氏酵母屬和接合糖酵母屬的菌種。
6.一種如權(quán)利要求4所述的次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑，其中所述酵母菌是至少一種選自東方伊氏酵母、馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、耐熱克魯維氏酵母、Hanseniaspora uvarum、啤酒糖酵母、大連糖酵母、微小糖酵母、單孢糖酵母、巴楊氏糖酵母、Hyphopichiaburtonii、乳酒假絲酵母、Candida etchellsii、涎沫假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母、麥芽糖假絲酵母、熱帶假絲酵母、Candidacylindracea、產(chǎn)朊假絲酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、Pichia anomala、Pichia holstii和Zygosaccharomyces rouxii的菌種。
7.一種用于抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生的食品和飲料，其含有一種如權(quán)利要求4至6中任意一項(xiàng)權(quán)利要求中所列舉的酵母菌。
8.至少一種屬于假絲酵母屬、伊氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、克勒克氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬或有孢圓酵母屬的酵母菌在制備降膽固醇劑中的用途。
9.至少一種屬于乳酒假絲酵母、東方伊氏酵母、Hanseniasporauvarum、非洲克勒克氏酵母、馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、粉狀畢赤氏酵母和戴爾凱氏有孢圓酵母的酵母菌在制備降膽固醇劑中的用途。
10.一種如權(quán)利要求1或2中所列舉的酵母菌在制備用于降低膽固醇的食品和飲料中的用途。
11.一種酵母菌在制備次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑中的用途。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述酵母菌是至少一種選自伊氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、糖酵母屬、絲狀畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、畢赤氏酵母屬和接合糖酵母屬的菌種。
13.如權(quán)利要求11所述的一種酵母菌在制備次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑中的用途，其中所述酵母菌是至少一種選自東方伊氏酵母、馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、耐熱克魯維氏酵母、Hanseniasporauvarum、啤酒糖酵母、大連糖酵母、微小糖酵母、單孢糖酵母、巴楊氏糖酵母、Hyphopichia burtonii、乳酒假絲酵母、Candidaetchellsii、涎沫假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母、麥芽糖假絲酵母、熱帶假絲酵母、Candida cylindracea、產(chǎn)朊假絲酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、Pichia anomala、Pichia holstii、Pachiticosporatransverensis和Zygosaccharomyces rouxii的菌種。
14.一種如權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)權(quán)利要求中所列舉的酵母菌在制備用于抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生的食品和飲料中的用途。
15.一種用于降低膽固醇的治療方法，包括施用至少一種屬于假絲酵母屬、伊氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、克勒克氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬或有孢圓酵母屬的酵母菌。
16.一種用于降低膽固醇的治療方法，包括施用至少一種選自乳酒假絲酵母、東方伊氏酵母、Hanseniaspora uvarum、非洲克勒克氏酵母、馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、粉狀畢赤氏酵母和戴爾凱氏有孢圓酵母的酵母菌。
17.一種抑制次級(jí)膽酸產(chǎn)生的治療方法，包括施用一種酵母菌。
18.一種如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述酵母菌是至少一種選自伊氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、有孢漢遜氏酵母屬、糖酵母屬、絲狀畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、畢赤氏酵母屬和接合糖酵母屬的菌種。
19.一種如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述酵母菌是至少一種選自東方伊氏酵母、馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、耐熱克魯維氏酵母、Hanseniaspora uvarum、啤酒糖酵母、大連糖酵母、微小糖酵母、單孢糖酵母、巴楊氏糖酵母、Hyphopichia burtonii、乳酒假絲酵母、Candida etchellsii、涎沫假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母、麥芽糖假絲酵母、熱帶假絲酵母、Candida cylindracea、產(chǎn)朊假絲酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、Pichia anomala、Pichia holstii、Pachiticosproa transverensis和Zygosaccharomyces rouxii的菌種。
全文摘要
含有一種作為活性成分的酵母菌的次級(jí)膽酸產(chǎn)生抑制劑和降膽固醇劑。
文檔編號(hào)A61P3/06GK1361696SQ00810674
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月21日
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