專利名稱：作為vegf受體kdr拮抗劑的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為VEGR受體KDR的拮抗劑、因而可用于治療血管生成性疾病的小肽，還涉及編碼這些肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體和細(xì)胞，以及利用這些肽、多核苷酸、載體或細(xì)胞的治療血管生成性疾病的方法和藥物組合物。
背景技術(shù)：
血管生成是正常機(jī)體活動(dòng)所必需的，包括生殖、發(fā)育和傷口愈合。雖然血管生成在正常條件下是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過(guò)程，但許多疾病是由持續(xù)失調(diào)的血管生成所驅(qū)動(dòng)的，這些疾病稱為血管生成性疾病。換句話說(shuō)，血管生成失調(diào)可以直接引起特定的疾病，或者加劇已經(jīng)存在的疾病。例如，眼的新血管化是失明的最常見原因。在一些已經(jīng)存在的疾病如關(guān)節(jié)炎中，新生成的毛細(xì)血管侵入關(guān)節(jié)并破壞軟骨。在糖尿病人中，視網(wǎng)膜中新生成的毛細(xì)血管侵入玻璃體，導(dǎo)致出血和失明。實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有賴于新血管的形成，這包括起始血管膜的溶解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移以及新血管的形成等多個(gè)步驟(Folkman J.Angiogenesis in cancer，rheumatoid and other disease.Nature Med.，1995a，1，27-30)。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是血小板源生長(zhǎng)因子家族的一個(gè)成員，是最直接的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂素(Ferrara N.Molecular and biologicalproperties of vascular endothelial growth factor.J.Mol.Med.，1999，77527-543)。它通過(guò)其受體(VEGFR)介導(dǎo)其活性，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VEGF結(jié)合受體KDR(Kinase insert Domain containing Receptor)能引起內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，是抑制血管生成的重要靶點(diǎn)(Hanahan H.Signaling vascular morphogenesis and maintenance.Science，1997，27748-50；Shinichi K.et al.Roles of two VEGF receptors，F(xiàn)lt-1 and KDR，in the VEGF effects in human vascular endothelial cells.Oncogene，2000，192138-2146)。
Binetruy-Tournaire R.等人在The EMBO Journal.2000，19(7)1525-1533中報(bào)道了一些作為VEGF-KDR相互作用拮抗劑的小肽，據(jù)稱它們能封閉VEGF誘導(dǎo)的新血管形成。
由于現(xiàn)在臨床使用的血管生成抑制劑不能令人滿意，例如具有嚴(yán)重的系統(tǒng)毒性(Suramin)或抗血管生成作用弱(干擾素、抗雌激素等)，因而需要尋找更多的血管生成抑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供含一個(gè)或多個(gè)相同或不同的下式氨基酸序列的多肽或其藥物可接受的鹽A-X1-X2-X3-H-H-X4-X5-H-B (I)其中A為0-3個(gè)任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；X1為不存在或任選保護(hù)的疏水氨基酸殘基；X2為不存在或任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；X3為任選保護(hù)的極性氨基酸殘基；X4為任選保護(hù)的極性氨基酸殘基；X5為不存在或任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；B為0-5個(gè)任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；
H獨(dú)立地為任選保護(hù)的組氨酸。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其含有一種或多種上述本發(fā)明的肽和必要時(shí)的藥物可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明涉及作為藥物、特別是作為治療血管生成性疾病之藥物的上述本發(fā)明的肽。
本發(fā)明還涉及一種或多種上述本發(fā)明肽在制備治療血管生成性疾病的藥物中的應(yīng)用。
同樣，本發(fā)明提供一種治療需要抗血管生成治療之患者的方法，包括給予所述患者治療有效量的一種或多種上述本發(fā)明肽。
另外本發(fā)明涉及編碼上述本發(fā)明肽的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)?；虿《据d體。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核苷酸序列或載體的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供作為藥物的上述本發(fā)明的核苷酸序列、載體或細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核苷酸序列、載體或細(xì)胞的治療血管生成性疾病的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及上述本發(fā)明核苷酸序列或載體從取自患者的細(xì)胞制備待回輸給患者以治療血管生成性疾病的細(xì)胞的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及一種治療血管生成性疾病的方法，包括給予需此治療的患者治療有效數(shù)量的上述本發(fā)明核苷酸序列、載體或細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.測(cè)定不同小肽融合蛋白抑制VEGF與可溶性受體sKDR結(jié)合的放免競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖2.不同小肽對(duì)VEGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖3.小肽抑制雞胚絨毛尿囊膜血管增生的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(A)VEGF刺激血管增生明顯；(B)DHFR對(duì)血管無(wú)明顯影響；(C)K237處理的雞胚血管分布紊亂和萎縮。
圖4.小肽融合蛋白腹腔注射對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制，在停藥30天后的荷瘤狀況。
圖5.小肽融合蛋白腹腔注射對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制，給藥后裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)曲線。
發(fā)明詳述基于阻斷VEGF和相應(yīng)KDR受體結(jié)合來(lái)抑制血管生成這一策略，本發(fā)明人利用克隆表達(dá)獲得的可溶性KDR為靶點(diǎn)進(jìn)行噬菌體肽庫(kù)篩選，發(fā)現(xiàn)并通過(guò)體內(nèi)、體外試驗(yàn)證明了下述小肽和小肽融合蛋白具有抗血管生成活性，能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及治療其他血管生成性疾病含一個(gè)或多個(gè)相同或不同的下式氨基酸序列的多肽或其藥物可接受的鹽A-X1-X2-X3-H-H-X4-X5-H-B (I)其中A為0-3個(gè)任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；X1為不存在或任選保護(hù)的疏水氨基酸殘基；X2為不存在或任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；X3為任選保護(hù)的極性氨基酸殘基；X4為任選保護(hù)的極性氨基酸殘基；X5為不存在或任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；B為0-5個(gè)任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；H獨(dú)立地為任選保護(hù)的組氨酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是沒有保護(hù)的游離肽或其藥物可接受的鹽。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明肽的N末端α氨基上帶有氨基保護(hù)基和/或在C末端的α羧基上帶有羧基保護(hù)基。
在上式(I)中，X5優(yōu)選為極性氨基酸殘基，更優(yōu)選X5為Asn或Gln，最優(yōu)選X5為Gln。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽含有一個(gè)式(I)氨基酸序列。在此方案中，更優(yōu)選本發(fā)明的多肽為H2N-His-Thr-Met-Tyr-Tyr-His-His-Tyr-Gln-His-His-Leu-COOH(K237)H2N-Met-His-Asn-His-His-Asn-His-Pro-Arg-Pro-Ser-Ser-COOH(K112)或H2N-Cys-Asp-Pro-Leu-Leu-Lys-His-His-Thr-His-Pro-Lys-COOH(K212)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽為式(I)氨基酸序列與另一多肽的融合蛋白。依據(jù)本發(fā)明小肽的活性，可以設(shè)想將該小肽與其他功能性肽或蛋白融合，形成不同形式的多功能融合蛋白。例如可以將本發(fā)明小肽與下列肽或蛋白組合成融合蛋白1.各類細(xì)胞因子，如白介素2，以在腫瘤部位封閉受體的同時(shí)局部活化T淋巴細(xì)胞等；2.可溶性受體KDR或Flt-1，以發(fā)揮封閉受體和通過(guò)可溶性受體結(jié)合VEGF的雙重功能，從不同環(huán)節(jié)阻斷VEGF同其受體的結(jié)合；3.異性抗體或其片段，如腫瘤血管內(nèi)皮特異性抗體或其片段，從而使本發(fā)明小肽在體內(nèi)的分布具有靶向性；4.任選通過(guò)一定長(zhǎng)度的接頭與其他功能性小肽融合，如本發(fā)明人在相同申請(qǐng)日提交的另一PCT申請(qǐng)中所公開的封閉受體Flt-1的一類小肽，特別是H2N-Trp-His-Ser-Asp-Met-Glu-Trp-Trp-Tyr-Leu-Leu-Gly-COOH(F56)H2N-Trp-His-Val-Asp-Glu-Thr-Trp-Trp-Leu-Leu-Met-Leu-COOH(F87)H2N-Trp-His-Asp-Pro-Thr-Pro-Trp-Trp-Ser-Trp-Glu-Ile-COOH(F90)這樣同一分子可以同時(shí)封閉KDR和Flt-1兩類受體，從而更高效地抑制VEGF與其受體的結(jié)合；5.B7等分子，以便在封閉受體的同時(shí)在腫瘤局部活化淋巴細(xì)胞；6.其他任何能與本發(fā)明小肽相容并在功能上互補(bǔ)或協(xié)同的肽或蛋白。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同或不同的式(I)氨基酸序列，在相鄰的序列之間任選有適當(dāng)?shù)慕宇^。換句話說(shuō)，本發(fā)明的式(I)小肽可以任選通過(guò)適當(dāng)?shù)慕宇^相互連接，形成同聚、或異聚的多聚體。
在本文中，“氨基保護(hù)基”指保護(hù)氨基酸或肽的氨基基團(tuán)使其不參與特定反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。關(guān)于氨基保護(hù)基，請(qǐng)參見Greene“Protective Groups InOrganic Synthesis”(John Wiley & Sons，New York(1981))中的描述。例如，氨基保護(hù)基包括C1-6低級(jí)烷?；缫阴；?、丙酰基、新戊?；?、叔丁基乙酰基等；其他?；?-氯乙?；?、2-溴乙?；?、三氟乙酰基、三氯乙?；?、鄰苯二甲?；?、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲?；龋换酋；绫交酋；?、對(duì)甲苯磺?；?；能形成氨基甲酸酯的基團(tuán)如芐氧羰基、對(duì)氯芐氧羰基、對(duì)甲氧基芐氧羰基、對(duì)硝基芐氧羰基、對(duì)溴芐氧羰基、3，4-二甲氧基芐氧羰基、3，5-二甲氧基芐氧羰基、2，4-二甲氧基芐氧羰基、4-甲氧基芐氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基芐氧羰基、3，4，5-三甲氧基芐氧羰基、1-(聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基3，5-二甲氧基芐氧羰基、二苯甲基氧羰基、叔丁氧羰基、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧羰基、乙氧基羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧羰基、環(huán)戊基氧羰基、金剛烷基氧羰基、環(huán)己基氧羰基、苯基硫代羰基等；芳基烷基如芐基、三苯甲基、芐氧羰基、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)等；以及甲硅烷基如三甲基甲硅烷基等。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是甲酰基、乙酰基、苯甲?；?、新戊?；⑹宥』阴；?、苯磺?；?、芐基、叔丁氧羰基(Boc)和芐氧羰基(Cbz)。例如，賴氨酸的α氨基用酸不穩(wěn)定基團(tuán)(如Boc)保護(hù)，而ε氨基用堿不穩(wěn)定基團(tuán)(如Fmoc)保護(hù)，然后在合成中可以選擇性地脫保護(hù)。
本文中的“羧基保護(hù)基“指當(dāng)對(duì)化合物其他位點(diǎn)功能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)保護(hù)羧酸的酯或酰胺基團(tuán)。關(guān)于羧基保護(hù)基，請(qǐng)參見Greene“Protective Groups InOrganic Synthesis”(John Wiley & Sons，New York(1981))中的描述。例如，羧基保護(hù)基的例子包括C1-8低級(jí)烷基、(如甲基、乙基、叔丁基等)；芳基烷基如苯乙基、芐基或取代的芐基；芳基烯基如苯基乙烯基；而烷基氨基烷基如而甲氨基乙基等；烷酰氧烷基如乙酰氧甲基、丁酰氧甲基、戊酰氧甲基、異丁酰氧甲基、異戊酰氧甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、新戊酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；環(huán)烷酰氧基烷基如環(huán)丙基羰氧甲基、環(huán)丁基羰氧甲基、環(huán)戊基羰氧甲基、環(huán)己基羰氧甲基等；芳酰氧烷基如苯甲酰氧甲基、苯甲酰氧乙基等；芳基烷基羰氧烷基如芐基羰氧甲基、2-芐基羰氧乙基等；烷氧羰基烷基或環(huán)烷氧羰基烷基如甲氧羰基甲基、環(huán)己氧羰基甲基、1-甲氧羰基-1-乙基等；烷氧基羰氧烷基或環(huán)烷氧基羰氧烷基如甲氧基羰氧甲基、叔丁氧基羰氧甲基、1-乙氧基羰氧基-1-乙基、1-環(huán)己基氧基羰氧基-1-乙基等；芳氧基羰氧基烷基如2-(苯氧基羰氧基)乙基、2-(5-二氫茚基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基烷基羰氧基烷基如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酰氧基)乙基等；芳基烷氧基羰氧基烷基如2-(芐氧基羰氧基)乙基等；芳基鏈烯氧基羰氧基烷基如2-(3-苯基丙烯-2-基氧羰基氧基)乙基等；烷氧羰基氨基烷基如叔丁氧羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基如甲氨基羰基氨基甲基等；烷?；被榛缫阴０被谆龋浑s環(huán)基羰氧烷基如4-甲基哌嗪基羰氧甲基等；二烷基氨基羰基烷基如二甲氨基羰基甲基二乙氨基羰基甲基等。對(duì)本發(fā)明肽優(yōu)選的羧基保護(hù)基是C1-6低級(jí)烷基、C3-7環(huán)烷基或芳烷基酯，例如甲基酯、乙基酯、丙基酯異丙基酯、丁基酯、仲丁基酯、異丁基酯、戊基酯、異戊基酯、環(huán)己基酯苯乙基酯等，或烷酰氧羰基、環(huán)烷酰氧羰基、芳酰氧烷基或芳烷基羰氧基烷基酯。例如天冬氨酸的α-羧基用酸不穩(wěn)定基團(tuán)(如叔丁基)保護(hù)，而β羧基用氫化不穩(wěn)定的基團(tuán)(如芐基)保護(hù)，然后在合成過(guò)程中選擇性脫保護(hù)。
本發(fā)明所述天然氨基酸包括極性氨基酸絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和組胺酸(His)；疏水性氨基酸甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。若沒有特別指明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解本發(fā)明中所述氨基酸和肽中的氨基酸殘基的α碳的立體化學(xué)為其天然的形式，即“L”構(gòu)型，當(dāng)然非手性氨基酸除外。
本發(fā)明中所述氨基酸也可以帶有非天然的側(cè)鏈殘基，如高苯丙氨酸、苯基甘氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、噻唑基丙氨酸等。
本發(fā)明的肽可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明肽可以按Steward and Young(Steward，J.M.and Young，J.D.，SolidPhase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成。也可以先合成多個(gè)片段，然后連在一起形成更大的片段。對(duì)于固相肽合成，在Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973中可以找到許多技術(shù)的介紹。一般，這些方法包括向生長(zhǎng)的肽鏈上依次添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸。一般，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)，然后將保護(hù)的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應(yīng)氨基或羧基被適當(dāng)保護(hù)的序列中的下一個(gè)氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護(hù)基，再加入必要時(shí)適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸，如此重復(fù)操作。當(dāng)所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時(shí)除去任何剩余的保護(hù)基和固相支持物，得到最終的多肽。通過(guò)簡(jiǎn)單修改此一般程序，可以一次向生長(zhǎng)鏈添加一個(gè)以上的氨基酸。
制備本發(fā)明肽的特別優(yōu)選的方法是固相肽合成，其中使用α氨基被酸或堿敏感性基團(tuán)保護(hù)的氨基酸。這種保護(hù)基應(yīng)該在肽鍵形成條件下穩(wěn)定，又容易除去而不破壞生長(zhǎng)的肽鏈、不會(huì)引起其中的任何手性中心外消旋。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本發(fā)明肽特別優(yōu)選的。
其他優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基為對(duì)賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈氨基2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?pmc)、硝基、對(duì)甲苯磺?；?-甲氧基苯磺?；?、Cbz、Boc、和金剛烷氧羰基；對(duì)酪氨酸芐基、鄰溴芐氧羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基、環(huán)己基、環(huán)戊基和己酰基；對(duì)于絲氨酸叔丁基、芐基、和四氫吡喃基；對(duì)于組胺酸三苯甲基、芐基、Cbz、對(duì)甲苯磺酰基和2，4-二硝基苯基；對(duì)于色氨酸甲酰基；對(duì)于天冬氨酸和谷氨酸芐基和叔丁基；對(duì)于半胱氨酸三苯甲基。
在固相肽合成方法中，首先要將C末端α氨基酸連接在適當(dāng)?shù)墓滔噍d體或樹脂上。適用于上述方法的固相載體是那些對(duì)每步縮合—脫保護(hù)反應(yīng)的試劑和反應(yīng)條件為惰性并在所用的溶媒中不溶的材料。對(duì)于α-C末端羧酸肽的合成優(yōu)選的固相載體是4-羥甲基苯氧基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。對(duì)于α-C末端酰胺肽的合成優(yōu)選的固相載體是4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂，可從Applied Biosystems(Foster City，Calif.)購(gòu)得。C末端α氨基酸一般按如下方法連接在樹脂上利用N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)，以及在有或沒有4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)或二(2-氧代-3-噁唑烷基氯化膦(BOPCl)存在下，在適當(dāng)?shù)娜軇┤缍燃淄榛駾MF中、于10-50℃偶聯(lián)約1-24小時(shí)。當(dāng)固相載體為4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂時(shí)，在如上所述與C末端α氨基酸偶聯(lián)之前先用仲胺(優(yōu)選哌啶)除去Fmoc基團(tuán)。與脫保護(hù)后的4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂偶聯(lián)的優(yōu)選方法是在DMF中使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU，1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。
隨后的氨基酸偶聯(lián)可以在本領(lǐng)域熟知的自動(dòng)肽合成儀中進(jìn)行。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，生長(zhǎng)肽鏈的氨基酸α-N末端是用Fmoc保護(hù)的?？梢酝ㄟ^(guò)用仲胺(優(yōu)選哌啶)從生長(zhǎng)肽鏈的該α-N末端側(cè)除去Fmoc保護(hù)基。每個(gè)保護(hù)的氨基酸以約3倍的摩爾過(guò)量引入，優(yōu)選在DMF中進(jìn)行偶聯(lián)。偶聯(lián)試劑一般是O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU，1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。在固相合成結(jié)束時(shí)，相繼或一次性從樹脂上切下多肽和脫保護(hù)。可以用含有硫代茴香醚、水、二巰基乙烷和三氟乙酸的裂解試劑處理樹脂-多肽結(jié)合物一次性切下多肽并脫保護(hù)。當(dāng)多肽的α-C末端是烷基酰胺時(shí)，通過(guò)用烷基胺進(jìn)行氨解從樹脂上切下多肽?；蛘咄ㄟ^(guò)酯交換(如用甲醇)然后氨解，或者直接進(jìn)行轉(zhuǎn)酰胺切下多肽。此時(shí)可以純化保護(hù)的多肽，或者直接用于下一步?？梢杂蒙鲜龌旌狭呀庖撼?cè)鏈保護(hù)基。完全脫保護(hù)的肽可以通過(guò)部分或全部如下類型的色譜方法純化弱堿性樹脂(如乙酸鹽形式)上的離子交換；在非衍生化聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂(如Amberlite XAD)上的疏水性吸附色譜；硅膠吸附色譜；羧甲基纖維素離子交換色譜；分配色譜，如在Sephadex G-25，LH-20上，或?qū)α鞣峙?；高效液相色譜(HPLC)，特別是在辛基-或十八烷基二氧化硅柱上的反向HPLC。通過(guò)快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜測(cè)定所合成多肽的分子量。關(guān)于本發(fā)明多肽的具體合成，見實(shí)施例1-3。
本發(fā)明較長(zhǎng)的多肽和融合蛋白優(yōu)選通過(guò)含有本發(fā)明肽或融合蛋白編碼序列的多核苷酸在適當(dāng)宿主中表達(dá)，然后純化所表達(dá)的肽產(chǎn)物來(lái)獲得。編碼本發(fā)明小肽的核苷酸序列正、反義鏈可以按本領(lǐng)域熟知的固相亞磷酸酰胺三酯法在DNA合成儀上合成。將合成得到的互補(bǔ)的正、反義鏈在適當(dāng)緩沖液中退火得到編碼本發(fā)明小肽的寡核苷酸。在該合成過(guò)程中，可以在寡核苷酸兩側(cè)引入用于克隆的粘性末端序列。然后，可以將編碼本發(fā)明小肽的寡核苷酸與用相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化的含另一多肽或蛋白編碼序列的適當(dāng)載體用T4連接酶連接，得到編碼融合蛋白的DNA序列。所述另一多肽或蛋白的編碼序列一般是已知的，有些可以以載體形式購(gòu)買得到，或者可以按常規(guī)方法合成或從已知生物體中克隆得到。如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列的測(cè)定可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。當(dāng)然，在表達(dá)載體中應(yīng)含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子等。為了表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞腔室中的定位，在多肽編碼序列上游可加入適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列。合適載體和啟動(dòng)子的選擇為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知。細(xì)菌適用的有效表達(dá)載體可以這樣來(lái)構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)被插入到帶有一個(gè)功能啟動(dòng)子的可操縱的閱讀框中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知用于構(gòu)建含有本發(fā)明核苷酸序列以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件之載體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，根據(jù)本發(fā)明DNA序列所插入的表達(dá)載體或構(gòu)建體的種類和特性選擇合適的宿主以表達(dá)目的蛋白質(zhì)。適于表達(dá)本發(fā)明的多肽的宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細(xì)胞系，Gluzman(Cell 23175，1981)及其它的能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系。將構(gòu)建體導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，包括但不限于氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J. (1989)，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F(xiàn).M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，913224-3227；Logan，J.等人，PNAS，81365 5-3659)。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細(xì)胞，使其生長(zhǎng)到恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用適當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)藥品誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。針對(duì)不同的宿主菌株或細(xì)胞選擇以及所表達(dá)的目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)相應(yīng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)。所表達(dá)的多肽或融合蛋白按常規(guī)方法從培養(yǎng)物中分離和純化，如離心、沉淀、各種色譜、HPLC等。實(shí)施例4中給出了本發(fā)明小肽與二氫葉酸還原酶融合蛋白的克隆和表達(dá)。
本發(fā)明的肽具有抗血管生成活性，如下文的試驗(yàn)實(shí)施例所示，它們能競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF與其KDR受體的結(jié)合，特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制雞胚絨毛尿囊膜血管的增生，并抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移。作為血管生成抑制劑，本發(fā)明的肽可用于治療例如下列器官的原發(fā)或轉(zhuǎn)移的實(shí)體腫瘤和癌乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸；尿道包括腎、膀胱和泌尿道上皮；女性生殖道，包括宮頸、子宮、卵巢、絨毛膜癌和妊辰營(yíng)養(yǎng)層病；男性生殖道，包括前列腺、精囊和睪丸；內(nèi)分泌腺體，包括甲狀腺、腎上腺和垂體；皮膚，包括血管生成性瘤、黑素瘤、從骨或軟組織發(fā)生的肉瘤和卡波濟(jì)肉瘤；腦、神經(jīng)、眼和腦膜的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)膜瘤；從造血惡性疾病如白血病發(fā)生的實(shí)體腫瘤，包括綠色瘤、漿細(xì)胞瘤、和皮膚性T-細(xì)胞瘤/白血??；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；預(yù)防自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫和變性性關(guān)節(jié)炎；眼疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、未熟兒視網(wǎng)膜病、角膜移植排斥、晶狀體后纖維組織形成、新血管性青光眼、由于斑變性和缺氧引起的視網(wǎng)膜新血管化；皮膚病，包括牛皮癬；血管病，包括成血管性瘤和動(dòng)脈硬化斑內(nèi)的毛細(xì)管增殖；心肌血管生成；斑新血管化；毛細(xì)管擴(kuò)張；出血性關(guān)節(jié)血管纖維瘤；傷口肉芽化；以內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度或異常刺激未特征的疾病，包括腸粘連局限性回腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化、硬皮病和肥大性疤痕；和有血管生成病因的疾病，包括潰瘍。另外，本發(fā)明的肽可抑制排卵和胎盤生成，因而可用作生育控制藥。本發(fā)明的肽還可用于防止上述腫瘤的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明化合物可以以藥物可接受的鹽形式使用?！八幬锟山邮艿柠}”指適于與人或動(dòng)物的組織接觸，而無(wú)過(guò)多的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)等。藥物可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。這種鹽可以在本發(fā)明肽的最終分離和純化的過(guò)程中就地制備，也可以將游離的堿或酸與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無(wú)機(jī)酸或堿反應(yīng)單獨(dú)制備。代表性酸加成鹽包括但不限于乙酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。能用于形成藥物可接受鹽的優(yōu)選的酸是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、草酸、馬來(lái)酸、琥珀酸和檸檬酸。藥物可接受的堿加成鹽中的陽(yáng)離子包括但不限于堿金屬或堿土金屬離子如鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁等，以及非毒性季銨陽(yáng)離子如銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。優(yōu)選的堿加成鹽包括磷酸鹽、Tris和乙酸鹽。
本發(fā)明的肽或融合蛋白可以與藥物可接受的賦形劑或載體結(jié)合形成藥物組合物。藥物可接受的載體或賦形劑指無(wú)毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料。所述藥物組合物適于胃腸外、舌下、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、頰內(nèi)、腫瘤內(nèi)或表皮給藥。
胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。適于胃腸外給藥的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨使用前在無(wú)菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑等佐劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。
表皮給藥包括在皮膚、黏膜上、以及在肺和眼的表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。在適于吸入的組合物中，本發(fā)明肽被壓縮或含于壓縮氣體如氮?dú)饣蛞夯瘹怏w推進(jìn)劑中。優(yōu)選地，本發(fā)明肽不溶于液化推進(jìn)介質(zhì)中。
直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選為栓劑，它可以通過(guò)將本發(fā)明的肽與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合制備，所述賦形劑或載體在室溫為固態(tài)，在體溫下為液態(tài)，因此在直腸或陰道腔內(nèi)熔化并釋放出活性化合物。
當(dāng)以上述或其他方式進(jìn)行治療時(shí)，治療有效量的本發(fā)明肽可以是本發(fā)明肽的純凈形式、藥物可接受的鹽形式，使用或不使用藥物可接受的賦形劑。治療有效量指以適宜的治療量對(duì)治療血管生成性疾病有效的本發(fā)明肽的量。對(duì)任何特定患者的具體治療有效劑量取決于許多因素，包括所治療的疾病和氣其嚴(yán)重程度；所用具體化合物的活性；所用的特定組合物；患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況；給藥時(shí)間；給藥途徑；具體化合物的排泄速度；治療的持續(xù)時(shí)間聯(lián)合或同時(shí)服用的其他藥物等。例如，在局部給藥時(shí)，本發(fā)明肽總的日劑量為0.05-20mg/kg體重，在系統(tǒng)給藥時(shí)的日劑量為0.15-50mg/kg體重。對(duì)于分子量為約2.7萬(wàn)的融合蛋白，在局部給藥時(shí)的日劑量為0.15-60mg/kg體重，體統(tǒng)給藥時(shí)的日劑量為0.5-150mg/kg體重。如果需要，日劑量可以分成多次給藥。因此，組合物的單一劑量形式可以含有構(gòu)成日劑量的全部或其一部分的量。
另一方面，本發(fā)明還涉及編碼如上所定義本發(fā)明多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還包括基因治療，即通過(guò)將編碼本發(fā)明多肽的基因轉(zhuǎn)移到患者的細(xì)胞中，以在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的多肽，從而產(chǎn)生治療效果。本領(lǐng)域中已知各種各樣的將DNA轉(zhuǎn)移或傳遞到細(xì)胞來(lái)表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的方法，例如《體內(nèi)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移》N.Yang，Crit.Rev.Biotechn.12(4)335-356(1992)中所述?；蛑委煱▽NA序列摻入體細(xì)胞或者生殖細(xì)胞用于離體或體內(nèi)治療。
基因治療的基因轉(zhuǎn)移方法分成三大類(1)物理的(例如電穿孔，直接基因轉(zhuǎn)移和粒子轟擊)，(2)化學(xué)的(例如基于脂質(zhì)的載體和其它非病毒載體)和(3)生物的(例如病毒載體)。例如，像包被有DNA的脂質(zhì)體這樣的非病毒載體可以靜脈注射入患者體內(nèi)。載體或者“裸露”DNA的基因也可以直接注入期望的器官、組織或者腫瘤來(lái)靶向轉(zhuǎn)移治療性DNA。
基本轉(zhuǎn)移基因的方法包括離體基因轉(zhuǎn)移、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和體外基因轉(zhuǎn)移。對(duì)于離體基因轉(zhuǎn)移，細(xì)胞取自患者并在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，然后再重新移植入患者。對(duì)于體外基因轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)化細(xì)胞是生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中的細(xì)胞，像組織培養(yǎng)細(xì)胞，而不是來(lái)自從特定患者的特定細(xì)胞。這些“實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞”被轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被選擇和擴(kuò)增，用來(lái)移植入患者體內(nèi)或者用于其它用途。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移包括當(dāng)細(xì)胞在患者體內(nèi)時(shí)把DNA導(dǎo)入到患者的細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選生物基因療法，即應(yīng)用病毒載體把基因插入細(xì)胞。這里使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指可以包含或者結(jié)合特定多核苷酸序列的載體，并且負(fù)責(zé)把這些特定多核苷酸序列運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以來(lái)自患者正常組織，患者的患病組織或者不是來(lái)自患者。載體的例子包括質(zhì)粒和像病毒這樣的感染性微生物或者像配基-DNA偶聯(lián)體、脂質(zhì)體和脂質(zhì)-DNA復(fù)合體這樣的非病毒載體。
將包含有本發(fā)明肽或融合蛋白編碼DNA序列的重組DNA分子有效地連接到一個(gè)表達(dá)調(diào)控序列下來(lái)形成能夠表達(dá)本發(fā)明多肽或融合蛋白的表達(dá)載體。已經(jīng)用于基因治療方案的病毒載體包括，但是并不局限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒，其它RNA病毒，像脊髓灰質(zhì)炎病毒或者新培斯病毒，腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、猴病毒40、痘病毒或其它DNA病毒。復(fù)制缺陷型鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最廣泛使用的基因轉(zhuǎn)移載體。病毒載體也已經(jīng)用來(lái)在體內(nèi)把基因插入細(xì)胞。為了定向組織特異性表達(dá)的外源基因，可以使用已知的組織特異性順式作用調(diào)控元件或者啟動(dòng)子?；蛘?，利用DNA原位傳遞或者特異于體內(nèi)解刨位點(diǎn)的病毒載體也可以實(shí)現(xiàn)。例如，通過(guò)移植體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)脈壁上選定位點(diǎn)的內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了把基因轉(zhuǎn)移到血管。被病毒感染的周圍細(xì)胞也表達(dá)基因產(chǎn)物。病毒載體可以直接傳遞到體內(nèi)位點(diǎn)(例如通過(guò)導(dǎo)管)，這樣允許僅僅某些地方被病毒感染而且提供長(zhǎng)期位點(diǎn)特異的基因表達(dá)。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，也已經(jīng)展示了在乳房組織和肝組織的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，其是通過(guò)將重組病毒注入到流入這些器官的血管中實(shí)現(xiàn)的。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明多核苷酸的質(zhì)?；虿《据d體，以及含有本發(fā)明多核苷酸或載體的細(xì)胞。
如上所述，本發(fā)明涉及作為基因治療藥物的編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸、載體或細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及一種治療血管生成性疾病的藥物組合物，其含有本發(fā)明的多核苷酸、載體或細(xì)胞，和必要時(shí)藥物可接受、特別是基因治療適用的賦形劑。
基于本發(fā)明多核苷酸的基因治療應(yīng)用，本發(fā)明涉及上述多核苷酸或載體從取自患者的細(xì)胞制備待回輸給患者以治療血管生成性疾病的細(xì)胞的應(yīng)用。
最后，本發(fā)明涉及治療血管生成性疾病的方法，包括給予需此治療的患者治療有效數(shù)量的本發(fā)明所定義的多肽、多核苷酸、載體或細(xì)胞。
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，而對(duì)本發(fā)明范圍沒有任何限制意義。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
H2N-His-Thr-Met-Tyr-Tyr-His-His-Tyr-Gln-His-His-Leu-COOH(K237)將裝填4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂的肽合成柱置于PioneerTM肽合成儀中，并按如下順序在氮?dú)庀逻M(jìn)行肽的合成1.將樹脂在DMF中溶劑化5分鐘；2.用DMF中20％哌啶處理樹脂約15分鐘，除去樹脂接枝基團(tuán)上(或樹脂結(jié)合的氨基酸α-氨基上)的保護(hù)基Fmoc；3.用DMF洗滌樹脂約分鐘；4.用HBTU和HOBT在DMSO-NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的0.2M溶液和DMSO-NMP中的0.4M二異丙基乙基胺溶液活化C末端第一個(gè)氨基酸Leu(Fmoc-Leu)的α-羧基；5.將在步驟4獲得的活化的氨基酸在DMF中與步驟2的樹脂(或樹脂結(jié)合的氨基酸)偶聯(lián)約30分鐘；6.用DMF洗滌樹脂5分鐘；7.用下列氨基酸重復(fù)步驟2-6Fmoc-His(Trt)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Gln(Trt)→Fmoc-Tyr(tBu)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Tyr(tBu)→Fmoc-Tyr(tBu)→Fmoc-Met→Fmoc-Thr(tBu)→Fmoc-His(Trt)；8.用THF洗滌樹脂約5分鐘，9.將樹脂與新制備的混合切割試劑硫代茴香醚∶水∶二巰基乙烷∶三氟乙酸(2∶1∶1∶36，體積比)0℃攪拌10-15分鐘，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)；10.過(guò)濾并將濾液在冷乙醚中離心，倒出上清并重復(fù)冷乙醚離心直到肽完全沉淀，將所得肽粗品在制備性C18硅膠柱層析純化，用乙腈/(水，0.1％ TFA)梯度洗脫，收集含目標(biāo)肽的個(gè)洗脫流分并冷凍干燥，得到50mg標(biāo)題肽。
實(shí)施例2H2N-Met-His-Asn-His-His-Asn-His-Pro-Arg-Pro-Ser-Ser-COOH(K112)按實(shí)施例1描述的操作方法制備標(biāo)題肽。第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Ser(tBu)，按所述條件依次添加下列氨基酸Fmoc-Ser(tBu)→Fmoc-Pro→Fmoc-Arg(Pmc)→Fmoc-Pro→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Asn(Trt)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Asn(Trt)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Met。得到45mg標(biāo)題肽。
實(shí)施例3H2N-Cys-Asp-Pro-Leu-Leu-Lys-His-His-Thr-His-Pro-Lys-COOH(K212)按實(shí)施例1描述的操作方法制備標(biāo)題肽。第一個(gè)氨基酸為Fmoc-Lys(Boc)，按所述條件依次添加下列氨基酸Fmoc-Pro→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Thr(tBu)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-His(Trt)→Fmoc-Lys(Boc)→Fmoc-Leu→Fmoc-Leu→Fmoc-Pro→Fmoc-Asp(β-OtBu)→Fmoc-Cys(Trt)。得到25mg標(biāo)題肽。
實(shí)施例4.DHFR-K237融合蛋白的制備方法1.K237 DNA的合成根據(jù)K237肽的DNA編碼序列，按照固相亞磷酸酰胺三酯法在DNA合成儀(ABI，381A型)上合成正、反單鏈DNA片段，并在其兩側(cè)引入用于克隆的粘性末端序列；取互補(bǔ)的正、反義鏈DNA各30ng，在8μl TE中，65℃水浴5分鐘后，在15-30分鐘內(nèi)使其逐漸恢復(fù)至室溫。
2.DHFR-K237表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)用PstI、HindIII(購(gòu)自New England Biolabs)先后消化二氫葉酸還原酶(DHFR)表達(dá)質(zhì)粒pQE 42，然后用QIAGEN試劑盒回收；將純化的載體片段與根據(jù)上述方法得到的退火后的寡核苷酸片段用T4DNA連接酶(購(gòu)自NewEngland Biolabs)連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化并進(jìn)行克隆篩選。
在pQE 42二氫葉酸還原酶質(zhì)粒中有一個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)在DHFR的5’端，而小肽DNA是與DHFR的3’端相連接，由于在K237 DNA序列的3’端中也有一個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)，故用BamH I(購(gòu)自New England Biolabs)酶切構(gòu)建的pQE 42-K237時(shí)應(yīng)有約700bp左右的DNA條帶產(chǎn)生，而沒有克隆片段插入的空載體應(yīng)無(wú)此條帶產(chǎn)生，酶切鑒定結(jié)果與此完全相符，說(shuō)明K237已克隆到pQE 42表達(dá)載體中。
將重組質(zhì)粒pQE 42-K237轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，用氨芐青霉素和卡那霉素進(jìn)行篩選培養(yǎng)。次日，挑取細(xì)菌克隆在LB(60μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素)液體中培養(yǎng)，用IPTG(0.1mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)，10％SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。
3.DHFR-K237融合蛋白的純化取100ml誘導(dǎo)表達(dá)載體，用2ml TE溶液懸浮沉淀，在冰浴中間歇超聲30秒破菌；離心(12000g，10分鐘，4℃)，棄上清；加入2ml去氧膽酸鈉(20g/L)超聲懸浮沉淀物，室溫30分鐘，再離心(10000g，10分鐘，4℃)，沉淀即為包含體。加入一定量變性液于包含體中，室溫作用3h，然后緩慢加入10倍體積的復(fù)性液，室溫作用3-4h后，調(diào)制pH至8，1xPBS透析(4℃過(guò)夜)，離心(10000g，4℃，10分鐘)后，用10％ SDS-PAGE進(jìn)行蛋白純度及含量檢測(cè)。
4.Western blot檢測(cè)以蛋白DHFR(陽(yáng)性對(duì)照)、DHFR-K237、6 His-Kringle(I-V)(陰性對(duì)照)上樣，10％ SDS-PAGE電泳；然后以本實(shí)驗(yàn)室制備的抗DHFR鼠源單克隆抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗，Western blot檢測(cè)蛋白DHFR、DHFR-K237、6 His-Kringle(I-V)與抗DHFR單克隆抗體的結(jié)合。本實(shí)施例所得融合蛋白的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
實(shí)施例5 DHFR-K237與sKDR結(jié)合特異性的鑒定本實(shí)施例中通過(guò)ELISA檢測(cè)融合蛋白DHFR-K237與受體KDR結(jié)合的特異性。
具體地講，分別用VEGF可溶性受體sFlt-1、sKDR[宋述梅、壽成超，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(KDR)的分子克隆與原核表達(dá)，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，1998，14(1)57-61；安平、董志偉、壽成超，可溶性VEGF受體的分子克隆與原核表達(dá)產(chǎn)物活性，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2000，16(1)62-66]包被96孔板(5mg/L，50μl/孔)，或用預(yù)冷0.125％戊二醛溶液固定96孔板中的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞或NIH3T3細(xì)胞，封閉后分別加入DHFR或DHFR-K237，用抗DHFR單克隆抗體進(jìn)行常規(guī)ELISA檢測(cè)，重復(fù)2次。
試驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。結(jié)果表明DHFR-K237能與可溶性受體KDR和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，而與VEGF受體Flt-1和NIH3T3細(xì)胞不結(jié)合。陰性對(duì)照DHFR與sFlt-1和sKDR均無(wú)反應(yīng)。這提示DHFR-K237與KDR的結(jié)合為特異性的。
表1.ELISA檢測(cè)DHFR-K237的結(jié)合特異性(OD492nm)

實(shí)施例6.DHFR-K237抑制VEGF與KDR結(jié)合的試驗(yàn)本實(shí)施例利用同位素標(biāo)記的VEGF測(cè)定DHFR-K237能否阻斷VEGF與其受體KDR的相互作用。
基本按Tanaka，K.，Yamaguchi，S.，Shibuya，M.，et al.Characterizationof the extracellular domain in vascular endothelial growth factorreceptor-1(Flt-1 tyrosine kinase).Jpn J Cancer Res.1997，88867-876中所述方法進(jìn)行操作。簡(jiǎn)單地講，用0.5mg/L可溶性受體(sKDR)包被96孔板，包被液為0.01mol/L磷酸緩沖液，pH6.2，4℃過(guò)夜；用洗滌液(0.9％ NaCl，0.01mol/L，pH6.2)洗滌3次。各孔加入250μl結(jié)合緩沖液(0.3％ BSA，25mmol/LHEPES，DMEM，ph7.6)進(jìn)行封閉，室溫反應(yīng)3小時(shí)，加入不同濃度(1、5、10、15、20μg/ml)的DHFR-K237(對(duì)照組加入相應(yīng)不同濃度的DHFR)與固定濃度的125I-VEGF(購(gòu)自Life Technology Inc.)(2μg/L，50μl/孔)，每一個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行孔，室溫結(jié)合1小時(shí)。用結(jié)合緩沖液洗板4次，待96孔板徹底干燥后加入液閃液(120μl/孔)，使固相殘留物溶解后在Wallac co液體閃爍計(jì)數(shù)器讀取cpm值。
結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，隨著溶液DHFR-K237濃度的提高，125I-VEGF與包被的sKDR的結(jié)合逐漸降低；而不同濃度的DHFR對(duì)125I-VEGF與KDR結(jié)合沒有明顯影響。這表明K237能競(jìng)爭(zhēng)抑制VEGF與受體KDR的結(jié)合。
實(shí)施例7.K237特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖為進(jìn)一步研究K237抑制VEGF與KDR結(jié)合的生物學(xué)效應(yīng)，用3HTdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K237對(duì)VEGF促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
具體地講，人臍帶標(biāo)本(取自北京婦產(chǎn)醫(yī)院)用0.1％膠原酶II(來(lái)源于GIBCOBRL公司)消化后，離心(1000rpm，10分鐘)收集人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用20％ FCS/RPMI1640(來(lái)源于GIBCO BRL公司)懸浮后，移入塑料瓶中培養(yǎng)，置于CO2孵箱中培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。2天后將培養(yǎng)的HUVEC用0.04％胰蛋白酶-EDTA消化，按3×104細(xì)胞/孔接種24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)。換用2％ FCS/RPIM1640繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，分別單獨(dú)加入VEGF165(Sigma公司產(chǎn)品)(2μg/L)，VEGF與不同濃度K237(50、100、200、300μmol/L)的混合物，每組設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，加入3H-TdR(1μ ci/ml)，再培養(yǎng)8小時(shí)。分別收集到玻璃纖維濾膜上，常規(guī)進(jìn)行cpm檢測(cè)，同樣實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，VEGF165(2μg/L)在不存在K237的情況下可以顯著促進(jìn)HUVEC的增殖，但在加入K237后，VEGF促進(jìn)HUVEC增殖的作用受到抑制，其抑制程度與K237的濃度呈正相關(guān)。當(dāng)所加入K237濃度為300μmol/L時(shí)，增殖抑制率接近100％。這說(shuō)明K237能有效阻斷VEGF對(duì)HUVEC的促增殖作用。
實(shí)施例8.K237抑制雞胚絨毛尿囊膜血管的增生本實(shí)施例用雞胚絨毛尿囊膜血管的增生實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K237對(duì)血管生成的抑制作用。
參照文獻(xiàn)“付生法，陸應(yīng)麟，張朝山等，待測(cè)血管生長(zhǎng)因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993，17294-97”中描述的方法操作。具體地講，把新鮮的授精后雞蛋在38℃、0.1％新潔爾滅溶液中浸泡2分鐘后，放入37.5℃、60-70％濕度的孵箱中孵化3天。然后去掉雞蛋外殼移入平皿培養(yǎng)。待尿囊膜長(zhǎng)至約1cm2時(shí)分組加藥，每組5個(gè)雞胚。將VEGF165(2μg/L)、DHFR(陰性對(duì)照)或K237溶液18μl(0.8μg/μl)滴于Φ5mm的玻璃纖維濾膜上，并將其置于絨毛尿囊膜的遠(yuǎn)心端。早晚各1次連續(xù)加藥2天。觀察結(jié)果并攝影記錄。重復(fù)試驗(yàn)2次(Kodak100，曝光時(shí)間3s)。
結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，人源VEGF165能促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管的增生(圖3.A)，而K237除能明顯抑制血管形成外，還能引起血管的分布紊亂及原有血管的萎縮(圖3.C)。DHFR對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管的增生無(wú)明顯影響(圖3.B)。這說(shuō)明K237有抑制血管生成的生物學(xué)活性。
實(shí)施例9.DHFR-K237對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制為了證明K237在抑制新生血管形成的基礎(chǔ)上，能否抑制腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)行了Balb/c裸鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)。
從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心購(gòu)買的5周齡Balb/c裸鼠8只，在右臀部皮下接種人胃癌MGC803細(xì)胞(2×106細(xì)胞/0.1ml/只)。接種后第5天，隨機(jī)分成2組，每組4只。腹腔注射DHFR(150μg/100μl/次)或DHFR-K237(150μg/100<p>粒料與注射成型制品通過(guò)與實(shí)施例1相同的方法得到，除了將實(shí)施例1中用到的固體(A)改為上述對(duì)比制備實(shí)施例3中得到的固體(D)。測(cè)量得到的注射成型制品的物理性能，將結(jié)果列于表2。
表1

表2

實(shí)施例1是使用制備實(shí)施例1得到的堿性硫酸鎂纖維的聚丙烯樹脂組合物(該組合物滿足本發(fā)明的特征)，以及使用該樹脂組合物得到的注射成型制品。顯然，該產(chǎn)物具有優(yōu)良的剛性和沖擊強(qiáng)度，特別是低溫下沖擊強(qiáng)度。
權(quán)利要求
1.含一個(gè)或多個(gè)相同或不同的下式氨基酸序列的多肽或其藥物可接受的鹽A-X1-X2-X3-H-H-X4-X5-H-B (I)其中A為0-3個(gè)任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；X1為不存在或任選保護(hù)的疏水氨基酸殘基；X2為不存在或任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；X3為任選保護(hù)的極性氨基酸殘基；X4為任選保護(hù)的極性氨基酸殘基；X5為不存在或任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；B為0-5個(gè)任選保護(hù)的天然氨基酸殘基；H獨(dú)立地為任選保護(hù)的組氨酸。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中X5為極性氨基酸殘基。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中X5為Asn或Gln。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中X5為Gln。
5.權(quán)利要求1的多肽，其含有一個(gè)式(I)氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的多肽，其選自下列肽H2N-His-Thr-Met-Tyr-Tyr-His-His-Tyr-Gln-His-His-Leu-COOH(K237)H2N-Met-His-Asn-His-His-Asn-His-Pro-Arg-Pro-Ser-Ser-COOH(K112)H2N-Cys-Asp-Pro-Leu-Leu-Lys-His-His-Thr-His-Pro-Lys-COOH(K212)
7.權(quán)利要求1的多肽，其為式(I)氨基酸序列與另一多肽的融合蛋白。
8.權(quán)利要求7的多肽，其中所述另一多肽選自VEGF Flt1受體拮抗劑、二氫葉酸還原酶、細(xì)胞因子、可溶性VEGF受體KDR或Flt1、特異性抗體或抗體片段和B7分子。
9.權(quán)利要求1的多肽，其含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同或不同的式(I)氨基酸序列，在相鄰的序列之間任選有適當(dāng)?shù)慕宇^。
10.一種藥物組合物，其含有一種或多種權(quán)利要求1的肽和必要時(shí)的藥物可接受的載體或賦形劑。
11.作為藥物、特別是作為治療血管生成性疾病之藥物的權(quán)利要求1的肽。
12.一種或多種權(quán)利要求1的肽在制備治療血管生成性疾病的藥物中的應(yīng)用。
13.編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸。
14.含有權(quán)利要求13的多核苷酸的質(zhì)?；虿《据d體。
15.含有權(quán)利要求13的多核苷酸或權(quán)利要求14的載體的細(xì)胞。
16.作為藥物的權(quán)利要求13的多核苷酸、權(quán)利要求14的載體或權(quán)利要求1 5的細(xì)胞。
17.一種治療血管生成性疾病的藥物組合物，其含有權(quán)利要求13的多核苷酸、權(quán)利要求14的載體或權(quán)利要求15的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求13的多核苷酸或權(quán)利要求14的載體從取自患者的細(xì)胞制備待回輸給患者以治療血管生成性疾病的細(xì)胞的應(yīng)用。
19.一種治療血管生成性疾病的方法，包括給予需此治療的患者治療有效數(shù)量的權(quán)利要求1的肽、權(quán)利要求13的多核苷酸、權(quán)利要求14的載體或權(quán)利要求15的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了含一個(gè)或多個(gè)相同或不同的式A－X1－X2－X3－H－H－X4－X5－H－B(式中各符號(hào)的意義見說(shuō)明書)氨基酸序列的多肽或其藥物可接受的鹽和含有所述多肽用于治療血管生成性疾病如實(shí)體腫瘤的藥物組合物。本發(fā)明還涉及編碼上述多肽的多核苷酸，以及其基因治療應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1406948SQ0114220
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月12日
發(fā)明者壽成超, 雷和田, 安平, 吳健, 孟麟, 劉曉穎 申請(qǐng)人:北京市腫瘤防治研究所