專利名稱：甲脒修飾的二環(huán)堿核苷類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核苷類似物及其使用方法的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哺乳動物免疫系統(tǒng)包含兩個主要的淋巴細(xì)胞類型B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，來源于骨髓；和來源于胸腺的T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。B細(xì)胞主要負(fù)責(zé)體液免疫(即產(chǎn)生抗體)，而T細(xì)胞主要負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
一般認(rèn)為T細(xì)胞分為兩個亞類，輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞通過釋放參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的稱作細(xì)胞因子的可溶性蛋白介質(zhì)來活化其它淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞。這里使用的淋巴因子是細(xì)胞因子的一類。
一般也認(rèn)為輔助T細(xì)胞分為兩個亞類1型和2型。1型細(xì)胞產(chǎn)生白介素2(IL-2)，腫瘤壞死因子(TNFα)和干擾素伽馬(IFNγ)，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，如遲發(fā)型過敏反應(yīng)和抗病毒免疫。相比之下，2型細(xì)胞產(chǎn)生白介素，IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，主要參與協(xié)助體液免疫反應(yīng)，如對變應(yīng)原的反應(yīng)中看到的，例如IgE和IgG4抗體同型轉(zhuǎn)換(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7145-173)。
這里使用的術(shù)語1型和2型“反應(yīng)”分別是指包括1型和2型淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的完整范圍的作用。除了別的之外，這種反應(yīng)包括通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌和其它可能機(jī)制使相應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)生變異，相應(yīng)淋巴細(xì)胞增生增加，和其它與細(xì)胞因子產(chǎn)生增加相伴的其它作用，包括運動性作用。
以前的申請(09/462714，09/291097，09/291093，09/471513，60/164365，60/164366，60/172097，60/175111)，每篇都引入此處作為參考，它們與我們最近的發(fā)現(xiàn)的方面相關(guān)，包括各種核苷(這里定義包括天然核苷的衍生物和類似物)對選擇性調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞反應(yīng)彼此相關(guān)的作用。除了別的之外，我們指出1型和2型反應(yīng)任一個可被選擇性抑制，而另一個被誘導(dǎo)或保留相對不受影響，1型或2型反應(yīng)任一個可被選擇性誘導(dǎo)，而另一個被抑制或保留相對不受影響。我們也發(fā)現(xiàn)令人驚奇的事實，一些能有效選擇性調(diào)節(jié)1型和2型彼此相關(guān)的反應(yīng)的核苷傾向于具有雙峰作用。除了別的之外，一般傾向于在相對高劑量時抑制或誘導(dǎo)1型和2型活性的一些核苷，傾向于在相對低劑量時選擇性調(diào)節(jié)彼此相關(guān)的1型和2型。
以前沒有研究或證明過其它核苷類似物化合物對選擇性調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞彼此相關(guān)的反應(yīng)的作用。我們發(fā)現(xiàn)在給予其它核苷類似物化合物，如該化合物的前體藥物形式后，也發(fā)生雙峰作用，或1型和2型反應(yīng)彼此相關(guān)的選擇性調(diào)節(jié)。
在生物活性化合物發(fā)展到臨床上有效的試劑的過程中，需要克服很多障礙。許多有效的生物活性化合物從來沒有變?yōu)榕R床上有效的試劑，是由于它們不受歡迎的生物藥學(xué)性能，包括由于通過生物屏障，如血腦屏障(BBB)和腸道屏障的滲透性低造成的生物可利用率低。盡管許多因素影響藥物的生物可利用率，很多藥物不受歡迎的生物藥學(xué)性能(如電荷、親脂性、氫鍵電勢、大小)可能是最常碰到的阻礙藥物滲透通過屏障的因素之一。因此，藥物物理化學(xué)特性(電荷、親脂性、氫鍵電勢、大小)的優(yōu)化可能是利于藥物轉(zhuǎn)運通過這種膜屏障的最可能的一般策略。
為了優(yōu)化藥物物理化學(xué)性能，一個可能的策略是優(yōu)化前體藥物的物理化學(xué)性能。(H.Bundgaard，Desigzl of Prodrugs，Elsevier，Amsterdam，1985；N.Bodor，L.Prokai，W.M.Wu，H.Farag，S.Jonalagadda，M.Kawamura，J.Simpkins，Science，257，1698-1700，1992；H.E.Taylor，K.B.Sloan，J.Pharm.Sci，87，5-20，1998)。術(shù)語前體藥物用于描述一種試劑，它在給藥后，應(yīng)經(jīng)化學(xué)或酶轉(zhuǎn)化變?yōu)榛钚曰蚰阁w藥物，以使代謝產(chǎn)物或母體藥物隨后能顯示出期望的藥理學(xué)反應(yīng)。通過在小有機(jī)分子中短暫且生物可逆地衍生某些極性功能基團(tuán)，“隱蔽”了這些機(jī)體的不受歡迎的物理化學(xué)特性(電荷、親脂性、氫鍵電勢、大小)，但沒有永久改變該分子的藥理學(xué)性能。這個策略已非常成功地用于藥物衍生化的情況，包括將羧基或羥基轉(zhuǎn)化為酯，能夠用化學(xué)或酶學(xué)方法在體內(nèi)容易水解。有希望的前體藥物觀念，我們期望其它部分導(dǎo)入母體藥物，能增加生物可利用率、吸收和抗病毒作用。
這些發(fā)現(xiàn)特別有意義，因為對于很多上列疾病的現(xiàn)代治療策略的有效性有限，具有明顯的副作用，或二者兼有。例如，自身免疫疾病的治療常常限于緩解措施，去除毒性抗體(如在重癥肌無力)，和給予危險藥物包括皮質(zhì)類固醇，氯喹衍生物，和抗代謝或抗腫瘤藥物，和如對準(zhǔn)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的環(huán)孢菌素的藥物。
盡管本領(lǐng)域已知大量免疫調(diào)節(jié)化合物，它們所有都具有一種或多種缺點。因此，仍需要提供改進(jìn)的方法和免疫調(diào)節(jié)化合物的組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的核苷類似物化合物和相關(guān)化合物，如前體藥物、其治療用途和合成。
本發(fā)明的一個方面中，核苷酸類似物化合物具有根據(jù)分子式1的一般結(jié)構(gòu)，其中化學(xué)構(gòu)象可以是L-構(gòu)型或D-構(gòu)型 分子式1ICN-10776本發(fā)明的另一個方面中，藥物組合物包含與至少一種藥物可接受載體混合的治療有效量的根據(jù)分子式1的化合物，或其藥物可接受酯或鹽。
本發(fā)明的另一個方面中，藥物組合物包含與至少一種藥物可接受載體混合的根據(jù)分子式化合物的前體藥物形式，或其藥物可接受酯或鹽。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面中，根據(jù)分子式1或分子式2的化合物，通過能獲得積極反應(yīng)的配方和方案，用于治療對該化合物給藥后發(fā)生積極反應(yīng)的任何病癥。除了別的之外，預(yù)期分子式1或分子式2的化合物可以用于治療感染、侵染、癌癥、腫瘤或其它瘤、巨細(xì)胞動脈炎或自身免疫疾病。


圖1A-1F是考慮的化合物對活化人T細(xì)胞的細(xì)胞因子和增生反應(yīng)的劑量效應(yīng)的描述圖。
圖2是顯示考慮的化合物治療反應(yīng)中，各種RNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的放射自顯影圖。
圖3是考慮的化合物治療反應(yīng)中，產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量的描述圖。
圖4A-4F是考慮的化合物對活化的人T細(xì)胞的活力、細(xì)胞因子反應(yīng)和增生的暫時作用的描述圖。
圖5A-5B是考慮的化合物對來自正常供體和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的活化外周T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的對比作用的描述圖。
圖6是顯示考慮的化合物治療反應(yīng)中，各種RNA在細(xì)胞中的表達(dá)的放射自顯影圖。
圖7是考慮的化合物對CD4+和CD8+T細(xì)胞亞型的活化細(xì)胞因子反應(yīng)的影響的描述圖。
圖8是考慮的化合物對鼠Th1細(xì)胞產(chǎn)生影響的描述圖。
圖9A是耳朵腫脹測定的描述圖。
圖9B是顯示考慮的化合物治療反應(yīng)中，各種RNA在細(xì)胞中的表達(dá)的放射自顯影圖。
圖10A是另一個耳朵腫脹測定的描述圖。
圖10B是顯示對考慮的化合物治療反應(yīng)中，各種RNA在細(xì)胞中的表達(dá)的另一個放射自顯影圖。
詳細(xì)描述在本說明書中使用下列術(shù)語的地方，它們定義如下。
術(shù)語“核苷”和“核苷類似物化合物”可互換，涉及由任何戊糖或修飾的戊糖部分與雜環(huán)、芳香雜環(huán)的特定位點，或嘌呤(9位)或嘧啶(1位)的天然位點，或類似物的等同位點連接組成的化合物。
術(shù)語“核苷酸”是指在核苷5’位點被磷酸酯取代。
術(shù)語“雜環(huán)”是指在具有至少一個雜原子如N、O或S的單價飽和或不飽和碳環(huán)根，環(huán)內(nèi)每個可利用的位點都能獨立地分別被如羥基、氧、氨基、亞氨基、低鏈烷基、溴基、氯基和/或氰基選擇性取代。包括在這種取代基類中的是嘌呤、嘧啶。
術(shù)語“嘌呤”是指含氮兩個環(huán)的雜環(huán)。
術(shù)語“嘧啶”是指含氮單環(huán)的雜環(huán)。
術(shù)語“D核苷”是指具有D核糖糖部分的核苷化合物。
術(shù)語“L核苷”是指具有L核糖糖部分的核苷化合物。
貫穿本發(fā)明的術(shù)語“L構(gòu)型”和“D構(gòu)型”用來描述與該分子吡咯并-嘧啶酮部分連接的化合物的呋喃核糖部分的化學(xué)構(gòu)型。
貫穿本發(fā)明的術(shù)語“C核苷”用來描述核糖糖部分和雜環(huán)基之間形成的鍵的類型。在C核苷中，該鍵在核糖糖部分的C-1位點產(chǎn)生并與雜環(huán)基的碳連接。形成C核苷的鍵是碳-碳型。
貫穿本發(fā)明的術(shù)語“N核苷”用來描述核糖糖部分和雜環(huán)基之間形成的鍵的類型。在N核苷中，該鍵在核糖糖部分的C-1位點產(chǎn)生并與雜環(huán)基的氮連接。形成N核苷的鍵是碳-氮型。
術(shù)語“保護(hù)性基團(tuán)”是指加入的化學(xué)基團(tuán)氧或氮原子，以防止它在具有氧或氮的分子中的其它部分衍生化過程中進(jìn)一步反應(yīng)。氧和氮保護(hù)性基團(tuán)的廣泛種類是有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。
術(shù)語“低鏈烷基”是指甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、t-丁基、異丁基或正己基。這個術(shù)語進(jìn)一步示例是環(huán)狀、支鏈或支鏈的一到六個碳原子。
術(shù)語“芳香基”是指具有單環(huán)(如苯基)或兩個稠合環(huán)(如萘基)單價不飽和芳香碳環(huán)基?？蛇x擇性被羥基、低鏈烷基和/或氰基取代。
術(shù)語“雜環(huán)”是指在具有至少一個雜原子如N、O、S、Se或P的單價飽和或不飽和碳環(huán)根，環(huán)內(nèi)每個可利用的位點都能獨立地分別被如羥基、氧合、氨基、亞氨基、低鏈烷基、溴基、氯基和/或氰基選擇性取代。
術(shù)語“單環(huán)”是指具有至少一個雜原子，如O，N，S，Se或P的單價飽和碳環(huán)基，在環(huán)內(nèi)每個可利用的位點可獨立地被糖部分或其它任何如溴基、氯基和/或氰基的基團(tuán)選擇性取代，以使單環(huán)的環(huán)系統(tǒng)最終被芳香化[如胸腺嘧啶核苷]。
術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”和“調(diào)節(jié)劑”可互換使用，是指能夠通過刺激或抑制改變正?；虍惓Ｃ庖呦到y(tǒng)的天然或合成產(chǎn)物。
術(shù)語“有效量”是指為了消除感染能使免疫功能恢復(fù)至正常水平，或使免疫功能增加超過正常水平的分子式(1)的化合物的量。
分子式1的化合物可以具有多個不對稱的中心。因此，它們可以以旋光活性形式或作為外消旋混合物而制備。描述和要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍包括分子式1化合物的獨立的旋光異構(gòu)體和非外消旋混合物，和外消旋形式。
術(shù)語“α”和“β”指所畫化學(xué)結(jié)構(gòu)中在不對稱碳原子的取代基的特殊立體化學(xué)構(gòu)型。
術(shù)語“旋光對映體”是指彼此為不可疊加的鏡像的一對立體異構(gòu)體。1∶1比例的一對旋光對映體的混合物是“外消旋”混合物。
術(shù)語“異構(gòu)體”是指具有相同分子式的不同化合物?！傲Ⅲw異構(gòu)體”是僅原子在空間排列的方式不同的異構(gòu)體。
“藥物可接受鹽”可以是無機(jī)和有機(jī)酸或堿衍生的任何鹽。
化合物本發(fā)明的核苷類似物化合物一般用分子式1描述 分子式1ICN-10776其中化學(xué)構(gòu)型可以是L構(gòu)型或D構(gòu)型，其中考慮的化合物可以是任何合適的鹽形式(如HCl鹽)。應(yīng)該進(jìn)一步特別指出的是考慮的化合物也包括根據(jù)分子式1的化合物的前體藥物形式。特別考慮的前體藥物形式能有益達(dá)到趨向靶器官或靶細(xì)胞的特異性增加，除了靶細(xì)胞或器官的腔室的代謝穩(wěn)定性增加，降低毒性，延長血清半衰期時間，增加特定細(xì)胞和/或腔室的吸收，和增強(qiáng)物理化學(xué)性能(增加溶解度、中和或?qū)霂щ婋姾?、增?降低極性和/或疏水性)等的至少一種。而且，應(yīng)該理解考慮的化合物的所有酯和鹽也認(rèn)為是合適的。
本領(lǐng)域已知的核苷藥物的前體藥物形式有很多，考慮的前體藥物形式可以包括糖部分和/或堿基的修飾。根據(jù)特殊的化合物和目標(biāo)，特別考慮的修飾可以包括形成考慮的化合物的三-O-乙酰衍生物，5’OH基的酯化而形成5’-retinoyl衍生物或可替換的酸的衍生物(如C.Sergheraert，C.Pierlot，A.Tartar，Y.Henin，M.Lemaitre，J.Med.Chem.，36，826-830，1993中描述的合成)?？晒┻x擇地，可以由考慮的化合物制備香豆素或氨基酸酯。對于藥物特定傳送到肝和膽道系統(tǒng)，內(nèi)源性膽酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是有吸引力的候選。因此，可以由考慮的化合物制備膽酸酯。
考慮的化合物是核苷酸(即包括5’磷酸基)時，可以制備保護(hù)性的5’單磷酸衍生物(如環(huán)和非環(huán)單、二和三酯)，特別包括親脂性化合物的氨基酸氨基磷酸酯、水楊酸磷酸酯和磷酸酯(烷基、烯基、單甾醇等修飾和未修飾的)。其它可能的前體藥物包括PCT專利申請WO 98/39342，WO98/39343，WO 98/39344和WO 99/45016中所示基團(tuán)的可能組合。考慮的化合物的前體藥物也可以由脒官能團(tuán)衍生得到，并特別優(yōu)選的衍生物包括與考慮的化合物的carboxamide基團(tuán)偶合的取代酰胺。進(jìn)一步考慮的核苷及其類似物的前體藥物形式在2002年6月16日申請的美國專利申請?zhí)?9/594,410中描述，這里引入作為參考。
用途預(yù)期根據(jù)分子式1的化合物用于治療種類多樣的病癥，和事實上對考慮的化合物給藥后產(chǎn)生積極反應(yīng)的任何病癥。除了別的之外，特別預(yù)期本發(fā)明的化合物可以用于治療感染、侵染、癌癥或腫瘤或自身免疫疾病。進(jìn)一步預(yù)期本發(fā)明的化合物可以用于靶向患者特定器官，如肝臟或心臟的病癥或病變。
預(yù)期用本發(fā)明化合物治療的感染包括呼吸道合孢病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、單純皰疹1和2型、生殖器皰疹、角膜炎皰疹、腦炎皰疹、帶狀皰疹、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感A病毒、hantann病毒(出血熱)、人乳頭瘤病毒(HPV)、麻疹和真菌。
預(yù)期用本發(fā)明化合物治療的侵染包括原生動物感染，和蠕蟲和其它寄生蟲感染。
預(yù)期治療的癌癥或腫瘤包括由病毒引起的，效果可以包括抑制感染病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為瘤狀態(tài)，抑制病毒從轉(zhuǎn)化細(xì)胞傳播到其它正常細(xì)胞和/或阻止病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長。
預(yù)期治療的自身免疫疾病和其它疾病包括關(guān)節(jié)炎、銀屑病、腸病、少年糖尿病、狼瘡、多發(fā)性硬化、痛風(fēng)和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植排斥、巨細(xì)胞動脈炎、過敏和哮喘。
仍預(yù)期的根據(jù)本發(fā)明的化合物的其它用途包括可作為其他核苷或核苷類似物化學(xué)合成的中間體，后者又可作為治療試劑或用于其它目的。
仍在另一個方面中，治療哺乳動物的方法包括給予治療和/或預(yù)防有效量的含有本發(fā)明化合物的藥劑。在這個方面，作用可以涉及調(diào)節(jié)哺乳動物免疫系統(tǒng)的一些部分，特別是1型和2型淋巴因子譜彼此相關(guān)的調(diào)節(jié)。當(dāng)對1型和2型淋巴因子進(jìn)行調(diào)節(jié)時，特別預(yù)期這種調(diào)節(jié)包括抑制1型和2型，或抑制1型和刺激2型。
例如，已經(jīng)表明許多自身免疫疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病)與極化1型細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān)。考慮的化合物顯示出能有效促進(jìn)2型細(xì)胞因子表達(dá)，降低1型細(xì)胞因子表達(dá)，和減少活化的T細(xì)胞增生(下文)。因此，應(yīng)該領(lǐng)會到，除了別的之外，可以有利地使用考慮的化合物來治療與1型細(xì)胞因子表達(dá)增加有關(guān)的疾病，或2型細(xì)胞因子表達(dá)降低有關(guān)的疾病，或與1型細(xì)胞因子表達(dá)增加和2型細(xì)胞因子表達(dá)降低有關(guān)的疾病。因此，特別預(yù)期使用考慮的化合物的治療包括1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病。因而，應(yīng)該領(lǐng)會到考慮的化合物可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，尤其是作為1型細(xì)胞因子抑制劑和/或作為2型細(xì)胞因子刺激劑。
一般來說，根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選的用途是活性化合物對非靶宿主細(xì)胞的毒性相對較低，且對靶的活性相對高。在這個方面，L核苷增加穩(wěn)定性的能力高于D核苷也可能是有利的，可能產(chǎn)生較好的藥物動力。這個結(jié)果可以達(dá)到，因為L核苷可能不被酶識別，因此可能具有較長的半衰期。
給藥預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的化合物可以以任何適當(dāng)?shù)乃幬镏苿┬问角以谌魏芜m當(dāng)?shù)姆桨赶陆o予。因此，可以通過口服、胃腸外(包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或灌注技術(shù))、吸入噴霧、或直腸、局部給藥等，并以含有常規(guī)無毒藥物可接受載體、佐劑和媒介的劑量單位制劑形式給予。
作為實例，預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的化合物可與藥物可接受載體配制成混合物。例如，本發(fā)明的化合物可作為藥物可接受鹽口服給予。因為本發(fā)明的化合物大部分是水溶性的，所以它們可以以生理鹽水溶液的形式(如緩沖至pH大約7.2至7.5)靜脈內(nèi)給予。常規(guī)緩沖液如磷酸鹽、碳酸氫鹽或檸檬酸鹽可用于此目的。當(dāng)然，一個本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在說明書的教導(dǎo)下修改配方，提供大量不表現(xiàn)本發(fā)明組合物不穩(wěn)定或危害其治療活性的特殊給藥途徑的制劑。特別是，修飾本發(fā)明化合物而使它們更易溶于水或其它媒介，例如，可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的小的改動(鹽制劑、酯化等)輕易完成。為了控制本發(fā)明化合物的藥動學(xué)以達(dá)到對患者最有益的效果而改變特定化合物的給藥途徑和劑量安排也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。
在某些藥物劑量形式中，優(yōu)選本化合物的前體藥物形式，特別包括本化合物的?；?乙酰化或其它)衍生物、吡啶酯和各種鹽形式，且可以以治療患者病癥的方法給藥。
而且，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以單獨或與其它用于治療上面感染或病癥的試劑聯(lián)合給予。根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合治療包括給予至少一種本發(fā)明的化合物或其功能性衍生物和至少一種其它藥物活性成分。該活性成分和藥物活性試劑可以分開或一起給予，當(dāng)分開給藥時，可以任何次序同時或分開給予。為了達(dá)到期望的聯(lián)合治療效果，可以選擇活性成分和藥物活性試劑的量和給藥的相對時間。優(yōu)選，聯(lián)合治療包括給予一種本發(fā)明的化合物或其生理功能衍生物和一種此下提及的試劑。
預(yù)期與考慮的化合物聯(lián)合有效的其它藥物或活性成分的例子是抗病毒試劑如干擾素，包括但不限于干擾素α和γ、三氮唑核苷、無環(huán)鳥苷和AZTTM；抗真菌試劑如托萘酯、FungizoneTM、LotriminTM、MycelexTM、制霉菌素和兩性霉素；抗寄生蟲劑如MintezolTM、NiclocideTM、VermoxTM和FlagylTM、腸道試劑如ImmodiumTM、LomotilTM和PhazymeTM；抗腫瘤試劑如干擾素α和γ、阿霉素TM、環(huán)磷酰胺TM、Itnuran TM、氨甲喋呤、Mithracin TM、Tiazofurin TM、Taxol TM；皮膚病試劑如AclovateTM、CyclocortTM、Denorex、FloroneTM、氧化補(bǔ)脂骨素TM、碳焦油和水楊酸；偏頭痛制劑如麥角胺化合物；上面未列的甾族化合物和免疫抑制劑，包括環(huán)孢菌素、DiprosoneTM、氫化可的松，霉酚酸、AravaTM(leflunomide)；FloronTM、LidexTM、Topicort和Valisone；和代謝試劑如胰島素，和不能很好分入上面種類的其它藥物，包括細(xì)胞因子如IL2、IL4、IL6、IL8、IL10和IL12。特別優(yōu)選的初期藥物是AZT、3TC、8位取代的鳥苷類似物、2，3-雙脫氧核苷、白介素II、干擾素如IαB-干擾素、tucaresol、左旋咪唑、異丙肌苷和cyclolignans。
這種進(jìn)一步的治療試劑的例子包括有效調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)或伴發(fā)病癥的試劑，如AZT、3TC、8位取代的鳥苷類似物、2’，3’-雙脫氧核苷、白介素II、干擾素如α-干擾素、tucaresol、左旋咪唑、異丙肌苷和cyclolignans。根據(jù)本發(fā)明的某些化合物可通過降低根據(jù)本發(fā)明的某些試劑的代謝或滅活而有效增強(qiáng)其生物活性，為達(dá)到這種效果，二者一起給藥。
關(guān)于劑量，一個本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到治療有效量會隨待治療的感染或病癥，其嚴(yán)重性，使用的治療安排，所用試劑的藥動學(xué)，和被治療的患者(動物或人)而變化。預(yù)期各種可供選擇的劑量，包括0.5mg/kg和0.1mg/kg之間和更小的劑量也是適當(dāng)?shù)模?.5到2.0mg/kg(如1.25mg/kg)和更高的劑量也是適當(dāng)?shù)摹＿M(jìn)一步預(yù)期，考慮的化合物的血漿濃度相對低時可成功治療有些疾病病癥，而其它疾病病癥可能需要相對高的劑量。然而預(yù)期，適當(dāng)?shù)陌才趴梢赃@樣進(jìn)行，通過給予少量，然后增加量直到副作用變得十分不利，或達(dá)到了預(yù)期效果。
活性化合物的給藥可以從連續(xù)給藥到每天幾次口服給藥(如每天四次)變化，除了其它給藥途徑外，可以包括口服、局部、胃腸外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)皮(可以包括滲透增強(qiáng)試劑)、頰粘膜和栓劑給藥。
為了制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選治療有效量的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的化合物與藥物可接受載體密切混合，根據(jù)常規(guī)藥物配合技術(shù)制備一種制劑。載體可以是各種形式，依賴于期望的制劑給藥形式，如口服或胃腸外。在制備口服劑量形式的藥物組合物中，可使用任何通常的藥物介質(zhì)。因此，對于液體口服制劑如懸浮劑、酏劑和溶液，可以使用合適的載體和添加劑包括水、乙二醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等等。對于固體口服制劑如粉劑、片劑、膠囊，以及對于固體制劑如栓劑，可以使用合適的載體和添加劑包括淀粉、糖載體，如葡萄糖、甘露醇、乳糖和相關(guān)載體、稀釋劑、粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等等。如果需要，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對片劑或膠囊進(jìn)行腸包衣或持久釋放。
對于胃腸外制劑，載體通常包括無菌水或氯化鈉水溶液，然而也可包含其它包括輔助分散的成分。當(dāng)然，當(dāng)使用無菌水并保持無菌時，組合物和載體也應(yīng)該滅菌。也可以制備可注射懸浮劑，在這種情況下也可使用適當(dāng)?shù)囊后w載體，懸浮試劑等等。
實施例提供下列實施例解釋考慮的化合物的一些生物作用。特別是，實驗數(shù)據(jù)表明考慮的化合物顯示出以劑量依賴性方式對人T細(xì)胞產(chǎn)生活化-誘導(dǎo)IFNγ、IL-2和TNFα分泌和T細(xì)胞增生，但增強(qiáng)IL-4和IL-5產(chǎn)生。
考慮的化合物介導(dǎo)的對外周T細(xì)胞在48h的生物效果達(dá)到高峰，用PMA/離子霉素或PHA刺激可看到，在正常個體和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的細(xì)胞因子蛋白和mRNA水平觀察到，2型數(shù)量增加而1型產(chǎn)生細(xì)胞因子細(xì)胞數(shù)量減少。
而且，考慮的化合物對2型細(xì)胞因子的偏向誘導(dǎo)與可誘導(dǎo)一氧化氮合成酶、c-myc、IL-6和IL-1b(表現(xiàn)抗炎癥作用)的mRNA表達(dá)減少相并行，對人T細(xì)胞的CD4+群更加明顯。此外，考慮的化合物在體外偏向誘導(dǎo)鼠淋巴結(jié)來源的Th1細(xì)胞的Th2細(xì)胞因子，(以0.3和0.6mg/kg)腹膜內(nèi)給予BALB/c小鼠，抑制兩個1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)-對二氮氟苯的接觸性過敏和葡萄球菌腸毒素B介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
這些在體內(nèi)的作用與淋巴器官中IL-10的mRNA表達(dá)增加和IFNγmRNA表達(dá)降低關(guān)聯(lián)。收集的這些數(shù)據(jù)表明考慮的化合物在體外和體內(nèi)可功能性偏向誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子。
化合物示例的考慮的化合物7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒如前描述(Synthesis and cytokine modulation properties of pyrrolo[2，3-d]-4-pyrimidone nucleosides.J Med Chem.2000 Jun 2943(13)2566-74.)進(jìn)行合成。兩個化合物具有309.28的分子量且可溶于水溶液中。
人T細(xì)胞的制備和在體外的活化采用密度梯度離心，隨后用Lymphokwik(One Lambda，Canoga ParkCA)進(jìn)行T細(xì)胞富集的方法，從健康供體或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者分離外周血單核細(xì)胞。附著于塑料上去除含污染的單核細(xì)胞。純化的T細(xì)胞＞99％CD2+、＜1％HLA-DR+和＜5％CD25+，維持在RPMI-AP5(含20mMHEPES緩沖液，pH 7.4、5％自體固有血漿、1％谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素和0.05％2-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基)中。
為確定細(xì)胞因子蛋白水平，添加10ng PMA加0.5μg離子霉素(均來自Calbiochem，La Jolla，CA)活化T細(xì)胞(1ml體積中含1×106個細(xì)胞)，在20μM核苷存在下，24孔板中，37℃，5％CO2的加濕保溫箱中培養(yǎng)達(dá)到48小時?；罨螅治錾锨逯屑?xì)胞來源的細(xì)胞因子產(chǎn)量。對于增生和活力研究，方案如上，但改為96孔板規(guī)格，使用0.2ml體積中含0.2×106個細(xì)胞，用2ng PMA和0.1μg離子霉素活化。在獨立的實驗中，用20ngPMA加1μg離子霉素活化2ml的5×106個T細(xì)胞。這里培養(yǎng)6-24小時后從T細(xì)胞分離總RNA并用RT-PCR分析確定各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的mRNA水平。也在獨立的實驗中，進(jìn)一步純化人T細(xì)胞(使用來自Stem CellTechnologies，Vancouver，BC的細(xì)胞富集試劑)獲得純的CD4+(＜1％ CD8+使用RosetteSep人CD4+T細(xì)胞分離試劑)，和CD8+(＜1％CD4+使用RosetteSep人CD4+T細(xì)胞分離試劑)T細(xì)胞亞型群體，用PMA和離子霉素活化每毫升1×106個細(xì)胞，如總T細(xì)胞實驗。
細(xì)胞外細(xì)胞因子分析在適當(dāng)稀釋后，使用特異性針對IL-2、IFNg，TNFa、IL-4和IL-5的ELISA試劑盒(Biosource International，Camarillo，CA)確定細(xì)胞上清中的人細(xì)胞因子水平。用特異性針對鼠IFNg和IL-4(R and D Systems，Minneapolis，MN)的ELISA試劑盒確定鼠細(xì)胞因子水平。所有ELISA結(jié)果以pg/ml表示。有些數(shù)據(jù)以活化對照的百分比顯示，以測試核苷存在下活化T細(xì)胞細(xì)胞因子水平超過未活化T細(xì)胞的細(xì)胞因子水平的比率×100％計算。測試核苷對細(xì)胞因子水平?jīng)]有作用將給出活化對照值100％的百分比?？晒┻x擇的數(shù)據(jù)是以由活化對照改變的百分比顯示([(測試pg/ml-活化對照pg/ml)/活化對照pg/ml×100％])。測試核苷對細(xì)胞因子水平?jīng)]有作用將是0％。
zELISA斑點實驗用含捕獲抗體的無菌PBS包被ELISA斑點板(Whatman Polyfiltronics，Rockland，MA)過夜。對于IFNg使用4mg/ml抗人干擾素g的鼠單克隆抗體(mAb)(IFNg，克隆MD1，Biosource)。對于IF-2使用抗IL-2捕獲抗體(4μg/ml，克隆5334.21，R&D Systems)，對于IL-4使用5μg/ml抗IL-4捕獲抗體(克隆8D4-8，Pharmingen，San Diego，CA)，對于IL-5使用抗IL-5捕獲抗體(5μg/ml，克隆TRFK-5，Pharmingen)。用無菌PBS洗滌2次后，用含1％BSA的無菌PBS阻斷平板，其后用無菌PBS洗滌3次。在含4μg/mlPHA以及含有和不含核苷(10μM)的每個孔中放入含0.2×106PBMC的200ml RPMI培養(yǎng)基(含1％pen-strep，1％谷酰胺和10％FCS)在37℃下5％CO2下培養(yǎng)24小時(IL-2)或48小時(IL-4，IL-5，IFNγ)。洗滌后，加入生物素化的抗淋巴因子檢測抗體過夜，抗人IFNγ(4μg/ml，Biosource)，抗IL-2(3μg/ml，R&D Systems)，抗IL-4(2μg/ml，Pharmingen)，和抗IL-5(2μg/ml，Pharmingen)。為了估計生物素化抗體的結(jié)合，使用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶(PBS中1∶2000，0.025％Tween，室溫下1.5小時，Vector，Burlingame，CA)。使用400μl AEC(Sigma，St.Louis，MO，10mg溶于1ml二甲基甲酰胺)與12ml 0.1M醋酸鈉緩沖液，pH5.0，加6mlH2O2混合使平板顯色。在計算機(jī)輔助ELISA斑點圖像分析儀(ImmunoSpotTMImage Analyzer，Celluar Technology，Ltd.，Cleveland，OH)上計算所得斑點，它根據(jù)預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)檢測ELISA斑點。
增生和活力實驗測定每個實驗最后16小時[3H]-胸腺嘧啶核苷(lμCi，ICN，Irvine，CA)的摻入來估計T細(xì)胞增生反應(yīng)。細(xì)胞涂布于過濾器上，用Wallac Betaplate計數(shù)器(Perkin-Elmer/Wallac，Gaithersburg，MD)計算閃爍后測定DNA合成。用碘化丙錠(5μg/ml)估計活力，排出未處理的和核苷處理的FITC-CD3(Becton Dickinson，San Jose，CA)染色的人T細(xì)胞。加入碘化丙錠(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)后，用流式細(xì)胞儀(FACScan，Becton Dickinson)測定CD3+細(xì)胞的活力。
接觸性過敏(CHS)測定BALB/c對接觸性變應(yīng)原的反應(yīng)，DNFB，如前所述(Ishii，N.，K.Takahashi，H.Nakajima，S.Tanaka，P.W.Askenase.1994.DNFB contactsensitivity(CS)in BALB/c and C3H/He mice.J.Invest.Dermatol.102321)。簡而言之，給新生小鼠剪毛腹部施用20μl含0.3％DNFB的4∶1的丙酮∶橄欖油，使小鼠致敏。為了得到最佳的CHS誘導(dǎo)，用20μl的0.12％DNFB攻擊小鼠每個耳朵的兩側(cè)，5天后致敏。未致敏的小鼠也進(jìn)行攻擊并在每個實驗中用作對照。24小時后，進(jìn)行耳朵厚度測定，用攻擊前值減去攻擊后值來估計對DNFB的反應(yīng)。這里指出，在用DNFB攻擊的同時，腹膜內(nèi)注射含6.2μg 7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒的50μlPBS(0.3mg/kg)，或含12.4μg的100μl PBS(0.6mg/kg)的劑量。在初步優(yōu)化研究中，這些劑量的7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒得到了最佳的效果。最后的耳朵厚度測定后，頸部脫位殺死小鼠，并取出腋窩/腋窩側(cè)邊淋巴結(jié)。從分離的淋巴結(jié)細(xì)胞分離總細(xì)胞RNA后，進(jìn)行RT-PCR和Southern印跡分析來監(jiān)測鼠IFNg、IL-2和IL-10mRNA水平。
葡萄球菌腸毒素B在體內(nèi)的處理在第0天，以每只鼠50μg SEB的劑量腹膜內(nèi)注射給每4只鼠一組的3個組。一個組注射6.2μg 7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒(0.3mg/kg)，一個組注射12.4μg 7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒(0.6mg/kg)，都在SEB注射前以50μl PBS腹膜內(nèi)注射。在初步優(yōu)化研究中，0.6mg/kg劑量的7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒得到了最佳的效果。24小時后，用適當(dāng)劑量的吸入麻醉劑甲氧氟烷(Abbott Labs，N.Chicago，IL)麻醉所有小鼠，心臟穿刺exanguinate以獲得全血，去除脾臟。用ACK裂解緩沖液(0.15M NH4Cl，1mM KHCO3和0.1mM Na2EDTA調(diào)節(jié)至pH7.2-7.4并過濾)去除污染的紅細(xì)胞后，由各自的脾臟制備脾細(xì)胞懸液。從分離的脾細(xì)胞分離總細(xì)胞RNA之后，進(jìn)行RT-PCT和Southern印跡分析以監(jiān)測鼠IFNγ、IL-2和IL-10和iNOS mRNA水平。從凝固的血液中獲得血清，用于確定一氧化氮的產(chǎn)生。一氧化氮的產(chǎn)生是通過其穩(wěn)定的終產(chǎn)物亞硝酸鹽和硝酸鹽來測定的。亞硝酸鹽還原酶反應(yīng)將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽后，基于用Griess試劑將總亞硝酸鹽的還原變?yōu)樽仙嫉衔锏谋壬▽嶒?Sigma)，測定亞硝酸鹽/硝酸鹽總水平。
細(xì)胞因子mRNA分析用Trizol試劑(Life Technologies，Gaithersburg，MD)提取細(xì)胞總RNA。用oligo(dT)12-18引物和Superscript II(Life Technologies)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)。PCR反應(yīng)(GeneAmp PCR試劑盒，Perkin-Elmer，F(xiàn)osterCity，CA)由含cDNA、dNTPs(每種200μM)、每個0.5μM的引物對和1.25單位Taq聚合酶的50μl混合物組成。使用人IL-2，IL-10，IL-4，IL-6，IL-1b，IFNg，c-myc，IL-2R，CD40L的引物(Stratagene，La Jolla，CA)、iNOS(Clontech，Palo Alto，CA)和pHE7核糖體基因。典型的擴(kuò)增條件包括94℃變性5分鐘和60℃退火5分鐘，后跟35個循環(huán)的72℃1.5分鐘，94℃45秒和60℃45秒，最后72℃延伸時間10分鐘。從Stratagene獲得鼠IL-2、IFNγ和β-肌動蛋白的引物，從Clontech獲得鼠IL-10引物。Stratagene鼠細(xì)胞因子引物的擴(kuò)增條件是94℃變性5分鐘和60℃退火5分鐘，后跟35個循環(huán)的72℃1.5分鐘，94℃45秒和60℃45秒，最后72℃延伸時間10分鐘。對于IF-10，PCR條件是94℃變性5分鐘后，35個循環(huán)的94℃45秒，60℃45秒和72℃2分鐘，最后72℃延伸時間7分鐘。
對于每個基因產(chǎn)物，實驗測定最優(yōu)cDNA稀釋度，定義為可獲得遠(yuǎn)低于飽和條件的可檢測到濃度的cDNA稀釋度。在含溴化乙錠的2％瓊脂糖上分離PCR產(chǎn)物，并用0.4MNaOH和0.2MNaCl固定到Hybond N+膜(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)上過夜。斑點與32P-γ ATP標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，該探針由原始引物(Stratagene)或由設(shè)計與各自PCR產(chǎn)物內(nèi)中心區(qū)互補(bǔ)的特異性引物(人iNOS，鼠IL-10和人pHE7)產(chǎn)生。與pHE7有義引物產(chǎn)生的探針雜交后，估計等分的加樣液。然后用PhosphoImager(Biorad，Richmond，CA)分析洗滌的斑點。細(xì)胞因子或其它測試mRNA的相對改變以光密度讀數(shù)表示，并通過測定感興趣的mRNA相對于看家基因pHE7的mRNA的光密度比率使輸入RNA的任何變異正?；?br> Th1和Th2T細(xì)胞的產(chǎn)生頸部脫位殺死8至10只BALB/c或C57BL/6小鼠，并取出腋窩/腋窩側(cè)邊淋巴結(jié)。制備每個動物的淋巴結(jié)細(xì)胞懸液并混合。用StemSep鼠T細(xì)胞富集試劑(Stem Cell Technologies)從每個小鼠株混合的淋巴結(jié)制劑中分離鼠CD4+T細(xì)胞。采用與前述(Austrup，F(xiàn).，D.Vestweber，E.Borges，M.Lohning，R.Brauer，U.Herz，H.Renz，R.Haqllmann，A.Scheffold，A.Radbruch，A.Hamann.1997.P-and E-selectin mediate recruitment of T-hekper-1 but notT-hekper-2 cells into inflamed tissues.Nature.38581)類似的方案產(chǎn)生Th1和Th2細(xì)胞。簡而言之，在最佳量(每孔1mg)的抗CD3mAb(克隆145-2Cll，Pharmingen)包被的24孔組織培養(yǎng)板上，在所示重組鼠細(xì)胞因子和細(xì)胞因子Abs(全部來自Pharmingen)(IL-2單獨，50U/ml；Th1IL-2，50U/ml；IL-12，1000U/ml；IFNg含和不含10mM ICN 10776和Th2IL-2，50U/ml；IL-4，10ng/ml；抗IFNg(克隆XMG1.2)10mg/ml)存在下活化細(xì)胞，培養(yǎng)4天。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到介質(zhì)不變的新鮮板上，進(jìn)一步培養(yǎng)48小時，然后洗滌三次并加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，然后用PMA(10ng)和離子霉素(0.5mg)重新刺激5小時。然后使用無細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA測定鼠IL-4和IFNg水平。沒有重新刺激的細(xì)胞，IL-4和IFNγ陰性，表明培養(yǎng)過程中加入的細(xì)胞因子沒有被帶出。
統(tǒng)計分析用單因素或雙因素ANOVA分析進(jìn)行趨勢分析。使用Student-Newman-Keuls多比較方法估計統(tǒng)計學(xué)顯著性、相關(guān)性。
結(jié)果ICN10776對人活化T細(xì)胞的細(xì)胞因子和增生反應(yīng)的劑量效應(yīng)我們研究了7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒(ICN 10776)與人活化外周T細(xì)胞培養(yǎng)48小時后誘導(dǎo)的1型和2型細(xì)胞因子譜，和對T細(xì)胞增生反應(yīng)的影響。在0.2至20μM的劑量范圍，ICN 10776能以劑量依賴性方式增強(qiáng)PMA-離子霉素(PMA-ION)-誘導(dǎo)2型細(xì)胞因子、IL-4和IL-5水平，在10μM時達(dá)到增強(qiáng)高峰，分別是166％和77％(圖1B，1D)。數(shù)據(jù)顯示的是5個供體中的一個典型。而且，ICN 10776以相同劑量范圍，也以劑量依賴性方式大大抑制PMA-ION誘導(dǎo)的1型細(xì)胞因子、IL-2、IFNγ和TNFα水平，在20μM時的高峰抑制分別為62％、72％和78％(圖1A，1C，1E)，也基本抑制T細(xì)胞增生，在20μM時的高峰抑制為99％(圖1F)。也采用基于用線粒體脫氫酶使四唑鎓鹽MTT轉(zhuǎn)變?yōu)榧譥染料(在540nm可檢測到)的光密度實驗(MTT細(xì)胞增生試劑盒I，RocheMolecular Biochemicals)進(jìn)行第二次增生實驗。采用這個實驗，ICN 10776也大大抑制了T細(xì)胞增生(數(shù)據(jù)未顯示)，證明ICN 10776引起的作用不是由于已經(jīng)在其它核苷類似物中證明的胸腺嘧啶核苷吸收的干擾。在T細(xì)胞中也見到了對細(xì)胞因子調(diào)節(jié)類似的作用，以及PHA刺激的PBMCs(數(shù)據(jù)未顯示)。
在第二組實驗中，在RNA分離前，單獨用PMA-ION或在2，5或10μMICN 10776或其L旋光對映體ICN 17465存在下活化T細(xì)胞6小時或24小時，RT-PCR分析確定1型和2型細(xì)胞因子mRNA水平。我們觀察到隨著ICN 10776劑量的增加，IL-4mRNA增加，IFNγ和TNFα的mRNA同時降低(圖2，顯示來自三個供體的一個代表的數(shù)據(jù))。有趣的是，ICN 10776的L旋光對映體ICN 17465時，沒有觀察到對這些細(xì)胞因子活化水平的相似調(diào)節(jié)，證明對于生物活性來說，絕對需要D核糖糖部分(圖2)。
在第三組實驗中，單獨用PHA或在10μM ICN 10776或其L旋光對映體ICN 17465存在下，在特異性細(xì)胞因子抗體結(jié)合ELISA斑點板上活化PBMCs 24-48小時。然后如材料和方法中描述，測定特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。觀察到在ICN 10776存在時，IL-2和IFNγ產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量大大下降，但其L旋光對映體ICN 17465存在下未觀察到(圖3)。相比之下，ICN 10776誘導(dǎo)IL-4和IL-5產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，而L旋光對映體ICN 17465沒有(圖3)。
綜合這些數(shù)據(jù)表明ICN 10776能以劑量依賴性方式降低1型細(xì)胞因子產(chǎn)生和T細(xì)胞增生，而升高2型細(xì)胞因子水平。在蛋白和mRNA水平觀察到ICN 10776對細(xì)胞因子反應(yīng)的作用并影響特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。而且，由于該核苷的L旋光對映體未顯示相似的生物活性，因此2型細(xì)胞因子的偏向誘導(dǎo)需要D-核糖基化。
ICN 10776對人活化T細(xì)胞的活力、細(xì)胞因子反應(yīng)和增生的短暫作用我們確定了1型細(xì)胞因子表達(dá)抑制和T細(xì)胞增生反應(yīng)抑制是否僅僅由于ICN 10776引起T細(xì)胞毒性產(chǎn)生的。如果這些觀察結(jié)果是由于毒性，那么培養(yǎng)時間和ICN 10776的劑量都會影響T細(xì)胞的活力。采用碘化丙錠排出分析，我們觀察到在與20μM 10776培養(yǎng)48小時后，靜息CD3+T細(xì)胞的活力確實從95％降低至85％(圖4A，4B)。在未用核苷處理，PMA-ION活化CD3+T細(xì)胞時，觀察到活力短暫降低，從8小時的91±1％降低到24小時的88±2％到48小時的83±1％。然而發(fā)現(xiàn)，在劑量范圍跨越0.2至20μM的核苷ICN 10776存在下，這些數(shù)值沒有顯著性差異(圖4C)。這些數(shù)據(jù)提示活力微降推測是由于活化誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡引起的，不是由于核苷引起的直接毒性作用。而且，與ICN 10776培養(yǎng)的短暫作用確實顯示出T細(xì)胞增生(圖4D)和IFNγ分泌(圖4F)的劑量依賴性降低，但在48小時達(dá)到高峰抑制。同樣，在48小時也觀察到IL-4高峰劑量依賴性將降低(圖4E)。這些數(shù)據(jù)表明用ICN 10776處理后觀察到的生物作用不是體外毒性的結(jié)果，且在培養(yǎng)48小時后具有高峰作用。48小時后作用下降可能與核苷通過脫磷酸或脫核糖基化而代謝為失活降解產(chǎn)物有關(guān)。
ICN 10776對正常供體和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者活化外周T細(xì)胞的TNFα、IFNγ和IL-4產(chǎn)生的對比作用前已表明當(dāng)與正常供體比較時，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的外周T細(xì)胞在體外向2型表型的分化受到影響(Berg，D.J.，M.W.Leach，R.Kuhn，K.Rajewski，W.Muller，N.J.Davidson，D.Rennick.1995.Interleukin 10 but notinterculeukin 4 is a natural suppressant of cutaneous inflammatory responses.J.Exp.Med.18299)。這里我們比較了ICN 10776對來自16個正常供體和16個RA患者的PMA-ION活化外周T細(xì)胞的活化細(xì)胞因子譜的影響。我們觀察到來自正常供體和RA患者的活化外周T細(xì)胞中發(fā)生了活化10μM ICN10776對2型細(xì)胞因子的偏向誘導(dǎo)，由分泌IFNγ水平降低(分別是43％和63％，p＝0.0008，ICN 10776＜未處理組和ICN17465組)和IL-4產(chǎn)生增高(分別是266％和192％，p＜0.0001，ICN 10776＞未處理組和ICN17465組)測定(圖5A，左板)。盡管正常組的細(xì)胞因子反應(yīng)明顯增加(p＜0.0001)，二者任何一組中由ICN 10776偏向誘導(dǎo)的2型細(xì)胞因子數(shù)量沒有顯著性差異(圖5A，左板)。在外周T細(xì)胞接觸10μM ICN 10776的L旋光對應(yīng)體ICN 17465接觸后，二者任何一組都沒有觀察到對活化細(xì)胞因子譜的相似作用(圖5A，右板)。在獨立實驗中，在10μM ICN 10776和ICN17465存在和缺乏下，測定正常供體和RA患者由PMA-ION刺激的外周T細(xì)胞的活化細(xì)胞因子mRNA譜。如上面分泌細(xì)胞因子蛋白數(shù)據(jù)見到的，ICN 10776可使兩個受試組的外周T細(xì)胞的IL-4mRNA水平升高和抑制IFNγ和TNFα，而ICN17465沒有(圖5B)。因此ICN 10776在蛋白和mRNA水平上對2型細(xì)胞因子的偏向誘導(dǎo)，代表了外周血T細(xì)胞的一般現(xiàn)象，看來不受RA患者外周T細(xì)胞的影響。
ICN 10776介導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)對炎癥前和抗炎癥介質(zhì)的影響由于1型細(xì)胞因子偏向一般誘導(dǎo)炎癥前反應(yīng)，而2型細(xì)胞因子偏向通常誘導(dǎo)抗炎癥反應(yīng)，我們確定了人活化T細(xì)胞的1型和2型mRNA水平，將這些的表達(dá)與相同供體細(xì)胞內(nèi)的某些臨床抗炎癥或炎癥前介質(zhì)的mRNA水平進(jìn)行比較。我們觀察到ICN 10776，除了它對1型(抑制IFNγ、TNFα和IL-2)和2型(增加IL-4)的影響外，也促進(jìn)抗炎癥細(xì)胞因子IL-10增加，并抑制兩個炎癥前細(xì)胞因子IL-6和IL-1β的水平。此外，也觀察到一種負(fù)責(zé)產(chǎn)生炎癥前介質(zhì)一氧化氮的酶-可誘導(dǎo)一氧化氮合成酶(iNOS)的表達(dá)協(xié)同降低(圖6)。而且，ICN 10776的抗增生作用明顯是由于一種上調(diào)增生淋巴細(xì)胞的基因-原癌基因c-myc被抑制(圖6)。這些數(shù)據(jù)表明ICN 10776處理引起的2型細(xì)胞因子反應(yīng)增強(qiáng)和1型細(xì)胞因子反應(yīng)降低，導(dǎo)致外周T細(xì)胞的抗炎癥環(huán)境增加和明顯的抗增生作用。
ICN 10776對CD4+和CD8+T細(xì)胞亞型的活化細(xì)胞因子反應(yīng)的影響T輔助(CD4+)和毒性(CD8+)T細(xì)胞亞型在對抗原的免疫反應(yīng)中都起著重要的作用，無論是外來的還是自身的。兩個亞型可分化產(chǎn)生1型或2型細(xì)胞因子。由于CD4+和CD8+T細(xì)胞在自身免疫的發(fā)病和對抗原的保護(hù)性反應(yīng)中起著不同的作用，因此區(qū)分這兩種T細(xì)胞亞型中ICN 10776引起的2型細(xì)胞因子偏向誘導(dǎo)的任何不同作用是重要的。因此我們比較了相同供體的分離CD4+和CD8+T細(xì)胞和總T細(xì)胞中ICN 10776介導(dǎo)的活化細(xì)胞因子反應(yīng)。與未處理的活化對照相比，在ICN 10776存在下，用PMA-ION刺激48小時后，總T細(xì)胞組的分泌IL-4水平明顯增高，但在17465存在下不增高(p＜0.0001，ICN 10776＞未處理和ICN 17465)(圖7)。此外，與活化對照或ICN 17465處理組相比，所有三個T細(xì)胞組的IFNγ水平明顯降低(p＜0.0001)。奇怪的是，ICN 10776介導(dǎo)的IL-4增高在CD4+T細(xì)胞中最顯著(分別與CD8+T細(xì)胞和總T細(xì)胞中228％和32％相比，增加超過活化對照994％，p＜0.03)。而且，盡管ICN 10776對所有三個T細(xì)胞組的抑制都明顯，但是ICN 10776再次對IFNγ的抑制在CD4+T細(xì)胞中顯然更明顯(分別與CD8+T細(xì)胞和總T細(xì)胞中37％和52％相比，增加超過活化對照81％，p＜0.05)(圖7)。用ICN 17465處理后，所有三個T細(xì)胞組未觀察到類似的抑制作用。也提示CD8+T細(xì)胞可能對ICN 10776介導(dǎo)的作用更具抗性，并可能實際上給CD4+T細(xì)胞提供調(diào)節(jié)信號，降低ICN 10776引起的2型細(xì)胞因子偏向誘導(dǎo)。
ICN 10776對鼠Th1細(xì)胞產(chǎn)生的作用我們確定了ICN 10776甚至在鼠淋巴T細(xì)胞正常產(chǎn)生Th1 T細(xì)胞的條件下，是否能偏向誘導(dǎo)2型細(xì)胞因子。分離BALB/c和C57BL/6淋巴結(jié)T細(xì)胞，如前描述(Austrup，F(xiàn).，D.Vestweber，E.Borges，M.Lohning，R.Brauer，U.Herz，H.Renz，R.Haqllmann，A.Scheffold，A.Radbruch，A.Hamann.1997.P-and E-selectin mediate recruitment of T-hekper-1 but not T-hekper-2 cells intoinflamed tissues.Nature.38581)在平板結(jié)合抗CD3 Ab和IL-2、IFNγ和IL-12存在下初次培養(yǎng)后，產(chǎn)生了Th1細(xì)胞。與抗CD3 Ab和IL-2單獨處理相比，這些Th1細(xì)胞再次刺激分泌低水平的IL-4和相當(dāng)量的IFNγ(圖8)。然而，第一次培養(yǎng)時期與ICN 10776共同培養(yǎng)能誘導(dǎo)這些鼠T細(xì)胞產(chǎn)生升高水平的IL-4和低水平IFNγ，類似于Th2細(xì)胞中觀察到的(用抗CD3Ab，IL-2，IL-4和IFNγ處理T細(xì)胞再次刺激后產(chǎn)生)(圖8)。兩個鼠株的這些觀察結(jié)果一致。收集的這些數(shù)據(jù)表明ICN 10776能誘導(dǎo)Th2細(xì)胞產(chǎn)生，甚至在傾向產(chǎn)生Th1細(xì)胞的條件下。
給予ICN 10776后導(dǎo)致接觸性過敏反應(yīng)的損害與鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中IL-10表達(dá)升高和IL-2和IFNγ表達(dá)降低有關(guān)如前述(Ishii，N.，K.Takahashi，H.Nakajima，S.Tanaka，P.W.Askenase.1994.DNFB contact sensitivity(CS)in BALB/c and C3H/He mice.J.Invest.Dermatol.102321)用0.2％DNFB攻擊后，DNFB致敏的BALB/c小鼠產(chǎn)生了接觸性過敏(CHS)反應(yīng)。圖9A顯示了在攻擊后，確定DNFB致敏的和原初小鼠的耳朵腫脹測定，DNFB致敏的小鼠用0.3mg/kg和0.6mg/kg ICN 10776處理。在這個代表性實驗中，攻擊的同時腹膜內(nèi)注射ICN 10776，以劑量依賴性方式大大損害了對DNFB的CHS反應(yīng)，如在攻擊后24小時，給予0.3mg/kg的劑量后耳朵厚度平均降低42％，給予0.6mg/kg的劑量后平均降低68％顯示(從DNFB攻擊的未致敏小鼠(原初)的反應(yīng)減去計算CHS的抑制)。在用丙酮∶橄欖油攻擊的DNFB致敏小鼠或用DNFB攻擊的丙酮∶橄欖油致敏小鼠中未觀察到攻擊后耳朵厚度實質(zhì)變化。此外，如圖9B所示，與單獨DNFB致敏小鼠相比，ICN 10776處理的DNFB致敏小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞中IL-10的mRNA表達(dá)大大增強(qiáng)，但I(xiàn)L-2和IFNγmRNA表達(dá)水平降低。收集的這些數(shù)據(jù)證明ICN 10776引起B(yǎng)ALB/c小鼠體內(nèi)CHS反應(yīng)的降低與對DNFB起CHS反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞因子-IL-10升高，和CHS反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑-IL-2和IFNγ的抑制有關(guān)。
體內(nèi)給予ICN 10776后，用一氧化氮釋放估計SEB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)損害與小鼠脾細(xì)胞中IL-10表達(dá)升高和IFNγ表達(dá)下降有關(guān)如前述(Tam，R.C.，K.Ramasamy，J.Bard，B.Pai，C.Lim，D.R.Averett.2000.The ribavirin analog ICN 17261 demonstrates reduced toxicity andantiviral effects with retention of both immunomodulatory activity and reductionof hepatitis-induced serum alanine aminotransferase levels.Antimicrob.AgentsChemother.441276)50μg SEB腹膜內(nèi)注射后，小鼠產(chǎn)生SEB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。圖10A顯示了在SEB攻擊后，確定的用0.3mg/kg或0.6mg/kg ICN10776處理的小鼠的總血清亞硝酸鹽測定結(jié)果。在這個代表性實驗中，攻擊的同時腹膜內(nèi)注射ICN 10776，以劑量依賴性方式大大損害了對SEB的炎癥反應(yīng)，如在攻擊后24小時，給予0.3mg/kg的劑量后血清亞硝酸鹽水平平均降低54％，給予0.6mg/kg的劑量后平均降低78％。而且，如圖10B所示，與單獨SEB攻擊小鼠相比，ICN 10776處理的SEB攻擊小鼠的脾細(xì)胞中鼠IL-10的mRNA表達(dá)大大增強(qiáng)，但I(xiàn)FNγmRNA表達(dá)水平顯著降低。收集的這些數(shù)據(jù)證明ICN 10776引起B(yǎng)ALB/c小鼠體內(nèi)SEB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)降低與抗炎癥細(xì)胞因子，SEB誘導(dǎo)的炎癥中主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子-IL-10升高，和SEB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑-IFNγ的抑制有關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種治療患者病癥的方法，包括給予根據(jù)分子式1的化合物，其中化學(xué)構(gòu)型可以是L構(gòu)型或D構(gòu)型。 分子式1ICN-10776
2.權(quán)利要求1的方法，其中病癥是自身免疫疾病。
3.權(quán)利要求1的方法，其中自身免疫疾病選自由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和糖尿病組成的組。
4.權(quán)利要求1的方法，其中自身免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
5.權(quán)利要求1的方法，其中自身免疫疾病是多發(fā)性硬化。
6.權(quán)利要求1的方法，其中自身免疫疾病是糖尿病。
7.權(quán)利要求1的方法，其中病癥是炎癥疾病。
8.權(quán)利要求1的方法，其中炎癥疾病是接觸性皮炎。
9.權(quán)利要求7的方法，其中炎癥疾病包括1型細(xì)胞因子的表達(dá)水平高于健康人的1型細(xì)胞因子表達(dá)水平。
10.權(quán)利要求9的方法，其中1型細(xì)胞因子是白介素2。
11.權(quán)利要求9的方法，其中1型細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子α。
12.權(quán)利要求1的方法，其中給藥步驟包括體內(nèi)給藥。
13.權(quán)利要求1的方法，其中給藥步驟包括口服給藥。
14.權(quán)利要求1的方法，其中給藥步驟包括注射L核糖核苷。
15.權(quán)利要求1的方法，其中給藥步驟包括給予劑量在患者每kg體重0.1mg和患者每kg體重1.0mg之間的化合物。
16.權(quán)利要求2的方法，其中自身免疫疾病包括2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平高于健康人的2型細(xì)胞因子表達(dá)水平。
17.權(quán)利要求16的方法，其中2型細(xì)胞因子是白介素4。
全文摘要
公開了新的核苷類似物化合物。新化合物或其可藥用的酯或鹽可以用于藥物組合物，這種組合物可以用于治療感染、侵染、瘤或自身免疫疾病。新化合物也可以用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的方面，包括1型和2型活性的調(diào)節(jié)。
文檔編號A61K31/7068GK1420779SQ01805036
公開日2003年5月28日 申請日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月15日
發(fā)明者R·譚, 王廣義, 洪志, J·勞 申請人:里巴藥品公司