等溫核酸擴(kuò)增的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2009年6月11日的國際申請(qǐng)PCT/GB2009/050662進(jìn)入中 國、申請(qǐng)?zhí)枮?00980131223. 9的題為"等溫核酸擴(kuò)增"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及核酸的擴(kuò)增,尤其涉及用于擴(kuò)增雙鏈核酸靶分子的等溫方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在核酸和遺傳材料技術(shù)范疇,經(jīng)常需要確定基因、基因的一部分或核苷酸序列是否存 在于活的生物體、該生物體的細(xì)胞提取物或生物樣品內(nèi)。因?yàn)槿魏位蚧蚧虻囊徊糠值?特征在于特定序列的核苷酸堿基,所以只需要在包含多核苷酸混合物的樣品中直接查找所 述特定序列的全部或部分的存在。
[0004] 對(duì)于特定多核苷酸序列的查找存在巨大興趣,尤其是對(duì)于致病生物的檢測(cè),等位 基因存在的確定,宿主基因組中病變存在的檢測(cè),或細(xì)胞宿主的特定RNA或修飾的存在。因 此可以通過分析個(gè)體的核酸診斷遺傳性疾病諸如亨廷頓氏病,Duchenne' s病,苯丙酮酸尿 癥和β地中海貧血。還有可能通過使用核探針的測(cè)試診斷或鑒定病毒,類病毒,細(xì)菌,真 菌,原生動(dòng)物,或任意其他形式的植物或動(dòng)物。
[0005] -旦已知生物體或疾病的特定序列,應(yīng)當(dāng)從樣品提取核酸,并確定是否存在這 種序列。核酸檢測(cè)的各種方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。這些方法基于DNA-DNA,DNA-RNAjP RNA-RNA雙鏈中互補(bǔ)核酸鏈的嘌呤-嘧啶配對(duì)的特性。這種配對(duì)過程通過雙鏈DNA的腺嘌 呤-胸腺嘧啶(A-T)和鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)堿基之間建立的氫鍵來實(shí)現(xiàn);腺嘌呤-尿嘧 啶(A-U)堿基對(duì)也可以通過DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈中的氫鍵鍵合形成。用于確定指定核 酸分子的存在或缺失的核酸鏈配對(duì)通常被稱為"核酸雜交"或簡(jiǎn)單地被稱為"雜交"。
[0006] 檢測(cè)核酸樣品中靶序列存在最直接的方法是獲得"探針",其序列與靶核酸的一部 分充分互補(bǔ)以與其雜交??梢栽诎怂針悠分惺褂妙A(yù)先合成的探針。如果存在靶序列, 則探針將與靶形成雜交產(chǎn)物。當(dāng)不存在靶序列時(shí),將沒有雜交產(chǎn)物形成??梢岳帽绢I(lǐng)域 已知的許多方法檢測(cè)探針雜交。通常可以將探針與可檢測(cè)的標(biāo)記物綴合。熒光或酶標(biāo)記物 形成均勻體系中分子信標(biāo)、Taqman以及其他可切割探針的基礎(chǔ)??蛇x的,使用探針捕獲擴(kuò)增 或標(biāo)記的材料,這樣的話可以將與擴(kuò)增子雜交的探針和未雜交的材料分離后檢測(cè)擴(kuò)增子。
[0007] 但是,這種方法的主要困難在于不直接適用于以下情況:樣品中存在的靶序列拷 貝數(shù)較低,低于大約IO 7個(gè)拷貝。在這些條件下,很難將探針與其靶序列的特異性粘附和探 針與不同于靶序列的序列非特異性的粘附區(qū)分開來。這個(gè)問題的一個(gè)解決方案是使用由增 強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)組成的擴(kuò)增技術(shù),通過設(shè)計(jì)用于特異性并且顯著增加靶核酸片段(如果其存在 于樣品中)的拷貝數(shù)的預(yù)備技術(shù)。
[0008] Lewis (1992,Genetic Engineering News 12: 1-9)以及 Abramson 和 Myers (1993,Curr. Opin. Biotechnol. 4: 41-47)的文章是擴(kuò)增技術(shù)的良好全面綜述。該技術(shù) 主要基于:擴(kuò)增過程中需要多個(gè)循環(huán)的技術(shù)或在單一溫度下進(jìn)行的技術(shù)。
[0009] 循環(huán)技術(shù)由需要熱循環(huán)的方法舉例說明,使用最廣泛的這類技術(shù)是PCR (聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng),美國專利號(hào)4, 683, 195,4, 683, 202,和4, 800, 159 ;歐洲專利號(hào)0 201 184),其能 夠擴(kuò)增來自DNA或RNA的感興趣區(qū)域。這種方法通常由三個(gè)步驟組成: (i) 通過熱變性/熔解將雙鏈DNA分解(變性)為單鏈DNAs (圖1B); (ii) 將引物寡核苷酸與單鏈DNA退火(圖1B);和 (iii) 從引物合成(延伸)互補(bǔ)鏈以便拷貝感興趣的DNA的區(qū)域(圖1C)。
[0010] 在此過程完成后,加熱系統(tǒng)(分離互補(bǔ)鏈),并重復(fù)上述過程。通常進(jìn)行20-40個(gè) 循環(huán)將基因組DNA擴(kuò)增到可以進(jìn)一步分析的程度。
[0011] 大部分指數(shù)級(jí)核酸擴(kuò)增過程依賴于過量的上游和下游引物,它們與被研宄的靶核 酸模板的3'末端和5'末端的互補(bǔ)序列結(jié)合,如圖IA-C所示。
[0012] 擴(kuò)增技術(shù)的第二類(被稱為等溫技術(shù))是在單一溫度進(jìn)行的技術(shù),或其中擴(kuò)增過 程的主要方面是在單一溫度進(jìn)行。與PCR過程(其中加熱反應(yīng)產(chǎn)物以分離兩條鏈,這樣的 話其他引物可以結(jié)合模板以重復(fù)上述過程)不同,等溫技術(shù)依賴于鏈置換聚合酶以便分 離/置換雙鏈的兩條鏈和再拷貝模板。這種公知的特性是許多科學(xué)論文的主題(參見例 如 Y. Masamute and C.C. Richardson, 1971,J. Biol. Chem. 246,2692-2701; R. L. Lechner et al·,1983,J. Biol Chem. 258,11174-11184; or R. C. Lundquist and Β· M. Olivera,1982,Cell 31,53-60)。區(qū)分等溫技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)是使用的方法以便起始重 復(fù)的過程。
[0013] 廣義的等溫技術(shù)可以被再分成以下方法:依賴于引物的置換以起始重復(fù)的模板拷 貝(以下舉例說明,HDA (解旋酶依賴性擴(kuò)增),核酸外切酶依賴性擴(kuò)增(EP1866434),重組 酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)和環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP))的方法和依賴于單引物分子的持續(xù)再使用或 從頭合成(以下舉例說明,SDA (鏈置換擴(kuò)增和基于核酸的擴(kuò)增(NASBA和TM))的方法。
[0014] 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)是一種方法,其中重組酶介導(dǎo)的寡核苷酸與DNA靶 的革巴向與聚合酶的DNA合成結(jié)合(Morrical SW et. Al. J Biol Chem. 1991 Jul 25; 266 (21) :14031-8 和 Armes and Stemple, US 申請(qǐng) 10/371,641)。WO 2008/035205 描 述了擴(kuò)增雙鏈靶核酸分子的RPA方法,包括以下步驟:(a)將UvsX、UvsY和gp32蛋白與對(duì) 所述雙鏈靶核酸分子特異的第一和第二單鏈核酸引物接觸以形成第一和第二核蛋白引物; (b)將第一核蛋白引物與所述雙鏈靶核酸分子接觸以在所述雙鏈靶核酸分子的第一部分產(chǎn) 生第一 D環(huán)結(jié)構(gòu),將第二核蛋白引物與所述雙鏈靶核酸分子接觸以在所述雙鏈靶核酸分子 的第二部分產(chǎn)生第二D環(huán)結(jié)構(gòu),這樣的話所述第一核酸引物和所述第二核酸引物的3'端在 相同的雙鏈靶核酸分子上朝向彼此并且沒有將靶核酸分子完全變性;(c)利用一種或更多 種能夠進(jìn)行鏈置換合成的聚合酶和dNTPs延伸所述第一和第二核蛋白引物的3'端以產(chǎn)生 第一和第二雙鏈革G核酸分子和第一和第二置換的核酸鏈;和(d)通過(b)和(c)的重復(fù)持 續(xù)反應(yīng)直至達(dá)到所需的擴(kuò)增程度。
[0015] 為了將靶的擴(kuò)增與產(chǎn)生假象的無用擴(kuò)增區(qū)別開來,可以使用基于探針的系統(tǒng),其 檢測(cè)被研宄的擴(kuò)增子(在提供給系統(tǒng)的引物中不存在)的序列。
[0016] 所有這些方法只依賴于模板,所述模板在它們的末端包括針對(duì)兩條引物的結(jié)合位 點(diǎn)。具備這些性能的模板可由上游和下游引物之間的非特異性相互作用單獨(dú)產(chǎn)生,產(chǎn)物 (引物-二聚體)可以不依賴被研宄的模板有效擴(kuò)增,如圖ID-E所示。作為這種無用擴(kuò)增 的結(jié)果,測(cè)定成分被非生產(chǎn)性事件消耗,限制了測(cè)定方法的敏感性。
[0017] 本發(fā)明的目的是提供一種選擇性等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明的另一目的是提供一 種指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)。另一目的是最小化或消除擴(kuò)增假象,從而提供一種特異性和/或敏感性 增加的擴(kuò)增核酸的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0018] 本發(fā)明因此提供一種擴(kuò)增核酸靶分子的等溫方法,其依賴上游引物、下游引物、鏈 插入系統(tǒng)和寡核苷酸,其中上游和下游引物不是擴(kuò)增過程期間鏈插入系統(tǒng)的底物,并且沒 有鏈插入系統(tǒng)就不擴(kuò)增靶分子,其中寡核苷酸是鏈插入系統(tǒng)的底物。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種等溫方法,包括下列步驟: (a) 提供上游引物、下游引物、鏈插入系統(tǒng)和寡核苷酸,其中上游和下游引物不是擴(kuò)增 過程期間鏈插入系統(tǒng)的底物,并且沒有鏈插入系統(tǒng)就不擴(kuò)增靶分子,其中寡核苷酸是鏈插 入系統(tǒng)的底物; (b) 將寡核苷酸用于靶分子,允許其插入雙鏈從而使靶分子的一些或全部變成單鏈; (c) 將上游引物用于靶分子的單鏈區(qū),利用聚合酶和dNTPs延伸上游引物的3'端以產(chǎn) 生雙鏈核酸祀分子; (d) 將下游引物用于單鏈靶分子,利用聚合酶和dNTPs延伸下游引物的3'端以產(chǎn)生另 外的雙鏈核酸祀分子; (e) 通過(b)到(d)的重復(fù)持續(xù)反應(yīng)。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種等溫方法,包括下列步驟: (a) 提供: (i) 上游和下游引物,每種包括小于30個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子,其至少一部分與靶分 子的序列互補(bǔ); (ii) 包括至少30個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子的寡核苷酸,其至少一部分與插入正向和反 向引物的靶分子的序列互補(bǔ),和任選的在其3'端還包括下游元件,其與靶分子的序列互補(bǔ) 并且不是聚合酶底物; (b) 將寡核苷酸(ii)與重組酶接觸以使其插入靶分子的互補(bǔ)區(qū),從而使得靶分子的互 補(bǔ)區(qū)和相鄰區(qū)變成單鏈; (c) 將上游引物用于靶分子的單鏈區(qū),利用聚合酶和dNTPs延伸上游引物的3'端以產(chǎn) 生雙鏈核酸祀分子; (d) 將下游引物用于單鏈靶分子,利用聚合酶和dNTPs延伸下游引物的3'端以產(chǎn)生另 外的雙鏈核酸祀分子; (e) 通過(b)到(d)的重復(fù)持續(xù)反應(yīng)。
[0021] 有利地這些方法提供靶核酸分子的等溫和指數(shù)擴(kuò)增。上述擴(kuò)增方法的特異性和敏 感性比已知方法更高,產(chǎn)生最小的擴(kuò)增假象或無擴(kuò)增假象。
[0022] 優(yōu)選的鏈插入系統(tǒng)包括重組酶系統(tǒng),諸如T4 UvsX / gp32 / UvsY系統(tǒng)。優(yōu)選的 寡核苷酸的至少一部分與插入上游和下游引物的靶序列的一部分互補(bǔ)。優(yōu)選的寡核苷酸包 括至少30個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子,其具有不可延伸的3'端。
[0023] 優(yōu)選的用于鏈插入系統(tǒng)的底物促進(jìn)靶模板雙鏈的分離或靶核酸上引物延伸的產(chǎn) 物。一種或更多種其他的寡核苷酸可以通過插入的寡核苷酸促進(jìn)靶雙鏈的分離。優(yōu)選的寡 核苷酸在其3'端包括下游元件,其與靶序列互補(bǔ)并且不是有效的聚合酶底物。這可以結(jié)合 寡核苷酸釋放的靶鏈,分枝迀移入鄰近的雙鏈核酸進(jìn)一步分離雙鏈。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種等溫?cái)U(kuò)增核酸靶分子的試劑盒,包括上游 引物、下游引物、鏈插入系統(tǒng)和寡核苷酸,其中上游和下游引物不是擴(kuò)增過程期間鏈插入系 統(tǒng)的底物,并且沒有鏈插入系統(tǒng)就不擴(kuò)增靶分子,其中寡核苷酸是鏈插入系統(tǒng)的底物。
【附圖說明】
[0025] 圖1顯示在引物依賴性擴(kuò)增反應(yīng)中引物二聚體的形成。
[0026] IA :將上游和下游引物與雙鏈模板溫育。模板在其末端與引物同源。模板的一條 鏈與上游引物同源,另一條鏈與下游引物同源。
[0027] IB :模板鏈被分離,這使得上游和下游引物可以結(jié)合。
[0028] IC :模板結(jié)合引物的延伸產(chǎn)生兩條相同的雙鏈。每條雙鏈可以參與反應(yīng)的前面幾 步,這樣的話模板被指數(shù)擴(kuò)增。
[0029] ID-E :在沒有模板的情況下上游和下游引物彼此拷貝。這些可能取代被研宄的模 板,還可能指數(shù)擴(kuò)增造成假象。
[0030] 圖2顯示本發(fā)明的基礎(chǔ)擴(kuò)增系統(tǒng)以及任選的基于探針的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0031] 圖3顯示一種擴(kuò)增方法,其