專利名稱：瑞圖希單抗的鞘內施用,用于中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤的治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明描述了利用抗B細胞靶標抗體(例如抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40或抗-CD37抗體，優(yōu)選地抗-CD20抗體，更加優(yōu)選地瑞圖希單抗(Rituximab))治療和/或預防中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤和預防腦膜復發(fā)的方法。這些抗-B細胞抗體能單獨使用，或與其它抗體(例如，參與B細胞激活的T細胞的抗體，如抗-CD40L)或其它治療(例如化學治療或放射治療)聯(lián)合使用。
背景技術：
I.抗-CD20抗體CD20是在90％以上的B細胞淋巴瘤上表達的一種細胞表面抗原，它在腫瘤細胞中不釋放或調節(jié)(McLaughlin等人，J.Clin.Oncol.162825-2833(1998b))。已經制備了抗-CD20抗體用于研究和治療。一種抗-CD20抗體是單克隆B1抗體(美國專利號5,843,398)?？?CD20抗體也已經制備為放射性核素的形式用于治療B細胞淋巴瘤(例如，131I-標記的抗-CD20抗體)，以及89Sr-標記的形式用于緩解前列腺癌和乳腺癌轉移引起的骨痛(Endo，Gan TO Kagaku Ryoho26744-748(1999))。
曾報道通過連續(xù)靜脈內輸液對B細胞淋巴瘤患者施用一種鼠單克隆抗體——1F5(一種抗-CD20抗體)。然而，據報道消除循環(huán)腫瘤細胞需要極高水平(＞2克)的1F5，結果描述為“短暫的”(Press等人，Blood69584-591(1987))。在治療中使用單克隆抗體的一個可能的問題是，非人類單克隆抗體(例如鼠單克隆抗體)一般缺乏人類效應物功能，例如，它們不能介導補體依賴的裂解，或通過抗體依賴的細胞毒性或Fc受體介導的吞噬作用裂解人類靶細胞。此外，非人類單克隆抗體能被人類宿主作為外源蛋白質識別；因此，重復注射這類外源抗體能誘發(fā)免疫應答，導致有害的過敏反應。對于基于鼠的單克隆抗體，通常稱為人抗小鼠抗體應答，或“HAMA”應答。另外，這些“外源”抗體能遭到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，使得它們實際上在到達靶部位之前即已被中和。
A.瑞圖希單抗瑞圖希單抗(也稱為Rituxan、MabThera和IDEC-C2B8)是第一種獲得FDA批準的單克隆抗體，由IDEC Pharmaceuticals研制(參見美國專利號5,843,439；5,776,456和5,736,137)。瑞圖希單抗是一種嵌合的抗-CD20單克隆抗體(MAb)，推薦用于治療輕度或濾泡性B細胞非何杰金氏淋巴瘤(McLaughin等人，Oncology(Huntingt)121763-1777(1998a)；Leget等人，Curr.Opin.Oncol.10548-551(1998))。在歐洲，瑞圖希單抗已獲準用于治療復發(fā)的III/IV期濾泡性淋巴瘤(White等人，Pharm.Sci.Technol.Today295-101(1999))?？捎萌饒D希單抗治療的其它疾病包括濾泡性中樞細胞淋巴瘤(FCC)、套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞淋巴瘤(SLL/CLL)(Nguyen等人，1999)。在I期和II期臨床研究中，瑞圖希單抗已經顯示對輕度非何杰金氏淋巴瘤(NHL)有最小的毒性和明顯的治療活性(Berinstein等人，Ann.Oncol.9995-1001(1998))。
瑞圖希單抗單獨用于治療B細胞NHL，對于復發(fā)的或頑固性輕度或濾泡性NHL，劑量一般為每周375mg/M2，4周，它被很好地耐受，具有明顯的臨床活性(Piro等人，Ann.Oncol.10655-61(1999)；Nguyen等人，Eur.J.Haematol.6276-82(1999)；Coiffier等人，Blood921927-1932(1998))。然而，在使用抗體的試驗中也施用了高達4周500mg/M2的劑量(Maloney等人，Blood902188-2195(1997))。瑞圖希單抗也曾與化療劑如CHOP(例如，環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)聯(lián)合，用于治療輕度或濾泡性B細胞非何杰金氏淋巴瘤患者(Czuczman等人，J.Clin.Oncol.17268-76(1999)和McLaughlin等人，Oncology(Huntingt)121763-1777(1998))。
II.CD40和CD40LCD40在成熟B細胞表面以及白血病和淋巴B細胞和何杰金氏病(HD)的何杰金氏和里-斯(RS)細胞上表達(Valle等人，Eur.J.Immunol.191463-1467(1989)；Gruss等人，Leu k.Lymphoma24393-422(1997))。CD40是一種B細胞受體，可導致正常和惡性B細胞的激活和存活，如非何杰金氏濾泡性淋巴瘤(Johnson等人，Blood821848-1857(1993))。通過CD40受體的信號傳導保護未成熟的B細胞和B細胞淋巴瘤免于IgM-或fas-誘導的凋亡(Wang等人，J.Immunol.1553722-5(1995))。類似地，套細胞淋巴瘤細胞也含有高水平的CD40，加入外源CD40L提高了它們的存活率，使它們免于氟達拉濱誘導的凋亡(Clodi等人，Brit.J.Haematol.103217-9(1998))。相反，其他人報道，CD40刺激可抑制腫瘤B細胞的體外(Funakoshi等人，Blood832787-2794(1994))和體內(Murphy等人，Blood861946-1953(1995))生長。
對小鼠施用的抗-CD40抗體據說提高了荷有人B細胞淋巴瘤的小鼠的存活率(Funakoshi等人，(1994)；Tutt等人，J.Immunol.1613176-3185(1998))。美國專利號5,674,492(1997)和國際PCT申請WO95/17202中描述了利用抗-CD40抗體抑制CD40-CD40L相互作用治療腫瘤(包括B細胞淋巴瘤和EBV-誘發(fā)的淋巴瘤)的方法，在此引用作為參考。CD40信號據報道也與CD20的協(xié)同作用相關(Ledbetter等人，Circ.Shock 4467-72(1994))。描述抗-CD40抗體的制備和應用的其它參考文獻包括美國專利號5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)和5,674,492(1997)，在此引用作為參考。
gp39(也稱為CD40配體或CD40L)是一種CD40配體，在激活而不是靜止的CD4+Th細胞上表達(Spriggs等人，J.Exp.Med.1761543-1550(1992)；Lane等人，Eur.J.Immunol.222573-2578(1992)；Roy等人，J.Immunol.1511-14(1993))。CD40和CD40L都已經克隆并表征(Stamenkovi等人，EMBO J.81403-1410(1989)；Armitage等人，Nature 35780-82(1992)；Lederman等人，J.Exp.Med.1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等人，EMBO J.114313-4321(1992))。用CD40L基因轉染并在其表面上表達CD40L蛋白的細胞能觸發(fā)B細胞增殖，與其它刺激信號一起能誘導抗體產生(Armitage等人，(1992))。在何杰金氏病中，CD40L可能在腫瘤濾泡或里-斯細胞(CD40+)內腫瘤B細胞(CD40+)的細胞接觸依賴的相互作用中起作用(Carbone等人，Am.J.Pathol.147912-22(1995))。
抗-CD40L單克隆抗體已經有效地用于抑制LP-BM5-感染小鼠中鼠AIDS(MAIDS)的誘導(Green等人，Virology 241260-268(1998))。如美國專利號5,874,082(1999)所述，也已經制備抗-CD40抗體，用以預防或治療抗體介導的疾病，如變態(tài)反應和自身免疫病。據報道，抗-CD40抗體曾經與抗-CD20抗體聯(lián)合使用，在抑制細胞培養(yǎng)中非何杰金氏B細胞淋巴瘤的生長中產生加成作用(Benoit等人，(1996)Immunopharmacology35129-139(1996))。小鼠體內研究證實，在提高荷有某些但不是全部淋巴瘤系的小鼠的存活率方面，抗-CD20抗體比個別施用的抗-CD40更有效(Funakoshi等人，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.1993-101(1996))?？?CD19在對兩種同系小鼠B細胞淋巴瘤——BCL1和A31——的治療中也在體內有效(Tutt等人，(1998))。
曾經描述了抗-CD40L抗體用于治療與B細胞激活有關的疾病(歐洲專利號555,880(1993))。抗-CD40L抗體包括如美國專利號5,747,037(1998)所述的單克隆抗體3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79，和美國專利號5,876,718(1999)描述的用于治療移植物抗宿主疾病的抗-CD40L抗體。
III.中樞神經系統(tǒng)癌癥及其治療A.原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)定義為限于腦和腦干的淋巴瘤，不含全身性疾病。該術語適用于起源于并局限于中樞神經系統(tǒng)(CNS)的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。過去，這種腫瘤也被稱為小神經膠質細胞瘤、網狀細胞肉瘤或血管周圍肉瘤。然而到今天，其淋巴來源已經明確。
PCNSL以前是一種罕見的腫瘤，只占全部顱內腫瘤的0.5-1.2％，通常與先天性、獲得性或醫(yī)源性免疫缺陷狀態(tài)有關，如威斯科特-奧爾德里奇綜合征或腎移植引起的免疫抑制。據報道，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者的PCNSL發(fā)病率最高，為1.9-6％(DeAngelis等人，“原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤”，《癌癥腫瘤學原理與實踐》2233-2242(DeVita等人編寫，1997))。然而，在有免疫應答的患者中PCNSL的發(fā)病率提高。
AIDS患者中可發(fā)生全身性和原發(fā)性CNS非何杰金氏淋巴瘤(Kramer等人，Cancer802469-2477(1997))。而且，AIDS與非AIDS患者之間的PCNSL臨床、診斷和預后也有較大差別(Fine等人，Ann.Intern.Med.1191093-1104(1993))。
HIV相關的PCNSL是一種侵襲性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，只限于CNS內。大多數(shù)HIV相關的PCNSL在組織學上分類為B細胞來源的彌漫性、大細胞或大細胞免疫母細胞淋巴瘤。另外，PCNSL的來源仍有爭議，問題在于它是起因于浸潤性非惡性淋巴細胞的顱內轉化，還是外周腫瘤細胞遷移到CNS內并只在其中結合(Moses等人，1999)。
PCNSL的最佳治療尚未確定(Reni等人，Ann.Oncol.8227-234(1997)；Lesser等人，Cancer Treat.Rev.19261-281(1993))。起因于AIDS并發(fā)癥的PCNSL由于其位置和多病灶性通常不能外科切除。典型治療是顱腦照射，包括劑量為4000-5000cGy的外部波束(externalbeam)放射治療。盡管臨床和放射顯影改善迅速，但存活期中位數(shù)只是2-5個月。也曾經使用全腦照射和佐劑化學治療，包括照射前CHOP(例如，環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)和照射后阿糖胞苷，然而，許多患者仍然死亡(O’Neill等人，Int’l J.Radiation Oncol.Biol.Phys.33663-673(1995))。據報道，聯(lián)合使用阿糖胞苷(例如ARA-C)、氨甲喋呤和顱腦放射治療比單獨的放射治療更加有效(Abrey等人，J.Clin.Oncol.16859-63(1998))。據報道，高劑量氨甲喋呤、甲酰四氫葉酸、硫替哌、長春新堿和地塞米松的組合也可有效地治療有免疫應答的患者(Sandor等人，J.Clin.Oncol.163000-3006(1998))。據報道，使用Ommaya容器組合施用氨甲喋呤和阿糖胞苷可有效治療涉及CNS的復合性眼內淋巴瘤(Valluri等人，Retina 15125-9(1995))；對這種眼內淋巴瘤的新治療方法是有效的，因為20％的PCNSL患者累及眼睛(Monjour等人，Rev.Neurol.(巴黎)148589-600(1992))。遺憾的是，據報道這種加強治療由于醫(yī)源性腦白質病導致嚴重的認知缺陷。回顧數(shù)據提示，在放射治療之前應用化學治療時發(fā)生癡呆的危險提高(Fine等人，Annals Intern.Med.1191093-1104(1993)和Blay等人，J.Clin.Oncol.16864-871(1998))。其它研究提議單獨用化學療法治療PCNSL。據說應用提高化療劑通過血-腦屏障通透性的藥劑，能提高化學治療的效果(Cheng等人，Cancer821946-51(1998))。
但是，盡管有這些治療選擇，存活期中位數(shù)仍固定在約40個月(Abrey等人，J.Clin.Onc.16859-863(1998))。而且，這些治療可能導致延遲性神經毒性的明確、固定的危險，這在100％的60歲以上患者中十分嚴重(Abrey等人，“原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤的聯(lián)合化學治療”(摘要)Proc.Am.Soc.Clin.Onc.(1999))。累及CNS也使5-29％的全身性NHL病例變復雜，與極嚴重的預后相關(Fine等人，Ann.Intern.Med.1191093-1104(1993)；van Besien等人，Blood911178-1184(1998))。
B.其它CNS癌癥及其治療其它CNS癌癥包括NHL向腦的轉移，如軟腦膜轉移(LM)。曾經用Ommaya內注射氨甲喋呤和111銦-二乙撐三胺五乙酸(111In-DTPA)治療LM，獲得不同的結果(Mason等人，Neurology50438-444(1998))。也曾經用阿糖胞苷和硫替哌聯(lián)合照射治療LM(Schabet等人，Nervenarzt63317-27(1992))。在IV期何杰金氏病(HD)患者中也診斷有LM；據報道用全腦照射和鞘內施用氨甲喋呤能成功治療這些患者(Orlowski等人，Cancer531833-1835(1984))。
當前對原發(fā)性腦瘤、腦轉移和軟腦膜癌擴散的治療，包括使用單克隆抗體，是不夠的，或者具有很差的治療活性。已經提出將單克隆抗體與蛋白質毒素連接作為治療CNS癌癥的藥物(Youle，Semin.Cancer Biol.765-70(1996))。例如，曾報道在LM動物模型中使用免疫毒素，如抗-CD7篦麻毒素A鏈(DA7)(Herrlinger等人，J.Neurooncol.401-9(1998))。據報道曾經用LMB-7(由鼠單克隆抗體B3和截短的假單胞菌外毒素PE38構建的一種單鏈免疫毒素)治療小鼠模型的腫瘤性腦膜炎(Pastan等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA922765-2769(1995))。
IV.藥物向腦的輸送為了治療任何類型的腦瘤向腦部輸送治療劑由于血-腦屏障(BBB)而成為一個障礙。治療腦癌的方法包括(1)可能時采用外科手段；(2)全腦放射治療；(3)在有免疫應答的患者中使用皮質類固醇；(4)能穿過BBB的化學治療?；焺┑氖┯每梢杂萌魏屋斠和緩?，如腦間質輸液(Shin等人，J.Neurosurg.821021-1029(1995))或鞘內施用。也設計了滲透BBB破壞方法用來治療腦內腫瘤(Kroll等人，Neurosurgery421083-99(1998))。
也研制了能穿過BBB的其它藥劑。例如，親脂性輸送載體(例如甲基芐肼)以及高劑量CNS穿透劑(例如高劑量的氨甲喋呤)推薦用于治療PCNSL(DeAngelis等人，1997)。最近，提出使用單克隆抗體OX26靶向腦癌，它允許通過大鼠BBB進行載體介導的藥物輸送(Partridge等人，Pharm.Res.15576-82(1998))。據報道，OX26 MAb能用于向腦部輸送偶聯(lián)的肽放射性藥物(Deguchi等人，BioconjugChem.1032-37(1999))。據報道也制備了其它單克隆抗體作為腦部藥物輸送載體，它們針對含有體內BBB的腦毛細血管內皮上的細胞表面受體(例如轉鐵蛋白受體或胰島素受體)(Wu等人，Drug.Metabl.Dispos.26937-9(1998))。也制備了免疫脂質體(抗體定向的脂質體)，據說它能向大鼠腦中輸送抗腫瘤劑柔紅霉素(Huwyler等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA9314164-14169(1996))。也描述了生物分子親脂性復合物，據說它們能向哺乳動物腦中輸送活性劑(美國專利號5,716,614)。
因此，由于不能施行以前文獻中所報道的，需要改進對PCNSL和其它B細胞腦淋巴瘤的診斷和治療。而且，據發(fā)明者所知，還沒有人提出單獨鞘內施用抗-CD20抗體或與其它抗癌劑或抗體(例如，抗-CD40或抗-CD40L抗體)聯(lián)合，治療中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤和腦膜復發(fā)。
發(fā)明目的與概述本發(fā)明的一個目的在于提供一種治療或預防淋巴瘤患者腦膜復發(fā)的方法，包括施用治療有效量的B細胞靶標抗體(例如抗-CD22、抗-CD21、抗-CD23、抗-CD37、抗-CD40、抗-CD20抗體或其片段)的步驟。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤的方法，包括施用治療有效量的B細胞抗體或影響B(tài)細胞激活的抗體(例如抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40、抗-CD40L或抗-CD20抗體或其片段)的步驟?？梢灾委煹腃NS淋巴瘤包括原發(fā)性CNS淋巴瘤(PCNSL)、軟腦膜轉移(LM)或累及CNS的何杰金氏病。
本發(fā)明的一個特殊目的在于使用抗-B細胞抗體(它是人類抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或嵌合抗體)治療CNS淋巴瘤。例如，抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40或抗-CD40L抗體片段，如Fab、Fab’和F(ab’)2也計劃用于治療CNS淋巴瘤。
本發(fā)明的一個更優(yōu)選的目的在于使用瑞圖希單抗作為抗-CD20抗體治療CNS淋巴瘤。該抗-CD20抗體優(yōu)選地能以每周約10-375mg/M2的劑量心室內或鞘內施用4周。
本發(fā)明的另一個目的在于與下列任一種或多種物質聯(lián)合施用抗-CD20抗體治療CNS淋巴瘤(1)抗-CD40抗體或另一種B細胞結合抗體，(2)CD40L拮抗劑，(3)化療劑，和/或(4)抗-B細胞抗體。
本發(fā)明的另一個目的在于將抗-B細胞抗體(例如抗-CD20抗體或下文所述其它B細胞靶標的抗體)與放射性同位素連接，用于CNS淋巴瘤的治療或診斷?？?CD20抗體或另一種抗-B細胞抗體能與211At、212Bi、67Cu、123I、131I、111In、32P、212Pb、186Re、188Re、153Sm、99mTc或90Y連接，如果為了治療目的施用，對患者施用放射免疫治療有效的量。
本發(fā)明的另一個目的在于一種診斷患者的CNS淋巴瘤(如PCNSL)的方法，包括下列步驟(A)對患者施用與可檢測標記物結合的B細胞抗體、抗-CD20抗體或抗-CD20抗體片段；(B)檢測該標記物的位置。
為治療CNS淋巴瘤施用的組合物能與血-腦屏障(BBB)通透增強劑聯(lián)合或連接。
發(fā)明詳述I.定義“CNS淋巴瘤”是指中樞神經系統(tǒng)(CNS)的任何B細胞淋巴瘤。包括何杰金氏病(ND)淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、軟腦膜轉移和原發(fā)性CNS淋巴瘤(“PCNSL”)。
在此使用時，術語“抗體”是指完整的抗體及其Fab片段、Fv、scFv和F(ab)2片段。完整抗體包括單克隆抗體，如鼠單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、靈長類動物化(primatized)抗體、人源化抗體和人類抗體?？贵w的生產和完整抗體、Fab片段和F(ab)2片段的蛋白質結構以及編碼這些分子的基因序列的組構眾所周知，例如在Harlow等人，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1988)中描述，在此引用作為參考?？贵w(例如抗-CD20抗體、抗-B細胞抗體等)可以是免疫毒素或雙特異性抗體形式中的完整抗體或片段。
“抗-CD40抗體”包括免疫球蛋白及其片段，它們對CD40蛋白或其肽或CD40融合蛋白有特異反應性?？?CD40抗體包括人類抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體和人源化抗體。
“B細胞表面標志”或“B細胞靶標”或“B細胞抗原”是指B細胞表面表達的一種抗原，它針對與之結合的拮抗劑。代表性B細胞表面標志包括CD10、CD14、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白細胞表面標志。與哺乳動物的其它非B細胞組織相比，特別重要的B細胞表面標志在B細胞上優(yōu)先表達，并且可以在前體B細胞和成熟B細胞上表達。在一個實施方案中，B細胞標志使用CD19、CD20或CD22，在譜系由干細胞階段分化直到最終分化為漿細胞之前的整個過程中存在于B細胞上。最優(yōu)選的B細胞標志是CD20。
“B細胞抗體”是特異結合B細胞上抗原(如下文所述)的抗體。
“B細胞拮抗劑”是指一種分子，它在與B細胞表面標志結合后，例如通過降低或防止B細胞引發(fā)的體液反應，破壞或消耗哺乳動物的B細胞，和/或干擾一種或多種B細胞功能。拮抗劑優(yōu)選地能消耗用它治療的哺乳動物的B細胞(即降低循環(huán)B細胞水平)。這種消耗可通過多種機制實現(xiàn)，如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)，B細胞增殖的抑制和/或B細胞死亡的誘導(例如通過凋亡)。本發(fā)明范圍內包括的拮抗劑包括能與B細胞標志結合的抗體、合成或天然序列肽和小分子拮抗劑，任選地與細胞毒性劑偶聯(lián)或融合。優(yōu)選的拮抗劑包括抗體，更優(yōu)選地是B細胞消耗性抗體。
“抗-CD40L抗體”包括免疫球蛋白及其片段，它們對CD40L蛋白或及肽或CD40L融合蛋白有特異反應性?？?CD40L抗體包括人類抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體和人源化抗體。
“抗-CD20抗體”包括免疫球蛋白及其片段，它們對CD20或其肽有特異反應性?？?CD20抗體包括人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體和雙特異性或三特異性抗體。一種優(yōu)選的抗-CD20抗體是瑞圖希單抗。
“B細胞消耗性抗體”是指任何抗體(包括嵌合和人源化抗體)或其片段或含有它們的免疫毒素，當治療施用時，它能消耗施用抗體的患者的B細胞數(shù)量。這類B細胞消耗性抗體包括但不限于能結合上述任何B細胞抗原的抗體，優(yōu)選地包括抗-CD20抗體、抗-CD19抗體、抗-CD22抗體、抗-CD38抗體(例如OKT10抗體，參見，F(xiàn)lavell等人，Int.J.Cancer62337-44(1995))和抗主要組織相容性復合物(MHC)II抗體(參見Illidge等人，Blood94233-43(1999))。B細胞消耗性抗體優(yōu)選地是抗-CD20抗體。B細胞消耗性抗體可以是與治療用同位素連接的放射性形式，與毒劑連接的免疫毒素，完整抗體或其片段(例如Fab’)，以及B細胞消耗性抗體的嵌合抗體和人源化抗體。
“抗-CD19抗體”是指可識別并結合B細胞上表達的CD19抗原的任何抗體或其片段或免疫毒素。優(yōu)選的抗-CD19抗體能治療性消耗患者的B細胞或影響B(tài)細胞，使其對其它試劑更敏感或減少細胞的壽命。特異性抗-CD19抗體包括但不限于單克隆抗體HD37(參見Ghetie等人，Clin.Cancer Res.53920-7(1999))、單克隆抗體B43或其衍生的單鏈Fv(VFS191)(Li等人，Cancer Immunol.Immunother.47121-30(1998))、單克隆鼠抗體HD37(Stone等人，Blood881188-97(1996))和單鏈Fv(scFv)抗體片段FVS192(Bejcek等人，Cancer Res.552346-51(1995))。
“抗-CD22抗體”是指可識別并結合B細胞上表達的CD22抗原的任何抗體或其片段或免疫毒素。優(yōu)選的抗-CD22抗體能治療性消耗患者的B細胞或影響B(tài)細胞，使其對其它試劑更敏感或減少細胞的壽命。特異性抗-CD22抗體包括但不限于人源化抗-CD22抗體hLL2(Behr等人，Clin.Cancer Res.53304s-14s(1999))、單克隆抗體OM124(Bolognesi等人，Br.J.Haematol.101179-88(1998))和抗-CD22IgG1抗體RFB4及其免疫毒素(Mansfield等人，Bioconjug.Chem.7557-63(1996))。
“雙特異性抗體”是指一種抗體分子，它含有一個對一種抗原特異的抗原結合部位，和對另一種抗原特異的另一個抗原結合部位。
“抗體依賴的細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指一種細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上的結合抗體，隨后導致靶細胞裂解。介導ADCC的主要細胞——NK細胞只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達總結于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)第464頁的表3中。為了估計目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，如美國專利號5,500,362或5,821,337所述?？捎糜谶@種測定的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。此外，也可在體內估測目的分子的ADCC活性，例如使用動物模型，如Clynes等人，PNAS(USA)95652-656(1998)所公開的。
“人效應細胞”是表達一種或多種FcR并行使效應細胞功能的白細胞。優(yōu)選地，這些細胞至少表達FcγRIII，并行使ADCC效應細胞功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；PBMC和NK細胞是優(yōu)選的。
術語“Fc受體”或“FCR”用于描述可與抗體Fc區(qū)結合的受體。
優(yōu)選的FcR是一種天然序列人FcR。而且，一種優(yōu)選的FcR可結合IgG抗體(一種γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和其它剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(一種“激活受體”和)和FcγRIIB(一種“抑制受體”)，它們具有類似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于胞質域。激活受體FcγRIIA在胞質域含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在胞質域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見Daeron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 425-34(1994)；de Hass等人，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)綜述了FcR。此處的術語“FCR”包括其它FcR，包括將來鑒定的。該術語也包括新生受體FcRn，它負責母親IgG向胎兒的轉移(Guyer等人，J.Immunol.117587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24249(1994))。
“補體依賴的細胞毒性”或“CDC”是指一種分子在補體存在下裂解靶標的能力。補體系統(tǒng)的第一種成分(C1q)結合與同源抗原復合的分子(例如抗體)，起始補體激活途徑。為了估計補體激活，可以進行CDC測定，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202163(1996)所述。
“生長抑制”拮抗劑可阻止或降低表達一種可與拮抗劑結合的抗原的細胞增殖。例如，拮抗劑可以阻止或降低B細胞的體外和/或體內增殖。
“誘導凋亡”的拮抗劑可誘導例如B細胞的程序性死亡，這可用標準凋亡試驗測定，如膜聯(lián)蛋白V的結合，DNA的破碎，細胞收縮，內質網膨脹，細胞破碎，和/或膜泡的形成(稱為凋亡體)。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；疊抗；線性抗體；單鏈抗體分子；由抗體片段形成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是約150000道爾頓的異四聚體糖蛋白，它由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈連接，而在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間，二硫鍵數(shù)量不同。每條重鏈和輕鏈也含有一定間距的鏈內二硫鍵。每條重鏈在一端含有一個可變域(VH)，隨后是許多恒定域。每條輕鏈在一端含有一個可變域(VL)，在另一端含有一個恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的恒定域對準，輕鏈的可變域與重鏈的可變域對準。認為特定氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成一個界面。
術語“可變”是指抗體之間可變域的某些部分的序列廣泛不同，用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性在抗體的整個可變域中并非平等分布。它集中于輕鏈和重鏈可變域中被稱為超變區(qū)的三個片段中?？勺冇虻母痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q為構架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域每個含有4個FR，大多采用β-折疊構型，通過三個超變區(qū)連接，形成與β折疊結構連接的環(huán)，有時形成β折疊結構的一部分。每條鏈的超變區(qū)通過FR與另一個鏈的超變區(qū)緊密鄰接在一起，有助于形成抗體的抗原結合部位(參見Kabat等人，《具有免疫學意義的蛋白質的序列》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結合，但顯示不同的效應物功能，如抗體參與抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩條相同的抗原結合片段(稱為“Fab”片段，每條含有一個抗原結合部位)，和剩余的“Fc”片段，該名稱反映它容易結晶的能力。胃蛋白酶處理產生F(ab’)2片段，它具有兩個抗原結合部位，仍能交聯(lián)抗原。
“Fv”是含有完整抗原識別和抗原結合部位的最小抗體片段。該區(qū)域包含緊密非共價結合的一條重鏈和一條輕鏈可變域的二聚體。該構型中每個可變域的三個超變區(qū)相互作用，在VH-HL二聚體表面上確定了一個抗原結合部位。概括起來，六個超變區(qū)為抗體提供抗原結合特異性。然而，甚至一個可變域(或者只含抗原特異的三個超變區(qū)的Fv的一半)也具有識別并結合抗原的能力，盡管親和力低于完整結合部位。
Fab片段也含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一個恒定域(CHI)。Fab’片段不同于Fab片段，在重鏈CHI域的羧基端添加了一個新殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH是此處對恒定區(qū)的半胱氨酸殘基含有至少一個游離巰基的Fab’的命名。F(ab’)2抗體片段最初作為Fab’片段對產生，在片段之間含有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)也周知。
來自任何脊椎動物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據恒定域的氨基酸序列，能夠歸類為兩種截然不同的類型之一，稱為kappa(κ)和lambda(λ)。
根據重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體能被歸為不同的類型。完整的抗體有5個主要類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾種可以進一步分為亞型(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應于不同抗體類型的重鏈恒定域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型眾所周知。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段含有抗體的VH和VL域，其中這些域存在于多肽單鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽在VH和VL域之間還含有一個多肽接頭，它使scFv能形成抗原結合所希望的結構。scFv的綜述參見Pluckthun的《單克隆抗體藥理學》，第113卷，Rosenburg和Moore編寫，Springer-Verlag，紐約，269-315(1994)。
術語“疊抗(diabody)”是指含有兩個抗原結合部位的小抗體片段，該片段在同一多肽鏈(VH-VL)中含有一個與輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)。利用一個因太短而不能使同一條鏈上的兩個域配對的接頭，使該域與另一條鏈的互補域配對，產生兩個抗原結合部位。例如在EP404,097；WO93/11161和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中詳述了疊抗。
術語“單克隆抗體”在此使用時是指從基本上同質的抗體群體中獲得的抗體，即該群體的抗體除了可能較少出現(xiàn)的自然發(fā)生的突變之外相同。單克隆抗體高度特異，針對一個抗原部位。而且，與一般包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品不同，每種單克隆抗體只針對抗原上的一種決定簇。除了特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點還在于通過雜交瘤培養(yǎng)合成，不被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”是指抗體從基本上同質的抗體群體獲得的特征，不應視為需要用任何特殊方法產生。例如，根據本發(fā)明使用的單克隆抗體可以利用Kohler等人，Nature256495(1975)第一次描述的雜交瘤法制備，或者可以利用重組DNA方法制備(參見，例如，美國專利號4,816,567)。“單克隆抗體”也可以利用如Clackson等人，Nature352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)所述的技術從噬菌體抗體庫中分離。
此處的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定種或屬于特定抗體類型或亞型的抗體的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與來自另一個種或屬于另一抗體類型或亞型的抗體的相應序列相同或同源，以及這些抗體的片段，只要它們顯示希望的生物活性(美國專利號4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。此處的目的嵌合抗體包括“靈長類動物化”抗體，其含有來自非人類靈長類動物(例如Old World猴，如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變域抗原結合序列和人恒定區(qū)序列(美國專利號5,693,780)。
非人類(例如鼠)抗體的“人源化”形式是含有來自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體超變區(qū)的殘基被替換為來自非人類物種(如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)的超變區(qū)的殘基(供體抗體)，具有希望的特異性、親和力和能力。有時，人類免疫球蛋白的構架區(qū)(FR)殘基被替換為相應的非人類殘基。此外，人源化抗體還可含有在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。為了進一步精修抗體的性能進行這些修飾?？傊?，人源化抗體含有基本上所有或至少一個，一般兩個可變域，其中所有或基本上所有超變環(huán)對應于非人類免疫球蛋白的超變環(huán)，所有或基本上所有FR具有人類免疫球蛋白序列。人源化抗體任選地也至少含有免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，一般是人類免疫球蛋白的。進一步的詳述參見Jones等人，Nature321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
術語“超變區(qū)”在此使用時是指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基。超變區(qū)含有來自“補體決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《具有免疫學意義的蛋白質的序列》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或來自“超變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變域的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重鏈可變域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))?！皹嫾軈^(qū)”或“FR”殘基是不同于此處所述超變區(qū)殘基的可變域殘基。“可結合”目的抗原(如B細胞表面標志)的拮抗劑能夠以足夠的親和力和/或親合力結合該抗原，使得該拮抗劑可用作針對表達該抗原的細胞的治療劑。
可結合CD20抗原的抗體的例子包括“C2B8”，現(xiàn)在稱為“瑞圖希單抗”(“RITUXAN”)(美國專利號5,736,137，在此引用作為參考)；釔-[90]標記的2138鼠抗體，命名為“Y2B8”(美國專利號5,736,137，在此引用作為參考)；任選地用1311標記的鼠IgG2a“131”，產生“1311-B1”抗體(BEXXARTM)(美國專利號5,595,721，在此引用作為參考)；鼠單克隆抗體“1F5”(Press等人，Blood 69(2)584-591(1987))；“嵌合2H7”抗體(美國專利號5,677,180，在此引用作為參考)；可從國際白細胞分型會獲得的單克隆抗體L27、G28-2、93-1133、B-C1或NU-B2(Valentine等人，《白細胞分型III》，McMichael編寫，第440頁，牛津大學出版社(1987))?？山Y合CD19抗原的抗體的例子包括Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32364-372(1991)和Vlasveld等人，Cancer Immunol.Immunother.4037-47(1995)中的抗-CD19抗體，和Kiesel等人，Leukemia Research11，121119(1987)中的B4抗體。
術語“瑞圖希單抗”或“RITUXAN”在此是指抗CD20抗原的遺傳工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利號5,736,137中命名為“C2B8”，在此引用作為參考。該抗體是一種IgG，κ免疫球蛋白，含有鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列和人恒定區(qū)序列。瑞圖希單抗對CD20抗原有大約8.0nM的結合親和力。
“分離的”拮抗劑是指從其天然環(huán)境成分中鑒定、分離和/或回收的拮抗劑。天然環(huán)境的污染成分是干擾拮抗劑診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質或非蛋白質溶質。在優(yōu)選實施方案中，拮抗劑將被純化為(1)大于拮抗劑的95％重量，最優(yōu)選地大于99％重量，利用Lowry法測定，(2)利用自旋杯式測序儀足以獲得至少15個N端殘基或內部氨基酸序列的程度，或(3)在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE經考馬斯藍或者優(yōu)選地銀染顯示均質。分離的拮抗劑包括重組細胞內的原位拮抗劑，因為拮抗劑自然環(huán)境中的至少一種成分將不存在。然而，分離的拮抗劑通常通過至少一個純化步驟制備。用于處理的“哺乳動物”是指被歸類為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農畜、動物園動物、運動動物或寵物，如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動物是人。
“處理”是指治療性處理和預防性措施。需要處理的動物包括已經患有疾病的以及將要預防疾病的動物。因此，哺乳動物可能已診斷為患病或可能易患疾病。
表述“治療有效量”是指可有效預防、改善或治療所述自身免疫病的拮抗劑的量。術語“免疫抑制劑”在此用于輔助治療時是指用于抑制或遮蔽所治療的哺乳動物免疫系統(tǒng)的物質。包括可抑制細胞因子產生、下調或抑制自身抗原表達或遮蔽MHC抗原的物質。
這些試劑的實例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見美國專利號4,665,077，其內容在此引用作為參考)；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；溴環(huán)肽；達那唑；氨苯砜；戊二醛(遮蔽MHC抗原，如美國專利號4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇，如糖皮質類固醇，例如強的松、甲基強的松龍和地塞米松；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-γ、-β或-α抗體，抗腫瘤壞死因子-α抗體，抗腫瘤壞死因子-β抗體，抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；全T抗體，優(yōu)選地抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域的可溶性肽(1990年7月26日公開的WO90/08187)；鏈激酶；TGF-O；鏈激酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細胞受體(Cohen等人，美國專利號5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等人，Science251430-432(1991)；WO90/11294；Ianeway，Nature，341482(1989)；WO91/01133)；和T細胞受體抗體(EP340,109)，如TLOB9。
術語“細胞毒性劑”在此使用時是指可抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞破壞的物質。該術語包括放射性同位素(如I131、Y90、Ar211、P32、Re188、Re186、Sm153、B212等)、化療劑和毒素，如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，或其片段。
“化療劑”是可用于癌癥治療的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑，如硫替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替派；氮丙啶和甲基吐根胺(amelamine)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、雙氯乙基甲胺、鹽酸氧化雙氯乙基甲胺、美法侖、novembiehin、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，如阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加利車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、久莫霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、絳色霉素、鏈脲霉素、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，如二甲葉酸、氨甲喋呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄氨、睪內酯；抗腎上腺素，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，如frolinic acid；醋葡醛內酯；aldophosphamide糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸；乙酸elliptinium；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；nitracrine；噴司他??；phenamet；吡柔比星；podophyllinic acid；2-乙基酰肼；甲基芐肼；PSK；丙亞胺；西佐喃；鍺螺胺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；硫替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOLO，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(TAXOTEW，Rh6ne-Pulenc Rorer，Antony，法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲喋呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓；navelbine；三羥基蒽醌；替尼泊甙；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素；capecitabine；和上述任一種的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。該定義也包括用來調節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，如抗雌激素，包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、bicalutamide、亮丙瑞林、戈舍瑞林；和上述任一種的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。
術語“細胞因子”是由一個細胞群體產生的，作為細胞間介質作用于另一種細胞的蛋白質的通稱。細胞因子的實例包括淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括生長激素，如人類生長激素、N-甲硫氨酰人類生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-o；mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，如NGF-P；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-o；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(osteoinductive)因子；干擾素，如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在此使用時，術語細胞因子包括自然來源或來自重組細胞培養(yǎng)的蛋白質，和天然序列細胞因子的生物活性相當物。
術語“前體藥物”在本申請書中使用時是指藥學活性物質的前體或衍生形式，與親本藥物相比，它對腫瘤細胞的細胞毒性較低，并且能被酶促激活或者轉化為更有活性的親本形式。參見，例如，Wihnan，“癌癥化學治療中的前體藥物”Biochemical Society Transactions，14，375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人，“前體藥物定向藥物輸送的一種化學方法”《定向藥物輸送》，Borchardt等人(編寫)，247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽的前體藥物、含硫代磷酸鹽的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含肽的前體藥物、D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化前體藥物、含β-內酰胺的前體藥物、任選地取代的含苯氧基乙酰胺的前體藥物或任選地取代的含苯基乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物，它們能轉化為更有活性的細胞毒性游離藥物。能衍生為本發(fā)明使用的前體藥物形式的細胞毒性藥物的實例包括但不限于上述化療劑。
“脂質體”是由多種類型的脂類、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，它可用于向哺乳動物輸送藥物(如此處公開的拮抗劑，和任選地化療劑)。脂質體的成分通常以雙層結構排列，類似于生物膜的脂類排列。術語“包裝插頁”用來指治療產物商品包裝中通常包含的說明書，包括關于適應證、用法、劑量、施用、禁忌癥的信息和/或關于使用這些治療性產物的警告。
“治療有效量”或“預防有效量”或“施用有效量”是指可抑制CNS淋巴瘤發(fā)展的藥劑量。這種抑制可以是導致淋巴瘤不可檢測的完全反應或部分反應。以易于施用和劑量均一的劑量單位形式配制腸胃外組合物是特別有利的?！皠┝繂挝恍问健痹诖耸褂脮r是指物理分散的單位，適于作為所治療的哺乳動物患者的單一劑量；計算含有預定量的活性化合物的每一單位，產生與需要的藥物載體有關的希望的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的特性直接取決于(A)活性化合物的獨特特性和將要達到的特殊治療效果；(B)這種用于治療個體敏感性的活性化合物的混合技術所固有的限制。
“放射免疫治療有效量”是指與放射性同位素連接的抗-CD20抗體的量，當為了治療CNS淋巴瘤對患者施用時，使CNS淋巴瘤完全或部分地恢復。一般而言，所述任何抗體以300-1500mg/m3的劑量施用。
“藥用賦形劑”是指為了制備適宜或方便的劑型而與活性藥物、試劑或抗原結合的任何惰性物質。
“免疫原性”是指導向的蛋白質或治療部分當對患者施用時引發(fā)免疫應答(例如體液或細胞應答)的能力。
II.拮抗劑的生產本發(fā)明的生產方法和產品使用或加入可結合B細胞表面標志的拮抗劑，例如CD20、CD19、CD21、CD22、CD40等。因此，此處將描述生產這些拮抗劑的方法。用于生產或篩選拮抗劑的B細胞表面標志或細胞因子可以是例如含有希望的表位的可溶性抗原或其部分。另外，在細胞表面表達B細胞表面標志的細胞能用來生產或篩選拮抗劑。本領域技術人員知道可用于生產拮抗劑的B細胞表面標志的其它方式。優(yōu)選地，B細胞表面標志是CD19或CD20抗原。
盡管優(yōu)選的拮抗劑是抗體，但此處也涉及抗體之外的拮抗劑。例如，拮抗劑可包括任選地與細胞毒性劑(如此處所述)融合或偶聯(lián)的小分子拮抗劑。為了鑒定可結合該抗原的小分子，可以針對目的B細胞表面標志篩查小分子文庫?？梢愿鶕卓剐再|進一步篩選小分子，和/或與細胞毒性劑偶聯(lián)。
拮抗劑也可以是通過合理設計或噬菌體展示產生的肽(參見，例如，1998年8月13日公開的WO98/35036)。在一個實施方案中，選擇的分子可以是根據抗體的CDR設計的“CDR模擬物”或抗體類似物。雖然這些肽可被其本身拮抗，但任選地可將肽與細胞毒性劑融合，以添加或增強該肽的拮抗性質。
下面描述了用于生產根據本發(fā)明使用的抗體拮抗劑的典型技術。
多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選地通過對動物多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑產生?？梢岳秒p功能劑或衍化劑，如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOC12或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，偶聯(lián)相關抗原與在所免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質，例如匙孔戚血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。動物用抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫，方法是將例如100pg或5μg蛋白質或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑組合，在多個部位皮內注射該溶液。一個月后，通過在多個部位皮下注射初始量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物與弗氏完全佐劑，加強動物。7-14天后，動物放血，測定血清的抗體效價。加強動物直到效價穩(wěn)定。優(yōu)選地，用與不同蛋白質偶聯(lián)的同一抗原和/或通過不同交聯(lián)劑的偶聯(lián)物加強動物。偶聯(lián)物也能作為融合蛋白在重組細胞培養(yǎng)中制備。聚集劑(如明礬)也適用于增強免疫應答。
單克隆抗體單克隆抗體從基本上同質的抗體群體中獲得，即，該群體的各種抗體除可能少量存在的自然發(fā)生的突變之外相同。因此，修飾語“單克隆”是指抗體不是不同抗體混合物的性質。例如，單克隆抗體可以利用Kohler等人，Nature256495(1975)第一次描述的雜交瘤技術制備，或者可以通過重組DNA方法制備(美國專利號4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，如倉鼠，誘導產生或能產生可特異結合免疫用蛋白質的抗體的淋巴細胞。此外，也可以在體外免疫淋巴細胞。然后應用合適的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞[Goding，《單克隆抗體原理與實踐》，59-103頁(Academic Press，1986)]。
這樣制備的雜交瘤細胞接種于合適的培養(yǎng)基中生長，其中優(yōu)選地含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細胞是有效融合的，支持選擇的抗體產生細胞穩(wěn)定、高水平地產生抗體，并且對培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如可從Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA獲得的來源于MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的細胞系，和可從美國模式培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也曾描述了人骨髓瘤和小鼠人異骨髓瘤細胞系用于人單克隆抗體生產[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等人，《單克隆抗體生產技術和應用》，51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，紐約，1987)]。
測定培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中針對該抗原的單克隆抗體的產生。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或體外結合試驗，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。單克隆抗體的結合親和力例如可通過Munson等人，Anal.Biochem.，107220(1980)所述的夾心分析法測定。
在確定可產生具有希望的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可以通過有限稀釋法亞克隆這些克隆，并通過標準方法培養(yǎng)(Goding，《單克隆抗體原理與實踐》，59-103頁(Academic Press，1986))。適用于該目的的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞也可以作為腹水腫瘤在動物體內生長。
這些亞克隆分泌的單克隆抗體通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當分離。
編碼單克隆抗體的DNA利用常規(guī)方法(例如，利用能特異結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離并測序。雜交瘤細胞用作該DNA的優(yōu)選來源。分離后，DNA可置于表達載體中，然后轉染宿主細胞，如不產生免疫球蛋白的大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關于編碼抗體的DNA在細菌中重組表達的綜述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.5256-262(1993)和Phickthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在另一個實施方案中，能利用McCafferty等人，Nature，348552-554(1990)所述的技術從抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)分別描述了利用噬菌體文庫對鼠和人抗體的分離。以后的文章描述了應用鏈改組(shuffling)以及聯(lián)合感染和體內重組作為構建極大噬菌體文庫的策略(Waterhouse等人，Nuc.AcidsRes.212265-2266(1993))，產生高親和力(nM級)人抗體(Marks等人，BioTechnology，10779-783(1992))。因此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術的有效備選技術。
DNA也可以修飾，例如，用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替同源鼠序列(美國專利號4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或者共價連接免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。一般用這些非免疫球蛋白多肽代替抗體的恒定域，或者代替抗體的一個抗原結合部位的可變域，產生一種嵌合雙價抗體，其含有一個具有抗原特異性的抗原結合部位和另一個具有不同抗原特異性的抗原結合部位。
人源化抗體人源化非人類抗體的方法在本領域中已經描述。優(yōu)選地，人源化抗體中引入一個或多個來自非人類來源的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常被稱為“引入(import)”殘基，一般來自“引入”可變域。人源化基本上能按照Winter及其同事(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988))的方法進行，是用超變區(qū)序列代替人類抗體的相應序列。因此，“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中大大少于完整人類可變域部分被替換為來自非人類物種的相應序列。實際上，人源化抗體一般是人類抗體，其中一些超變區(qū)殘基，或許一些FR殘基被替換為來自嚙齒類動物抗體類似位點的殘基。
用于生產人源化抗體的人類可變域(輕鏈和重鏈)的選擇對于降低抗原性極其重要。根據所謂的“最佳擬合(best-fit)”法，對已知人類可變域序列的完整文庫篩查嚙齒類動物抗體的可變域序列。然后用最接近嚙齒類動物的人類序列作為人源化抗體的人類構架區(qū)(FR)(Sims等人，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一種方法使用特定輕鏈或重鏈亞型的所有人類抗體的共有序列衍生的特定構架區(qū)。幾種不同的人源化抗體可以使用相同的框架(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等人，J.Immunol.1512623(1993))。
抗體人源化對于保持高度的抗原親和力和其它有利的生物學性質是十分重要的。為了達到這一目的，按照一種優(yōu)選方法，利用親代和人源化序列的三維模型，通過對親代序列和不同概念人源化產物的分析方法，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型一般可以獲得，為本領域技術人員所周知?？梢垣@得圖形顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序。觀察這些圖示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合抗原能力的殘基。這樣，能從受體引入序列中選擇并結合FR殘基，以獲得希望的抗體特性，如提高的靶抗原親和力。超變區(qū)殘基通常直接并最充分地參與影響抗原結合。
人類抗體作為人源化的備選，可以生產人類抗體。例如，現(xiàn)在能生產在免疫后能產生全套人類抗體而不產生內源免疫球蛋白的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失使內源抗體產生被完全抑制。這種種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因排列的轉移導致在抗原攻擊后產生人類抗體。參見，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，733(1993)；美國專利號5,591,669、5,589,369和5,545,807。此外，也能用噬菌體展示技術(McCafferty等人，Nature348552-553(1990))由未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全部成分(repertoire)在體外生產人類抗體和抗體片段。按照該技術，將抗體V域基因符合讀框地克隆到絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，在噬菌體顆粒表面展示為功能抗體片段。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能性的選擇也導致選擇編碼顯示這些性質的抗體的基因。因此，該噬菌體模擬B細胞的一些性質。噬菌體展示能用多種方式進行；綜述參見，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology3564-571(1993)。V基因片段的幾種來源能用于噬菌體展示。Clackson等人，Nature，352624-628(1991)從來自免疫小鼠脾臟的V基因小隨機組合文庫中分離了不同排列的抗惡唑啉抗體。能夠構建來自未免疫的人類供體的V基因全部成分，并能基本上按照Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12725-734(1993)所述的技術，分離抗不同抗原(包括自身抗原)的抗體。參見，美國專利號5,565,332和5,573,905。人類抗體也可由體外激活的B細胞產生(參見美國專利號5,567,610和5,229,275)。
抗體片段已經發(fā)展了多種技術生產抗體片段。傳統(tǒng)上是通過蛋白水解消化完整抗體產生這些片段(參見，例如，Morimoto等人，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等人，Science，22981(1985))。然而，現(xiàn)在能由重組宿主細胞直接產生這些片段。例如，能從上述抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。此外，也能直接從大腸桿菌中回收Fab’-Sli片段，并化學偶聯(lián)形成F(ab’)2片段[Carter等人，Bio/Technology10163-167(1992)]。按照另一種方法，能直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離F(ab’)2片段。生產抗體片段的其它技術為技術人員所知。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185；美國專利號5,571,894；美國專利號5,587,458?？贵w片段也可以是“線性抗體”，如美國專利5,641,870所述。這些線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩種不同的表位具有結合特異性的抗體。典型的雙特異性抗體可以結合B細胞表面標志的兩種不同表位。其它抗體可以結合第一種B細胞標志，并進一步結合第二種B細胞表面標志。此外，抗B細胞標志結合臂可以與結合白細胞上的觸發(fā)分子(如T細胞受體分子，如CD2或CD3，或IgG的Fc受體(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂結合，以將細胞防御機制集中于B細胞。雙特異性抗體也可用于將細胞毒性劑定位于B細胞。這些抗體具有一個B細胞標志結合臂，和一個結合細胞毒性劑(例如皂草素、抗干擾素-α、長春花生物堿、蓖麻毒素A鏈、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體能制備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。
生產雙特異性抗體的方法在本領域周知。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等人，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分類，這些雜交瘤(細胞雜交瘤)產生一種可能含有10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種抗體分子具有正確的雙特異性結構。正確分子的純化通常利用親和層析步驟進行，十分繁瑣，產物產量較低。WO93/08829和Traunecker等人，EMBO J.103655-3659(1991)公開了類似的方法。
按照不同的方法，具有希望的結合特異性的抗體可變域(抗體-抗原結合部位)與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選地與免疫球蛋白重鏈恒定域融合，它含有鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的至少一部分。優(yōu)選地含有第一個重鏈恒定區(qū)(CHI)，它含有輕鏈結合所必需的部位，存在于至少一種融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，必要時將編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入分別的表達載體中，共轉染合適的宿主生物。當在構建中使用的三種多肽鏈的不相等比例獲得最佳產量時，提供了調節(jié)實施方案中三種多肽片段相互比例的較大靈活性。然而，當比例相等的至少兩種多肽鏈的表達導致高產量時，或當比例不是特別顯著時，能在一個表達載體中插入兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體含有在一條臂上具有第一種結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和在另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈輕鏈對(具有第二種結合特異性)。發(fā)現(xiàn)這種不對稱的結構有利于從不必要的免疫球蛋白鏈組合中分離希望的雙特異性化合物，因為只有一半雙特異性抗體中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種簡單的分離方法。該方法在WO94/04690中公開。關于生產雙特異性抗體的進一步的細節(jié)，參見，例如，Suresh等人，Methods inEnzymology，121210(1986)。
按照美國專利號5,731,168所述的另一種方法，能改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分數(shù)最大。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的CH3域的至少一部分。在該方法中，來自第一種抗體分子的界面的一條或多條小氨基酸側鏈被替換為較大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過將較大的氨基酸側鏈替換為較小的側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)，在第二種抗體分子的界面上產生與較大側鏈相同或相似大小的補償“腔”。這提供了提高異二聚體產量，高于其它不必要的終產物(如同型二聚體)的一種機制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)”抗體。例如，異偶聯(lián)物中的一種抗體能與親合素偶聯(lián)，另一種與生物素偶聯(lián)。例如，這些抗體已經打算用于將免疫系統(tǒng)細胞導向不希望的細胞(美國專利號4,676,980)，并用于HIV感染的治療(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。異偶聯(lián)抗體可以利用任何適宜的交聯(lián)法制備。合適的交聯(lián)劑在本領域眾所周知，在美國專利號4,676,980中公開，還有許多交聯(lián)技術。
由抗體片段生產雙特異性抗體的技術已經在文獻中描述。例如，雙特異性抗體可以利用化學連接制備。Brennan等人，Science，22981(1985)描述了一種方法，其中蛋白水解切割完整的抗體，產生F(ab’)2片段。這些片段在雙硫醇復合劑亞砷酸鈉存在下還原，穩(wěn)定鄰近的雙硫醇并防止分子間二硫并阻止分子間二硫化物形成。然后將產生的Fab’片段轉化為硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通過巰乙胺還原將Fab’-TNB衍生物之一恢復為Fab’-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab’-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體能用作酶的選擇性固定的試劑。
最新進展有利于從大腸桿菌中直接回收Fab’-SH片段，它們能夠化學偶聯(lián)，形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.175217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)2分子的產生。每條Fab’片段由大腸桿菌分別分泌，在體外直接化學偶聯(lián)，形成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能夠結合過量表達ErbB2受體的細胞和正常人類T細胞，并觸發(fā)人類細胞毒性淋巴細胞對人類乳癌靶標的裂解活性。
也描述了直接從重組細胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，曾經利用亮氨酸拉鏈生產了雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab’部分連接?？贵w同型二聚體在鉸鏈區(qū)處還原，形成單體，然后再次氧化，形成抗體異二聚體。該方法也能用于生產抗體同型二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“疊抗”技術提供了一種生產雙特異性抗體片段的備選機制。這些片段含有通過接頭與輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)，該接頭因太短而不能使同一條鏈上的兩個域配對。
因此，使一條片段的VH和VL域與另一條片段的互補VL和VH域配對，從而形成兩個抗原結合部位。也曾經報道了利用單鏈Fv(sFv)二聚體生產雙特異性抗體的另一個策略。參見，Gruber等人，J.Immunol.1525368(1994)。預期兩價以上的抗體。例如，能制備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.14760(1991)。
III.拮抗劑的偶聯(lián)和其它修飾此處所述方法中使用的或產品中所含的拮抗劑任選地與一種細胞毒性劑偶聯(lián)?？捎糜谏a這種拮抗劑-細胞毒性劑偶聯(lián)物的化療劑在上文中已經描述。
在此也涉及拮抗劑與一種或多種小分子毒素(如加利車霉素、美登素(美國專利號5,208,020)、trichothene和CC1065)的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個實施方案中，拮抗劑與一個或多個美登素分子偶聯(lián)(例如，每個拮抗劑分子約1-10個美登素分子)。例如，美登素可以轉化為May-SS-Me，它可還原為May-SH3，并與修飾的拮抗劑反應(Chari等人，Cancer Research52127-131(1992))，產生類美登素-拮抗劑偶聯(lián)物。
此外，拮抗劑也可與一個或多個加利車霉素分子偶聯(lián)?？股丶永嚸顾丶易迥茉趤喥つ枬舛纫痣p鏈DNA斷裂?？梢允褂玫募永嚸顾氐慕Y構類似物包括但不限于yJ1、a21、a31、N-乙酰-yl’、PSAG和011(Hinman等人，Cancer Research533336-3342(1993)和Lode等人，Cancer Research582925-2928(1993))。
能夠使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、非洲蒴蓮毒蛋白(modeccin)A鏈、α-八疊球菌、leuritesfordii蛋白、dianthin蛋白、美洲商陸(phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、gelonin、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢霉烯(tricothecene)。參見，例如，1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發(fā)明進一步涉及與具有核裂解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶，如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)的拮抗劑。多種放射性同位素可用于生產放射偶聯(lián)的拮抗劑。實例包括At211、I125、Re188、In111、Tc99m、Pb212、Y90、Re186、Sm153、Cu67、I131、P52、Bi212和Lu的放射性同位素。拮抗劑與細胞毒性劑的偶聯(lián)物可以用多種雙功能蛋白質偶聯(lián)劑制備，如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶雙硫醇)-丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己胺-1-羧酸、亞氨基thiolane(IT)、亞氨酯的雙功能衍生物(如二甲基乙二酰亞胺HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺)、醛類(如戊二醛)、雙疊氮化合物(如雙(對-疊氮苯甲酰)己二胺)、雙重氮衍生物(如雙(重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(如亞芐基-2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素能如Vitetta等人，Science 2381098(1987)所述制備。碳-14-標記的1-異硫氰酰芐基-3-甲基二乙烯三胺基戊乙酸(MX-DTPA)是用于結合放射性核苷酸與拮抗劑的一種典型螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于從細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可以使用酸不穩(wěn)定的接頭、肽酶敏感的接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等人，Cancer Research 52127-131(1992))。此外，含有拮抗劑和細胞毒性劑的融合蛋白也可以通過例如重組技術或肽合成法制備。
在另一個實施方案中，拮抗劑可以與一種“受體”(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，用于腫瘤預導向，其中對患者施用拮抗劑-受體偶聯(lián)物，隨后利用螯合劑從循環(huán)中除去未結合的偶聯(lián)物，然后施用與細胞毒性劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(如親和素)。本發(fā)明的拮抗劑也可以與一種能將前體藥物(如肽?；焺?，參見WO81/01145)轉化為活性抗癌藥物的前體藥物-激活的酶偶聯(lián)。參見，例如，WO88/07378和美國專利號4,975,278。
這些偶聯(lián)物的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉化為更具活性的細胞毒性形式的任何酶。本發(fā)明的方法中有用的酶包括但不限于可用于將含磷酸前體藥物轉化為游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含硫酸鹽前體藥物轉化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可用于將無毒5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨基酶；可用于將含肽前體藥物轉化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)；可用于轉化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化前體藥物轉化為游離藥物的碳水化合物裂解酶，如li-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；可用于將β-內酰胺衍生的藥物轉化為游離藥物的β-內酰胺酶；可用于將胺氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；芑乃幬镛D化為游離藥物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。此外，具有酶活性的抗體在本領域中也被稱作“抗體酶”，能用來將本發(fā)明的前體藥物轉化為游離活性藥物(參見，例如，Massey，Nature328457-458(1987))。拮抗劑-抗體酶偶聯(lián)物能如此處所述制備，用于對腫瘤細胞群輸送抗體酶。
能利用本領域眾所周知的技術，如使用上述異雙功能交聯(lián)劑，將本發(fā)明的酶與拮抗劑共價結合。此外，也能用本領域眾所周知的重組DNA技術構建融合蛋白，其至少含有本發(fā)明的拮抗劑的抗原結合區(qū)，至少與本發(fā)明的酶的功能活性部分連接[參見，例如，Neuberger等人，Nature，312604-608(1984)]。
此處也涉及拮抗劑的其它修飾。例如，拮抗劑可以與多種非蛋白質聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。此處公開的拮抗劑也可以配制為脂質體。含有拮抗劑的脂質體通過本領域周知的方法制備，如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；美國專利號4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公布的WO97/38731所述。美國專利號5,013,556中公開了循環(huán)時間延長的脂質體。
特別有用的脂質體能用反相蒸發(fā)法產生，其中使用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)脂類組合物。脂質體通過規(guī)定孔徑的濾器噴出，產生具有希望的直徑的脂質體。本發(fā)明的抗體的Fab’片段能通過二硫化物交換反應與如Martin等人，J.Biol.Chem.257286-288(1982)所述的脂質體偶聯(lián)。脂質體中任選地含有化療劑。參見Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。涉及此處所述的蛋白質或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，希望改善拮抗劑的結合親和力和/或其它生物學性質。
通過向拮抗劑核酸中引入適當核苷酸改變，或通過肽合成，制備拮抗劑的氨基酸序列變體。這些修飾包括，例如拮抗劑氨基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或置換。進行缺失、插入和置換的任一組合，以獲得最終構建體，只要最終構建體具有希望的特性。氨基酸改變也可改變拮抗劑的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數(shù)量或位置。
一種方法可用于鑒定拮抗劑中是優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域，稱作“丙氨酸掃描誘變法”，如Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)所述。在此確定了一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，并替換為中性或帶負電的氨基酸(最優(yōu)選的是丙氨酸或聚丙氨酸)，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在置換位點引入其它變異，精確確定證實對置換功能敏感的氨基酸位置。因此，預先確定用于引入氨基酸序列變異的位點，而不需預先確定突變本身的性質。例如，為了分析特定位點突變的表現(xiàn)，在靶密碼子或區(qū)域處進行丙氨酸掃描或隨機誘變，并根據希望的活性篩選表達的拮抗劑變體。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，其長度從一個殘基到含有一百個或以上殘基的多肽，以及一個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括含有一個N端甲硫氨酰殘基的拮抗劑，或與細胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括與酶拮抗劑N端或C端的融合體，或延長拮抗劑血清半衰期的多肽。
另一種變體是氨基酸置換變體。這些變體在拮抗劑分子中至少一個氨基酸殘基被替換為不同的殘基。最適于抗體拮抗劑置換誘變的位點包括超變區(qū)，但是也包括FR改變。
表1在“優(yōu)選置換”標題下列出了保守置換。如果這些置換導致生物活性改變，可引入更大改變，在表1中被命名為“代表性置換”，或者如以下關于氨基酸類別所進一步描述，并且篩選產物。
表1
拮抗劑生物學性質的本質改變通過選擇置換實現(xiàn)，這些置換在下列方面顯著不同影響保持(a)置換區(qū)域中多肽主鏈的結構，如片層或螺旋構象，(b)靶部位處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小。自然存在的殘基根據共同的側鏈性質分為以下幾類(1)疏水正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈方向的殘基gly，pro；和(6)芳族trp，tyr，phe。
非保守性置換需要將這些類別之一的成員換為另一類別。
不參與保持拮抗劑正確構象的任何半胱氨酸殘基一般也可以置換為絲氨酸，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。反之，也可以向拮抗劑中加入半胱氨酸鍵，以提高其穩(wěn)定性(特別是在拮抗劑是抗體片段如Fv片段時)。
一種特別優(yōu)選的置換變體包括置換親本抗體的一個或多個超變區(qū)殘基。為進一步發(fā)展選擇的變體一般具有比親本抗體改進的生物學性質。生產這些置換變體的一種適宜方法是利用噬菌體展示的親和成熟法。簡言之，突變幾個超變區(qū)位點(例如6-7個位點)，產生每個位點的所有可能的氨基置換。這樣產生的抗體變體由絲狀噬菌體顆粒以單價方式展示，作為與包裝于每個顆粒中的M13的基因III產物的融合體。然后根據此處公開的生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體展示的變體。為了確定用于修飾的候選超變區(qū)位點，能進行丙氨酸掃描誘變，以確定明顯有助于抗原結合的超變區(qū)殘基。此外，為了確定抗體與抗原之間的接觸點，分析抗原-抗體復合物的晶體結構也是有利的。這些接觸殘基和鄰近殘基是按照此處詳述的技術置換的候選殘基。產生這些變體后，如此處所述篩選全部變體，可以選擇在一次或多次相關試驗中具有優(yōu)越性質的抗體進一步發(fā)展。
拮抗劑的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑的原始糖基化模型。改變是指刪除拮抗劑中的一個或多個碳水化合物部分，和/或添加一個或多個拮抗劑中沒有的糖基化位點。
多肽的糖基化一般是N-連接的或O-連接的。N-連接的是指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側鏈連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)是碳水化合物部分酶促連接天冬酰胺側鏈的識別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任一種產生可能的糖基化位點。O-連接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥氨基酸(最常見的是絲氨酸或蘇氨酸)連接，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。方便地通過改變氨基酸序列使其含有一種或多種上述三肽序列向拮抗劑中添加糖基化位點(用于N-連接的糖基化位點)。也可以通過向原始拮抗劑序列中添加或置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基進行這種改變(用于O-連接的糖基化位點)。
編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子用本領域周知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(對于天然存在的氨基酸序列變體)，或通過寡核苷酸介導(或定點)誘變、PCR誘變和盒誘變以前制備的拮抗劑變體或非變體形式。
希望在效應物功能方面修飾本發(fā)明的拮抗劑，例如，提高拮抗劑的抗原依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)。這可通過在抗體拮抗劑的Fc區(qū)中引入一個或多個氨基酸置換實現(xiàn)。此外，也可以在Fc區(qū)中導入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。這樣產生的同型二聚抗體可能具有提高的內化能力和/或增強的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J.Exp.Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)?？鼓[瘤活性提高的同型二聚抗體也可以應用如Wolff等人，Cancer Research532560-2565(1993)所述的異雙功能交聯(lián)劑制備。此外，也能構建含有雙Fc區(qū)從而具有增強的補體裂解和ADCC能力的抗體。參見Stevenson等人，Anti-Cancer DrugDesign3219-230(1989)。
為了提高拮抗劑的血清半衰期，可以向拮抗劑(特別是抗體片段)中加入補救受體結合表位，如美國專利5,739,277所述。在此使用時，術語“補救受體結合表位”是指負責延長IgG分子體內血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)的表位。
IV.藥用制劑通過將具有希望的純度的拮抗劑與任選地藥學可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington制藥學》第16版，Osol，A.編寫(1980))，制備按照本發(fā)明使用的拮抗劑的治療制劑以備貯存，形式為凍干制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度時對受體無毒，包括緩沖液，如磷酸、檸檬酸或其他有機酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如二甲苯十八烷酯氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苯甲烴銨、苯索氯銨；苯酚、丁基或芐基乙醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和m-甲酚；低分子量(少于10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖或其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡合物(如鋅-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
WO98/56418描述了代表性抗-CD20抗體制劑，在此引用作為參考。該公開文本描述了一種液體多劑量制劑，其含有40mg/ml瑞圖希單抗、25mM乙酸鹽、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨酸酯20，pH5.0，在2-8℃下最短貯存期限為2年。另一種目的抗-CD20制劑在9.0mg/ml氯化鈉、7.35mg/ml二水合檸檬酸鈉、0.7mg/ml聚山梨酸酯80和無菌注射用水中含有10mg/ml瑞圖希單抗，pH6.5。WO97/04801描述了適于皮下施用的凍干制劑。這些凍干制劑可以用合適的稀釋劑重建為高蛋白質濃度，重建的制劑可以對此處治療的哺乳動物皮下施用。
此處所述制劑也可含有一種以上的活性化合物，它們是所治療的特定適應證所需的，優(yōu)選地具有不會彼此不利影響的補充活性。例如，希望進一步提供一種細胞毒性劑、化療劑、細胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細胞的，如環(huán)孢菌素或結合T細胞的抗體，例如結合LFA-1的抗體)。這種試劑的有效量取決于制劑中所含的拮抗劑的量，所治療的疾病類型，和上述其它因素。它們一般以上文使用的施用途徑以相同劑量使用，或者約為現(xiàn)在使用劑量的1-99％。
活性成分也可以包封于通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如，分別是羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸)微膠囊，在膠體藥物輸送系統(tǒng)(例如脂質體、白蛋白小球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或大乳劑中。Osol，A.編寫的《Remington制藥學》第16版(1980)中公開了這些技術。
也可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當實例包括含有拮抗劑的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質為成形形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸))，或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射小球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
將用于體內施用的制劑必須是無菌的。這可通過無菌濾膜過濾實現(xiàn)。
V.施用抗-B細胞抗體的方法和組合物A.施用抗-B細胞抗體的方法用于治療CNS淋巴瘤中的施用抗-B細胞抗體的方法可以是靜脈內(iv)、口服或腹膜內施用。然而，為治療中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤或相關疾病，施用抗-B細胞抗體(例如抗-CD20抗體)或其免疫原性片段的優(yōu)選方法可以是鞘內施用。鞘內施用優(yōu)選地通過Ommaya容器施用，但也能通過腰部穿刺或心室內施用。抗-B細胞抗體能通過相同途徑與另一種藥物聯(lián)合施用；第二種藥劑也能通過不同的途徑施用。另外，預期的抗-B細胞抗體也可以在顱腦照射之前或之后施用。
此外，也能夠破壞血腦屏障(BBB)，隨后動脈內施用藥物?？?B細胞抗體，如可結合B細胞的抗-CD20抗體，或可抑制B細胞的抗-CD40L抗體，能單獨或與其它藥劑(例如，抗-CD40抗體、其它抗-B細胞抗體、氨甲喋呤、環(huán)磷酰胺、甲基芐肼和地塞米松)聯(lián)合動脈內施用。破壞BBB的方法包括Kroll等人，Neurosurgery421083-99(1998)和Dahlborg等人，Cancer J.Sci.Am.2166(1996)所述的方法。
如上所述，抗-B細胞抗體，例如抗-CD20抗體，如瑞圖希單抗，或其治療有效的片段(例如Fab、Fab’或F(ab’)2)，可單獨或與另外一種或多種活性劑聯(lián)合施用。另外的活性劑包括其它化療劑，如甲酰四氫葉酸、CHOP、氨甲喋呤、阿糖胞苷、硫替哌或長春新堿，如前所述?？?B細胞抗體或其治療有效片段也能與抑制CD40與其配體CD40L相互作用的試劑聯(lián)合施用。CD40/CD40L抑制劑包括抗-CD40抗體或其片段、抗-CD40L抗體或其片段和CD40或CD40L的擬肽。特別是，抗-CD20抗體也能與其它抗-B細胞抗體(如抗-CD19、抗-CD22、抗-CD38和抗-MHC II抗體)聯(lián)合施用。而且，抗-CD20抗體能單獨施用，與其它抗體聯(lián)合或與其它治療形式(例如化學治療和放射治療)聯(lián)合施用，以及其組合。
這些活性劑(例如抗-CD20抗體，如瑞圖希單抗)能夠在藥學有效的載體中。載體包括親脂性載體(例如甲基芐肼)或免疫親脂性載體，如Huwyler等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA9314164-14169(1996)和美國專利號5,716,614所述。此外，活性劑也能與導向腦上皮上的受體(如轉鐵蛋白受體)的載體連接(參見Wu等人，Drug.Metabol.Dispos.26937-9(1998))。
VI.抗-CD20抗體與其它藥劑或治療形式的聯(lián)合應用
A.抗-B細胞抗體與照射聯(lián)合已經證明，在治療PCNSL時單獨照射不如與其它形式(如化學治療)聯(lián)合應用有效。本發(fā)明的一方面涉及單獨應用抗-CD20抗體或與其它藥劑(如CHOP)及腦部照射聯(lián)合治療腦淋巴瘤患者?？贵w能在腦部照射之前、之后或同時在之前和之后施用。例如，能對患者施以全腦放射治療(WBRT)，隨后用阿糖胞苷和單獨用抗-CD20抗體或與其它抗-B細胞抗體聯(lián)合高劑量治療。優(yōu)選地對患者施以4000-5000cGy。此外，如DeAngelis等人所述，能對患者腦部施以4000cGy放射治療，并對有關區(qū)域以2000cGy加強。如果患者累及眼睛，則可對眼睛施以3600cGy。
能首先施以照射，然后單獨用抗-CD20抗體或與其它抗-B細胞抗體聯(lián)合治療。照射后施用抗-CD20抗體能與甲基芐肼、洛莫司汀和長春新堿(PCV)聯(lián)合。PCV的施用能如Chamberlain等人，J.Neuro.Oncol.14271-275(1992)所述進行。此外，抗體也能與環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松(CHOP)或環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和地塞米松(CHOD)聯(lián)合。能在全腦放射治療之前施以這些抗體和化學治療組合。在顱腦照射之前，本發(fā)明的抗-CD20抗體也能與氨甲喋呤(400mg/M2)、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、強的松和博來霉素(MACOP-B)聯(lián)合。MACOP-B、CHOP和CHOD的施用能如DeAngelis等人，1997和此處引用的參考文獻所述進行。
此外，抗-CD20抗體本身也可以與醫(yī)學上有用的同位素連接。這些放射性核素在下文中進一步詳述。
B.抗-CD20抗體與化學治療聯(lián)合本發(fā)明的另一個實施方案是應用抗-B細胞抗體(例如抗-CD20抗體)或其治療有效片段與化療劑聯(lián)合而不與放射治療聯(lián)合治療腦淋巴瘤。
一個實例是施用抗-CD20抗體與高劑量的氨甲喋呤。也能聯(lián)合施用其它試劑。例如，本發(fā)明的抗-CD20抗體能與高劑量的氨甲喋呤(2.5mg/M2)、甲基芐肼和長春新堿一起施用，氨甲喋呤、甲基芐肼和長春新堿如Freilich等人，Neurology46435-439(1996)所述施用。高劑量氨甲喋呤也能如Perez-Jaffe等人，Diagn.Cytopathol.20219-223(1999)所述施用。此外，抗-CD20抗體也能與高劑量阿糖胞苷(3g/M2)一起施用。高劑量阿糖胞苷的施用能如Strauchen等人，Cancer631918-21(1989)所述進行。本發(fā)明的另一個實施方案涉及抗-CD20抗體與化療劑和/或與抗-CD40或抗-CD40L抗體和/或與其它抗-B細胞抗體的聯(lián)合施用。
C.抗-B細胞抗體(如抗-CD20抗體)與提高血腦屏障通透性的試劑聯(lián)合因為血腦屏障能對向患者施用藥物造成困難，在不希望鞘內施用的情況中，或者在優(yōu)選的另一種抗-CD20抗體施用形式時，可以應用可提高血腦屏障(BBB)通透性的試劑或方法?？商岣連BB通透性的試劑的一個實例是對腦毛細血管內皮細胞上存在的轉鐵蛋白受體有反應性的抗體。對轉鐵蛋白受體的至少一部分有反應性的單克隆抗體包括OX-26、B3/25、Tf6/14、OKT-9、L5.1、5E-9、RI7217和T58/30。這些抗轉鐵蛋白受體抗體能如美國專利號5,182,107所述應用，在此引用作為參考。
本發(fā)明涉及的組合物也可含有親脂性載體(例如甲基芐肼)，用于向腦中的靶部位輸送抗體。也涉及免疫脂質體(Huwyler等人，1996)。親脂性分子優(yōu)選地是Ω-3系列的脂肪酸或其脂衍生物。其它親脂性分子有脂肪酸、甘油二酯、二酰磷脂、溶血磷脂、膽固醇和含有18-46個碳原子的多不飽和烴基的其它類固醇。
優(yōu)選的生物聚合物載體是聚(α)-氨基酸(例如PLL、聚L-精氨酸PLA、聚L-鳥氨酸PLO)、人血清白蛋白、氨基葡聚糖、酪蛋白等。這些載體優(yōu)選地是可生物降解的、生物相容的，可能是藥物輸送系統(tǒng)的優(yōu)良候選物。關于這些載體及其施用的進一步描述，參見美國專利號5,716,614，在此引用作為參考。
VII.抗-B細胞抗體(如抗-CD20抗體)與干擾CD40/CD40L相互作用的試劑的聯(lián)合施用本發(fā)明涉及的另一種方法是用B細胞抗體(優(yōu)選地B細胞消耗性抗體，最優(yōu)選地是消耗性抗-CD20抗體)與干擾CD40/CD40L相互作用的試劑(優(yōu)選地抗-CD40或抗-CD40L抗體)聯(lián)合治療腦淋巴瘤。
根據本發(fā)明這一方面，對患者施用“CD40L拮抗劑”，以干擾CD40L與其結合配偶體CD40的相互作用，聯(lián)合施用抗-B細胞抗體，如RITUXAN。“CD40L拮抗劑”定義為干擾這一相互作用的分子。CD40L拮抗劑可以是抗CD40L抗體(例如抗CD40L的單克隆抗體)、抗CD40L抗體的片段或衍生物(例如Fab或F(ab’)片段、嵌合抗體或人源化抗體)、CD40的可溶形式、含CD40的融合蛋白的可溶形式，或破壞或干擾CD40L-CD40相互作用的藥劑。
為了制備抗-CD40L抗體，能用可在哺乳動物中引發(fā)抗體應答的CD40L蛋白或其蛋白質片段(例如肽片段)的免疫原形式免疫哺乳動物(例如小鼠、倉鼠、兔或有蹄類動物)。在其表面表達CD40L的細胞也能用作免疫原。其它免疫原包括純化的CD40L蛋白或蛋白質片段。CD40L能用標準純化技術從表達CD40L的細胞中純化(Armitage等人，Nature35780-82(1992)；Lederman等人，J.Exp.Med.1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等人，EMBO J.114313-4321(1992))。此外，也能如Armitage等人(1992)所公開的，根據CD40L的氨基酸序列制備CD40L肽。賦予蛋白質免疫原性的技術包括與載體偶聯(lián)或本領域周知的其它技術。例如，能在佐劑存在下施用蛋白質。能通過檢測血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)視免疫過程。標準ELISA或其它免疫測定能使用免疫原作為抗原，評價抗體水平。免疫后，能獲得抗血清，并分離多克隆抗體。為了生產單克隆抗體，收獲抗體生產細胞，并利用標準體細胞融合方法與骨髓瘤細胞融合，如美國專利號5,833,987(1998)和5,747,037(1997)所述。抗-CD20抗體和抗-CD40抗體能用類似的方法制備。文獻中已經報道了幾種抗-CD40L抗體、抗-CD40抗體和抗-CD20抗體，它們可以公開獲得。
抗體可以是片段，篩選的些片段與以上對完整抗體所述相同的方法應用。例如，能用胃蛋白酶處理抗體產生F(ab’)2片段。能夠處理得到的F(ab’)2片段，還原二硫鍵產生Fab’片段。預期的其它抗體片段包括Fab和scFv。
對人類治療應用時，使非人類抗體的識別最小化而不是普遍免疫抑制的一種方法是，產生嵌合抗體衍生物，即組合了非人類動物可變區(qū)和人類恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體分子可包含，例如，來自小鼠、大鼠或其它種的抗體的抗原結合域，及人類恒定區(qū)。制備嵌合抗體的方法包括美國專利號5,833,987(1998)所述的方法。
為了人類治療目的，通過產生人類可變區(qū)嵌合體能進一步使對CD40L蛋白或肽有特異反應性的抗體人源化，其中可變區(qū)部分，特別是抗原結合域的保守構架區(qū)，是人類來源的，只有超變區(qū)是非人類來源的。這些改變的免疫球蛋白分子可以通過本領域周知的幾種方法之一制備(例如，Teng等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA807308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today 47279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.923-16(1982))，優(yōu)選地按照PCT申請WO92/06193或EP0239400所述制備。人源化抗體可由例如Scotgen Limited(2Holly Road，Twickenham，Middlesex，英國)商業(yè)生產。
生產對CD40L蛋白或肽有反應性的特異性抗體或抗體片段的另一種方法是用CD40L蛋白或肽篩查在細菌中表達的編碼免疫球蛋白基因或其片段的表達文庫。例如，完整Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)能用噬菌體表達文庫在細菌中表達。參見，例如，Ward等人，Nature341544-546(1989)；Huse等人，Science2461275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature348552-554(1990)。例如，用CD40L肽篩查這些文庫能鑒定CD40L反應性的免疫球蛋白片段。此外，SCID-hu小鼠(可從Genpharm獲得)也能用來生產抗體或其片段。
標題為“抗-gp39抗體及其應用”的PCT專利申請?zhí)朩O95/06666描述了生產抗CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)單克隆抗體(mAb)的方法和適用于本發(fā)明的方法的單克隆抗體，其內容在此引用作為參考。本發(fā)明特別優(yōu)選的抗人CD40L抗體是MAb24-31和89-76，分別由雜交瘤24-31和89-76產生。(這些抗體如美國專利號5,747,037所述克隆)。分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤按照布達佩斯條約條款于1994年9月2日保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209。89-76雜交瘤分配ATCC保藏號HB11713，24-31雜交瘤分配ATCC保藏號HB11712。
重組抗-CD40L抗體，如嵌合和人源化抗體，能根據標準重組DNA技術通過操作編碼抗-CD40L抗體的核酸(例如DNA或cDNA)生產。因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈的分離的核酸分子，或其部分，它們對CD40L特別是人CD40L有反應性。編碼免疫球蛋白的核酸能編碼免疫球蛋白輕鏈(VL)或重鏈(VH)可變區(qū)，含有或不含連接的重鏈或輕鏈恒定區(qū)(或其部分)。這些核酸能通過標準技術從產生抗-人CD40L mAb的細胞(例如雜交瘤)中分離。例如，編碼24-31或89-76mAb的核酸能通過cDNA文庫篩查、PCR擴增或其它標準技術分別從24-31或89-76雜交瘤中分離。而且，編碼抗-人CD40LmAb的核酸能摻入表達載體中，并導入合適的宿主細胞，以利于重組抗-人CD40L抗體的表達和產生。
為了制備抗-CD20、抗-CD40L或抗-CD40抗體，能使用上述方法。
除了可識別并結合CD40L并抑制CD40與CD40L相互作用的抗體之外，還涉及其它CD40L拮抗劑，單獨或與其它治療(例如放射治療或化學治療)聯(lián)合用于治療B細胞淋巴瘤和白血病。CD40L拮抗劑可以是CD40L配體的可溶形式。CD40L的單價可溶性配體，如可溶性CD40，能結合CD40L，從而抑制CD40L與表達的B細胞上的CD40的相互作用。術語“可溶性”是指配體不與細胞膜永久結合?？扇苄訡D40L配體能通過化學合成或優(yōu)選地通過重組DNA技術制備，例如只表達配體的胞外域(缺乏跨膜和胞質域)。一種優(yōu)選的可溶性CD40L配體是可溶性CD40。此外，可溶性CD40L配體也可以是融合蛋白的形式。這種融合蛋白含有與第二種分子連接的CD40L配體的至少一部分。例如，CD40能表達為含免疫球蛋白的融合蛋白(即CD40Ig融合蛋白)。在一個實施方案中，生產一種融合蛋白，其含有CD40分子胞外域部分的氨基酸殘基，與對應于免疫球蛋白重鏈(例如Cα1)鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的序列的氨基酸殘基連接，形成CD40Ig融合蛋白(參見，例如，Linsley等人，J.Exp.Med.1783721-730(1991)；Capon等人，Nature 337525-531(1989)；美國專利號5,116,964(1992))。這些融合蛋白能通過化學合成或優(yōu)選地根據CD40的cDNA通過重組DNA技術生產(Stamenkovic等人，EMBO J.81403-1410(1989))。
以適于體內給藥的生物相容形式對患者施用CD40L或CD40拮抗劑?！斑m于體內施用的生物相容形式”是指將要施用的拮抗劑形式，其中蛋白質的治療效果超過毒性作用。術語“患者”包括能引發(fā)免疫應答的活生物，例如哺乳動物。優(yōu)選的患者的例子包括人、狗、貓、馬、母牛、豬、山羊、綿羊、小鼠、大鼠及其轉基因種。CD40L或CD40拮抗劑能以任何藥理學形式施用，任選地在藥學可接受的載體中。治療有效量的CD40L或CD40拮抗劑的施用定義為有效的量，即獲得希望的結果(例如抑制所治療的腦淋巴瘤的進展或增殖)所需的劑量和時間。例如，CD40L拮抗劑的治療有效量可根據因素不同而不同，如患者的疾病分期(例如I期與IV期)、年齡、性別、醫(yī)學并發(fā)癥(例如AIDS)和體重，和拮抗劑在患者中引發(fā)希望的反應的能力?？梢哉{整劑量方案，以產生最佳治療反應。例如，可以每天施用幾份分開的劑量，或者可以按照治療情況急需按比例減少劑量?；钚曰衔?如抗-CD40抗體)自身或與其它活性劑組合，可以以方便的方式施用，例如注射(皮下、肌內、鞘內、心室內、靜脈內等)、口服、吸入、穿皮或直腸施用。根據施用途徑，活性化合物可以包被于物質中，以保護化合物免遭酶、酸或可滅活該化合物的其它自然條件的作用。一種優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(i.v.)注射。
為了通過腸胃外施用之外的方式施用CD40L拮抗劑或CD40拮抗劑，可能必須用防止其滅活的物質包被該拮抗劑，或與之同時施用。例如，拮抗劑能在合適的載體或稀釋劑中對個體施用，與酶抑制劑同時施用，或在合適的載體如脂質體中。藥學可接受的稀釋劑包括鹽水和水緩沖液。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂質體包括油包水、水包油型乳劑，以及常規(guī)脂質體(Strejan等人，J.Neuroimmunol.727(1984))。其它藥學可接受的載體和賦形劑在本領域中周知。
活性化合物也可以腸胃外或腹膜內施用。也能在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中進行分散。在普通貯存和使用條件下，這些制品可含有防腐劑，以防止微生物的生長。
適于注射的藥用組合物包括無菌水溶液(水溶性的)或分散液和用于隨時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，組合物必須是無菌的，并且必須具有易于注射的流動性。它在生產和貯存條件下必須穩(wěn)定，必須能防止微生物(如細菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的分散基質及其合適的混合物。例如，使用包被如卵磷脂，在分散時保持需要的顆粒大小，使用表面活性劑，都能保持適當?shù)牧鲃有?。使用多種抗細菌劑和抗真菌劑能防止微生物的作用，如paraben、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況中，組合物中優(yōu)選地包含等滲劑，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。使組合物中含有一種延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠，能實現(xiàn)注射組合物的延時吸收。
無菌注射溶液的制備方法是在合適的溶劑中摻入需要量的活性化合物(例如CD40L或CD40的拮抗劑自身，或與其它活性劑或抗-CD20抗體和抗-B細胞抗體組合)，需要時含有此處列舉的一種成分或其組合，隨后過濾除菌。分散液一般如下制備向無菌載體中摻入活性化合物，該載體含有基本分散基質和需要的上述其它成分。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這由無菌過濾的溶液產生活性成分加其它任何希望的成分的粉末。
當活性化合物如上所述被適當保護時，蛋白質可以與例如惰性稀釋劑或可食用、可吸收的載體一起口服。在此使用時，“藥學可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散基質、包被、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些基質和試劑在藥學活性物中的用途在本領域眾所周知。除了任一常規(guī)基質或試劑與活性化合物不相容的情況，它在治療組合物中的應用是所希望的。上述使用CD40L或CD40拮抗劑的所有組合物也可含有附加的活性化合物(例如化療劑)。而且，上述藥用組合物也可用于制備含抗-CD20抗體的化合物。
VIII.利用放射免疫療法對CNS的治療對于放射性標記用作治療或診斷劑的活性抗體(例如抗-B細胞抗體等)，有幾種考慮。首先，必須選擇放射性同位素，然后必須選擇使放射性同位素與抗體結合的方法。對于放射性同位素的選擇，考慮因素的綜述見Magerstadt，《抗體偶聯(lián)物與惡性疾病》，93-109(1991)。必須主要考慮希望的輻射范圍(受腫瘤組織類型、是實體瘤還是播散性腫瘤、所有腫瘤細胞是否預期都是抗原陽性的等參數(shù)影響)、能量釋放率、與輸注時間相比同位素的半衰期和清除率、是成像還是治療有助于標記抗體的施用等。對于根據本發(fā)明的診斷成像目的，認為用99Tc、111In、123I或131I標記是優(yōu)選的，用111In或131I標記最優(yōu)選的。對于根據本發(fā)明的治療目的，認為用β-發(fā)射器如90Y或131I標記是優(yōu)選的。值得為治療或診斷應用考慮的醫(yī)學上合適的其它同位素有186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、211At、67Cu、212Pb和Lu的放射性同位素。
考慮連接放射性同位素與抗體的方法時，必須首先考慮同位素的性質。碘同位素能通過多種方法與抗體連接，它們使同位素直接與蛋白質共價連接。氯胺T標記(Greenwood等人，Biochem.J.89114(1963))和iodogen標記(Fraker等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.80849-857(1978))是兩種常用的放射性碘標記方法。對于金屬同位素，例如90Y或186Re，同位素的連接方法一般是共價連接螯合部分與抗體，然后使螯合劑與金屬配位。這些方法例如在Gansow等人，美國專利號4,831,175；4,454,106和4,472,509中描述，在此引用作為參考。應當指出，用碘同位素(例如131I)標記的抗體在向靶細胞內化后脫鹵，而通過螯合標記的抗體經歷放射誘導的螯合劑斷裂，從而通過配位復合物解離丟失放射性同位素。在某些情況中，從復合物中解離的金屬能再次復合，從而更快地清除非特異性定位的同位素，因此對非靶組織有極低的毒性。例如，螯合劑化合物如EDTA或DTPA能輸入到患者體內，使螯合劑結合釋放的放射性金屬，并促使游離的放射性同位素從尿中排泄。也注意到，脫鹵產生的游離碘和小的碘化蛋白質從體內快速清除。這有利于使正常組織(包括骨髓)免遭放射毒性作用。
Magerstadt(1991)也綜述了施用方法。對于淋巴瘤的治療，一方面考慮靜脈內注射是一種良好方法，因為完全循環(huán)對于快速破壞標記抗體是有利的，特別是對于避免注射部位處放射性標記的局部高濃度。靜脈內(iv)施用受限于“血管屏障”，包括血管的內皮細胞和也負責BBB的內皮下基質。本領域技術人員周知如何配制適用于上述任何注射途徑的標記抗體組合物。
施用時間可能十分不同。能在一個大丸劑中提供全部劑量。此外，也能通過延長的輸液法或通過長達數(shù)周的重復注射提供劑量。放射免疫治療之間優(yōu)選的間隔時間是6-12周。如果用低劑量進行放射免疫治療，能以2周間隔施用藥劑。如果部分輸送總治療劑量，能在2-4天時間內施用。由于輸注的劑量較低，能以較短間隔施用示蹤標記的劑量；對于臨床應用，優(yōu)選1-2周的間隔。
使用的放射劑量可能十分不同。對于免疫診斷成像，應用抗體的示蹤標記，一般用約1-35mCi放射性同位素標記約1-20mg抗體。劑量在一定程度上依賴于用于成像的同位素；此范圍的高限，優(yōu)選地約20-30mCi，應當使用99mTc和123I；此范圍的低限，優(yōu)選地約1-10mCi，應當應用131I和111In。為了成像，對患者施用約1-30mg這種示蹤標記的抗體。為了放射免疫治療，抗體標記為高比活性。獲得的比活性取決于使用的放射性同位素；對于131I，活性一般為1-10mCi/mg。對患者施用足量的抗體，使得接受的全身劑量可達1100cGy，但優(yōu)選地低于或等于500cGy?？贵w(包括標記的和未標記的抗體)的量約為0.2-40mg/kg患者體重。標記的抗-CD20抗體或抗-CD40抗體能用來診斷或確定PCNSL或其它腦淋巴瘤的位置。
向全身提供約500cGy的放射性強度估計約為825mCi的131I。再次使用的放射性強度部分取決于選擇的同位素。對于使用131I的治療方案，可使用約5-1500mCi，優(yōu)選的是約5-800mCi，約5-250mCi是最優(yōu)選的。對于90Y治療，認為約1-200mCi的放射性是合適的，更優(yōu)選的是約1-150mCi，約1-100mCi是最優(yōu)選的。由使用的放射性強度估計組織劑量的優(yōu)選方法是用示蹤劑量進行成像或其它藥物動力學方案，以獲得預測劑量的估計值。
在診斷和治療施用之一或兩者之前能“預施用”未標記的抗體。發(fā)現(xiàn)預施用對成像和治療的影響因患者而不同。一般優(yōu)選使用預劑量逐漸提高的未標記抗體，進行一系列診斷成像施用。然后應用可產生最佳腫瘤劑量與全身劑量之比的預劑量，之后施以放射免疫治療劑量。
Goldberg等人描述了使用抗癌胚抗原(CEA)抗體對實體瘤(癌)的放射免疫診斷成像和放射免疫治療(J.Clin.Oncol.9548(1991))。美國專利號4,348,376和4,460,559(在此引用作為參考)描述的材料與方法的許多方面也適用于本發(fā)明，它是針對大腦淋巴瘤的診斷和治療。參考文獻中提供了用于估計患者接受放射劑量的方法的其它描述(Siegel等人，Med.Phys.20579-582(1993))。
IX.藥用組合物本發(fā)明的抗-B細胞抗體(例如抗-CD20、抗-CD22、抗-CD21、抗-CD40或抗-CD40L抗體或其片段)與可檢測標記物或治療劑的偶聯(lián)或連接能使用共價或其它化學結合方法。化學結合法包括，例如戊二醛、異雙功能和同雙功能連接劑。異雙功能連接劑包括，例如SMPT(琥珀酰亞胺羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基dition)-tolume)、SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-亞吡啶基硫代)-丙酸和SMCC(琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸。同雙功能連接劑包括，例如DMP(二甲基pimelimidate)、DMA(二甲基suberinidate)和DTBP(二甲基3，3’-二硫-雙丙亞胺)。
一些蛋白質可檢測標記物和治療劑能與本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)重組結合，構建作為融合蛋白的組合物，其中單克隆抗體的可變區(qū)保持其結合特異性，而可檢測標記物或治療劑保留其活性。構建這些融合蛋白的重組方法在本領域周知。
本發(fā)明包括含有單克隆抗體或重組結合蛋白(偶聯(lián)或未偶聯(lián))的藥用組合物。一種藥用組合物可含有單克隆抗體和藥學可接受的載體。對于本發(fā)明，“藥學可接受的載體”可以是本領域眾所周知的任何標準載體。例如，合適的載體包括磷酸緩沖液、乳劑如水包油乳劑和不同類型的濕潤劑。其它載體包括無菌溶液、片劑、包衣片劑和膠囊。這些載體一般能含有賦形劑，如淀粉、牛奶、糖、粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或鈣、滑石、植物脂或植物油、樹膠、甘油或其它已知的賦形劑。這些載體也包括香味和顏色添加劑、防腐劑或其它成分。含有這些載體的組合物通過眾所周知的常規(guī)方法配制。參見《Remington制藥學》(第15版，1980)。
對于診斷用途，能標記或不標記抗體和重組結合蛋白。診斷測定一般需要檢測細胞表面上單克隆抗體或重組結合蛋白與人CD20結合形成的復合物。當未標記時，抗體和重組結合蛋白可用于凝集試驗。另外，未標記的抗體也能與對單克隆抗體或重組結合蛋白有特異反應性的其它標記抗體(第二抗體)(如免疫球蛋白特異的抗體)組合應用。此外，單克隆抗體和重組結合蛋白也可直接標記。能使用多種標記物，如放射性核素、(上述)熒光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、配體(特別是半抗原)等。多種類型的免疫測定在本領域眾所周知。
熒光測定中常使用本發(fā)明的單克隆抗體和重組結合蛋白，其中抗體或重組結合蛋白與熒光分子如異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。
下列實施例并非意在限制本發(fā)明，而是提供本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
實施例實施例1非人類靈長類動物中的鞘內瑞圖希單抗由于腦膜復發(fā)是淋巴瘤患者的常見復發(fā)部位，使用瑞圖希單抗可有益于預防或抑制腦膜復發(fā)的出現(xiàn)。
材料與方法。一種連續(xù)保持的非人類靈長類動物模型已經由NCI批準，它有一個與皮下Ommaya容器連接的慢性留置的Pudenz第4室導管。該導管允許在多個時間點對未麻醉的動物進行腦脊液(CSF)采樣(參見，McCully等人，Lab.Animal Sci.40520-525(1990))。
劑量可達10mg的瑞圖希單抗以完全濃度(10mg/ml)施用，或在不含防腐劑的無菌鹽水中稀釋為可達1ml，保存稀釋藥物溶液的樣品用于以后分析瑞圖希單抗?jié)舛取?br> 使用的動物是4只重約10kg的成年雄性恒河猴(Macacamulatta)。動物靠NIH公開配方壓制的非人類靈長類動物飲食維持，每日喂養(yǎng)動物兩次。1號動物(缺少CSF采集裝置)通過臨時腰導管腰內注射瑞圖希單抗。如果1號動物耐受瑞圖希單抗，另外3只動物通過皮下進入裝置在側腦室中接受瑞圖希單抗劑量。從第4室Ommaya容器獲得這些動物的樣品，至少一只動物也從腰間隙獲得。在每次CSF樣品采集之前和之后向Ommaya容器泵氣4次，以確保與腦室CSF充分混合。帶有Ommaya容器的兩只動物在腰內施用瑞圖希單抗后也進行第4心室CSF采樣，以估計藥物從腰間隙向心室的分配。在完成藥物動力學研究后，通過每周向三只動物腰內注射劑量6周以上估計鞘內瑞圖希單抗的耐受。
在鞘內或心室內施用可達10mg后，用4只動物研究瑞圖希單抗的CSF藥物動力學。在施用之前和施用瑞圖希單抗0.5、1、2、3、4、6、8、10、24小時后采集CSF樣品(0.3ml)。這些樣品立即在-70℃下冷凍，并凍存于聚丙烯管中。
實施例2在大鼠模型原發(fā)性CNS淋巴瘤的治療中，向腦脊液中施用瑞圖希單抗材料與方法。不荷腫瘤的裸鼠接受通過小腦延髓池穿刺術輸送的劑量升高的抗體，估計其毒性。向大鼠施用5-100μl體積(大鼠的CSF體積約為1ml)的瑞圖希單抗(10mg/ml)。假如沒有毒性，則進行效能研究。將證明抗-CD20敏感的B淋巴瘤細胞植入大鼠的小腦延髓池中。然后將動物分為兩組，每組10只對照和腫瘤植入1周后的瑞圖希單抗治療組。終點是測量神經學性質，體重喪失、存活率和抗淋巴瘤活性的形態(tài)學和組織學相關性。
實施例3人類PCNSL患者中瑞圖希單抗的檢測材料與方法。通過向Ommaya容器中注射5-10ml瑞圖希單抗給藥。注射前，取出相等體積的CSF，使CSF體積的明顯流出量最少(成人中的平均CSF體積為104ml)。不進行其它化學治療或放射治療。治療包括向Ommaya容器中注射體積為5-10ml的瑞圖希單抗。在1、2、4、24、48、72小時和7天時，并在之后以固定間隔測定瑞圖希單抗的CSF和血清水平。
復發(fā)PCNSL患者在病理學分析中肯定為CD20+?；颊弑仨殲?7歲以上，KPS小于50，預期壽命少于2個月，PCNSL累及全身，并且在開始CSF內施用瑞圖希單抗不到5周之前不能接受放射或化學治療。
研究患者分為三組，每組通過Ommaya容器接受一定劑量水平的瑞圖希單抗。一周后，以取決于計算的靈長類動物中清除率的間隔向CSF中重復施用瑞圖希單抗。瑞圖希單抗施用繼續(xù)90天，其間繼續(xù)評價毒性和反應。提前終止歸類為由CSF內施用瑞圖希單抗引起的四級神經毒性。神經毒性是評價安全性和確定研究應當終止還是使用較低劑量的基礎。假如在給定的劑量水平沒有毒性，則將劑量提高到下一水平。目的在于確定安全劑量，對于人類，其達到的CSF中的瑞圖希單抗低谷水平至少10倍于與活性相關的血清低谷水平(McLaughlin等人，J.Clin.Oncol.162825-2833(1998))。
實施例4為了治療PCNSL對人類患者施用瑞圖希單抗與氨甲喋呤的方法累及CNS的淋巴瘤患者能用鞘內氨甲喋呤(15mg)聯(lián)合劑量為250mg/M2每周4次到350mg/M2每周4次的瑞圖希單抗治療。
實施例5用放射性標記的瑞圖希單抗和CHOP治療PCNSL的方法PCNSL患者能用放射性標記的瑞圖希單抗和化學治療組合CHOP(例如環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)如下治療。CHOP治療將按照標準方法靜脈內施用。131-碘標記的瑞圖希單抗以約1-10mCi的劑量對患者鞘內施用，(標記和未標記的)瑞圖希單抗的量為約0.2-40mg/kg患者體重。放射性瑞圖希單抗能在一個大丸劑中或在約2-4天時間內施用。
上述所有參考文獻在此完整引用作為參考。
權利要求
1.一種治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤的方法，包括施用治療有效量的抗-CD20抗體或其片段的步驟。
2.一種治療或預防淋巴瘤患者腦膜復發(fā)的方法，包括施用治療有效量的抗-CD20抗體或其片段的步驟。
3.權利要求1的方法，其中CNS淋巴瘤選自原發(fā)性CNS淋巴瘤(PCNSL)、軟腦膜轉移(LM)或累及CNS的何杰金氏病。
4.權利要求3的方法，其中CNS淋巴瘤是LM，抗-CD20抗體或其片段與阿糖胞苷和硫替哌或氨甲喋呤和111In-二乙烯三胺戊乙酸聯(lián)合施用。
5.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體片段選自Fab、Fab’和F(ab’)2。
6.權利要求2的方法，其中抗-CD20抗體片段選自Fab、Fab’和F(ab’)2。
7.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體是人類抗體、人源化、雙特異性或嵌合抗體。
8.權利要求2的方法，其中抗-CD20抗體是人類抗體、人源化、雙特異性或嵌合抗體。
9.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗或IF5。
10.權利要求2的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗或IF5。
11.權利要求9的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并以每周約10-約375mg/M2共4周的劑量對患者施用。
12.權利要求11的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并以每周約10-約375mg/M2共4周的劑量對患者施用。
13.權利要求1的方法，其中鞘內或心室內施用抗-CD20抗體。
14.權利要求2的方法，其中鞘內或心室內施用抗-CD20抗體。
15.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體與氨甲喋呤、CHOP、CHOD、阿糖胞苷、甲酰四氫葉酸、硫替哌和長春新堿或其組合聯(lián)合施用。
16.權利要求2的方法，其中抗-CD20抗體與氨甲喋呤、CHOP、CHOD、阿糖胞苷、甲酰四氫葉酸、硫替哌和長春新堿或其組合聯(lián)合施用。
17.權利要求1的方法，其中在全腦照射前施用抗-CD20抗體。
18.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并與氨甲喋呤一起鞘內施用。
19.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并且標記抗體。
20.權利要求19的方法，其中瑞圖希單抗用選自211At、212Bi、67Cu、123I、131I、111In、32P、212Pb、186Re、188Re、153Sm、99mTc和90Y的同位素標記并以放射免疫治療有效量施用。
21.權利要求20的方法，其中放射免疫治療有效量對患者全身提供劑量約為10-約200cGy的照射。
22.權利要求21的方法，其中抗-CD20抗體與抗-CD40抗體或抑制CD40與CD40L相互作用的試劑聯(lián)合施用。
23.權利要求22的方法，其中以藥學可接受的抗體劑量施用抗-CD20抗體，約為0.001-約30mg/kg人體重。
24.權利要求23的方法，其中以藥學可接受的抗體劑量施用抗-CD20抗體，約為0.01-約25mg/kg人體重。
25.權利要求24的方法，其中以藥學可接受的抗體劑量施用抗-CD20抗體，約為0.4-約20.0mg/kg人體重。
26.一種診斷患者PCNSL的方法，包括下列步驟(A)對患者施用與可檢測標記物結合的抗-CD20抗體或抗-CD20抗體片段；(B)檢測該標記物的位置。
27.權利要求26的方法，其中可檢測標記物是211At、212Bi、67Cu、123I、131I、111In、32P、212Pb、186Re、188Re、153Sm、99mTc或90Y。
28.權利要求26的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗。
29.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體與血腦屏障(BBB)通透性增強劑連接。
30.權利要求29的方法，其中BBB通透性增強劑是OX-26、B3/25、Tf6/14、OKT-9、L5.1、5E-9、RI7217和T58/30。
31.權利要求1的方法，其中抗-CD20抗體進一步含有親脂性載體或免疫親脂性載體。
32.權利要求31的方法，其中親脂性載體是甲基芐肼、Ω-3脂肪酸、甘油二酯、二酰磷脂、溶血磷脂、膽固醇或類固醇。
33.權利要求1的方法，其進一步包括與抗-CD20抗體或其片段聯(lián)合施用抗-B細胞抗體或其片段的步驟。
34.權利要求33的方法，其中抗-B細胞抗體是抗-CD19抗體或其片段、抗-CD22抗體或其片段、抗-CD38抗體或其片段或抗-主要組織相容性復合物(MHC)II抗體或其片段。
35.一種通過鞘內施用治療CNS淋巴瘤的組合物，其含有抗-CD20抗體和抗-B細胞抗體，其中以約0.4-20.0mg/kg體重的劑量施用該抗體。
36.一種治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤的方法，其包括鞘內施用治療有效量的可與B細胞抗原結合的抗體或其片段。
37.權利要求36的方法，其中所述抗原選自CD10、CD14、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86。
38.權利要求36的方法，其中所述抗體是一種B細胞消耗性抗體。
39.權利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種毒素偶聯(lián)。
40.權利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種藥物偶聯(lián)。
41.權利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種酶偶聯(lián)。
42.權利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種放射性核素偶聯(lián)。
43.權利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與至少一種化療劑聯(lián)合施用。
44.權利要求43的方法，其中所述化療劑選自硫替哌、環(huán)磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、烏瑞替派、六甲蜜胺、曲他胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺、三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、雙氯乙基甲胺、鹽酸氧化雙氯乙基甲胺、美法侖、novembiehin、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加利車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、久莫霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、絳色霉素、鏈脲霉素、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲葉酸、氨甲喋呤、蝶羅呤、三甲曲沙、氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤、環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU、卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄氨、睪內酯、氨魯米特、米托坦、曲洛司坦、frolinic acid、醋葡醛內酯、aldophosphamide糖苷、氨基乙酰丙酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、依達曲沙、defofamine、地美可辛、地吖醌、依氟鳥氨酸、乙酸elliptinium、依托格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌達醇、nitracrine、噴司他丁、phenamet、吡柔比星、podophyllinic acid、2-乙基酰肼、甲基芐肼、丙亞胺、西佐喃、鍺螺胺、細格孢氮雜酸、三亞胺醌、2，2’，2”-三氯三乙胺、烏拉坦、長春地辛、達卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿拉伯糖苷、環(huán)磷酰胺、硫替哌、紫杉醇、紫杉萜(doxetaxel)、苯丁酸氮芥、吉西他濱、6-硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、氨甲喋呤、順鉑、卡鉑、長春堿、鉑、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16)、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞賓、navelbine、三羥基蒽醌、替尼泊甙、柔紅霉素、氨基蝶呤、xeloda、伊拜膦酸鹽、拓撲異構酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(DMFO)、視黃酸、埃斯波霉素、capecitabine、他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone、托瑞米芬、氟他胺、尼魯米特、bicalutamide、亮丙瑞林、戈舍瑞林；和上述任一種的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。
45.權利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段對選自CD19、CD20、CD21、CD22、CD37和CD40的B細胞抗原是特異的。
46.權利要求45的方法，其中所述抗體或抗體片段是RITUXAN，該治療方法還包括細胞因子的施用。
47.權利要求46的方法，其中細胞因子是IL-10。
48.權利要求36的方法，其包括消耗性抗-CD20抗體和CD40L拮抗劑的施用。
49.權利要求48的方法，其中所述CD40L拮抗劑是一種可特異結合CD40L的抗體。
50.權利要求36的方法，其中施用一種放射性標記的抗-CD20抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述了利用抗B－細胞抗體(優(yōu)選地抗－CD20，最優(yōu)選地瑞圖希單抗)治療腦B細胞淋巴瘤，特別是原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)，和預防腦膜復發(fā)的方法。這些抗體能單獨鞘內施用，或與其它化療劑(如氨甲喋呤)或其它抗－B細胞抗體聯(lián)合，治療無免疫應答或有免疫應答的患者的PCNSL。這些抗體也能用于診斷CNS淋巴瘤患者，特別是無免疫應答的患者。
文檔編號A61K51/10GK1437478SQ01809384
公開日2003年8月20日 申請日期2001年4月25日 優(yōu)先權日2000年4月25日
發(fā)明者A·J·格利洛-洛佩茲 申請人:Idec藥物公司