專利名稱：：瑞圖希單抗的鞘內(nèi)施用,用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的治療的制作方法瑞圖希單抗的鞘內(nèi)施用，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的治療本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)?zhí)枮?1809384.1，申請(qǐng)日為2001年4月25日，發(fā)明名稱為"瑞圖希單抗的鞘內(nèi)施用，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的治療"的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用該申請(qǐng)要求對(duì)2000年4月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)系列號(hào)60/199,365的優(yōu)先權(quán)，在此引用作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明描述了利用抗B細(xì)胞耙標(biāo)抗體(例如抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40或抗-CD37抗體，優(yōu)選地抗-CD20抗體，更加優(yōu)選地瑞圖希單抗(Rituximab))治療和/或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤和預(yù)防腦膜復(fù)發(fā)的方法。這些抗-B細(xì)胞抗體能單獨(dú)使用，或與其它抗體(例如，參與B細(xì)胞激活的T細(xì)胞的抗體，如抗-CD40L)或其它治療(例如化學(xué)治療或放射治療)聯(lián)合使用。發(fā)明背景I.抗-CD20抗體CD20是在90。/。以上的B細(xì)胞淋巴瘤上表達(dá)的一種細(xì)胞表面抗原，它在肺瘤細(xì)胞中不釋放或調(diào)節(jié)(McLaughlin等人，J.Clin.Oncol.16:2825-2833(1998b))。已經(jīng)制備了抗-CD20抗體用于研究和治療.一種抗-CD20抗體是單克隆Bl抗體(美國(guó)專利號(hào)5,843,398).抗-CD20抗體也已經(jīng)制備為放射性核素的形式用于治療B細(xì)胞淋巴瘤(例如，^I-標(biāo)記的抗-CD20抗體)，以及"Sr-標(biāo)記的形式用于緩解前列腺癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移引起的骨痛(Endo，GanTOKagakuRyoho26:744-748(1999))。曾報(bào)道通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸液對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤患者施用一種鼠單克隆抗體——1F5(—種抗-CD20抗體).然而，據(jù)報(bào)道消除循環(huán)胂瘤細(xì)胞需要極高水平(>2克)的1F5，結(jié)果描述為"短暫的，，(Press等人，Blood69:584-591(1987))。在治療中使用單克隆抗體的一個(gè)可能的問(wèn)題是，非人類單克隆抗體(例如鼠單克隆抗體)一般缺乏人類效應(yīng)物功能，例如，它們不能介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的裂解，或通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒性或Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用裂解人類靶細(xì)胞。此外，非人類單克隆抗體能被人類宿主作為外源蛋白質(zhì)識(shí)別；因此，重復(fù)注射這類外源抗體能誘發(fā)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致有害的過(guò)敏反應(yīng)。對(duì)于基于鼠的單克隆抗體，通常稱為人抗小鼠抗體應(yīng)答，或"HAMA，，應(yīng)答。另外，這些"外源，，抗體能遭到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，使得它們實(shí)際上在到達(dá)靶部位之前即已被中和。A.瑞圖希單抗瑞圖希單抗(也稱為Rituxan⑧、MabThera⑧和IDEC-C2B8)是第一種獲得FDA批準(zhǔn)的單克隆抗體，由IDECPharmaceuticals研制(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,843,439;5，776，456和5，736，137)。瑞圖希單抗是一種嵌合的抗-CD20單克隆抗體(MAb),推薦用于治療輕度或?yàn)V泡性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(McLaughin等人，Oncology(Huntingt)12:17631777(1998a);Leget等人，Curr.Opin.Oncol.10:548-551(1998))。在歐洲，瑞圖希單抗已獲準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)的1II/IV期濾泡性淋巴瘤(White等人，Pharm.Sci.Technol.Today2:95-101(1999))可用瑞圖希單抗治療的其它疾病包括濾泡性中樞細(xì)胞淋巴瘤(FCC)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL/CLL)(Nguyen等人，1999)。在I期和II期臨床研究中，瑞圖希單抗已經(jīng)顯示對(duì)輕度非何杰金氏淋巴瘤(NHL)有最小的毒性和明顯的治療活性(Berinstein等人，Ann.Oncol.9:995-1001(1998))。瑞圖希單抗單獨(dú)用于治療B細(xì)胞NHL，對(duì)于復(fù)發(fā)的或頑固性輕度或?yàn)V泡性NHL，劑量一般為每周375mg/M2，4周，它被很好地耐受，具有明顯的臨床活性(Piro等人，Ann.Oncol.10:655-61(1999);Nguyen等人，Eur.J.Haematol.62:76-82(1999);Coiffier等人，Blood92:1927-1932(1998))。然而，在使用抗體的試驗(yàn)中也施用了高達(dá)4周500mg/M2的劑量(Maloney等人，Blood90:2188-2195(1997))。瑞圖希單抗也曾與化療劑如CHOP(例如，環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)聯(lián)合，用于治療輕度或?yàn)V泡性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤患者(Czuczman等人，J.Clin.Oncol.17:268-76(1999)和McLaughlin等人，Oncology(Himtingt)12:1763-1777(1998))。II.CD40和CD40LCD40在成熟B細(xì)胞表面以及白血病和淋巴B細(xì)胞和何杰金氏病(HD)的何杰金氏和里-斯(RS)細(xì)胞上表達(dá)(Valle等人，Eur.丄Immunol.19:1463-1467(1989);Gruss等人，Leuk.Lymphoma24:393-422(1997))。CD40是一種B細(xì)胞受體，可導(dǎo)致正常和惡性B細(xì)胞的激活和存活，如非何杰金氏濾泡性淋巴瘤(Johnson等人，Blood82:1848-1857(1993))。通過(guò)CD40受體的信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)未成熟的B細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤免于IgM-或fas-誘導(dǎo)的凋亡(Wang等人，J.Immunol.155:3722-5(1995))。類似地，套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞也含有高水平的CD40,加入外源CD40L提高了它們的存活率，使它們免于氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)的凋亡(Clodi等人，Brit.J.Haematol.103:217-9(1998))。相反，其他人報(bào)道，CD40刺激可抑制肺瘤B細(xì)胞的體外(Funakoshi等人，Blood83:2787-2794(1994))和體內(nèi)(Murphy等人，Blood86:1946-1953(1995))生長(zhǎng)。對(duì)小鼠施用的抗-CD40抗體據(jù)說(shuō)提高了荷有人B細(xì)胞淋巴瘤的小鼠的存活率(Funakoshi等人，(1994);Tutt等人，J.Immunol.161:3176-3185(1998))。美國(guó)專利號(hào)5，674，492(1997)和國(guó)際PCT申請(qǐng)WO95/17202中描述了利用抗-CD40抗體抑制CD40-CD40L相互作用治療肘瘤(包括B細(xì)胞淋巴瘤和EBV-誘發(fā)的淋巴瘤)的方法，在此引用作為參考。CD40信號(hào)據(jù)報(bào)道也與CD20的協(xié)同作用相關(guān)(Ledbetter等人，Circ.Shock44:67-72(1994))。描述抗-CD40抗體的制備和應(yīng)用的其它參考文獻(xiàn)包括美國(guó)專利號(hào)5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)和5，674，492(1997),在此引用作為參考。gp39(也稱為CD40配體或CD40L)是一種CD40配體，在激活而不是靜止的CD4+Th細(xì)胞上表達(dá)(Spriggs等人，J.Exp.Med.176:1543-1550(1992);Lane等人，Eur.J.Immunol.22:2573-2578(1992);Roy等人，J.Immunol.151:1-14(1993))。CD40和CD40L都已經(jīng)克隆并表征(Stamenkovi等人，EMBOJ.8:1403-1410(1989);Armitage等人，Nature357:80-82(1992);Lederman等人，J.Exp.Med.175:1091-1101(1992);Hollenbaugh等人，EMBOJ.11:4313-4321(1992))。用CD40L基因轉(zhuǎn)染并在其表面上表達(dá)CD40L蛋白的細(xì)胞能觸發(fā)B細(xì)胞增殖，與其它刺激信號(hào)一起能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生(Armitage等人，(1992))。在何杰金氏病中，CD40L可能在肺瘤濾泡或里-斯細(xì)胞(CD40+)內(nèi)肺瘤B細(xì)胞(CD40+)的細(xì)胞接觸依賴的相互作用中起作用(Carbone等人，Am.J.Pathol.147:912-22(1995))?？?CD40L單克隆抗體已經(jīng)有效地用于抑制LP-BM5-感染小鼠中鼠AIDS(MAIDS)的誘導(dǎo)(Green等人，Virology241:260-268(1998))。如美國(guó)專利號(hào)5，874，082(1999)所述，也已經(jīng)制備抗-CD40抗體，用以預(yù)防或治療抗體介導(dǎo)的疾病，如變態(tài)反應(yīng)和自身免疫病。據(jù)報(bào)道，抗-CD40抗體曾經(jīng)與抗-CD20抗體聯(lián)合使用，在抑制細(xì)胞培養(yǎng)中非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤的生長(zhǎng)中產(chǎn)生加成作用(Benoit等人，(1996)Immunopharmacology35:129-139(1996))。小鼠體內(nèi)研究證實(shí)，在提高荷有某些但不是全部淋巴瘤系的小鼠的存活率方面，抗-CD20抗體比個(gè)別施用的抗-CD40更有效(Funakoshi等人，J.Immunother.EmphasisTumorImmunol.19:93-101(1996))。抗-CD19在對(duì)兩種同系小鼠B細(xì)胞淋巴瘤——BCL1和A31——的治療中也在體內(nèi)有效(Tutt等人，(1998))。曾經(jīng)描述了抗-CD40L抗體用于治療與B細(xì)胞激活有關(guān)的疾病(歐洲專利號(hào)555,880(1993))?？?CD40L抗體包括如美國(guó)專利號(hào)5，747，037(1998)所述的單克隆抗體3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79,和美國(guó)專利號(hào)5,876,718(1999)描述的用于治療移植物抗宿主疾病的抗-CD40L抗體。III.中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥及其治療A.原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)定義為限于腦和腦干的淋巴瘤，不含全身性疾病。該術(shù)語(yǔ)適用于起源于并局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。過(guò)去，這種腫瘤也被稱為小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤或血管周圍肉瘤。然而到今天，其淋巴來(lái)源已經(jīng)明確。PCNSL以前是一種罕見(jiàn)的肺瘤，只占全部顱內(nèi)腫瘤的0.5-1.2%，通常與先天性、獲得性或醫(yī)源性免疫缺陷狀態(tài)有關(guān)，如威斯科特-奧爾德里奇綜合征或腎移植引起的免疫抑制。據(jù)報(bào)道，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者的PCNSL發(fā)病率最高，為1.9-6%(DeAngelis等人，"原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，，，《癌癥腫瘤學(xué)原理與實(shí)踐》2233-2242(DeVita等人編寫，1997))。然而，在有免疫應(yīng)答的患者中PCNSL的發(fā)病率提高。AIDS患者中可發(fā)生全身性和原發(fā)性CNS非何杰金氏淋巴瘤(Kramer等人，Cancer80:2469-2477(1997))。而且，AIDS與非AIDS患者之間的PCNSL臨床、診斷和預(yù)后也有較大差別(Fine等人，Ann.Intern.Med.119:1093-1104(1993))。HIV相關(guān)的PCNSL是一種侵襲性非何杰金氏淋巴瘤(NHL),只限于CNS內(nèi)。大多數(shù)HIV相關(guān)的PCNSL在組織學(xué)上分類為B細(xì)胞來(lái)源的彌漫性、大細(xì)胞或大細(xì)胞免疫母細(xì)胞淋巴瘤。另外，PCNSL的來(lái)源仍有爭(zhēng)議，問(wèn)題在于它是起因于浸潤(rùn)性非惡性淋巴細(xì)胞的煩內(nèi)轉(zhuǎn)化，還是外周腫瘤細(xì)胞遷移到CNS內(nèi)并只在其中結(jié)合(Moses等人，1999)PCNSL的最佳治療尚未確定(Reni等人，Aim.Oncol.8:227-234(1997);Lesser等人，CancerTreat.Rev.19:261-281(1993))。起因于AIDS并發(fā)癥的PCNSL由于其位置和多病灶性通常不能外科切除。典型治療是顱腦照射，包括劑量為4000-5000cGy的外部波束(externalbeam)放射治療。盡管臨床和放射顯影改善迅速，但存活期中位數(shù)只是2-5個(gè)月。也曾經(jīng)使用全腦照射和佐劑化學(xué)治療，包括照射前CHOP(例如，環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)和照射后阿糖胞苷，然而，許多患者仍然死亡(O，Neill等人，Int，IJ.RadiationOncol.Biol.Phys.33:663-673(1995))。據(jù)報(bào)道，聯(lián)合使用阿糖胞苷(例如ARA-C)、氨甲喋呤和顱腦放射治療比單獨(dú)的放射治療更加有效(Abrey等人，J.Clin.Oncol.16:859-63(1998))。據(jù)報(bào)道，高劑量氨甲喋呤、甲酰四氳葉酸、硫替哌、長(zhǎng)春新堿和地塞米松的組合也可有效地治療有免疫應(yīng)答的患者(Sandor等人，J.Clin.Oncol.16:3000-3006(1998))。據(jù)報(bào)道，使用Ommaya容器組合施用氨甲喋呤和阿糖胞苷可有效治療涉及CNS的復(fù)合性眼內(nèi)淋巴瘤(Valluri等人，Retina15:125-9(1995));對(duì)這種眼內(nèi)淋巴瘤的新治療方法是有效的，因?yàn)?0%的PCNSL患者累及眼睛(Monjour等人，Rev.Neurol.(巴黎)148:589-600(1992))。遺憾的是，據(jù)報(bào)道這種加強(qiáng)治療由于醫(yī)源性腦白質(zhì)病導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知缺陷?；仡檾?shù)據(jù)提示，在放射治療之前應(yīng)用化學(xué)治療時(shí)發(fā)生癡呆的危險(xiǎn)提高(Fine等人，AnnalsIntern.Med.119:1093-1104(1993)和Blay等人，J.Clin.Oncol.16:864-871(1998))。其它研究提議單獨(dú)用化學(xué)療法治療PCNSL。據(jù)說(shuō)應(yīng)用提高化療劑通過(guò)血-腦屏障通透性的藥劑，能提高化學(xué)治療的效果(Cheng等人，Cancer82:1946-51(1998))。但是，盡管有這些治療選擇，存活期中位數(shù)仍固定在約40個(gè)月(Abrey等人，J.Clin.One.16:859-863(1998))。而且，這些治療可能導(dǎo)致延遲性神經(jīng)毒性的明確、固定的危險(xiǎn)，這在100%的60歲以上患者中十分嚴(yán)重(Abrey等人，"原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的聯(lián)合化學(xué)治療，，(摘要)Proc.Am.Soc.Clin.One.(1999))。累及CNS也使5-29%的全身性NHL病例變復(fù)雜，與極嚴(yán)重的預(yù)后相關(guān)(Fine等人，Ann.Intern.Med.119:1093-1104(1993);vanBesien等人，Blood91:1178-1184(1998))。B.其它CNS癌癥及其治療其它CNS癌癥包括NHL向腦的轉(zhuǎn)移，如軟腦膜轉(zhuǎn)移(LM)。曾經(jīng)用Ommaya內(nèi)注射氨甲喋呤和m銦-二乙撐三胺五乙酸(mIn-DTPA)治療LM，獲得不同的結(jié)果(Mason等人，Neurology50:438-444(1998))。也曾經(jīng)用阿糖胞苷和硫替派聯(lián)合照射治療LM(Schabet等人，Nervenarzt63:317-27(1992))。在IV期何杰金氏病(HD)患者中也診斷有LM;據(jù)報(bào)道用全腦照射和鞘內(nèi)施用氨甲喋呤能成功治療這些患者(Orlowski等人，Cancer53:1833-1835(1984))。當(dāng)前對(duì)原發(fā)性腦瘤、腦轉(zhuǎn)移和軟腦膜癌擴(kuò)散的治療，包括使用單克隆抗體，是不夠的，或者具有很差的治療活性。已經(jīng)提出將單克隆抗體與蛋白質(zhì)毒素連接作為治療CNS癌癥的藥物(Youle，Semin.CancerBiol.7:65-70(1996))。例如，曾報(bào)道在LM動(dòng)物模型中使用免疫毒素，如抗-CD7篦麻毒素A鏈(DA7)(Herrlinger等人，J.Neurooncol.40:1-9(1998))。據(jù)報(bào)道曾經(jīng)用LMB-7(由鼠單克隆抗體B3和截短的假單胞菌外毒素PE38構(gòu)建的一種單鏈免疫毒素)治療小鼠模型的肺瘤性腦膜炎(Pastan等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA92:2765-2769(1995))。IV.藥物向腦的輸送為了治療任何類型的腦瘤向腦部輸送治療劑由于血-腦屏障(BBB)而成為一個(gè)障礙。治療腦癌的方法包括(l)可能時(shí)采用外科手段；(2)全腦放射治療；(3)在有免疫應(yīng)答的患者中使用皮質(zhì)類固醇；(4)能穿過(guò)BBB的化學(xué)治療?；焺┑氖┯每梢杂萌魏屋斠和緩?，如腦間質(zhì)輸液(Shin等人，J.Neurosurg.82:1021-1029(1995))或鞘內(nèi)施用。也設(shè)計(jì)了滲透BBB破壞方法用來(lái)治療腦內(nèi)腫瘤(Kroll等人，Neurosurgery42:1083-99(1998))。也研制了能穿過(guò)BBB的其它藥劑。例如，親脂性輸送載體(例如甲基千肼)以及高劑量CNS穿透劑(例如高劑量的氨甲喋呤)推薦用于治療PCNSL(DeAngelis等人，1997)。最近，提出使用單克隆抗體OX26靶向腦癌，它允許通過(guò)大鼠BBB進(jìn)行載體介導(dǎo)的藥物輸送(Partridge等人，Pharm.Res.15:576-82(1998))。據(jù)報(bào)道，OX26MAb能用于向腦部輸送偶聯(lián)的肽放射性藥物(Deguchi等人，Bioconjug.Chem.10:32-37(1999))。據(jù)報(bào)道也制備了其它單克隆抗體作為腦部藥物輸送載體，它們針對(duì)含有體內(nèi)BBB的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮上的細(xì)胞表面受體(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或胰島素受體)(Wu等人，Drug.Metabl.Dispos.26:937-9(1998))。也制備了免疫脂質(zhì)體(抗體定向的脂質(zhì)體)，據(jù)說(shuō)它能向大鼠腦中輸送抗腫瘤劑柔紅霉素(Huwyler等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA93:14164-14169(1996))。也描述了生物分子親脂性復(fù)合物，據(jù)說(shuō)它們能向哺乳動(dòng)物腦中輸送活性劑(美國(guó)專利號(hào)5，716，614)。因此，由于不能施行以前文獻(xiàn)中所報(bào)道的，需要改進(jìn)對(duì)PCNSL和其它B細(xì)胞腦淋巴瘤的診斷和治療。而且，據(jù)發(fā)明者所知，還沒(méi)有人提出單獨(dú)鞘內(nèi)施用抗-CD20抗體或與其它抗癌劑或抗體(例如，抗-CD40或抗-CD40L抗體)聯(lián)合，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤和腦膜復(fù)發(fā)。發(fā)明目的與概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種治療或預(yù)防淋巴瘤患者腦膜復(fù)發(fā)的方法，包括施用治療有效量的B細(xì)胞靶標(biāo)抗體(例如抗-CD22、抗-CD21、抗-CD23、抗-CD37、抗-CD40、抗-CD20抗體或其片段)的步驟。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤的方法，包括施用治療有效量的B細(xì)胞抗體或影響B(tài)細(xì)胞激活的抗體(例如抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40、抗-CD40L或抗-CD20抗體或其片段)的步驟?？梢灾委煹腃NS淋巴瘤包括原發(fā)性CNS淋巴瘤(PCNSL)、軟腦膜轉(zhuǎn)移(LM)或累及CNS的何杰金氏病。本發(fā)明的一個(gè)特殊目的在于使用抗-B細(xì)胞抗體(它是人類抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或嵌合抗體)治療CNS淋巴瘤。例如，抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40或抗-CD40L抗體片段，如Fab、Fab，和F(ab，)2也計(jì)劃用于治療CNS淋巴瘤。本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的目的在于使用瑞圖希單抗作為抗-CD20抗體治療CNS淋巴瘤。該抗-CD20抗體優(yōu)選地能以每周約10-375mg/M2的劑量心室內(nèi)或鞘內(nèi)施用4周。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于與下列任一種或多種物質(zhì)聯(lián)合施用抗-CD20抗體治療CNS淋巴瘤(1)抗-CD40抗體或另一種B細(xì)胞結(jié)合抗體，(2)CD40L拮抗劑，(3)化療劑，和/或(4)抗-B細(xì)胞抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于將抗-B細(xì)胞抗體(例如抗-CD20抗體或下文所述其它B細(xì)胞靶標(biāo)的抗體)與放射性同位素連接，用于CNS淋巴瘤的治療或診斷?？?CD20抗體或另一種抗-B細(xì)胞抗體能與211At、212Bi、67Cn、123I、131I、mIn、32P、212Pb、186Re、18SRe、153Sm、99mTc或9()Y連接，如果為了治療目的施用，對(duì)患者施用放射免疫治療有效的量。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于一種診斷患者的CNS淋巴瘤(如PCNSL)的方法，包括下列步驟(A)對(duì)患者施用與可檢測(cè)標(biāo)記物結(jié)合的B細(xì)胞抗體、抗-CD20抗體或抗-CD20抗體片段；(B)檢測(cè)該標(biāo)記物的位置。為治療CNS淋巴瘤施用的組合物能與血-腦屏障(BBB)通透增強(qiáng)劑聯(lián)合或連接。發(fā)明詳述I.定義"CNS淋巴瘤"是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的任何B細(xì)胞淋巴瘤。包括何杰金氏病(ND)淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、軟腦膜轉(zhuǎn)移和原發(fā)性CNS淋巴瘤("PCNSL")。在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指完整的抗體及其Fab片段、Fv、scFv和F(ab)2片段。完整抗體包括單克隆抗體，如鼠單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、靈長(zhǎng)類動(dòng)物化(primatized)抗體、人源化抗體和人類抗體。抗體的生產(chǎn)和完整抗體、Fab片段和F(ab)2片段的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及編碼這些分子的基因序列的組構(gòu)眾所周知，例如在Harlow等人，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(198S)中描述，在此引用作為參考?？贵w(例如抗-CD20抗體、抗-B細(xì)胞抗體等)可以是免疫毒素或雙特異性抗體形式中的完整抗體或片段。"抗-CD40抗體"包括免疫球蛋白及其片段，它們對(duì)CD40蛋白或其肽或CD40融合蛋白有特異反應(yīng)性?？?CD40抗體包括人類抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體和人源化抗體。"B細(xì)胞表面標(biāo)志"或"B細(xì)胞靶標(biāo)"或"B細(xì)胞抗原"是指B細(xì)胞表面表達(dá)的一種抗原，它針對(duì)與之結(jié)合的拮抗劑。代表性B細(xì)胞表面標(biāo)志包括CDIO、CD14、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白細(xì)胞表面標(biāo)志。與哺乳動(dòng)物的其它非B細(xì)胞組織相比，特別重要的B細(xì)胞表面標(biāo)志在B細(xì)胞上優(yōu)先表達(dá)，并且可以在前體B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞上表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞標(biāo)志使用CD19、CD20或CD22,在譜系由干細(xì)胞階段分化直到最終分化為漿細(xì)胞之前的整個(gè)過(guò)程中存在于B細(xì)胞上。最優(yōu)選的B細(xì)胞標(biāo)志是CD20。"B細(xì)胞抗體"是特異結(jié)合B細(xì)胞上抗原(如下文所述)的抗體。"B細(xì)胞拮抗劑"是指一種分子，它在與B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合后，例如通過(guò)降低或防止B細(xì)胞引發(fā)的體液反應(yīng)，破壞或消耗哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞，和/或干擾一種或多種B細(xì)胞功能。拮抗劑優(yōu)選地能消耗用它治療的哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。這種消耗可通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC),B細(xì)胞增殖的抑制和/或B細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)(例如通過(guò)凋亡)。本發(fā)明范圍內(nèi)包括的拮抗劑包括能與B細(xì)胞標(biāo)志結(jié)合的抗體、合成或天然序列肽和小分子拮抗劑，任選地與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)或融合。優(yōu)選的拮抗劑包括抗體，更優(yōu)選地是B細(xì)胞消耗性抗體。"抗-CD40L抗體"包括免疫球蛋白及其片段，它們對(duì)CD40L蛋白或及肽或CD40L融合蛋白有特異反應(yīng)性?？?CD40L抗體包括人類抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體和人源化抗體。"抗-CD20抗體"包括免疫球蛋白及其片段，它們對(duì)CD20或其肽有特異反應(yīng)性?？?CD20抗體包括人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體和雙特異性或三特異性抗體。一種優(yōu)選的抗-CD20抗體是瑞圖希單抗。"B細(xì)胞消耗性抗體"是指任何抗體(包括嵌合和人源化抗體)或其片段或含有它們的免疫毒素，當(dāng)治療施用時(shí)，它能消耗施用抗體的患者的B細(xì)胞數(shù)量。這類B細(xì)胞消耗性抗體包括但不限于能結(jié)合上述任何B細(xì)胞抗原的抗體，優(yōu)選地包括抗-CD20抗體、抗-CD19抗體、抗-CD22抗體、抗-CD38抗體(例如OKT10抗體，參見(jiàn)，F(xiàn)lavell等人，Int.J.Cancer62:337-44(1995))和抗主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II抗體(參見(jiàn)Illidge等人，Blood94:233-43(1999))。B細(xì)胞消耗性抗體優(yōu)選地是抗-CD20抗體。B細(xì)胞消耗性抗體可以是與治療用同位素連接的放射性形式，與毒劑連接的免疫毒素，完整抗體或其片段(例如Fab，)，以及B細(xì)胞消耗性抗體的嵌合抗體和人源化抗體。"抗-CD19抗體"是指可識(shí)別并結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)的CD19抗原的任何抗體或其片段或免疫毒素。優(yōu)選的抗-CD19抗體能治療性消耗患者的B細(xì)胞或影響B(tài)細(xì)胞，使其對(duì)其它試劑更敏感或減少細(xì)胞的壽命。特異性抗-CD19抗體包括但不限于單克隆抗體HD37(參見(jiàn)Ghetie等人，Clin.CancerRes.5:3920-7(1999))、單克隆抗體B43或其衍生的單鏈Fv(VFS191)(Li等人，CancerImmunol.Immunother.47:121-30(1998))、單克隆鼠抗體HD37(Stone等人，Blood88:1188-97(1996))和單鏈Fv(scFv)抗體片段FVS192(Bejcek等人，CancerRes.55:2346-51(1995))。"抗-CD22抗體，，是指可識(shí)別并結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)的CD22抗原的任何抗體或其片段或免疫毒素。優(yōu)選的抗-CD22抗體能治療性消耗患者的B細(xì)胞或影響B(tài)細(xì)胞，使其對(duì)其它試劑更敏感或減少細(xì)胞的壽命。特異性抗-CD22抗體包括但不限于人源化抗-CD22抗體hLL2(Behr等人，Clin.CancerRes.5:3304s-14s(1999))、單克隆抗體OM124(Bolognesi等人，Br.J.Haematol.101:179-88(1998))和抗畫CD22IgGi抗體RFB4及其免疫毒素(Mansfield等人，Bioconjug.Chem.7:557-63(1996))。"雙特異性抗體"是指一種抗體分子，它含有一個(gè)對(duì)一種抗原特異的抗原結(jié)合部位，和對(duì)另一種抗原特異的另一個(gè)抗原結(jié)合部位。"抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"是指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，隨后導(dǎo)致耙細(xì)胞裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞——NK細(xì)胞只表達(dá)FcyRIII,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIIL造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)總結(jié)于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464頁(yè)的表3中。為了估計(jì)目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定，如美國(guó)專利號(hào)5,500,362或5，821，337所述?？捎糜谶@種測(cè)定的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。此外，也可在體內(nèi)估測(cè)目的分子的ADCC活性，例如使用動(dòng)物模型，如Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)所公開(kāi)的。"人效應(yīng)細(xì)胞，，是表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)細(xì)胞功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，這些細(xì)胞至少表達(dá)FcyRIII，并行使ADCC效應(yīng)細(xì)胞功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；PBMC和NK細(xì)胞是優(yōu)選的。術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FCR"用于描述可與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是一種天然序列人FcR。而且，一種優(yōu)選的FcR可結(jié)合IgG抗體(一種y受體)，包括FcyRl、FcyRII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和其它剪接形式。FqrRII受體包括FcyRIIA(—種"激活受體"和)和FcyRIIB(—種"抑制受體，，)，它們具有類似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于胞質(zhì)域。激活受體FqrRIIA在胞質(zhì)域含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體F(7RIIB在胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn)Dae醒，Aimu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991);Capel等人，Immunomethods4:25-34(1994);deHass等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)綜述了FcR。此處的術(shù)語(yǔ)"FCR"包括其它FcR，包括將來(lái)鑒定的。該術(shù)語(yǔ)也包括新生受體FcRn,它負(fù)責(zé)母親IgG向胎兒的轉(zhuǎn)移(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。"補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性"或"CDC，，是指一種分子在補(bǔ)體存在下裂解靶標(biāo)的能力。補(bǔ)體系統(tǒng)的第一種成分(Clq)結(jié)合與同源抗原復(fù)合的分子(例如抗體)，起始補(bǔ)體激活途徑。為了估計(jì)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測(cè)定，如Gazzano國(guó)Santoro等人，J.Immunol.Methods202:163(1996)所述。"生長(zhǎng)抑制"拮抗劑可阻止或降低表達(dá)一種可與拮抗劑結(jié)合的抗原的細(xì)胞增殖。例如，拮抗劑可以阻止或降低B細(xì)胞的體外和/或體內(nèi)增殖。"誘導(dǎo)凋亡"的拮抗劑可誘導(dǎo)例如B細(xì)胞的程序性死亡，這可用標(biāo)準(zhǔn)凋亡試驗(yàn)測(cè)定，如膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，DNA的破碎，細(xì)胞收縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞破碎，和/或膜泡的形成(稱為凋亡體)。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段；疊抗；線性抗體；單鏈抗體分子；由抗體片段形成的多特異性抗體。"天然抗體"通常是約150000道爾頓的異四聚體糖蛋白，它由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與一條重鏈連接，而在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間，二硫鍵數(shù)量不同。每條重鏈和輕鏈也含有一定間距的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端含有一個(gè)可變域(VH)，隨后是許多恒定域。每條輕鏈在一端含有一個(gè)可變域(VL),在另一端含有一個(gè)恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的恒定域?qū)?zhǔn)，輕鏈的可變域與重鏈的可變域?qū)?zhǔn)。認(rèn)為特定氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成一個(gè)界面。術(shù)語(yǔ)"可變"是指抗體之間可變域的某些部分的序列廣泛不同，用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性在抗體的整個(gè)可變域中并非平等分布。它集中于輕鏈和重鏈可變域中被稱為超變區(qū)的三個(gè)片段中?？勺冇虻母痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域每個(gè)含有4個(gè)FR，大多采用P-折疊構(gòu)型，通過(guò)三個(gè)超變區(qū)連接，形成與P折疊結(jié)構(gòu)連接的環(huán)，有時(shí)形成P折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的超變區(qū)通過(guò)FR與另一個(gè)鏈的超變區(qū)緊密鄰接在一起，有助于形成抗體的抗原結(jié)合部位(參見(jiàn)Kabat等人，《具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列》〉，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示不同的效應(yīng)物功能，如抗體參與抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩條相同的抗原結(jié)合片段(稱為"Fab"片段，每條含有一個(gè)抗原結(jié)合部位)，和剩余的"Fc"片段，該名稱反映它容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab，)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，仍能交聯(lián)抗原。"Fv"是含有完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。該區(qū)域包含緊密非共價(jià)結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變域的二聚體。該構(gòu)型中每個(gè)可變域的三個(gè)超變區(qū)相互作用，在VH-HL二聚體表面上確定了一個(gè)抗原結(jié)合部位。概括起來(lái)，六個(gè)超變區(qū)為抗體提供抗原結(jié)合特異性。然而，甚至一個(gè)可變域(或者只含抗原特異的三個(gè)超變區(qū)的Fv的一半)也具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合部位。Fab片段也含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一個(gè)恒定域(CHI)。Fab，片段不同于Fab片段，在重鏈CHI域的羧基端添加了一個(gè)新殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab，-SH是此處對(duì)恒定區(qū)的半胱氨酸殘基含有至少一個(gè)游離巰基的Fab，的命名。F(ab，)2抗體片段最初作為Fab，片段對(duì)產(chǎn)生，在片段之間含有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也周知。來(lái)自任何脊推動(dòng)物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"，根據(jù)恒定域的氨基酸序列，能夠歸類為兩種截然不同的類型之一，稱為kappa(K)和lambda(1)。根據(jù)重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體能被歸為不同的類型。完整的抗體有5個(gè)主要類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中幾種可以進(jìn)一步分為亞型(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同抗體類型的重鏈恒定域分別被稱為a、8、￡、y和ji。不同類型免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型眾所周知。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段含有抗體的VH和VL域，其中這些域存在于多肽單鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽在VH和VL域之間還含有一個(gè)多肽接頭，它使scFv能形成抗原結(jié)合所希望的結(jié)構(gòu)。scFv的綜述參見(jiàn)Pluckthun的《單克隆抗體藥理學(xué)》，第113巻，Rosenburg和Moore編寫，Springer-Verlag,紐約，269-315(1994)。術(shù)語(yǔ)"疊抗(diabody)"是指含有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的小抗體片段，該片段在同一多肽鏈(VH-VL)中含有一個(gè)與輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)。利用一個(gè)因太短而不能使同一條鏈上的兩個(gè)域配對(duì)的接頭，使該域與另一條鏈的互補(bǔ)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合部位。例如在EP404,097;WO93/11161和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卯:6444-6448(1993)中詳述了疊抗。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，在此使用時(shí)是指從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，即該群體的抗體除了可能較少出現(xiàn)的自然發(fā)生的突變之外相同單克隆抗體高度特異，針對(duì)一個(gè)抗原部位。而且，與一般包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品不同，每種單克隆抗體只針對(duì)抗原上的一種決定簇。除了特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)合成，不被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)"單克隆"是指抗體從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的特征，不應(yīng)視為需要用任何特殊方法產(chǎn)生。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以利用Kohler等人，Nature256:495(1975)第一次描述的雜交瘤法制備，或者可以利用重組DNA方法制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。"單克隆抗體"也可以利用如Clackson等人，Nature352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離。此處的單克隆抗體具體包括"嵌合，，抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)自特定種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與來(lái)自另一個(gè)種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，以及這些抗體的片段，只要它們顯示希望的生物活性(美國(guó)專利號(hào)4，816，567;Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。此處的目的嵌合抗體包括"靈長(zhǎng)類動(dòng)物化，，抗體，其含有來(lái)自非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如OldWorld猴，如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(美國(guó)專利號(hào)5,693,780)。非人類(例如鼠)抗體的"人源化，，形式是含有來(lái)自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體超變區(qū)的殘基被替換為來(lái)自非人類物種(如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的超變區(qū)的殘基(供體抗體)，具有希望的特異性、親和力和能力。有時(shí)，人類免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被替換為相應(yīng)的非人類殘基。此外，人源化抗體還可含有在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。為了進(jìn)一步精修抗體的性能進(jìn)行這些修飾?？傊?，人源化抗體含有基本上所有或至少一個(gè)，一般兩個(gè)可變域，其中所有或基本上所有超變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人類免疫球蛋白的超變環(huán)，所有或基本上所有FR具有人類免疫球蛋白序列。人源化抗體任選地也至少含有免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，一般是人類免疫球蛋白的。進(jìn)一步的詳述參見(jiàn)Jones等人，Nature321:522-525(1986);Riechmami等人，Nature332:323-329(1988);Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。術(shù)語(yǔ)"超變區(qū)，，在此使用時(shí)是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。超變區(qū)含有來(lái)自"補(bǔ)體決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域的殘基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變域的31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人，《具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列》，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))和/或來(lái)自"超變環(huán)"的殘基(例如輕鏈可變域的殘基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96()，和重鏈可變域的26-32(HI)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:卯1畫917(1987))。"構(gòu)架區(qū)，，或"FR"殘基是不同于此處所述超變區(qū)殘基的可變域殘基。"可結(jié)合"目的抗原(如B細(xì)胞表面標(biāo)志)的拮抗劑能夠以足夠的親和力和/或親合力結(jié)合該抗原，使得該拮抗劑可用作針對(duì)表達(dá)該抗原的細(xì)胞的治療劑。可結(jié)合CD20抗原的抗體的例子包括"C2B8",現(xiàn)在稱為"瑞圖希單抗"("RITUXAN")(美國(guó)專利號(hào)5,736,137,在此引用作為參考)；釔-[90標(biāo)記的2138鼠抗體，命名為"Y2B8"(美國(guó)專利號(hào)5,736,137,在此引用作為參考)；任選地用1311標(biāo)記的鼠IgG2a"131"，產(chǎn)生"1311-B1，，抗體(BEXXARTM)(美國(guó)專利號(hào)5，595，721，在此引用作為參考)；鼠單克隆抗體"1F5"(Press等人，Blood69(2):584-591(1987));"嵌合2H7"抗體(美國(guó)專利號(hào)5，677，180，在此引用作為參考)；可從國(guó)際白細(xì)胞分型會(huì)獲得的單克隆抗體L27、G28-2、93-1133、B-C1或NU-B2(Valentine等人，《白細(xì)胞分型III》，McMichael編寫，第440頁(yè)，牛津大學(xué)出版社(1987))?？山Y(jié)合CD19抗原的抗體的例子包括Hekman等人，CancerImmunol.Immunother.32:364-372(1991)和Vlasveld等人，CancerImmunol.Immunother.40:37-47(1995)中的抗-CD19抗體，和Kiesel等人，LeukemiaResearch11，12:1119(1987)中的B4抗體。術(shù)語(yǔ)"瑞圖希單抗，，或"RITUXAN⑧，，在此是指抗CD20抗原的遺傳工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國(guó)專利號(hào)5,736,137中命名為"C2B8"，在此引用作為參考。該抗體是一種IgG,k免疫球蛋白，含有鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列和人恒定區(qū)序列。瑞圖希單抗對(duì)CD20抗原有大約8.0nM的結(jié)合親和力。"分離的"拮抗劑是指從其天然環(huán)境成分中鑒定、分離和/或回收的拮抗劑。天然環(huán)境的污染成分是干擾拮抗劑診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，拮抗劑將被純化為(1)大于拮抗劑的95%重量，最優(yōu)選地大于99%重量，利用Lowry法測(cè)定，(2)利用自旋杯式測(cè)序儀足以獲得至少15個(gè)N端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)在還原或非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE經(jīng)考馬斯藍(lán)或者優(yōu)選地銀染顯示均質(zhì)。分離的拮抗劑包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位拮抗劑，因?yàn)檗卓箘┳匀画h(huán)境中的至少一種成分將不存在。然而，分離的拮抗劑通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。用于處理的"哺乳動(dòng)物"是指被歸類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)畜、動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸铮绻?、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。"處理"是指治療性處理和預(yù)防性措施。需要處理的動(dòng)物包括已經(jīng)患有疾病的以及將要預(yù)防疾病的動(dòng)物。因此，哺乳動(dòng)物可能已診斷為患病或可能易患疾病。表述"治療有效量"是指可有效預(yù)防、改善或治療所述自身免疫病的拮抗劑的量。術(shù)語(yǔ)"免疫抑制劑"在此用于輔助治療時(shí)是指用于抑制或遮蔽所治療的哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。包括可抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)或遮蔽MHC抗原的物質(zhì)。這些試劑的實(shí)例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4，665，077，其內(nèi)容在此引用作為參考)；硫唑噤呤；環(huán)磷酰胺；溴環(huán)肽；達(dá)那唑；氨苯砜；戊二醛(遮蔽MHC抗原，如美國(guó)專利號(hào)4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A;類固醇，如糖皮質(zhì)類固醇，例如強(qiáng)的松、甲基強(qiáng)的松龍和地塞米松；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-Y、-P或-a抗體，抗腫瘤壞死因子-a抗體，抗肺瘤壞死因子-p抗體，抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CDlla和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；全T抗體，優(yōu)選地抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(1990年7月26曰公開(kāi)的WO90/08187);鏈激酶；TGF-O;鏈激酶；來(lái)自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細(xì)胞受體(Cohen等人，美國(guó)專利號(hào)5，114，721);T細(xì)胞受體片段(Offner等人，Science251:430-432(1991);WO卯/11294;Ianeway，Nature,341:482(1989);WO91/01133);和T細(xì)胞受體抗體(EP340,109)，如TLOB9。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒性劑，，在此使用時(shí)是指可抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括放射性同位素(如I131、Y9G、Arm、P32、Re188、Re186、Sm153、8212等)、化療劑和毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或酶活性毒素，或其片段。"化療劑"是可用于癌癥治療的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷化劑，如硫替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN);烷基磺酸，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如笨佐替派、卡波醌、美妥替派和烏瑞替派；氮丙啶和甲基吐根胺(amelamine)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine);氮芥,如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷跣胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、雙氯乙基甲胺、鹽酸氧化雙氯乙基甲胺、美法侖、novembiehin、笨芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧咬氮芥；亞硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，如阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、偶氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、加利車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、久莫霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、絳色霉素、鏈脲霉素、殺結(jié)核菌素、烏笨美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，如二甲葉酸、氨甲喋呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥噤呤；嘧啶類似物，如環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU;雄激素，如卡魯睪嗣、丙酸屈他雄嗣、表硫雄醇、美雄氨、睪內(nèi)酯；抗腎上腺素，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，如frolinicacid;醋葡醛內(nèi)酯；aldophosphamide糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙；defofamine;地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸；乙酸elliptinium;依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫派達(dá)醇；nitracrine;噴司他丁；phenamet;吡柔比星；podophyllinicacid;2-乙基酰肼;甲基千肼；PSK;丙亞胺；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2,2，,2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴溱；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；硫替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOLO,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和紫杉碎(TAXOTEW,Rh6ne國(guó)PulencRorerAntony,法國(guó))；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-疏鳥噤呤；巰基噤呤；氨甲喋呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞賓；navelbine;三羥基蒽醌；替尼泊甙；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda;伊拜膦酸鹽；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波霉素；capecitabine;和上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該定義也包括用來(lái)調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)肺瘤的作用的抗激素劑，如抗雌激素，包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、bicahitamide、亮丙瑞林、戈舍瑞林；和上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是由一個(gè)細(xì)胞群體產(chǎn)生的，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一種細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。細(xì)胞因子的實(shí)例包括淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，如人類生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人類生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-o;mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，如NGF-P;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，如TGF-a和TGF-o;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)(osteoinductive)因子；干擾素，如干擾素-a、-P和-y;集落刺激因子(CSF)，如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),如IL-1、IL-la、IL-2、IL國(guó)3、IL-4、IL畫5、IL-6、IL-7、IL國(guó)8、IL-9、IL畫ll、IL-12、IL-15;腫瘤壞死因子，如TNF-a或TNF-p;和其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括自然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白質(zhì)，和天然序列細(xì)胞因子的生物活性相當(dāng)物。術(shù)語(yǔ)"前體藥物"在本申請(qǐng)書中使用時(shí)是指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生形式，與親本藥物相比，它對(duì)肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，并且能被酶促激活或者轉(zhuǎn)化為更有活性的親本形式。參見(jiàn)，例如，Wihnan，"癌癥化學(xué)治療中的前體藥物"BiochemicalSocietyTransactions,14，375-382，615thMeetingBelfast(1986)和Stella等人，"前體藥物定向藥物輸送的一種化學(xué)方法，，《定向藥物輸送》，Borchardt等人(編寫)，247-267,HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽的前體藥物、含硫代磷酸鹽的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含肽的前體藥物、D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化前體藥物、含P-內(nèi)酰胺的前體藥物、任選地取代的含笨氧基乙酰胺的前體藥物或任選地取代的含苯基乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物，它們能轉(zhuǎn)化為更有活性的細(xì)胞毒性游離藥物。能衍生為本發(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的實(shí)例包括但不限于上述化療劑。"脂質(zhì)體"是由多種類型的脂類、磷脂和/或表面活性劑組成的小嚢泡，它可用于向哺乳動(dòng)物輸送藥物(如此處公開(kāi)的拮抗劑，和任選地化療劑)。脂質(zhì)體的成分通常以雙層結(jié)構(gòu)排列，類似于生物膜的脂類排列。術(shù)語(yǔ)"包裝插頁(yè)，，用來(lái)指治療產(chǎn)物商品包裝中通常包含的說(shuō)明書，包括關(guān)于適應(yīng)證、用法、劑量、施用、禁忌癥的信息和/或關(guān)于使用這些治療性產(chǎn)物的警告。"治療有效量"或"預(yù)防有效量"或"施用有效量"是指可抑制CNS淋巴瘤發(fā)展的藥劑量。這種抑制可以是導(dǎo)致淋巴瘤不可檢測(cè)的完全反應(yīng)或部分反應(yīng)。以易于施用和劑量均一的劑量單位形式配制腸胃外組合物是特別有利的。"劑量單位形式，，在此使用時(shí)是指物理分散的單位，適于作為所治療的哺乳動(dòng)物患者的單一劑量；計(jì)算含有預(yù)定量的活性化合物的每一單位，產(chǎn)生與需要的藥物載體有關(guān)的希望的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的特性直接取決于(A)活性化合物的獨(dú)特特性和將要達(dá)到的特殊治療效果；(B)這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物的混合技術(shù)所固有的限制。"放射免疫治療有效量"是指與放射性同位素連接的抗-CD20抗體的量，當(dāng)為了治療CNS淋巴瘤對(duì)患者施用時(shí)，使CNS淋巴瘤完全或部分地恢復(fù)。一般而言，所述任何抗體以300-1500mg/m3的劑量施用。"藥用賦形劑"是指為了制備適宜或方便的劑型而與活性藥物、試劑或抗原結(jié)合的任何惰性物質(zhì)。"免疫原性"是指導(dǎo)向的蛋白質(zhì)或治療部分當(dāng)對(duì)患者施用時(shí)引發(fā)免疫應(yīng)答(例如體液或細(xì)胞應(yīng)答)的能力。II.拮抗劑的生產(chǎn)本發(fā)明的生產(chǎn)方法和產(chǎn)品使用或加入可結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑，例如CD20、CD19、CD21、CD22、CD40等。因此，此處將描述生產(chǎn)這些拮抗劑的方法。用于生產(chǎn)或篩選拮抗劑的B細(xì)胞表面標(biāo)志或細(xì)胞因子可以是例如含有希望的表位的可溶性抗原或其部分。另外，在細(xì)胞表面表達(dá)B細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞能用來(lái)生產(chǎn)或篩選拮抗劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于生產(chǎn)拮抗劑的B細(xì)胞表面標(biāo)志的其它方式。優(yōu)選地，B細(xì)胞表面標(biāo)志是CD19或CD20抗原盡管優(yōu)選的拮抗劑是抗體，但此處也涉及抗體之外的拮抗劑。例如，拮抗劑可包括任選地與細(xì)胞毒性劑(如此處所述)融合或偶聯(lián)的小分子拮抗劑。為了筌定可結(jié)合該抗原的小分子，可以針對(duì)目的B細(xì)胞表面標(biāo)志篩查小分子文庫(kù)?？梢愿鶕?jù)拮抗性質(zhì)進(jìn)一步篩選小分子，和/或與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)。拮抗劑也可以是通過(guò)合理設(shè)計(jì)或噬菌體展示產(chǎn)生的肽(參見(jiàn)，例如，1998年8月13日公開(kāi)的WO98/35036)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的分子可以是根據(jù)抗體的CDR設(shè)計(jì)的"CDR模擬物"或抗體類似物。雖然這些肽可被其本身拮抗，但任選地可將肽與細(xì)胞毒性劑融合，以添加或增強(qiáng)該肽的拮抗性質(zhì)。下面描述了用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明使用的抗體拮抗劑的典型技術(shù)。多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選地通過(guò)對(duì)動(dòng)物多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑產(chǎn)生?？梢岳秒p功能劑或衍化劑，如馬來(lái)酰亞胺笨甲?；腔牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOC12或R1N=C=NR(其中R和Rl是不同的烷基)，偶聯(lián)相關(guān)抗原與在所免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)，例如匙孔威血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。動(dòng)物用抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫，方法是將例如100pg或5照蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑組合，在多個(gè)部位皮內(nèi)注射該溶液。一個(gè)月后，通過(guò)在多個(gè)部位皮下注射初始量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物與弗氏完全佐劑，加強(qiáng)動(dòng)物。7-14天后，動(dòng)物放血，測(cè)定血清的抗體效價(jià)。加強(qiáng)動(dòng)物直到效價(jià)穩(wěn)定。優(yōu)選地，用與不同蛋白質(zhì)偶聯(lián)的同一抗原和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑的偶聯(lián)物加強(qiáng)動(dòng)物。偶聯(lián)物也能作為融合蛋白在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備。聚集劑(如明礬)也適用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。單克隆抗體單克隆抗體從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得，即，該群體的各種抗體除可能少量存在的自然發(fā)生的突變之外相同。因此，修飾語(yǔ)"單克隆"是指抗體不是不同抗體混合物的性質(zhì)。例如，單克隆抗體可以利用Kohler等人，Nature256:495(1975)第一次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法制備(美國(guó)專利號(hào)4，816，567)。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，如倉(cāng)鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生或能產(chǎn)生可特異結(jié)合免疫用蛋白質(zhì)的抗體的淋巴細(xì)胞。此外，也可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后應(yīng)用合適的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞[Goding,《單克隆抗體原理與實(shí)踐》，59-103頁(yè)(AcademicPress,1986)。這樣制備的雜交瘤細(xì)胞接種于合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中優(yōu)選地含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般含有次黃噤呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合的，支持選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定、高水平地產(chǎn)生抗體，并且對(duì)培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如可從SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，CaliforniaUSA獲得的來(lái)源于MOPC-21和MPC-11小鼠肺瘤的細(xì)胞系，和可從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MarylandUSA獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。也曾描述了人骨髓瘤和小鼠人異骨髓瘤細(xì)胞系用于人單克隆抗體生產(chǎn)[Kozbor，J.Immunol"133:3001(1984);Brodeur等人，《單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用》，51-63頁(yè)(MarcelDekker，Inc.，紐約，1987)。測(cè)定培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)該抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，通過(guò)免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可通過(guò)Munson等人，Anal.Biochem.，107:220(1980)所述的夾心分析法測(cè)定。在確定可產(chǎn)生具有希望的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過(guò)有限稀釋法亞克隆這些克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding,《單克隆抗體原理與實(shí)踐》，59-103頁(yè)(AcademicPress,1986))。適用于該目的的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞也可以作為腹水肺瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。這些亞克隆分泌的單克隆抗體通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化方法，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當(dāng)分離。編碼單克隆抗體的DNA利用常規(guī)方法(例如，利用能特異結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離并測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞用作該DNA的優(yōu)選來(lái)源。分離后，DNA可置于表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如不產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中重組表達(dá)的綜述文章包括Skerra等人，Curr.OpinioninImmunol.5:256-262(1993)和Phickthun，Immunol.Revs.130:151-188(1992)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能利用McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)所述的技術(shù)從抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分別描述了利用噬菌體文庫(kù)對(duì)鼠和人抗體的分離。以后的文章描述了應(yīng)用鏈改組(shuffling)以及聯(lián)合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建極大噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse等人，Nuc.AcidsRes.21:2265-2266(1993)),產(chǎn)生高親和力(nM級(jí))人抗體(Marks等人，BioTechnology，10:779-783(1992))。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的有效備選技術(shù)。DNA也可以修飾，例如，用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替同源鼠序列(美國(guó)專利號(hào)4，816，567;Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851(1984))，或者共價(jià)連接免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。一般用這些非免疫球蛋白多肽代替抗體的恒定域，或者代替抗體的一個(gè)抗原結(jié)合部位的可變域，產(chǎn)生一種嵌合雙價(jià)抗體，其含有一個(gè)具有抗原特異性的抗原結(jié)合部位和另一個(gè)具有不同抗原特異性的抗原結(jié)合部位。人源化抗體人源化非人類抗體的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。優(yōu)選地，人源化抗體中引入一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人類來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常被稱為"引入(import)"殘基，一般來(lái)自"引入"可變域。人源化基本上能按照Winter及其同事(Jones等人，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))的方法進(jìn)行，是用超變區(qū)序列代替人類抗體的相應(yīng)序列。因此，"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其中大大少于完整人類可變域部分.被替換為來(lái)自非人類物種的相應(yīng)序列。實(shí)際上，人源化抗體一般是人類抗體，其中一些超變區(qū)殘基，或許一些FR殘基被替換為來(lái)自嚙齒類動(dòng)物抗體類似位點(diǎn)的殘基。用于生產(chǎn)人源化抗體的人類可變域(輕鏈和重鏈)的選擇對(duì)于降低抗原性極其重要。根據(jù)所謂的"最佳擬合(best-fit)"法，對(duì)已知人類可變域序列的完整文庫(kù)篩查嚙齒類動(dòng)物抗體的可變域序列。然后用最接近嚙齒類動(dòng)物的人類序列作為人源化抗體的人類構(gòu)架區(qū)(FR)(Sims等人，J.Immunol.，151:2296(1993);Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一種方法使用特定輕鏈或重鏈亞型的所有人類抗體的共有序列衍生的特定構(gòu)架區(qū)。幾種不同的人源化抗體可以使用相同的框架(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992);Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993))?？贵w人源化對(duì)于保持高度的抗原親和力和其它有利的生物學(xué)性質(zhì)是十分重要的。為了達(dá)到這一目的，按照一種優(yōu)選方法，利用親代和人源化序列的三維模型，通過(guò)對(duì)親代序列和不同概念人源化產(chǎn)物的分析方法，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型一般可以獲得，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。可以獲得圖形顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。觀察這些圖示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合抗原能力的殘基。這樣，能從受體引入序列中選擇并結(jié)合FR殘基，以獲得希望的抗體特性，如提高的靶抗原親和力。超變區(qū)殘基通常直接并最充分地參與影響抗原結(jié)合。人類抗體作為人源化的備選，可以生產(chǎn)人類抗體。例如，現(xiàn)在能生產(chǎn)在免疫后能產(chǎn)生全套人類抗體而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失使內(nèi)源抗體產(chǎn)生被完全抑制。這種種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因排列的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人類抗體。參見(jiàn)，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卯:2551(1993);Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993);Bmggermann等人，YearinImmuno.，7:33(1993);美國(guó)專利號(hào)5,591,669、5,589,369和5,545,807。此外，也能用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等人，Nature348:552-553(1990))由未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全部成分(repertoire)在體外生產(chǎn)人類抗體和抗體片段。按照該技術(shù)，將抗體V域基因符合讀框地克隆到絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，在噬菌體顆粒表面展示為功能抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能性的選擇也導(dǎo)致選擇編碼顯示這些性質(zhì)的抗體的基因。因此，該噬菌體模擬B細(xì)胞的一些性質(zhì)。噬菌體展示能用多種方式進(jìn)行；綜述參見(jiàn)，例如Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V基因片段的幾種來(lái)源能用于噬菌體展示。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)從來(lái)自免疫小鼠脾臟的V基因小隨機(jī)組合文庫(kù)中分離了不同排列的抗惡唑啉抗體。能夠構(gòu)建來(lái)自未免疫的人類供體的V基因全部成分，并能基本上按照Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人，EMBOJ.12:725-734(1993)所述的技術(shù)，分離抗不同抗原(包括自身抗原)的抗體。參見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)5,565,332和5,573,905。人類抗體也可由體外激活的B細(xì)胞產(chǎn)生(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,567,610和5，229，275)?？贵w片段已經(jīng)發(fā)展了多種技術(shù)生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)上是通過(guò)蛋白水解消化完整抗體產(chǎn)生這些片段(參見(jiàn)，例如，Morimoto等人，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)和Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，現(xiàn)在能由重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，能從上述抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體片段。此外，也能直接從大腸桿菌中回收Fab，-Sli片段，并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab，)2片段[Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992)]。按照另一種方法，能直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離F(ab，)2片段。生產(chǎn)抗體片段的其它技術(shù)為技術(shù)人員所知。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見(jiàn)WO93/16185;美國(guó)專利號(hào)5，571，894;美國(guó)專利號(hào)5，587，458?？贵w片段也可以是"線性抗體"，如美國(guó)專利5,641,870所述。這些線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。雙特異性抗體雙特異性抗體是對(duì)至少兩種不同的表位具有結(jié)合特異性的抗體。典型的雙特異性抗體可以結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的兩種不同表位。其它抗體可以結(jié)合第一種B細(xì)胞標(biāo)志，并進(jìn)一步結(jié)合第二種B細(xì)胞表面標(biāo)志。此外，抗B細(xì)胞標(biāo)志結(jié)合臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子(如T細(xì)胞受體分子，如CD2或CD3,或IgG的Fc受體(FeyR),如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16))的臂結(jié)合，以將細(xì)胞防御機(jī)制集中于B細(xì)胞。雙特異性抗體也可用于將細(xì)胞毒性劑定位于B細(xì)胞。這些抗體具有一個(gè)B細(xì)胞標(biāo)志結(jié)合臂，和一個(gè)結(jié)合細(xì)胞毒性劑(例如皂草素、抗干擾素-a、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒素A鏈、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體能制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab，)2雙特異性抗體)。生產(chǎn)雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域周知。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等人，Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分類，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤)產(chǎn)生一種可能含有IO種不同抗體分子的混合物，其中只有一種抗體分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化通常利用親和層析步驟進(jìn)行，十分繁瑣，產(chǎn)物產(chǎn)量較低。WO93/08829和Traunecker等人，EMBOJ.10:3655-3659(1991)公開(kāi)了類似的方法。按照不同的方法，具有希望的結(jié)合特異性的抗體可變域(抗體-抗原結(jié)合部位)與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選地與免疫球蛋白重鏈恒定域融合，它含有鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的至少一部分。優(yōu)選地含有第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CHI),它含有輕鏈結(jié)合所必需的部位，存在于至少一種融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA,必要時(shí)將編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA,插入分別的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染合適的宿主生物。當(dāng)在構(gòu)建中使用的三種多肽鏈的不相等比例獲得最佳產(chǎn)量時(shí)，提供了調(diào)節(jié)實(shí)施方案中三種多肽片段相互比例的較大靈活性。然而，當(dāng)比例相等的至少兩種多肽鏈的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)，或當(dāng)比例不是特別顯著時(shí)，能在一個(gè)表達(dá)載體中插入兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體含有在一條臂上具有第一種結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和在另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈輕鏈對(duì)(具有第二種結(jié)合特異性)。發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)有利于從不必要的免疫球蛋白鏈組合中分離希望的雙特異性化合物，因?yàn)橹挥幸话腚p特異性抗體中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種簡(jiǎn)單的分離方法。該方法在WO94/04690中公開(kāi)。關(guān)于生產(chǎn)雙特異性抗體的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)，例如，Suresh等人，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。按照美國(guó)專利號(hào)5,731,168所述的另一種方法，能改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分?jǐn)?shù)最大。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的CH3域的至少一部分。在該方法中，來(lái)自第一種抗體分子的界面的一條或多條小氨基酸側(cè)鏈被替換為較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過(guò)將較大的氨基酸側(cè)鏈替換為較小的側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)，在第二種抗體分子的界面上產(chǎn)生與較大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償"腔"。這提供了提高異二聚體產(chǎn)量，高于其它不必要的終產(chǎn)物(如同型二聚體)的一種機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或"異偶聯(lián)"抗體。例如，異偶聯(lián)物中的一種抗體能與親合素偶聯(lián)，另一種與生物素偶聯(lián)。例如，這些抗體已經(jīng)打算用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)向不希望的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4，676，980)，并用于HIV感染的治療(WO91/00360,WO92/200373和EP03089)。異偶聯(lián)抗體可以利用任何適宜的交聯(lián)法制備。合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域眾所周知，在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中公開(kāi)，還有許多交聯(lián)技術(shù)。由抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的技術(shù)已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。例如，雙特異性抗體可以利用化學(xué)連接制備。Brennan等人，Science,229:81(1985)描述了一種方法,其中蛋白水解切割完整的抗體，產(chǎn)生F(ab，)2片段。這些片段在雙硫醇復(fù)合劑亞砷酸鈉存在下還原，穩(wěn)定鄰近的雙硫醇并防止分子間二硫并阻止分子間二硫化物形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基笨甲酸(TNB)衍生物。然后通過(guò)巰乙胺還原將Fab，-TNB衍生物之一恢復(fù)為Fab，-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab，-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體能用作酶的選擇性固定的試劑。最新進(jìn)展有利于從大腸桿菌中直接回收Fab，-SH片段，它們能夠化學(xué)偶聯(lián)，形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab，)2分子的產(chǎn)生。每條Fab，片段由大腸桿菌分別分泌，在體外直接化學(xué)偶聯(lián)，形成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過(guò)量表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人類T細(xì)胞，并觸發(fā)人類細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)人類乳癌靶標(biāo)的裂解活性。也描述了直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，曾經(jīng)利用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)了雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Imimmol.148(5):1547-1553(1992)。來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab，部分連接?？贵w同型二聚體在鉸鏈區(qū)處還原，形成單體，然后再次氧化，形成抗體異二聚體。該方法也能用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)描述的"疊抗"技術(shù)提供了一種生產(chǎn)雙特異性抗體片段的備選機(jī)制。這些片段含有通過(guò)接頭與輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)，該接頭因太短而不能使同一條鏈上的兩個(gè)域配對(duì)。因此，使一條片段的VH和VL域與另一條片段的互補(bǔ)VL和VH域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合部位。也曾經(jīng)報(bào)道了利用單鏈Fv(sFv)二聚體生產(chǎn)雙特異性抗體的另一個(gè)策略。參見(jiàn)，Gruber等人，J.Immunol.152:5368(1994)。預(yù)期兩價(jià)以上的抗體。例如，能制備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。III.拮抗劑的偶聯(lián)和其它修飾此處所述方法中使用的或產(chǎn)品中所含的拮抗劑任選地與一種細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)?？捎糜谏a(chǎn)這種拮抗劑-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物的化療劑在上文中已經(jīng)描述。在此也涉及拮抗劑與一種或多種小分子毒素(如加利車霉素、美登素(美國(guó)專利號(hào)5,208,020)、trichothene和CC1065)的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑與一個(gè)或多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(例如，每個(gè)拮抗劑分子約1-10個(gè)美登素分子)。例如，美登素可以轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，它可還原為May-SH3，并與修飾的拮抗劑反應(yīng)(Chari等人，CancerResearch52:127-131(1992))，產(chǎn)生類美登素-拮抗劑偶聯(lián)物。此外，拮抗劑也可與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子偶聯(lián)。抗生素加利車霉素家族能在亞皮摩爾濃度引起雙鏈DNA斷裂?？梢允褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于yJl、a21、a31、N-乙酰-yl，、PSAG和011(Hinman等人，CancerResearch53:3336-3342(1993)和Lode等人，CancerResearch58:2925-2928(1993))。能夠使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、非洲蒴蓮毒蛋白(modeccin)A鏈、a-八疊球菌、leuritesfordii蛋白、dianthin蛋白、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP國(guó)S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒素、sapaonariaofficinalis抑制劑、gelonin、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢霉烯(tricothecene)。參見(jiàn)，例如，1993年10月28日公開(kāi)的WO93/21232。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與具有核裂解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)的拮抗劑。多種放射性同位素可用于生產(chǎn)放射偶聯(lián)的拮抗劑。實(shí)例包括At211、I125、Re188、Iii111、TC99m、Pb212、Y90、Re186、Sm153、Cu67、I131、P52、Bi212和Lu的放射性同位素。拮抗劑與細(xì)胞毒性劑的偶聯(lián)物可以用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備，如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶雙硫醇)-丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己胺-l-羧酸、亞氨基thiolane(IT)、亞氨酯的雙功能衍生物(如二甲基乙二酰亞胺HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺)、醛類(如戊二醛)、雙疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮苯甲酰)己二胺)、雙重氮衍生物(如雙(重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(如亞千基-2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素能如Vitetta等人，Science238:1098(1987)所述制備。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酰千基-3-甲基二乙烯三胺基戊乙酸(MX-DTPA)是用于結(jié)合放射性核苷酸與拮抗劑的一種典型螯合劑。參見(jiàn)WO94/11026。接頭可以是便于從細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的"可切割接頭"。例如，可以使用酸不穩(wěn)定的接頭、肽酶敏感的接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等人，CancerResearch52:127-131(1992))。此外，含有拮抗劑和細(xì)胞毒性劑的融合蛋白也可以通過(guò)例如重組技術(shù)或肽合成法制備。在另一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑可以與一種"受體"(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，用于肺瘤預(yù)導(dǎo)向，其中對(duì)患者施用拮抗劑-受體偶聯(lián)物，隨后利用螯合劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒性劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的"配體"(如親和素)。本發(fā)明的拮抗劑也可以與一種能將前體藥物(如肽酰化療劑，參見(jiàn)WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物的前體藥物-激活的酶偶聯(lián)。參見(jiàn)，例如，WO88/07378和美國(guó)專利號(hào)4，975，278。這些偶聯(lián)物的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為更具活性的細(xì)胞毒性形式的任何酶。本發(fā)明的方法中有用的酶包括但不限于可用于將含磷酸前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含硫酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可用于將無(wú)毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨基酶；可用于將含肽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L);可用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶，如li-半乳糖普酶和神經(jīng)氨酸酶；可用于將p-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的p-內(nèi)酰胺酶；可用于將胺氮處分別用笨氧乙?；虮揭阴；芑乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。此外，具有酶活性的抗體在本領(lǐng)域中也被稱作"抗體酶，，，能用來(lái)將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離活性藥物(參見(jiàn)，例如，Massey，Nature328:457-458(1987))。拮抗劑-抗體酶偶聯(lián)物能如此處所述制備，用于對(duì)腫瘤細(xì)胞群輸送抗體酶。能利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，如使用上述異雙功能交聯(lián)劑，將本發(fā)明的酶與拮抗劑共價(jià)結(jié)合。此外，也能用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建融合蛋白，其至少含有本發(fā)明的拮抗劑的抗原結(jié)合區(qū)，至少與本發(fā)明的酶的功能活性部分連接[參見(jiàn)，例如，Neuberger等人，Nature,312:604-608(1984)。此處也涉及拮抗劑的其它修飾。例如，拮抗劑可以與多種非蛋白質(zhì)聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。此處公開(kāi)的拮抗劑也可以配制為脂質(zhì)體。含有拮抗劑的脂質(zhì)體通過(guò)本領(lǐng)域周知的方法制備，如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:3688(1985);Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980);美國(guó)專利號(hào)4,485,045和4，544，545;和1997年10月23日公布的W097/38731所述。美國(guó)專利號(hào)5，013，556中公開(kāi)了循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體能用反相蒸發(fā)法產(chǎn)生，其中使用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)脂類組合物。脂質(zhì)體通過(guò)規(guī)定孔徑的濾器噴出，產(chǎn)生具有希望的直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明的抗體的Fab，片段能通過(guò)二硫化物交換反應(yīng)與如Martin等人，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)所述的脂質(zhì)體偶聯(lián)。脂質(zhì)體中任選地含有化療劑。參見(jiàn)Gabizon等人，J.NationalCancerInst.81(19):1484(1989)。涉及此處所述的蛋白質(zhì)或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，希望改善拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)性質(zhì)。通過(guò)向拮抗劑核酸中引入適當(dāng)核苷酸改變，或通過(guò)肽合成，制備拮抗劑的氨基酸序列變體。這些修飾包括，例如拮抗劑氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失和/或插入和/或置換。進(jìn)行缺失、插入和置換的任一組合，以獲得最終構(gòu)建體，只要最終構(gòu)建體具有希望的特性。氨基酸改變也可改變拮抗劑的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。一種方法可用于筌定拮抗劑中是優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域，稱作"丙氨酸掃描誘變法"，如Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)所述。在此確定了一個(gè)殘基或一組把殘基(例如，帶電殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，并替換為中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選的是丙氨酸或聚丙氨酸)，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過(guò)在置換位點(diǎn)引入其它變異，精確確定證實(shí)對(duì)置換功能敏感的氨基酸位置。因此，預(yù)先確定用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)，而不需預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了分析特定位點(diǎn)突變的表現(xiàn)，在靶密碼子或區(qū)域處進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并根據(jù)希望的活性篩選表達(dá)的拮抗劑變體。氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，其長(zhǎng)度從一個(gè)殘基到含有一百個(gè)或以上殘基的多肽，以及一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括含有一個(gè)N端甲硫氨酰殘基的拮抗劑，或與細(xì)胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括與酶拮抗劑N端或C端的融合體，或延長(zhǎng)拮抗劑血清半衰期的多肽。另一種變體是氨基酸置換變體。這些變體在拮抗劑分子中至少一個(gè)氨基酸殘基被替換為不同的殘基。最適于抗體拮抗劑置換誘變的位點(diǎn)包括超變區(qū)，但是也包括FR改變。表1在"優(yōu)選置換"標(biāo)題下列出了保守置換。如果這些置換導(dǎo)致生物活性改變，可引入更大改變，在表1中被命名為"代表性置換，，，或者如以下關(guān)于氨基酸類別所進(jìn)一步描述，并且篩選產(chǎn)物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>拮抗劑生物學(xué)性質(zhì)的本質(zhì)改變通過(guò)選擇置換實(shí)現(xiàn)，這些置換在下列方面顯著不同影響保持(a)置換區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，如片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶部位處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小。自然存在的殘基根據(jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)分為以下幾類(1)疏水正亮氨酸，met,ala，val,leu,ile;(2)中性親水cys,ser，thr;(3)酸性asp,glu;(4)堿性asn,gin,his,lys,arg;(5)影響鏈方向的殘基gly,pro;和(6)芳族trp，tyr,phe。非保守性置換需要將這些類別之一的成員換為另一類別。不參與保持拮抗劑正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基一般也可以置換為絲氨酸，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。反之，也可以向拮抗劑中加入半胱氨酸鍵，以提高其穩(wěn)定性(特別是在拮抗劑是抗體片段如Fv片段時(shí))。一種特別優(yōu)選的置換變體包括置換親本抗體的一個(gè)或多個(gè)超變區(qū)殘基。為進(jìn)一步發(fā)展選擇的變體一般具有比親本抗體改進(jìn)的生物學(xué)性質(zhì)。生產(chǎn)這些置換變體的一種適宜方法是利用噬菌體展示的親和成熟法。簡(jiǎn)言之，突變幾個(gè)超變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))，產(chǎn)生每個(gè)位點(diǎn)的所有可能的氨基置換。這樣產(chǎn)生的抗體變體由絲狀噬菌體顆粒以單價(jià)方式展示，作為與包裝于每個(gè)顆粒中的M13的基因III產(chǎn)物的融合體。然后根據(jù)此處公開(kāi)的生物活性(例如結(jié)合親和力)篩選噬菌體展示的變體。為了確定用于修飾的候選超變區(qū)位點(diǎn)，能進(jìn)行丙氨酸掃描誘變，以確定明顯有助于抗原結(jié)合的超變區(qū)殘基。此外，為了確定抗體與抗原之間的接觸點(diǎn)，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)也是有利的。這些接觸殘基和鄰近殘基是按照此處詳述的技術(shù)置換的候選殘基。產(chǎn)生這些變體后，如此處所述篩選全部變體，可以選擇在一次或多次相關(guān)試驗(yàn)中具有優(yōu)越性質(zhì)的抗體進(jìn)一步發(fā)展。拮抗劑的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑的原始糖基化模型。改變是指刪除拮抗劑中的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加一個(gè)或多個(gè)拮抗劑中沒(méi)有的糖基化位點(diǎn)。多肽的糖基化一般是N-連接的或0-連接的。N-連接的是指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈連接。三肽序列天冬跣胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)是碳水化合物部分酶促連接天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任一種產(chǎn)生可能的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥氨基酸(最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨酸)連接，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-幾賴氨酸。方便地通過(guò)改變氨基酸序列使其含有一種或多種上述三肽序列向拮抗劑中添加糖基化位點(diǎn)(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。也可以通過(guò)向原始拮抗劑序列中添加或置換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基進(jìn)行這種改變(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子用本領(lǐng)域周知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(對(duì)于天然存在的氨基酸序列變體)，或通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒誘變以前制備的拮抗劑變體或非變體形式。希望在效應(yīng)物功能方面修飾本發(fā)明的拮抗劑，例如，提高拮抗劑的抗原依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過(guò)在抗體拮抗劑的Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換實(shí)現(xiàn)。此外，也可以在Fc區(qū)中導(dǎo)入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。這樣產(chǎn)生的同型二聚抗體可能具有提高的內(nèi)化能力和/或增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等人，J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)?？狗瘟龌钚蕴岣叩耐投劭贵w也可以應(yīng)用如Wolff等人，CancerResearch53:2560-2565(1993)所述的異雙功能交聯(lián)劑制備。此外，也能構(gòu)建含有雙Fc區(qū)從而具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解和ADCC能力的抗體。參見(jiàn)Stevenson等人，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。為了提高拮抗劑的血清半衰期，可以向拮抗劑(特別是抗體片段)中加入補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國(guó)專利5,739,277所述。在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"是指負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子體內(nèi)血清半衰期的IgG分子(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)的表位。IV.藥用制劑通過(guò)將具有希望的純度的拮抗劑與任選地藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington制藥學(xué)》第16版，Osol，A.編寫(1980))，制備按照本發(fā)明使用的拮抗劑的治療制劑以備貯存，形式為凍干制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度時(shí)對(duì)受體無(wú)毒，包括緩沖液，如磷酸、檸檬酸或其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如二甲苯十八烷醋氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化笨甲烴銨、笨索氯銨；笨酚、丁基或節(jié)基乙醇；烷基對(duì)羥基笨甲酸酯，如甲基或丙基對(duì)羥基笨甲酸酯；兒茶酚；間笨二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和m-甲酚；低分子量(少于IO個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖或其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA;糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(如鋅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，如tweentm、PLURONICSTm或聚乙二醇(PEG)。W098/56418描述了代表性抗-CD20抗體制劑，在此引用作為參考。該公開(kāi)文本描述了一種液體多劑量制劑，其含有40mg/ml瑞圖希單抗、25mM乙酸鹽、150mM海藻糖、0.9%笨甲醇、0.02%聚山梨酸酯20，pH5.0,在2-8r下最短貯存期限為2年。另一種目的抗-CD20制劑在9.0mg/ml氯化鈉、7.35mg/ml二水合檸檬酸鈉、0.7mg/ml聚山梨酸酯80和無(wú)菌注射用水中含有10mg/ml瑞圖希單抗，pH6.5。WO97/04801描述了適于皮下施用的凍干制劑。這些凍干制劑可以用合適的稀釋劑重建為高蛋白質(zhì)濃度，重建的制劑可以對(duì)此處治療的哺乳動(dòng)物皮下施用。此處所述制劑也可含有一種以上的活性化合物，它們是所治療的特定適應(yīng)證所需的，優(yōu)選地具有不會(huì)彼此不利影響的補(bǔ)充活性。例如，希望進(jìn)一步提供一種細(xì)胞毒性劑、化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細(xì)胞的，如環(huán)孢菌素或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，例如結(jié)合LFA-1的抗體)。這種試劑的有效量取決于制劑中所含的拮抗劑的量，所治療的疾病類型，和上述其它因素。它們一般以上文使用的施用途徑以相同劑量使用，或者約為現(xiàn)在使用劑量的1-99%?；钚猿煞忠部梢园庥谕ㄟ^(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢中，例如，分別是羥甲基纖維素或明膠-微膠嚢和聚(甲基異丁烯酸)微膠嚢，在膠體藥物輸送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白小球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)或大乳劑中。Osol，A.編寫的《Remington制藥學(xué)》第16版(1980)中公開(kāi)了這些技術(shù)。也可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當(dāng)實(shí)例包括含有拮抗劑的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成形形式，例如薄膜或微膠嚢。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸))，或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRONDEPOTTM(由乳酸乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射小球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。將用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾實(shí)現(xiàn)。V.施用抗-B細(xì)胞抗體的方法和組合物A.施用抗-B細(xì)胞抗體的方法用于治療CNS淋巴瘤中的施用抗-B細(xì)胞抗體的方法可以是靜脈內(nèi)(iv)、口服或腹膜內(nèi)施用。然而，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤或相關(guān)疾病，施用抗-B細(xì)胞抗體(例如抗-CD20抗體)或其免疫原性片段的優(yōu)選方法可以是鞘內(nèi)施用。鞘內(nèi)施用優(yōu)選地通過(guò)Ommaya容器施用，但也能通過(guò)腰部穿刺或心室內(nèi)施用?？?B細(xì)胞抗體能通過(guò)相同途徑與另一種藥物聯(lián)合施用；第二種藥劑也能通過(guò)不同的途徑施用。另外，預(yù)期的抗-B細(xì)胞抗體也可以在顱腦照射之前或之后施用。此外，也能夠破壞血腦屏障(BBB)，隨后動(dòng)脈內(nèi)施用藥物。抗-B細(xì)胞抗體，如可結(jié)合B細(xì)胞的抗-CD20抗體，或可抑制B細(xì)胞的抗-CD40L抗體，能單獨(dú)或與其它藥劑(例如，抗-CD40抗體、其它抗-B細(xì)胞抗體、氨甲喋呤、環(huán)磷酰胺、甲基千肼和地塞米松)聯(lián)合動(dòng)脈內(nèi)施用。破壞BBB的方法包括KroH等人，Neurosurgery42:1083-99(1998)和Dahlborg等人，CancerJ.Sci.Am.2:166(1996)所述的方法。如上所述，抗-B細(xì)胞抗體，例如抗-CD20抗體，如瑞圖希單抗，或其治療有效的片段(例如Fab、Fab，或F(ab，)2),可單獨(dú)或與另外一種或多種活性劑聯(lián)合施用。另外的活性劑包括其它化療劑，如甲酰四氫葉酸、CHOP、氨甲喋呤、阿糖胞苷、硫替哌或長(zhǎng)春新堿，如前所述。抗-B細(xì)胞抗體或其治療有效片段也能與抑制CD40與其配體CD40L相互作用的試劑聯(lián)合施用。CD40/CD40L抑制劑包括抗-CD40抗體或其片段、抗-CD40L抗體或其片段和CD40或CD40L的擬肽。特別是，抗-CD20抗體也能與其它抗-B細(xì)胞抗體(如抗-CD19、抗-CD22、抗-CD38和抗-MHCII抗體)聯(lián)合施用。而且，抗-CD20抗體能單獨(dú)施用，與其它抗體聯(lián)合或與其它治療形式(例如化學(xué)治療和放射治療)聯(lián)合施用，以及其組合。這些活性劑(例如抗-CD20抗體，如瑞圖希單抗)能夠在藥學(xué)有效的載體中。載體包括親脂性載體(例如甲基爺肼)或免疫親脂性載體，如Huwyler等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA93:14164-14169(1996)和美國(guó)專利號(hào)5，716，614所述。此外，活性劑也能與導(dǎo)向腦上皮上的受體(如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)的載體連接(參見(jiàn)Wu等人，Drug.Metabol.Dispos.26:937-9(1998))。VI.抗-CD20抗體與其它藥劑或治療形式的聯(lián)合應(yīng)用A.抗-B細(xì)胞抗體與照射聯(lián)合已經(jīng)證明，在治療PCNSL時(shí)單獨(dú)照射不如與其它形式(如化學(xué)治療)聯(lián)合應(yīng)用有效。本發(fā)明的一方面涉及單獨(dú)應(yīng)用抗-CD20抗體或與其它藥劑(如CHOP)及腦部照射聯(lián)合治療腦淋巴瘤患者。抗體能在腦部照射之前、之后或同時(shí)在之前和之后施用。例如，能對(duì)患者施以全腦放射治療(WBRT),隨后用阿糖胞苷和單獨(dú)用抗-CD20抗體或與其它抗-B細(xì)胞抗體聯(lián)合高劑量治療。優(yōu)選地對(duì)患者施以4000-5000cGy。此外，如DeAngelis等人所述，能對(duì)患者腦部施以4000cGy放射治療，并對(duì)有關(guān)區(qū)域以2000cGy加強(qiáng)。如果患者累及眼睛，則可對(duì)眼睛施以3600cGy。能首先施以照射，然后單獨(dú)用抗-CD20抗體或與其它抗-B細(xì)胞抗體聯(lián)合治療。照射后施用抗-CD20抗體能與甲基千肼、洛莫司汀和長(zhǎng)春新堿(PCV)聯(lián)合。PCV的施用能如Chamberlain等人，J.Neuro.Oncol.14:271-275(1992)所述進(jìn)行。此外，抗體也能與環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松(CHOP)或環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和地塞米松(CHOD)聯(lián)合。能在全腦放射治療之前施以這些抗體和化學(xué)治療組合。在顱腦照射之前，本發(fā)明的抗-CD20抗體也能與氨甲喋呤(400mg/M2)、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松和博來(lái)霉素(MACOP-B)聯(lián)合。MACOP-B、CHOP和CHOD的施用能如DeAngelis等人，1997和此處引用的參考文獻(xiàn)所述進(jìn)行。此外，抗-CD20抗體本身也可以與醫(yī)學(xué)上有用的同位素連接。這些放射性核素在下文中進(jìn)一步詳述。B.抗-CD20抗體與化學(xué)治療聯(lián)合本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是應(yīng)用抗-B細(xì)胞抗體(例如抗-CD20抗體)或其治療有效片段與化療劑聯(lián)合而不與放射治療聯(lián)合治療腦淋巴一個(gè)實(shí)例是施用抗-CD20抗體與高劑量的氨甲喋呤。也能聯(lián)合施用其它試劑。例如，本發(fā)明的抗-CD20抗體能與高劑量的氨甲喋呤(2.5mg/M2)、甲基芐肼和長(zhǎng)春新堿一起施用，氨甲喋呤、甲基千肼和長(zhǎng)春新堿如Freilich等人，Neurology46:435-439(1996)所述施用。高劑量氨甲喋呤也能如Perez-Jaffe等人，Diagn.Cytopathol.20:219-223(1999)所述施用。此外，抗-CD20抗體也能與高劑量阿糖胞苷(3g/M2)—起施用。高劑量阿糖胞苷的施用能如Strauchen等人,Cancer63:1918-21(1989)所述進(jìn)行。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及抗-CD20抗體與化療劑和/或與抗-CD40或抗-CD40L抗體和/或與其它抗-B細(xì)胞抗體的聯(lián)合施用。C.抗-B細(xì)胞抗體(如抗-CD20抗體)與提高血腦屏障通透性的試劑聯(lián)合因?yàn)檠X屏障能對(duì)向患者施用藥物造成困難，在不希望鞘內(nèi)施用的情況中，或者在優(yōu)選的另一種抗-CD20抗體施用形式時(shí)，可以應(yīng)用可提高血腦屏障(BBB)通透性的試劑或方法。可提高BBB通透性的試劑的一個(gè)實(shí)例是對(duì)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有反應(yīng)性的抗體。對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的至少一部分有反應(yīng)性的單克隆抗體包括OX國(guó)26、B3/25、Tf6/14、OKT-9、L5.1、5E-9、RI7217和T58/30。這些抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體能如美國(guó)專利號(hào)5，182，107所述應(yīng)用，在此引用作為參考。本發(fā)明涉及的組合物也可含有親脂性載體(例如甲基千肼)，用于向腦中的靶部位輸送抗體。也涉及免疫脂質(zhì)體(Huwyler等人，1996)。親脂性分子優(yōu)選地是Q-3系列的脂肪酸或其脂衍生物。其它親脂性分子有脂肪酸、甘油二酯、二酰磷脂、溶血磷脂、膽固醇和含有18-46個(gè)碳原子的多不飽和烴基的其它類固醇。優(yōu)選的生物聚合物載體是聚(a)-氨基酸(例如PLL、聚L-精氨酸PLA、聚L-鳥氨酸PLO)、人血清白蛋白、氨基葡聚糖、酪蛋白等。這些載體優(yōu)選地是可生物降解的、生物相容的，可能是藥物輸送系統(tǒng)的優(yōu)良候選物。關(guān)于這些載體及其施用的進(jìn)一步描述，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，716，614，在此引用作為參考。VII.抗-B細(xì)胞抗體(如抗-CD20抗體)與干擾CD40/CD40L相互作用的試劑的聯(lián)合施用本發(fā)明涉及的另一種方法是用B細(xì)胞抗體(優(yōu)選地B細(xì)胞消耗性抗體，最優(yōu)選地是消耗性抗-CD20抗體)與干擾CD40/CD40L相互作用的試劑(優(yōu)選地抗-CD40或抗-CD40L抗體)聯(lián)合治療腦淋巴瘤。根據(jù)本發(fā)明這一方面，對(duì)患者施用"CD40L拮抗劑"，以干擾CD40L與其結(jié)合配偶體CD40的相互作用，聯(lián)合施用抗-B細(xì)胞抗體，如RITUXAN⑧。"CD40L拮抗劑"定義為干擾這一相互作用的分子。CD40L拮抗劑可以是抗CD40L抗體(例如抗CD40L的單克隆抗體)、抗CD40L抗體的片段或衍生物(例如Fab或F(ab，)片段、嵌合抗體或人源化抗體)、CD40的可溶形式、含CD40的融合蛋白的可溶形式，或破壞或干擾CD40L-CD40相互作用的藥劑。為了制備抗-CD40L抗體，能用可在哺乳動(dòng)物中引發(fā)抗體應(yīng)答的CD40L蛋白或其蛋白質(zhì)片段(例如肽片段)的免疫原形式免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、倉(cāng)鼠、兔或有蹄類動(dòng)物)。在其表面表達(dá)CD40L的細(xì)胞也能用作免疫原。其它免疫原包括純化的CD40L蛋白或蛋白質(zhì)片段。CD40L能用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)從表達(dá)CD40L的細(xì)胞中純化(Armitage等人，Nature357:80-82(1992);Lederman等人，J.Exp.Med.175:1091-1101(1992);Hollenbaugh等人，EMBOJ.11:4313-4321(1992))。此外，也能如Armitage等人(1992)所公開(kāi)的，根據(jù)CD40L的氨基酸序列制備CD40L肽。賦予蛋白質(zhì)免疫原性的技術(shù)包括與載體偶聯(lián)或本領(lǐng)域周知的其它技術(shù)。例如，能在佐劑存在下施用蛋白質(zhì)。能通過(guò)檢測(cè)血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)視免疫過(guò)程。標(biāo)準(zhǔn)EL1SA或其它免疫測(cè)定能使用免疫原作為抗原，評(píng)價(jià)抗體水平。免疫后，能獲得抗血清，并分離多克隆抗體。為了生產(chǎn)單克隆抗體，收獲抗體生產(chǎn)細(xì)胞，并利用標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合方法與骨髓瘤細(xì)胞融合，如美國(guó)專利號(hào)5,833,987(1998)和5，747，037(1997)所述?？?CD20抗體和抗-CD40抗體能用類似的方法制備。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了幾種抗-CD40L抗體、抗-CD40抗體和抗-CD20抗體，它們可以公開(kāi)獲得?？贵w可以是片段，篩選的些片段與以上對(duì)完整抗體所述相同的方法應(yīng)用。例如，能用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生F(ab，)2片段。能夠處理得到的F(ab，)2片段，還原二硫鍵產(chǎn)生Fab，片段。預(yù)期的其它抗體片段包括Fab和scFv。對(duì)人類治療應(yīng)用時(shí)，使非人類抗體的識(shí)別最小化而不是普遍免疫抑制的一種方法是，產(chǎn)生嵌合抗體衍生物，即組合了非人類動(dòng)物可變區(qū)和人類恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體分子可包含，例如，來(lái)自小鼠、大鼠或其它種的抗體的抗原結(jié)合域，及人類恒定區(qū)。制備嵌合抗體的方法包括美國(guó)專利號(hào)5，833,987(1998)所述的方法。為了人類治療目的，通過(guò)產(chǎn)生人類可變區(qū)嵌合體能進(jìn)一步使對(duì)CD40L蛋白或肽有特異反應(yīng)性的抗體人源化，其中可變區(qū)部分，特別是抗原結(jié)合域的保守構(gòu)架區(qū)，是人類來(lái)源的，只有超變區(qū)是非人類來(lái)源的。這些改變的免疫球蛋白分子可以通過(guò)本領(lǐng)域周知的幾種方法之一制備(例如，Teng等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA80:7308-7312(1983);Kozbor等人，ImmunologyToday4:7279(1983);Olsson等人，Meth.Enzymol.92:3-16(1982))，優(yōu)選地按照PCT申請(qǐng)WO92/06193或EP0239400所述制備。人源化抗體可由例如ScotgenLimited(2HollyRoad,Twickenham,Middlesex,英國(guó))商業(yè)生產(chǎn)。生產(chǎn)對(duì)CD40L蛋白或肽有反應(yīng)性的特異性抗體或抗體片段的另一種方法是用CD40L蛋白或肽篩查在細(xì)菌中表達(dá)的編碼免疫球蛋白基因或其片段的表達(dá)文庫(kù)。例如，完整Fab片段、Vh區(qū)和Fv區(qū)能用噬菌體表達(dá)文庫(kù)在細(xì)菌中表達(dá)。參見(jiàn)，例如，Ward等人，Nature341:544-546(1989);Huse等人，Science246:1275-1281(1989);McCafferty等人，Nature348:552-554(1990)。例如，用CD40L肽篩查這些文庫(kù)能鑒定CD40L反應(yīng)性的免疫球蛋白片段。此外，SCID-hu小鼠(可從Genpharm獲得)也能用來(lái)生產(chǎn)抗體或其片段。標(biāo)題為"抗-gp39抗體及其應(yīng)用"的PCT專利申請(qǐng)?zhí)朩O95/06666描述了生產(chǎn)抗CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)單克隆抗體(mAb)的方法和適用于本發(fā)明的方法的單克隆抗體，其內(nèi)容在此引用作為參考。本發(fā)明特別優(yōu)選的抗人CD40L抗體是MAb24-31和89-76，分別由雜交瘤24-31和89-76產(chǎn)生。(這些抗體如美國(guó)專利號(hào)5,747,037所述克隆)。分別產(chǎn)生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤按照布達(dá)佩斯條約條款于1994年9月2日保藏于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209。89-76雜交瘤分配ATCC保藏號(hào)HB11713，24-31雜交瘤分配ATCC保藏號(hào)HB11712。重組抗-CD40L抗體，如嵌合和人源化抗體，能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)通過(guò)操作編碼抗-CD40L抗體的核酸(例如DNA或cDNA)生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈的分離的核酸分子，或其部分，它們對(duì)CD40L特別是人CD40L有反應(yīng)性。編碼免疫球蛋白的核酸能編碼免疫球蛋白輕鏈(Vl)或重鏈(VH)可變區(qū)，含有或不含連接的重鏈或輕鏈恒定區(qū)(或其部分)。這些核酸能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從產(chǎn)生抗-人CD40LmAb的細(xì)胞(例如雜交瘤)中分離。例如，編碼24-31或89-76mAb的核酸能通過(guò)cDNA文庫(kù)篩查、PCR擴(kuò)增或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分別從24-31或89-76雜交瘤中分離。而且，編碼抗-人CD40LmAb的核酸能摻入表達(dá)載體中，并導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，以利于重組抗-人CD40L抗體的表達(dá)和產(chǎn)生。為了制備抗-CD20、抗-CD40L或抗-CD40抗體，能使用上迷方法。除了可識(shí)別并結(jié)合CD40L并抑制CD40與CD40L相互作用的抗體之外，還涉及其它CD40L拮抗劑，單獨(dú)或與其它治療(例如放射治療或化學(xué)治療)聯(lián)合用于治療B細(xì)胞淋巴瘤和白血病。CD40L拮抗劑可以是CD40L配體的可溶形式。CD40L的單價(jià)可溶性配體，如可溶性CD40,能結(jié)合CD40L，從而抑制CD40L與表達(dá)的B細(xì)胞上的CD40的相互作用。術(shù)語(yǔ)"可溶性"是指配體不與細(xì)胞膜永久結(jié)合?？扇苄訡D40L配體能通過(guò)化學(xué)合成或優(yōu)選地通過(guò)重組DNA技術(shù)制備，例如只表達(dá)配體的胞外域(缺乏跨膜和胞質(zhì)域)。一種優(yōu)選的可溶性CD40L配體是可溶性CD40。此外，可溶性CD40L配體也可以是融合蛋白的形式。這種融合蛋白含有與第二秤分子連接的CD40L配體的至少一部分。例如，CD40能表達(dá)為含免疫球蛋白的融合蛋白(即CD40Ig融合蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)一種融合蛋白，其含有CD40分子胞外域部分的氨基酸殘基，與對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白重鏈(例如Cal)鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的序列的氨基酸殘基連接，形成CD40Ig融合蛋白(參見(jiàn)，例如，Linsley等人，J.Exp.Med.1783:721-730(1991);Capon等人，Nature337:525-531(1989);美國(guó)專利號(hào)5，116，964(1992))。這些融合蛋白能通過(guò)化學(xué)合成或優(yōu)選地根據(jù)CD40的cDNA通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)(Stamenkovic等人，EMBOJ.8:1403-1410(1989))。以適于體內(nèi)給藥的生物相容形式對(duì)患者施用CD40L或CD40拮抗劑。"適于體內(nèi)施用的生物相容形式"是指將要施用的拮抗劑形式，其中蛋白質(zhì)的治療效果超過(guò)毒性作用。術(shù)語(yǔ)"患者"包括能引發(fā)免疫應(yīng)答的活生物，例如哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的患者的例子包括人、狗、貓、馬、母牛、豬、山羊、綿羊、小鼠、大鼠及其轉(zhuǎn)基因種。CD40L或CD40拮抗劑能以任何藥理學(xué)形式施用，任選地在藥學(xué)可接受的載體中。治療有效量的CD40L或CD40拮抗劑的施用定義為有效的量，即獲得希望的結(jié)果(例如抑制所治療的腦淋巴瘤的進(jìn)展或增殖)所需的劑量和時(shí)間。例如，CD40L拮抗劑的治療有效量可根據(jù)因素不同而不同，如患者的疾病分期(例如I期與IV期)、年齡、性別、醫(yī)學(xué)并發(fā)癥(例如AIDS)和體重，和拮抗劑在患者中引發(fā)希望的反應(yīng)的能力。可以調(diào)整劑量方案，以產(chǎn)生最佳治療反應(yīng)。例如，可以每天施用幾份分開(kāi)的劑量，或者可以按照治療情況急需按比例減少劑量。活性化合物(如抗-CD40抗體)自身或與其它活性劑組合，可以以方便的方式施用，例如注射(皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)等)、口服、吸入、穿皮或直腸施用。根據(jù)施用途徑，活性化合物可以包被于物質(zhì)中，以保護(hù)化合物免遭酶、酸或可滅活該化合物的其它自然條件的作用。一種優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)(i.v.)注射。為了通過(guò)腸胃外施用之外的方式施用CD40L拮抗劑或CD40拮抗劑，可能必須用防止其滅活的物質(zhì)包被該拮抗劑，或與之同時(shí)施用。例如，拮抗劑能在合適的載體或稀釋劑中對(duì)個(gè)體施用，與酶抑制劑同時(shí)施用，或在合適的載體如脂質(zhì)體中。藥學(xué)可接受的稀釋劑包括鹽水和水緩沖液。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂質(zhì)體包括油包水、水包油型乳劑，以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等人，J.Neuroimmunol.7:27(1984))。其它藥學(xué)可接受的載體和賦形劑在本領(lǐng)域中周知?；钚曰衔镆部梢阅c胃外或腹膜內(nèi)施用。也能在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中進(jìn)行分散。在普通^存和使用條件下，這些制品可含有防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。適于注射的藥用組合物包括無(wú)菌水溶液(水溶性的)或分散液和用于隨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。在所有情況下，組合物必須是無(wú)菌的，并且必須具有易于注射的流動(dòng)性。它在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，必須能防止微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的分散基質(zhì)及其合適的混合物。例如，使用包被如卵磷脂，在分散時(shí)保持需要的顆粒大小，使用表面活性劑，都能保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。使用多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑能防止微生物的作用，如paraben、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況中，組合物中優(yōu)選地包含等滲劑，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。使組合物中含有一種延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠，能實(shí)現(xiàn)注射組合物的延時(shí)吸收。無(wú)菌注射溶液的制備方法是在合適的溶劑中摻入需要量的活性化合物(例如CD40L或CD40的拮抗劑自身，或與其它活性劑或抗-CD20抗體和抗-B細(xì)胞抗體組合)，需要時(shí)含有此處列舉的一種成分或其組合，隨后過(guò)濾除菌。分散液一般如下制備向無(wú)菌載體中摻入活性化合物，該載體含有基本分散基質(zhì)和需要的上述其它成分。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這由無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加其它任何希望的成分的粉末。當(dāng)活性化合物如上所述被適當(dāng)保護(hù)時(shí)，蛋白質(zhì)可以與例如惰性稀釋劑或可食用、可吸收的載體一起口服。在此使用時(shí)，"藥學(xué)可接受的載體"包括任何和所有的溶劑、分散基質(zhì)、包被、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些基質(zhì)和試劑在藥學(xué)活性物中的用途在本領(lǐng)域眾所周知。除了任一常規(guī)基質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的情況，它在治療組合物中的應(yīng)用是所希望的。上述使用CD40L或CD40拮抗劑的所有組合物也可含有附加的活性化合物(例如化療劑)。而且，上述藥用組合物也可用于制備含抗-CD20抗體的化合物。VIII.利用放射免疫療法對(duì)CNS的治療對(duì)于放射性標(biāo)記用作治療或診斷劑的活性抗體(例如抗-B細(xì)胞抗體等)，有幾種考慮。首先，必須選擇放射性同位素，然后必須選擇使放射性同位素與抗體結(jié)合的方法。對(duì)于放射性同位素的選擇，考慮因素的綜述見(jiàn)Magerstadt，《抗體偶聯(lián)物與惡性疾病》，93-109(1991)。必須主要考慮希望的輻射范圍(受肺瘤組織類型、是實(shí)體瘤還是播散性腫瘤、所有腫瘤細(xì)胞是否預(yù)期都是抗原陽(yáng)性的等參數(shù)影響)、能量釋放率、與輸注時(shí)間相比同位素的半衰期和清除率、是成像還是治療有助于標(biāo)記抗體的施用等。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的診斷成像目的，認(rèn)為用"Tc、mIii、1231或1311標(biāo)記是優(yōu)選的，用min或mi標(biāo)記最優(yōu)選的。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的治療目的，認(rèn)為用P-發(fā)射器如9GY或1311標(biāo)記是優(yōu)選的。值得為治療或診斷應(yīng)用考慮的醫(yī)學(xué)上合適的其它同位素有186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、211At、67Cu、212Pb和Lu的放射性同位素。考慮連接放射性同位素與抗體的方法時(shí)，必須首先考慮同位素的性質(zhì)。碘同位素能通過(guò)多種方法與抗體連接，它們使同位素直接與蛋白質(zhì)共價(jià)連接。氯胺T標(biāo)記(Greenwood等人，Biochem.J.89:114(1963))和iodogen標(biāo)記(Fraker等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.80:849-857(1978))是兩種常用的放射性碘標(biāo)記方法。對(duì)于金屬同位素，例如9°￥或186Re,同位素的連接方法一般是共價(jià)連接螯合部分與抗體，然后使螯合劑與金屬配位。這些方法例如在Gansow等人，美國(guó)專利號(hào)4，831，175;4,454,106和4,472,509中描述，在此引用作為參考。應(yīng)當(dāng)指出，用碘同位素(例如1311)標(biāo)記的抗體在向靶細(xì)胞內(nèi)化后脫卣，而通過(guò)螯合標(biāo)記的抗體經(jīng)歷放射誘導(dǎo)的螯合劑斷裂，從而通過(guò)配位復(fù)合物解離丟失放射性同位素。在某些情況中，從復(fù)合物中解離的金屬能再次復(fù)合，從而更快地清除非特異性定位的同位素，因此對(duì)非把組織有極低的毒性。例如，螯合劑化合物如EDTA或DTPA能輸入到患者體內(nèi)，使螯合劑結(jié)合釋放的放射性金屬，并促使游離的放射性同位素從尿中排泄。也注意到，脫卣產(chǎn)生的游離碘和小的碘化蛋白質(zhì)從體內(nèi)快速清除。這有利于使正常組織(包括骨髓)免遭放射毒性作用。Magerstadt(1991)也綜述了施用方法。對(duì)于淋巴瘤的治療，一方面考慮靜脈內(nèi)注射是一種良好方法，因?yàn)橥耆h(huán)對(duì)于快速破壞標(biāo)記抗體是有利的，特別是對(duì)于避免注射部位處放射性標(biāo)記的局部高濃度。靜脈內(nèi)(iv)施用受限于"血管屏障"，包括血管的內(nèi)皮細(xì)胞和也負(fù)責(zé)BBB的內(nèi)皮下基質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知如何配制適用于上述任何注射途徑的標(biāo)記抗體組合物。施用時(shí)間可能十分不同。能在一個(gè)大丸劑中提供全部劑量。此外，也能通過(guò)延長(zhǎng)的輸液法或通過(guò)長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的重復(fù)注射提供劑量。放射免疫治療之間優(yōu)選的間隔時(shí)間是6-12周。如果用低劑量進(jìn)行放射免疫治療，能以2周間隔施用藥劑。如果部分輸送總治療劑量，能在2-4天時(shí)間內(nèi)施用。由于輸注的劑量較低，能以較短間隔施用示蹤標(biāo)記的劑量；對(duì)于臨床應(yīng)用，優(yōu)選l-2周的間隔。使用的放射劑量可能十分不同。對(duì)于免疫診斷成像，應(yīng)用抗體的示蹤標(biāo)記，一般用約l-35mCi放射性同位素標(biāo)記約l-20mg抗體。劑量在一定程度上依賴于用于成像的同位素；此范圍的高限，優(yōu)選地約20-30mCi,應(yīng)當(dāng)使用99mTc和1231;此范圍的低限，優(yōu)選地約l-10mCi，應(yīng)當(dāng)應(yīng)用1311和mIn。為了成像，對(duì)患者施用約l-30mg這種示蹤標(biāo)記的抗體。為了放射免疫治療，抗體標(biāo)記為高比活性。獲得的比活性取決于使用的放射性同位素；對(duì)于1311,活性一般為l-10mCi/mg。對(duì)患者施用足量的抗體，使得接受的全身劑量可達(dá)1100cGy，但優(yōu)選地低于或等于500cGy?？贵w(包括標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗體)的量約為0.2-40mg/kg患者體重。標(biāo)記的抗-CD20抗體或抗-CD40抗體能用來(lái)診斷或確定PCNSL或其它腦淋巴瘤的位置。向全身提供約500cGy的放射性強(qiáng)度估計(jì)約為825mCi的1311。再次使用的放射性強(qiáng)度部分取決于選擇的同位素。對(duì)于使用1311的治療方案，可使用約5-1500mCi,優(yōu)選的是約5-800mCi,約5-250mCi是最優(yōu)選的。對(duì)于^Y治療，認(rèn)為約l-200mCi的放射性是合適的，更優(yōu)選的是約l-150mCi，約l-100mCi是最優(yōu)選的。由使用的放射性強(qiáng)度估計(jì)組織劑量的優(yōu)選方法是用示蹤劑量進(jìn)行成像或其它藥物動(dòng)力學(xué)方案，以獲得預(yù)測(cè)劑量的估計(jì)值。在診斷和治療施用之一或兩者之前能"預(yù)施用"未標(biāo)記的抗體。發(fā)現(xiàn)預(yù)施用對(duì)成像和治療的影響因患者而不同。一般優(yōu)選使用預(yù)劑量逐漸提高的未標(biāo)記抗體，進(jìn)行一系列診斷成像施用。然后應(yīng)用可產(chǎn)生最佳腫瘤劑量與全身劑量之比的預(yù)劑量，之后施以放射免疫治療劑量。Goldberg等人描述了使用抗瘙胚抗原(CEA)抗體對(duì)實(shí)體瘤(癌)的放射免疫診斷成像和放射免疫治療(J.Clin.Oncol.9:548(1991))。美國(guó)專利號(hào)4,348,376和4,460,559(在此引用作為參考)描述的材料與方法的許多方面也適用于本發(fā)明，它是針對(duì)大腦淋巴瘤的診斷和治療。參考文獻(xiàn)中提供了用于估計(jì)患者接受放射劑量的方法的其它描述(Siegel等人，Med.Phys.20:579-582(1993))。IX.藥用組合物本發(fā)明的抗-B細(xì)胞抗體(例如抗-CD20、抗-CD22、抗-CD21、抗-CD40或抗-CD40L抗體或其片段)與可檢測(cè)標(biāo)記物或治療劑的偶聯(lián)或連接能使用共價(jià)或其它化學(xué)結(jié)合方法?；瘜W(xué)結(jié)合法包括，例如戊二醛、異雙功能和同雙功能連接劑。異雙功能連接劑包括，例如SMPT(琥珀酰亞胺羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基dition)-tolume)、SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-亞吡啶基硫代)-丙酸和SMCC(琥珀酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸。同雙功能連接劑包括，例如DMP(二甲基pimelimidate)、DMA(二甲基suberinidate)和DTBP(二甲基3，3，-二硫-雙丙亞胺)。一些蛋白質(zhì)可檢測(cè)標(biāo)記物和治療劑能與本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)重組結(jié)合，構(gòu)建作為融合蛋白的組合物，其中單克隆抗體的可變區(qū)保持其結(jié)合特異性，而可檢測(cè)標(biāo)記物或治療劑保留其活性。構(gòu)建這些融合蛋白的重組方法在本領(lǐng)域周知。本發(fā)明包括含有單克隆抗體或重組結(jié)合蛋白(偶聯(lián)或未偶聯(lián))的藥用組合物。一種藥用組合物可含有單克隆抗體和藥學(xué)可接受的載體。對(duì)于本發(fā)明，"藥學(xué)可接受的載體"可以是本領(lǐng)域眾所周知的任何標(biāo)準(zhǔn)載體。例如，合適的載體包括磷酸緩沖液、乳劑如水包油乳劑和不同類型的濕潤(rùn)劑。其它載體包括無(wú)菌溶液、片劑、包衣片劑和膠嚢。這些載體一般能含有賦形劑，如淀粉、牛奶、糖、粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或釣、滑石、植物脂或植物油、樹膠、甘油或其它已知的賦形劑。這些載體也包括香味和顏色添加劑、防腐劑或其它成分。含有這些載體的組合物通過(guò)眾所周知的常規(guī)方法配制。參見(jiàn)《Remington制藥學(xué)》(第15版，1980)。對(duì)于診斷用途，能標(biāo)記或不標(biāo)記抗體和重組結(jié)合蛋白。診斷測(cè)定一般需要檢測(cè)細(xì)胞表面上單克隆抗體或重組結(jié)合蛋白與人CD20結(jié)合形成的復(fù)合物。當(dāng)未標(biāo)記時(shí)，抗體和重組結(jié)合蛋白可用于凝集試驗(yàn)。另外，未標(biāo)記的抗體也能與對(duì)單克隆抗體或重組結(jié)合蛋白有特異反應(yīng)性的其它標(biāo)記抗體(第二抗體)(如免疫球蛋白特異的抗體)組合應(yīng)用。此外，單克隆抗體和重組結(jié)合蛋白也可直接標(biāo)記。能使用多種標(biāo)記物，如放射性核素、(上述)熒光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、配體(特別是半抗原)等。多種類型的免疫測(cè)定在本領(lǐng)域眾所周知。熒光測(cè)定中常使用本發(fā)明的單克隆抗體和重組結(jié)合蛋白，其中抗體或重組結(jié)合蛋白與熒光分子如異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。下列實(shí)施例并非意在限制本發(fā)明，而是提供本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的鞘內(nèi)瑞圖希單抗由于腦膜復(fù)發(fā)是淋巴瘤患者的常見(jiàn)復(fù)發(fā)部位，使用瑞圖希單抗可有益于預(yù)防或抑制腦膜復(fù)發(fā)的出現(xiàn)。材料與方法。一種連續(xù)保持的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型已經(jīng)由NCI批準(zhǔn)，它有一個(gè)與皮下Ommaya容器連接的慢性留置的Pudenz第4室導(dǎo)管。該導(dǎo)管允許在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)未麻醉的動(dòng)物進(jìn)行腦脊液(CSF)采樣(參見(jiàn)，McCully等人，Lab.AnimalSci.40:520-525(1990))。劑量可達(dá)10mg的瑞圖希單抗以完全濃度(10mg/ml)施用，或在不含防腐劑的無(wú)菌鹽水中稀釋為可達(dá)lml,。保存稀釋藥物溶液的樣品用于以后分析瑞圖希單抗?jié)舛?。使用的?dòng)物是4只重約10kg的成年雄性恒河猴(Macacamulatta)。動(dòng)物靠NIH公開(kāi)配方壓制的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物飲食維持，每曰喂養(yǎng)動(dòng)物兩次。1號(hào)動(dòng)物(缺少CSF采集裝置)通過(guò)臨時(shí)腰導(dǎo)管腰內(nèi)注射瑞圖希單抗。如果1號(hào)動(dòng)物耐受瑞圖希單抗，另外3只動(dòng)物通過(guò)皮下進(jìn)入裝置在側(cè)腦室中接受瑞圖希單抗劑量。從第4室Ommaya容器獲得這些動(dòng)物的樣品，至少一只動(dòng)物也從腰間隙獲得。在每次CSF樣品采集之前和之后向Ommaya容器泵氣4次，以確保與腦室CSF充分混合。帶有Ommaya容器的兩只動(dòng)物在腰內(nèi)施用瑞圖希單抗后也進(jìn)行第4心室CSF采樣，以估計(jì)藥物從腰間隙向心室的分配。在完成藥物動(dòng)力學(xué)研究后，通過(guò)每周向三只動(dòng)物腰內(nèi)注射劑量6周以上估計(jì)鞘內(nèi)瑞圖希單抗的耐受。在鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用可達(dá)10mg后，用4只動(dòng)物研究瑞圖希單抗的CSF藥物動(dòng)力學(xué)。在施用之前和施用瑞圖希單抗0.5、1、2、3、4、6、8、10、24小時(shí)后采集CSF樣品(0.3ml)。這些樣品立即在-70t:下冷凍，并凍存于聚丙烯管中。實(shí)施例2在大鼠模型原發(fā)性CNS淋巴瘤的治療中，向腦脊液中施用瑞圖希單抗材料與方法。不荷腫瘤的棵鼠接受通過(guò)小腦延髓池穿刺術(shù)輸送的劑量升高的抗體，估計(jì)其毒性。向大鼠施用5-100jil體積(大鼠的CSF體積約為lml)的瑞圖希單抗(10mg/ml)。假如沒(méi)有毒性，則進(jìn)行效能研究。將證明抗-CD20敏感的B淋巴瘤細(xì)胞植入大鼠的小腦延髓池中。然后將動(dòng)物分為兩組，每組10只對(duì)照和肺瘤植入1周后的瑞圖希單抗治療組。終點(diǎn)是測(cè)量神經(jīng)學(xué)性質(zhì)，體重喪失、存活率和抗淋巴瘤活性的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)相關(guān)性。實(shí)施例3人類PCNSL患者中瑞圖希單抗的檢測(cè)材料與方法。通過(guò)向Ommaya容器中注射5-10ml瑞圖希單抗給藥。注射前，取出相等體積的CSF，使CSF體積的明顯流出量最少(成人中的平均CSF體積為104ml)。不進(jìn)行其它化學(xué)治療或放射治療。治療包括向Ommaya容器中注射體積為5-10ml的瑞圖希單抗。在1、2、4、24、48、72小時(shí)和7天時(shí)，并在之后以固定間隔測(cè)定瑞圖希單抗的CSF和血清水平。復(fù)發(fā)PCNSL患者在病理學(xué)分析中肯定為CD20+?；颊弑仨殲?7歲以上，KPS小于50,預(yù)期壽命少于2個(gè)月，PCNSL累及全身，并且在開(kāi)始CSF內(nèi)施用瑞圖希單抗不到5周之前不能接受放射或化學(xué)治療。研究患者分為三組，每組通過(guò)Ommaya容器接受一定劑量水平的瑞圖希單抗。一周后，以取決于計(jì)算的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中清除率的間隔向CSF中重復(fù)施用瑞圖希單抗。瑞圖希單抗施用繼續(xù)90天，其間繼續(xù)評(píng)價(jià)毒性和反應(yīng)。提前終止歸類為由CSF內(nèi)施用瑞圖希單抗引起的四級(jí)神經(jīng)毒性。神經(jīng)毒性是評(píng)價(jià)安全性和確定研究應(yīng)當(dāng)終止還是使用較低劑量的基礎(chǔ)。假如在給定的劑量水平?jīng)]有毒性，則將劑量提高到下一水平。目的在于確定安全劑量，對(duì)于人類，其達(dá)到的CSF中的瑞圖希單抗低谷水平至少10倍于與活性相關(guān)的血清低谷水平(McLaughlin等人，J.Clin.Oncol.16:2825-2833(1998))。實(shí)施例4為了治療PCNSL對(duì)人類患者施用瑞圖希單抗與氨甲喋呤的方法累及CNS的淋巴瘤患者能用鞘內(nèi)氨甲喋呤(15mg)聯(lián)合劑量為250mg/M2每周4次到350mg/M2每周4次的瑞圖希單抗治療。實(shí)施例5用放射性標(biāo)記的瑞圖希單抗和CHOP治療PCNSL的方法PCNSL患者能用放射性標(biāo)記的瑞圖希單抗和化學(xué)治療組合CHOP(例如環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)如下治療。CHOP治療將按照標(biāo)準(zhǔn)方法靜脈內(nèi)施用。131-碘標(biāo)記的瑞圖希單抗以約l-10mCi的劑量對(duì)患者鞘內(nèi)施用，(標(biāo)記和未標(biāo)記的)瑞圖希單抗的量為約0.2-40mg/kg患者體重。放射性瑞圖希單抗能在一個(gè)大丸劑中或在約2-4天時(shí)間內(nèi)施用。上述所有參考文獻(xiàn)在此完整引用作為參考。權(quán)利要求1.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤的方法，包括施用治療有效量的抗-CD20抗體或其片段的步驟。2.—種治療或預(yù)防淋巴瘤患者腦膜復(fù)發(fā)的方法，包括施用治療有效量的抗-CD20抗體或其片段的步驟。3.權(quán)利要求l的方法，其中CNS淋巴瘤選自原發(fā)性CNS淋巴瘤(PCNSL)、軟腦膜轉(zhuǎn)移(LM)或累及CNS的何杰金氏病。4.權(quán)利要求3的方法，其中CNS淋巴瘤是LM,抗-CD20抗體或其片段與阿糖胞苷和硫替哌或氨甲喋呤和min-二乙烯三胺戊乙酸聯(lián)合施用。5.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體片段選自Fab、Fab，和F(ab，)2。6.權(quán)利要求2的方法，其中抗-CD20抗體片段選自Fab、Fab，和F(ab，)2。7.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體是人類抗體、人源化、雙特異性或嵌合抗體。8.權(quán)利要求2的方法，其中抗-CD20抗體是人類抗體、人源化、雙特異性或嵌合抗體。9.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗或IF5。10.權(quán)利要求2的方法，其中抗-CD20抗體是瑞自希單抗或IF5。11.權(quán)利要求9的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并以每周約10-約375mg/lVf共4周的劑量對(duì)患者施用。12.權(quán)利要求ll的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并以每周約10-約375mg/MZ共4周的劑量對(duì)患者施用。13.權(quán)利要求l的方法，其中鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用抗-CD20抗體。14.權(quán)利要求2的方法，其中鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用抗-CD20抗體。15.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體與氨甲喋呤、CHOP、CHOD、阿糖胞苷、甲酰四氫葉酸、硫替哌和長(zhǎng)春新堿或其組合聯(lián)合施用。16.權(quán)利要求2的方法，其中抗-CD20抗體與氨甲喋呤、CHOP、CHOD、阿糖胞苷、甲酰四氫葉酸、硫替哌和長(zhǎng)春新堿或其組合聯(lián)合施用。17.權(quán)利要求l的方法，其中在全腦照射前施用抗-CD20抗體。18.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并與氨甲喋呤一起鞘內(nèi)施用。19.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗，并且標(biāo)記抗體。20.權(quán)利要求19的方法，其中瑞圖希單抗用選自211At、212Bi、67Cu、123I、131I、mIn、32P、212Pb、186Re、1S8Re、153Sm、99mTc和90Y的同位素標(biāo)記并以放射免疫治療有效量施用。21.權(quán)利要求20的方法，其中放射免疫治療有效量對(duì)患者全身提供劑量約為10-約200cGy的照射。22.權(quán)利要求21的方法，其中抗-CD20抗體與抗-CD40抗體或抑制CD40與CD40L相互作用的試劑聯(lián)合施用。23.權(quán)利要求22的方法，其中以藥學(xué)可接受的抗體劑量施用抗-CD20抗體，約為0.001-約30mg/kg人體重。24.權(quán)利要求23的方法，其中以藥學(xué)可接受的抗體劑量施用抗-CD20抗體，約為0.01-約25mg/kg人體重。25.權(quán)利要求24的方法，其中以藥學(xué)可接受的抗體劑量施用抗-CD20抗體，約為0.4-約20.0mg/kg人體重。26.—種診斷患者PCNSL的方法，包括下列步驟(A)對(duì)患者施用與可檢測(cè)標(biāo)記物結(jié)合的抗-CD20抗體或抗-CD20抗體片段；(B)檢測(cè)該標(biāo)記物的位置。27.權(quán)利要求26的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)記物是211At、212Bi、67Cu、123I、131I、mIn、32P、212Pb、1S6Re、18SRe、153Sm、99mTc或90Y。28.權(quán)利要求26的方法，其中抗-CD20抗體是瑞圖希單抗。29.權(quán)利要求l的方法，其中抗-CD20抗體與血腦屏障(BBB)通透性增強(qiáng)劑連接。30.權(quán)利要求29的方法，其中BBB通透性增強(qiáng)劑是OX-26、B3/25、Tf6/14、OKT-9、L5.1、5E-9、RI7217和T58/30。31.權(quán)利要求1的方法，其中抗-CD20抗體進(jìn)一步含有親脂性載體或免疫親脂性載體。32.權(quán)利要求31的方法，其中親脂性載體是甲基千肼、Q-3脂肪酸、甘油二醋、二酰磷脂、溶血磷脂、膽固醇或類固醇。33.權(quán)利要求l的方法，其進(jìn)一步包括與抗-CD20抗體或其片段聯(lián)合施用抗-B細(xì)胞抗體或其片段的步驟。34.權(quán)利要求33的方法，其中抗-B細(xì)胞抗體是抗-CD19抗體或其片段、抗-CD22抗體或其片段、抗-CD38抗體或其片段或抗-主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II抗體或其片段。35.—種通過(guò)鞘內(nèi)施用治療CNS淋巴瘤的組合物，其含有抗-CD20抗體和抗-B細(xì)胞抗體，其中以約0.4-20.0mg/kg體重的劑量施用該抗體。36.—種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤的方法，其包括鞘內(nèi)施用治療有效量的可與B細(xì)胞抗原結(jié)合的抗體或其片段。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗原選自CDIO、CD14、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體是一種B細(xì)胞消耗性抗體。39.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種毒素偶聯(lián)。40.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種藥物偶聯(lián)。41.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種酶偶聯(lián)。42.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與一種放射性核素偶聯(lián)。43.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段與至少一種化療劑聯(lián)合施用。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述化療劑選自硫替哌、環(huán)磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、笨佐替派、卡波醌、美妥替哌、烏瑞替派、六甲蜜胺、曲他胺、三乙撐磷跣胺、三乙撐硫代磷酰胺、三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、雙氯乙基甲胺、鹽酸氧化雙氯乙基甲胺、美法侖、novembiehin、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、偶氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、加利車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、久莫霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、絳色霉素、鏈脲霉素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲葉酸、氨甲喋呤、蝶羅呤、三甲曲沙、氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤、環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU、卡魯睪酮、丙酸屈他雄嗣、表硫雄醇、美雄氨、睪內(nèi)酯、氨魯米特、米托坦、曲洛司坦、frolinicacid、醋葡醛內(nèi)酯、aldophosphamide糖苷、氨基乙跣丙酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、依達(dá)曲沙、defofamine、地美可辛、地吖醌、依氟鳥氨酸、乙酸eHiptinium、依托格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達(dá)明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌達(dá)醇、nitracrine、噴司他丁、phenamet、牝柔比星、podophyllinicacid、2國(guó)乙基醜肼、甲基千肼、丙亞胺、西佐喃、鍺螺胺、細(xì)格孢氮雜酸、三亞胺醌、2，2，,2，，-三氯三乙胺、烏拉坦、長(zhǎng)春地辛、達(dá)卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、派泊溴烷、gacytosine、阿拉伯糖苷、環(huán)磷酰胺、硫替哌、紫杉醇、紫杉萜(doxetaxel)、笨丁酸氮芥、吉西他濱、6-硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、氨甲喋呤、順鉑、卡鉑、長(zhǎng)春堿、鉑、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16)、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞賓、navelbine、三鞋基蒽醌、替尼泊戒、柔紅霉素、氨基蝶呤、xeloda、伊拜膦酸鹽、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(DMFO)、視黃酸、埃斯波霉素、capecitabine、他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone、托瑞米芬、氟他胺、尼魯米特、bicalutamide、亮丙瑞林、戈舍瑞林；和上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。45.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體或抗體片段對(duì)選自CD19、CD20、CD21、CD22、CD37和CD40的B細(xì)胞抗原是特異的。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述抗體或抗體片段是RITUXAN⑧，該治療方法還包括細(xì)胞因子的施用。47.權(quán)利要求46的方法，其中細(xì)胞因子是IL-IO。48.權(quán)利要求36的方法，其包括消耗性抗-CD20抗體和CD40L拮抗劑的施用。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述CD40L拮抗劑是一種可特異結(jié)合CD40L的抗體。50.權(quán)利要求36的方法，其中施用一種放射性標(biāo)記的抗-CD20抗體。全文摘要本發(fā)明描述了利用抗B-細(xì)胞抗體(優(yōu)選地抗-CD20，最優(yōu)選地瑞圖希單抗)治療腦B細(xì)胞淋巴瘤，特別是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)，和預(yù)防腦膜復(fù)發(fā)的方法。這些抗體能單獨(dú)鞘內(nèi)施用，或與其它化療劑(如氨甲喋呤)或其它抗-B細(xì)胞抗體聯(lián)合，治療無(wú)免疫應(yīng)答或有免疫應(yīng)答的患者的PCNSL。這些抗體也能用于診斷CNS淋巴瘤患者，特別是無(wú)免疫應(yīng)答的患者。文檔編號(hào)A61P35/00GK101130078SQ200710148288公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2001年4月25日優(yōu)先權(quán)日2000年4月25日發(fā)明者A·J·格利洛-洛佩茲申請(qǐng)人:拜奧根Idec公司