專利名稱：一種腫瘤細(xì)胞生長抑制物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤細(xì)胞生長及增殖的抑制物質(zhì)及其制備方法，特別涉及一種多糖類的腫瘤細(xì)胞生長及增殖抑制物質(zhì)及其制備方法，屬醫(yī)治腫瘤疾患技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是繼心血管疾病之后，排名第二的人類致命疾患。癌癥的治療，是世界醫(yī)學(xué)界的難題。癌癥的病因復(fù)雜，種類多，機(jī)理又難以全面認(rèn)知，并且因人類的個(gè)體差異、人種、地理、飲食、環(huán)境、遺傳等因素的綜合影響，增加了治療的難度。通常，對早期癌癥，一般采用手術(shù)治療，輔以放療、化療等手段；這種治療方法的缺陷是治愈率較低，癌癥患者在治療時(shí)很痛苦，費(fèi)用較高；對于非早期癌癥患者，則難有理想的治療方法，癌癥患者的死亡率一直很高。加拿大專利CIPO2085352介紹了一種骨髓細(xì)胞分泌的分子量為1,000～10,000之間的脂類物質(zhì)，該種脂類物質(zhì)具有免疫抑制作用。另一篇文獻(xiàn)報(bào)道了一種具有抗腫瘤作用的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，這種骨髓基質(zhì)細(xì)胞是一種貼壁生長具有粘附性的細(xì)胞[Maestroni GJ，Hertens E，Galli P.Factor(s)fromnonmacrophage bone marrow stromal cells inhibit lewis lungcarcinoma and B16 melanoma growth in mice.Cell Mol life Sci1999 Apr；55(4)663-7]；還有一篇文獻(xiàn)介紹了一種具有抗腫瘤作用的骨髓細(xì)胞分泌物，該骨髓細(xì)胞分泌物分子量小于12000道爾頓，對羧肽酶的消化作用非常敏感，其抗腫瘤作用可被羧肽酶迅速降解。[Dittmer JE，Oh SK，Corwin L，Bennett M·Suppression of tumor cell growth in vitro bya bone marrow factor.Cancer Res 1984；Mar；44(3)900-3]
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為多數(shù)癌癥患者提供一種全新的多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物質(zhì)。該物質(zhì)具有在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用，這種作用具有劑量-效應(yīng)關(guān)系、沒有種屬特異性、不受MHC的限制。目前已知的能夠被該多糖類物質(zhì)抑制的腫瘤細(xì)胞系包括人前列腺癌細(xì)胞、人淋巴瘤細(xì)胞、人白血病、人卵巢癌、人膀胱癌、人肝癌、人結(jié)腸癌、人上皮細(xì)胞癌、人胃癌及多種鼠類腫瘤細(xì)胞等。
本發(fā)明所述的多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物為一種由多種哺乳動(dòng)物的骨髓中的一種體積較大、密度較低、體外培養(yǎng)時(shí)無粘附性的CD31+細(xì)胞所分泌。是一種經(jīng)過對該種細(xì)胞培養(yǎng)的上清液的提取、純化而獲得的水溶性的、帶有陰離子基團(tuán)的、其抗腫瘤作用沒有種屬特異性、不受MHC限制的多糖類物質(zhì)，該多糖類物質(zhì)的分子量小于1000道爾頓。
以質(zhì)譜測量法對本多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物活性基團(tuán)進(jìn)行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)其中一種分子量為372的陰離子基團(tuán)具有本腫瘤細(xì)胞生長抑制物完整的抗腫瘤生物學(xué)活性。將該基團(tuán)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)局(NIST/EPA/NIH)質(zhì)譜測量數(shù)據(jù)庫中分子量為372的156種已知基團(tuán)進(jìn)行比較，沒有發(fā)現(xiàn)其中任何一種基團(tuán)具備該基團(tuán)所具有的生物學(xué)活性，它是一種全新的具有抗腫瘤活性的物質(zhì)。
本發(fā)明所述的多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物的顯著特點(diǎn)為1、具有明顯的抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用，這種作用具有劑量-效應(yīng)的關(guān)系；2、其抗腫瘤活性沒有MHC限制，無種屬的特異性；3、耐熱，煮沸不能使其活性喪失；4、可溶于水、甲醇，不溶于己烷、二氯甲烷；5、羧肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等對該多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物質(zhì)沒有降解作用，說明該物質(zhì)是一種非蛋白質(zhì)及非多肽類物質(zhì)；6、生物活性濃度為毫微克級。
本腫瘤細(xì)胞生長抑制物質(zhì)的活性單位測定以鼠早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞WEHI-3作為靶細(xì)胞系。其活性單位是指，在該物質(zhì)作用下，靶細(xì)胞系WEHI-3于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞分裂速率降低一半所需該物質(zhì)的量。約每0.1毫升上清液具有1個(gè)單位的抑制活性本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備該多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物的方法。具體的制備步驟為1、在哺乳類動(dòng)物中選出一種小動(dòng)物，2、從該種動(dòng)物的骨髓中分離取出骨髓細(xì)胞，3、用該骨髓細(xì)胞培養(yǎng)制備上清液，4、C18層析，5、凝膠滲透色譜，6、陰離子交換FPLC，7、(NH2)HPLC，8、反相HPLC。
具體實(shí)施例方式以大鼠骨髓制備本多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物；實(shí)施例1(1)、動(dòng)物準(zhǔn)備選體重為250-350克的Sprague Dawley(SD)雌性或雄性大鼠；(2)、骨髓細(xì)胞的準(zhǔn)備將SD大鼠用CO2窒息至死后于無菌狀態(tài)取出其股骨和脛骨，用10ml注射器和18號針頭將骨髓細(xì)胞沖洗出來，使其進(jìn)入10ml的培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿中含有已消毒的Hank’s平衡鹽溶液。通過利用逐漸變細(xì)針頭的沖洗，將骨髓細(xì)胞懸液變?yōu)槠鋯渭?xì)胞懸液，用HBSS再洗滌后將該單細(xì)胞懸液移入20ml玻璃小瓶中，通過將6ml大鼠淋巴細(xì)胞分離液置于懸液底部，在每分鐘1500轉(zhuǎn)的條件下離心30分鐘以去除紅細(xì)胞和其他碎屑，收集存留于交界面的細(xì)胞，用HBSS洗滌3次。
(3)、細(xì)胞培養(yǎng)將通過上述方法獲得的大鼠骨髓細(xì)胞鋪于150×20mm的培養(yǎng)皿中(含有無血清的HBSS)，密度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升；24小時(shí)后收集骨髓細(xì)胞的上清液，再加入新鮮的HBSS至培養(yǎng)皿中，48小時(shí)再收集一次骨髓細(xì)胞的上清液。收集的上清液在2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘以除去較大的碎屑，然后以0.2μm過濾膜過濾，過濾液于-70℃條件下儲存。
(4)、C18層析將C18層析柱先以10ml甲醇清洗，再用10ml去離子水蒸餾水洗滌，然后，用最大量不超過100ml的大鼠骨髓細(xì)胞上清液通過C18層析柱。層析完畢后，用5ml去離子水蒸餾水清洗C18層析柱，用3ml甲醇洗滌吸附在C18層析柱上的物質(zhì)，將該洗滌液在氮?dú)鈿饬飨聦⒓状颊舭l(fā)干凈，再將層析提取物溶解于小體積的甲醇中備用。在分析提取物的體外實(shí)驗(yàn)活性前，蒸發(fā)甲醇并再次加入已消毒的培養(yǎng)基。
(5)、凝膠滲透色譜Bio-Gel P-2為理論上能夠排除分子量大于1800Da的物質(zhì)的凝膠，將凝膠用20mM，PH 7.2的Tris-HCL緩沖液清洗并預(yù)膨脹，在真空下輕柔地?cái)嚢枰詮氐壮怏w。將經(jīng)過上述處理的Bio-Gel P-2凝膠置入玻璃圓筒。大鼠骨髓細(xì)胞上清液的C18層析柱提取物，在氮?dú)鈿饬飨抡舭l(fā)掉甲醇，再將其溶解于2.5毫升20mM的Tris-HCL緩沖液中，PH 7.2。然后將該樣本小心地加入圓柱體，并調(diào)節(jié)流量為7.8-8.2ml/小時(shí)，用收集器分段收集樣本，分光光度計(jì)測量各樣本在215nm的吸收值，用前述方法以C18層析柱再次收集各段樣本，用WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性。
(6)、陰離子交換FPLC將經(jīng)C18層析柱及凝膠滲透色譜提純的，具有生物學(xué)活性的提取物再次溶解于0.5ml、20mM的Tris-HCL緩沖液中，PH 8.4。通過陰離子交換FPLC層析柱將該物質(zhì)分離，然后在0-0.4M NaCL梯度下進(jìn)行洗脫，并測定其280nm的峰值。這些被洗脫物質(zhì)如前所述，再用C18層析柱提取，以WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性。
(7)、(NH2)HPLC將經(jīng)C18層析柱、凝膠滲透色譜及陰離子交換FPLC所得到的具有生物學(xué)活性的提取物溶解于150μl、80％的acetonitrile液中，以(NH2)HPLC層析柱進(jìn)行分離，流量為1ml/min，收集各段，測量215nm的吸收值，再以C18層析柱提取，并以WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性。
(8)、反相HPLC
將經(jīng)C18層析柱、凝膠滲透色譜及陰離子交換FPLC，及(NH2)HPLC獲得的具有生物活性的提取物，加入45μl含25％acetonitrile及0.1TFA的雙蒸水中，以C8層析柱進(jìn)行反相HPLC分離，流量為0.2ml/min，收集各段，測量215nm的吸收值，再以C18層析柱提取，并以WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性。
完成以上各步驟后獲得本多糖類腫瘤細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)，其活性和得率如下表純化步驟 體積(毫升)活性(單位)得率(％)上清液 6000C18層析 806871凝膠滲透色譜9 5653 82.0陰離子交換FPLC 5 2152 31.3(NH2)HPLC 1.3 865 12.6反相HPLC1.2 593 8.6實(shí)施例2本腫瘤細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)對于前列腺癌細(xì)胞DU-145、PC-3、LNCaP的生長抑制作用實(shí)驗(yàn)(1)、按實(shí)施例1所述制備本多糖類腫瘤細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)；(2)、腫瘤細(xì)胞系的準(zhǔn)備前列腺癌細(xì)胞系DU-145、PC-3、LNCaP購自美國典型培養(yǎng)保藏中心(ATCC，ROCKVILL MARYLAND)。其中DU-145與LNCaP細(xì)胞分別保存于加有10％胎牛血清(FCS)的α-MEM培養(yǎng)液中，PC-3細(xì)胞保存于加有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)液中。所有細(xì)胞均在37℃、5％CO2濕潤條件下生長，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到融合狀態(tài)時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶作用進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
(3)、生長抑制實(shí)驗(yàn)當(dāng)細(xì)胞生長處于對數(shù)生長期時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶作用提取細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的濃度將細(xì)胞加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，加入細(xì)胞溶液的體積為100μl，同時(shí)，每孔中加入如圖所示濃度的本多糖類腫瘤細(xì)胞抑制物100μl。將細(xì)胞置于37℃、5％CO2的濕潤條件下培養(yǎng)48小時(shí)，加入0.5Ci/孔的[H3]噻嘧啶50μl，再培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理，收集于玻璃纖維濾紙上，以液相閃爍儀讀取細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)。結(jié)果如

圖1所示，其中，折線1表示其對癌細(xì)胞DU-145的抑制作用，折線2表示其對癌細(xì)胞PC-3的抑制作用，折線3表示其對癌細(xì)胞LNCaP的抑制作用。如圖所示，本腫瘤細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)對前列腺癌細(xì)胞系DU-145、PC-3、LNCaP具有明顯的生長抑制作用，這種作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系。
實(shí)施例3本腫瘤細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)對不同種屬腫瘤細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)(1)、按上述實(shí)施例一制備本多糖類腫瘤細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)；(2)、腫瘤細(xì)胞系的準(zhǔn)備將淋巴瘤、膀胱癌、上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系分別保存于RPMI-1640、DMEM、α-MEM培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基均含有10％胎牛血清(FBS)、100U/ML的青霉素、100μg/ML鏈霉素、25μg/MLDE慶大霉素。
(3)、實(shí)驗(yàn)方法將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，以2×104個(gè)/ml濃度在不同稀釋度的本多糖類腫瘤細(xì)胞抑制物存在下進(jìn)行培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2的濕潤環(huán)境。每隔6小時(shí)加入濃度為0.5μCi//ml的[H3]噻嘧啶。收集細(xì)胞于玻璃纖維于濾紙上，以液相閃爍儀讀取細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)。
(4)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本腫瘤細(xì)胞抑制物對多種人類腫瘤細(xì)胞的抑制作用如下細(xì)胞系 對照組驗(yàn)組抑制率P值平均值±標(biāo)準(zhǔn)值Jurkat(淋巴瘤) 88918±3555 3937±428 96＜0.001MBT-2(膀胱癌)3636±1326895±46 75＜0.01Heta(上皮細(xì)胞癌) 98176±24305 14610±10649 85＜0.005本腫瘤細(xì)胞抑制物對多種鼠類腫瘤細(xì)胞的抑制作用如下細(xì)胞系對照組 實(shí)驗(yàn)組 抑制率P值平均值±標(biāo)準(zhǔn)值EL-4(淋巴瘤) 71149±1401524707±390365＜0.001YAC-1(淋巴瘤) 239530±19171 85341±11755 64＜0.01LBRM-33(T-淋巴瘤) 22133±4933 9540±1555 57＜0.005本腫瘤細(xì)胞抑制物對前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用如圖所示；圖中，1、表示本腫瘤細(xì)胞抑制物對前列腺癌細(xì)胞DU-145的增殖的抑制作用；2、表示本腫瘤細(xì)胞抑制物對前列腺癌細(xì)胞LNCaPU的增殖的抑制作用；3、表示本腫瘤細(xì)胞抑制物對前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖的抑制作用。
可見本多糖類腫瘤細(xì)胞生長抑制物對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且這種抑制作用沒有MHC限制，無種屬的特異性。
權(quán)利要求
1.一種新型腫瘤細(xì)胞生長抑制物，其特征在于它由多種哺乳動(dòng)物的骨髓中的一種CD31+骨髓細(xì)胞所分泌，經(jīng)過該種細(xì)胞培養(yǎng)的上清液的提取、純化而獲得的一種水溶性的、帶有陰離子基團(tuán)的、其抗腫瘤作用沒有種屬特異性、不受MHC的限制的多糖類物質(zhì)，其分子量小于1000道爾頓；特別是該多糖類物質(zhì)中一種分子量為372的陰離子基團(tuán)具有本多糖類抗腫瘤物質(zhì)完整的抗腫瘤生物學(xué)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞生長抑制物，其特征在于本腫瘤細(xì)胞生長抑制物從人、鼠、牛、豬、狗、猩猩等的骨髓中獲得；特別是從人類骨髓中分離的該多糖類腫瘤細(xì)胞抑制物是由骨髓中的一種體積較大、密度較低、體外培養(yǎng)時(shí)無粘附性的CD31+細(xì)胞所分泌，該細(xì)胞的特點(diǎn)為OKM1+、SSEA-1+、HNK-1+、OKT3+、OKT8+、glycophorin-、CD11-、CD16-，對放射線照射呈中度敏感。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞生長抑制物的制備方法，其特征在于其具體的制備步驟為1、在哺乳類動(dòng)物中選出一種小動(dòng)物，2、從該動(dòng)物的骨髓中分離提取骨髓細(xì)胞，3、用該骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4、C18層析，5、凝膠滲透色譜，6、陰離子交換FPLC，7、(NH2)HPLC，8、反相HPLC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤細(xì)胞生長抑制物的制備方法，其特征在于(1)、小動(dòng)物選體重為250-350克的雌性或雄性大鼠；(2)、提取骨髓細(xì)胞的方法是將大鼠用CO2窒息至死后于無菌狀態(tài)取出其股骨和脛骨，用10ml注射器和18號針頭將骨髓細(xì)胞沖洗出來，使其進(jìn)入10ml的培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿中含有已消毒的Hank’s平衡鹽溶液；通過利用逐漸變細(xì)針頭的沖洗，將骨髓細(xì)胞懸液變?yōu)槠鋯渭?xì)胞懸液，用HBSS再洗滌后將該單細(xì)胞懸液移入20ml玻璃小瓶中，通過將6m1大鼠淋巴細(xì)胞分離液置于懸液底部，在每分鐘1500轉(zhuǎn)的條件下離心30分鐘以去除紅細(xì)胞和其他碎屑，收集留在交界面的細(xì)胞，用HBSS洗滌3次；(3)、培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的步驟是將通過上述方法獲得的大鼠骨髓細(xì)胞鋪于150×20mm的含有無血清的HBSS培養(yǎng)皿中，密度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升；24小時(shí)后收集骨髓細(xì)胞的上清液，再加入新鮮的HBSS至培養(yǎng)皿中，48小時(shí)再收集一次骨髓細(xì)胞的上清液；收集的上清液在2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘以除去較大的碎屑，然后以0.2μm過濾膜過濾，過濾液于-70℃條件下儲存；(4)、C18層析方法將C18層析柱先以10ml甲醇清洗，再用10ml去離子水蒸餾水洗滌，然后，用最大量不超過100ml的大鼠骨髓細(xì)胞上清液通過C18層析柱。層析完畢后，用5ml去離子水蒸餾水清洗C18層析柱，用3ml甲醇洗滌吸附在C18層析柱上的物質(zhì)，將該洗滌液在氮?dú)鈿饬飨聦⒓状颊舭l(fā)干凈，再將層析提取物溶解于小體積的甲醇中備用。在分析提取物的體外實(shí)驗(yàn)活性前，蒸發(fā)甲醇并再次加入已消毒的培養(yǎng)基；(5)、凝膠滲透色譜方法Bio-Gel P-2為理論上能夠排除分子量大于1800Da的物質(zhì)的凝膠，將該凝膠用20mM，pH 7.2的Tris-HCL緩沖液清洗并預(yù)膨脹，在真空下輕柔地?cái)嚢枰詮氐壮怏w；將經(jīng)過上述處理的Bio-Gel P-2凝膠置入玻璃圓筒。大鼠骨髓細(xì)胞上清液的C18層析柱提取物，在氮?dú)鈿饬飨抡舭l(fā)掉甲醇，再將其溶解于2.5毫升20mM的Tris-HCL緩沖液中，pH 7.2。然后將該樣本小心地加入圓柱體，并調(diào)節(jié)流量為7.8-8.2ml/小時(shí)，用收集器分段收集樣本，用分光光度計(jì)測量各樣本在215nm的吸收值，用前述方法以C18層析柱再次收集各段樣本，用WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性；(6)、陰離子交換FPLC將經(jīng)C18層析柱及凝膠滲透色譜提純的，具有生物學(xué)活性的提取物溶解于0.5ml、20mM的Tris-HCL緩沖液中，pH 8.4；再經(jīng)陰離子交換FPLC層析柱將該物質(zhì)分離，然后在0-0.4M NaCL梯度下進(jìn)行洗脫，并測定其280nm的峰值；再用C18層析柱提取，以WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性；(7)、(NH2)HPLC將經(jīng)C18層析柱、凝膠滲透色譜及陰離子交換FPLC所得到的具有生物學(xué)活性的提取物溶解于150μl、80％的acetonitrile液中，以(NH2)HPLC層析柱進(jìn)行分離，流量為1ml/min，收集各段，測量215nm的吸收值，再以C18層析柱提取，并以WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性；(8)、反相HPLC將經(jīng)C18層析柱、凝膠滲透色譜、陰離子交換FPLC及(NH2)HPLC獲得的生物活性物質(zhì)，加入45μl含25％ acetonitrile及0.1TFA的雙蒸水中，以C8層析柱進(jìn)行反相HPLC分離，流量為0.2ml/min，收集各段，測量215nm的吸收值，再以C18層析柱提取，并以WEHI-3細(xì)胞測定其生物學(xué)活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的腫瘤細(xì)胞生長抑制物的制備方法，其特征在于從其它哺乳動(dòng)物(包括人)的骨髓中提取本腫瘤細(xì)胞生長抑制物時(shí)，首先需將骨髓中所含的脂肪與骨髓細(xì)胞分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤細(xì)胞生長抑制物及其制備方法，特別涉及從多種哺乳動(dòng)物的骨髓中的一種CD3文檔編號A61P35/00GK1398593SQ0211423
公開日2003年2月26日 申請日期2002年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月2日
發(fā)明者鐘朝暉 申請人:鐘朝暉