專利名稱：貯藏腫瘤細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及貯藏腫瘤細(xì)胞，如組織樣品、活組織檢查樣品或者外植塊的方法。更具體地，本發(fā)明涉及貯藏腫瘤細(xì)胞的簡單有效的方法，其中細(xì)胞中的RNA和/或DNA基本上沒被降解，從而可以在貯藏后分析RNA和/或DNA。
背景技術(shù)：
腫瘤活組織檢查樣品通常用于診斷目的和得到關(guān)于潛在有效治療的信息。例如，通過分析基因表達(dá)水平或者腫瘤細(xì)胞形狀可以鑒定可能應(yīng)答特定藥物的患者。可以表征造成腫瘤生長的潛在突變。在許多測試中，腫瘤來源的RNA被用作分析的起始材料，例如，使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行分析。然而，不幸的是，已知RNA是尤其不穩(wěn)定的。
由于不總是可能在得到腫瘤樣品，如活組織檢查樣品后立即進(jìn)行所有必要的測試，因此需要貯藏樣品的方法。在一些情況中，僅在某時(shí)間以后或者可以用于分析以前腫瘤的新試驗(yàn)存在之后，進(jìn)行某些測試的必要性才變得清晰。在長時(shí)間內(nèi)貯藏腫瘤活組織檢查樣品是令人期望的。
已經(jīng)開發(fā)了貯藏腫瘤細(xì)胞樣品的幾種方法。一種允許RT-PCR擴(kuò)增RNA的方法是通過將細(xì)胞或組織浸入液氮深度冷凍細(xì)胞或組織并在-80℃貯藏。為了防止RNA酶對RNA的降解，必須在冷凍狀態(tài)勻漿后將組織與RNA提取緩沖液混合。由于該方法嚴(yán)格需要液氮，所以該方法是勞動(dòng)密集型的并且不適于保存臨床條件中得到的組織樣品。
通常，將病理樣品與福爾馬林混合并石蠟包埋(FSPE)。這些樣品可用于組織學(xué)分析，但是RNA分析存在問題。已經(jīng)開發(fā)了特定方法從此類組織提取RNA，例如，K.Dannenberg等人(美國專利6,248,535和美國專利6,428,963)開發(fā)的方法。腫瘤細(xì)胞的貯藏和RNA或者DNA的提取的該方法也是非常勞動(dòng)密集的。
在水中貯藏可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的免疫組織學(xué)分析，但是RNA被快速降解。
貯藏腫瘤細(xì)胞，如腫瘤活組織檢查樣品的一種標(biāo)準(zhǔn)方法是使用液體組合物RNAlater，其可以通過商業(yè)途徑從Ambion或Qiagen獲得。如在美國專利6,528,641中描述的，該RNA保存介質(zhì)沉淀樣品中的RNA以及樣品蛋白質(zhì)，從而保護(hù)RNA免受RNA酶的破壞。該沉淀由高鹽濃度，通常由硫酸銨導(dǎo)致。
RNAlater不僅適于從組織提取RNA并以后分析RNA(W-H.Wang等人(2001)，Molecular Vision，卷789-94)，而且適于貯藏必須進(jìn)行組織學(xué)或免疫組織化學(xué)分析的組織樣品(S.R.Florell等人(2001)，Mod.Pathol.，卷14(2)116-128)。然而，這些方法直接殺死待貯藏的樣品中的細(xì)胞。
保存細(xì)胞的生存力將是有用的，例如，可用于克服所采集的組織樣品的大小的限制。將細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)可以允許增殖細(xì)胞。還可能在以后的時(shí)間點(diǎn)直接從培養(yǎng)物或者冷凍和解凍細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后對細(xì)胞的生物功能進(jìn)行測定。
保存生存力對于貯藏用于移植的器官是至關(guān)重要的。已經(jīng)認(rèn)識到為灌注和貯藏器官開發(fā)的某些溶液也適于保存組織或培養(yǎng)細(xì)胞。例如，US 5,599,659公開含有例如視網(wǎng)膜來源的成纖維細(xì)胞生長因子、環(huán)糊精和硫酸軟骨素的化學(xué)成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)基可以用于保存器官或者組織或者血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。
WO93/09220涉及詳細(xì)說明的基本培養(yǎng)基，其任選加入了可以用于造血祖細(xì)胞或白血病細(xì)胞的維持和生長的生長促進(jìn)劑，像血細(xì)胞(hem)、氯高鐵血紅素、IL-3、SCF、EPO、IGF或類維生素A。
美國專利號6,004,579和6,495,532提出使用液體組合物，其含有脂質(zhì)體，其中具有用于抑制程序性細(xì)胞死亡的溶血磷脂酸。然而，這些組合物對于貯藏腫瘤細(xì)胞不理想并且具有其他缺點(diǎn)，例如，磷脂被攝入到組織中。
作為一方面的器官和作為另一方面的健康或者病理組織樣品和細(xì)胞的區(qū)別在于它們對氧的需求并且保持器官生存力所需的氧分壓可以破壞組織樣品或者細(xì)胞。從而本發(fā)明的根本問題在于提供貯藏腫瘤細(xì)胞的容易且有效的方法，所述方法使得能夠在貯藏后分析腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明從而本發(fā)明提供了貯藏細(xì)胞的方法，其中將細(xì)胞在-196℃到37℃的溫度下貯藏在含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體的組合物中，所述方法的特征是脂質(zhì)體含有一種或多種固醇并且細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以長時(shí)間貯藏在含有包含一種或多種固醇的脂質(zhì)體的基本營養(yǎng)培養(yǎng)基中而基本上不破壞細(xì)胞或降解其中的RNA和/或DNA。本發(fā)明的方法具有特殊優(yōu)點(diǎn)腫瘤細(xì)胞，如腫瘤活組織檢查樣品可以在室溫下貯藏在一種組合物中數(shù)天，甚至數(shù)周。從而從患者得到的腫瘤活組織檢查樣品可以長時(shí)間貯藏和分析。腫瘤活組織檢查樣品甚至可以以冷凍狀態(tài)貯藏在相同組合物中。這將允許制備腫瘤活組織檢查樣品文庫，其可以用于藥物靶標(biāo)鑒定和多種藥學(xué)研究目的。腫瘤文庫的制備將例如允許將用某種藥物治療的患者的應(yīng)答與腫瘤樣品的詳細(xì)分子分析聯(lián)系起來。這將顯著簡化具有相同腫瘤類型的其他患者的最佳治療策略。
細(xì)胞可以貯藏在根據(jù)本發(fā)明方法的組合物中任意的時(shí)段，但是優(yōu)選貯藏至少1或數(shù)天到幾年。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，細(xì)胞可以在本發(fā)明方法中以如此方式貯藏從而細(xì)胞中的RNA和/或DNA在貯藏期間基本上不被降解。這將允許全面分析腫瘤細(xì)胞的表達(dá)模式和腫瘤類型的分類。根據(jù)本申請，術(shù)語“細(xì)胞中的RNA和/或DNA在貯藏期間基本上不被降解”是指貯藏后細(xì)胞中的各自分子類型與貯藏前細(xì)胞的分子類型相比表明仍然可以分析60％以上的RNA和/或DNA。例如，貯藏前通過RT-PCR分析某些RNA，如編碼目的組織中表達(dá)的已知的管家基因的RNA濃度，可能分析腫瘤樣品質(zhì)量。貯藏后重復(fù)試驗(yàn)。根據(jù)本申請中該術(shù)語的使用，當(dāng)分析揭示貯藏后擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到貯藏前擴(kuò)增產(chǎn)物的至少60％，優(yōu)選至少80％時(shí)，RNA在貯藏期間基本上不被降解。
備選地或額外地，使用本領(lǐng)域公知的用于分析蛋白質(zhì)的多種方法的任意一種可以分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)圖。再次優(yōu)選在貯藏期間蛋白質(zhì)基本上不被降解。貯藏后還可以通過組織學(xué)染色或者原位雜交分析細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，腫瘤細(xì)胞可以如此貯藏從而它們在貯藏后仍然能夠增殖。為此，如果需要可以從組織分離腫瘤細(xì)胞并且可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中根據(jù)公知的技術(shù)增殖腫瘤細(xì)胞。用于貯藏腫瘤細(xì)胞的組合物有利地可以用于腫瘤細(xì)胞的增殖。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，貯藏細(xì)胞的方法包括幾個(gè)步驟，其中首先將細(xì)胞在室溫下貯藏在組合物中，隨后在-196℃到0℃溫度下貯藏在所述組合物中。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，在室溫下將細(xì)胞貯藏在所述組合物中1到14天，隨后在-196℃到0℃溫度下貯藏在所述組合物中至少1個(gè)月，優(yōu)選幾年，其中細(xì)胞中的RNA和/或DNA在貯藏期間基本上不被降解。在室溫貯藏期間，當(dāng)營養(yǎng)物被耗竭時(shí)，可以更換組合物，如每3天更換組合物，其可以增強(qiáng)細(xì)胞的生存力。
在另一方面，本發(fā)明提供了冷凍任意細(xì)胞類型的細(xì)胞并將它們以冷凍狀態(tài)貯藏的方法，其中將細(xì)胞冷凍在含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體的組合物中，該方法的特征在于脂質(zhì)體含有一種或多種固醇。在該組合物中立即冷凍細(xì)胞而不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞的生存力是可能的，這可能是因?yàn)榻M合物抑制或者減小細(xì)胞中的結(jié)晶。為此，冷凍或者解凍期間不必向組合物加入添加劑像DMSO或者HES以保存細(xì)胞的生存力，這使得當(dāng)DMSO的毒性會(huì)產(chǎn)生問題，例如，對于敏感細(xì)胞時(shí)，所述方法特別合適。
因此，該組合物優(yōu)選不含有低溫防護(hù)劑，如HES(羥基乙基淀粉)、甘油、阿拉伯半乳聚糖、DMSO(二甲亞砜)或者乙二醇。優(yōu)選地，該組合物沒有血清或者不明確的蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在冷凍前，將細(xì)胞在室溫下貯藏在組合物中最多1周或最多72小時(shí)。備選地，冷凍前可以將細(xì)胞貯藏在4℃。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法可以冷凍或解凍細(xì)胞。盡管特定的冷凍或解凍方案對于實(shí)施本發(fā)明的方法不是必需的，但是優(yōu)選將細(xì)胞冷凍60分鐘(min)以上到達(dá)-120℃，然后轉(zhuǎn)移到液氮中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用下面的冷凍方案，利用計(jì)算機(jī)控制的冷箱冷凍細(xì)胞首先，在4℃保持組織15分鐘，然后以-99℃/分鐘冷凍到-5℃，以0.5℃/分鐘冷凍到-7℃，以-30℃/分鐘冷凍到-60℃，以8.4℃/分鐘冷凍到-18℃，保持在-18℃3分鐘，以-2℃/分鐘冷凍到-40℃，以-4℃/分鐘冷凍到-80℃，以-10℃/分鐘冷凍到-120℃，之后在液氮中冷卻到-170℃到-196℃。
優(yōu)選地，用于在組合物中長期貯藏細(xì)胞的溫度是-170℃到-196℃。優(yōu)選將細(xì)胞貯藏在液氮中，例如，“Biosafe”低溫罐中。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“基本營養(yǎng)培養(yǎng)基”是指含有氨基酸、鹽、維生素、核苷酸、糖和/或抗氧化劑的組合物?；緺I養(yǎng)培養(yǎng)基通常為液體組合物。
用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基還可以含有也適于貯藏腫瘤細(xì)胞的任意數(shù)量的化合物。特別地，優(yōu)選培養(yǎng)基含有一種或多種抗微生物劑和/或生長因子。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，生長因子包括上皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血小板衍生上皮生長因子和/或血管內(nèi)皮生長因子。該組合物優(yōu)選不含有任何溶血磷脂酸。
如上面提到的基于水的溶液中的脂質(zhì)體以脂質(zhì)泡存在，該脂質(zhì)泡具有圍繞親水核的同心脂質(zhì)雙層(編者Falbe，Regitz，Rmpp-Chemie-Lexikon，1990，Georg Thieme Verlag，Stuttgart)。
用于本發(fā)明方法中的組合物中的脂質(zhì)體含有一種或多種固醇。優(yōu)選地，固醇包括膽固醇。
根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，使用Liforlab組合物實(shí)施本發(fā)明的方法，Liforlab組合物含有下面的表1-4中描述的物質(zhì)。
腫瘤細(xì)胞可以是任意腫瘤細(xì)胞，如來源于腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織，如腫瘤活組織檢查樣品或者腫瘤外植塊的腫瘤細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，腫瘤細(xì)胞是腫瘤活組織檢查樣品。
腫瘤細(xì)胞優(yōu)選來源于人或者哺乳動(dòng)物并且腫瘤優(yōu)選為實(shí)體瘤，如黑素瘤或者腎細(xì)胞、胃、乳腺、食管或者結(jié)腸癌。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括以下步驟，其中a)從人獲得腫瘤活組織檢查樣品；b)在室溫下將活組織檢查樣品貯藏在含有包含膽固醇的脂質(zhì)體的組合物中1-14天；和c)隨后將活組織檢查樣品在-196℃到0℃溫度下在所述組合物中貯藏至少1個(gè)月，優(yōu)選數(shù)年；其中在貯藏期間細(xì)胞中的RNA和/或DNA基本上不被降解。優(yōu)選地，貯藏后細(xì)胞仍然能夠增殖。
該處理方法允許在外植后特別有利地直接收集腫瘤活組織檢查樣品，通過快件或者常規(guī)郵件(室溫下)將腫瘤活組織檢查樣品送到診斷實(shí)驗(yàn)室和/或以冷凍狀態(tài)長期貯藏腫瘤活組織檢查樣品，以及分析腫瘤類型以將腫瘤類型與患者對某種藥物治療的應(yīng)答聯(lián)系起來。
這種貯藏的另一優(yōu)點(diǎn)是其將使得可能將腫瘤樣品的基因組和蛋白質(zhì)組分析與相同個(gè)體的互補(bǔ)的非腫瘤組織進(jìn)行比較。非腫瘤組織可以來源于新鮮活組織檢查樣品或者其可以與腫瘤樣品平行貯藏。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及組合物用于貯藏細(xì)胞的用途，其中所述組合物含有如上定義的基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體，其特征在于所述的脂質(zhì)體含有一種或多種固醇并且所述的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及組合物，其含有腫瘤細(xì)胞、基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體含有一種或多種固醇。該組合物中的腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為腫瘤活組織檢查樣品。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，組合物含有腫瘤活組織檢查樣品、脂質(zhì)體和基本營養(yǎng)培養(yǎng)基，所述脂質(zhì)體含有膽固醇和一種或多種生長因子，優(yōu)選上皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血小板衍生上皮生長因子和/或血管內(nèi)皮生長因子，所述基本營養(yǎng)培養(yǎng)基含有氨基酸、鹽、維生素、核苷酸、糖、抗氧化劑。
在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及腫瘤活組織檢查樣品文庫，其含有貯藏在不同容器中的如上定義的組合物中的許多不同的活組織檢查樣品。
本發(fā)明還涉及各自腫瘤活組織檢查樣品文庫的用途，用于診斷篩選方法、藥物功效驗(yàn)證和/或鑒定抗腫瘤藥物靶標(biāo)的方法中。
例如，來自腫瘤活組織檢查樣品文庫的細(xì)胞可以經(jīng)解凍、進(jìn)行培養(yǎng)并植入裸鼠中。從而，它們可以用于藥物篩選，一方面檢驗(yàn)?zāi)承┧幬飳τ谠撎囟[瘤是否有效，另一方面篩選針對某些腫瘤的潛在活性物質(zhì)的文庫。例如，如果與不用藥物治療的對照動(dòng)物相比，經(jīng)藥物治療的相當(dāng)大百分比的小鼠中腫瘤的生長減慢、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目降低或者腫瘤部分或全部退化，那么認(rèn)為該藥物對所述腫瘤有效。
根據(jù)該實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備用于治療腫瘤的藥物組合物的方法，其包括使用來自根據(jù)權(quán)利要求28的腫瘤活組織檢查樣品文庫的腫瘤活組織檢查樣品來篩選活性抗腫瘤物質(zhì)并將如此鑒定的活性物質(zhì)與適宜的藥物添加劑或者載體一起配制以得到藥物組合物。
在一般方面，本發(fā)明提供了兩相液態(tài)組合物用于貯藏和穩(wěn)定腫瘤組織的用途，其中液態(tài)組合物的第一相含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基，第二相含有脂質(zhì)體。基本營養(yǎng)培養(yǎng)基含有生理上相容的濃度的水溶性或者可分散的營養(yǎng)物和生理鹽，例如，氨基酸、鹽、維生素、核苷酸、糖和抗氧化劑。第二相的脂質(zhì)體為納粒(nanoparticle)，其含有固醇，優(yōu)選膽固醇，和任選地，脂肪酸和細(xì)胞生長因子。脂質(zhì)體的假定結(jié)構(gòu)包含外部親脂覆層和內(nèi)部親水核心。
用于本發(fā)明的兩相組合物具有至少約300mOsM/kg的重量摩爾滲透壓濃度。優(yōu)選地，兩相組合物具有約385到425mOsM/kg的重量摩爾滲透壓濃度。兩相組合物的pH優(yōu)選為約7.2到約7.4。納粒優(yōu)選具有約100nm到約300nm，更優(yōu)選約100nm到約200nm的平均直徑。
用于本發(fā)明的組合物可以含有微量元素、簡單糖類、緩沖劑、質(zhì)膜體積增大劑、能量底物、黃嘌呤氧化酶抑制劑，等，它們?nèi)苡诨蛘叻稚⒂谒越橘|(zhì)中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基本營養(yǎng)培養(yǎng)基包括生理上適宜濃度的鹽、水溶性維生素、氨基酸和核苷酸。這些包括例如，并且不限于，腺苷及其磷酸酯、尿苷及其磷酸酯、其他核苷酸和脫氧核苷酸；B族維生素，例如，B1、B2、B6、B12、生物素、肌醇、膽堿、葉酸等；維生素輔酶和輔因子，例如，煙酰胺和黃素腺嘌呤二核苷酸，和它們的各自磷酸酯、輔酶A等；多種生理鹽和痕量礦物質(zhì)，例如，鈉、鉀、鎂、鈣、銅、鋅和鐵的鹽；必需氨基酸，盡管任選包括所有20種天然存在的氨基酸，和/或它們的衍生物?；九囵B(yǎng)基還包括例如，pH緩沖劑，如磷酸鹽緩沖劑和N-2-羥基乙基-哌嗪-N’-2-乙磺酸(“HEPES”)緩沖劑；簡單糖，例如，葡萄糖；滲透增強(qiáng)劑，如任意適宜的葡聚糖、甘露糖等；以及任選的混雜組分，如別嘌呤醇、軟骨素、輔羧酶、生理有機(jī)酸，例如，丙酮酸和任選地，天然來源的營養(yǎng)提取物，例如，酵母維生素提取物。
從而，基本營養(yǎng)培養(yǎng)基含有多種營養(yǎng)物和礦物質(zhì)因子，它們的濃度類似于在血液、血清、血漿和/或正常身體組織中發(fā)現(xiàn)的濃度，盡管這其中的某些不是天然血液組分。
任選地，用于本發(fā)明的組合物還可以包括抗微生物劑，如抗生素、抗細(xì)菌劑、特定抗體和/或其他公知的用于控制器官、組織和/或細(xì)胞中微生物污染的活性劑。多數(shù)公知的抗微生物劑由Goodman和Gilman′s，The pharmacological basis of therapeutics，第10版，McGraw Hill，特別是第43到51章詳細(xì)提及。
組合物可以還含有抗凝血?jiǎng)⑷苎ê?或抗血小板藥物，例如肝素和相關(guān)葡糖胺聚糖、雙香豆素、丙苯香豆素、醋硝香豆酮和雙香豆乙酸乙酯、茚滿二酮和它們的衍生物，和阿司匹林和潘生??；等等。任選還包括非甾體消炎劑。
在備選實(shí)施方案中，任選包括生理濃度或高于生理濃度的維生素C(抗壞血酸)。
不含不明確的蛋白質(zhì)或者動(dòng)物血清的許多通過商業(yè)途徑可獲得的細(xì)胞或者組織培養(yǎng)基產(chǎn)品可以適于作為基本營養(yǎng)培養(yǎng)基或者制備本發(fā)明組合物的起點(diǎn)，條件是此類培養(yǎng)基與該組合物用途的特定要求相容。
組合物的第二相是含有脂質(zhì)體或納米大小顆粒的液態(tài)水性乳劑，所述脂質(zhì)體或納米大小顆粒被認(rèn)為具有親脂外層和親水核心。通常，第二相包括能夠形成并穩(wěn)定外部親脂層的親脂組分，包括例如，膽固醇、磷脂酰膽堿、維生素E、魚肝油，等。額外的組分包括基于脂質(zhì)的能源，包括生理相容量的游離脂肪酸。
優(yōu)選地，兩相組合物的脂質(zhì)體含有游離脂肪酸，其選自油酸、亞油酸、棕櫚酸或者硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、和它們的組合。
優(yōu)選地，兩相組合物不含有藥學(xué)上重要量的磷脂酸或者糖，或者溶血磷脂酸或者糖。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二相包括親水性的支持內(nèi)分泌因子，如氫化可的松、甲狀腺素、或者其衍生物，等。此外，支持組分包括細(xì)胞生長因子，例如，上皮和內(nèi)皮生長因子，包括生理相容量的血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生的內(nèi)皮生長因子、上皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血小板衍生內(nèi)皮生長因子，等。任選地，預(yù)計(jì)包括在第二相中的其他因子包括細(xì)胞間信使，如前列腺素類，例如，前列腺素E1。優(yōu)選地，還包括生理上相容的表面活性劑和去污劑，例如，一種或多種水溶性表面活性劑，優(yōu)選分子量為數(shù)千道爾頓的兩親性嵌段共聚物，如聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物表面活性劑(例如，Pluronic F-68；來自BASF)和/或非離子型表面活性劑。適宜的非離子型表面活性劑包括，例如，山梨醇酯的聚氧化乙烯衍生物，例如，通過商業(yè)途徑以TWEEN(Atlas Chemical Co.)得到的聚氧化乙烯山梨聚糖單油酸酯表面活性劑。尤其優(yōu)選TWEEN 80。
應(yīng)該與脂質(zhì)體結(jié)合的氧在保持細(xì)胞的代謝中起重要作用。需要注意的是，盡管本發(fā)明的方法不需要富集氧的額外步驟，但是此類富集對于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存力，特別是具有高速增殖或者高代謝更新(turnover)的那些腫瘤細(xì)胞的生存力是有益的。從而可以為不同腫瘤優(yōu)化組合物中所含氧的含量。
通過讓空氣或氧氣通過溶液鼓泡可以富集氧。組合物攝取的氧氣量也取決于組合物中含有的固醇或膽固醇的量。脂質(zhì)體中固醇的量、脂質(zhì)體的量或者兩者可以改變以達(dá)到對不同腫瘤的最佳結(jié)果。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物富含氧氣。組合物含有例如，至少0.00475g/L膽固醇，尤其至少0.00525g/L膽固醇，并且富含氧氣。優(yōu)選地，氧氣通過組合物冒泡直到其用氧飽和?？梢詫Σ煌哪[瘤組織容易地測試膽固醇和氧氣的最優(yōu)、最小和最大量。
組合物的制備美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/469,200公開用于本發(fā)明方法的組合物可以用于保存器官和組織的生存力。
通常通過兩步方法產(chǎn)生用于本發(fā)明的組合物。第一步是制備第一相的預(yù)混合物，其是上述基本營養(yǎng)培養(yǎng)基，在本文中稱作Premix-I，和制備第二相的預(yù)混合物，其本文中稱作Premix-II，其中將所希望的組分預(yù)混合、溶解和/或懸浮在水中。然后通過微流化器或者類似的裝置，在有效提供精細(xì)分散的乳劑，例如，納粒規(guī)模乳劑的條件下處理Premix-II組合物。然后使所得乳劑組合物與提供多種微量營養(yǎng)物和其他組分的Premix-I混合，以完成本發(fā)明組合物的生產(chǎn)。
制備預(yù)混合組合物下面的表1-4一起列表概述了Premix-I和Premix-II的優(yōu)選組分和重量范圍。表1-4所列組分是在一升所有處理均已完成之后的最終組合物中發(fā)現(xiàn)的量。這些組分被分類到這些表中以方便描述，以便通過其中在下文討論的實(shí)施例中制備組合物的方法對組分分組。除非另外說明，表1-4中所示所有量都為克/升最終組合物，即，包括水相和乳劑相的組合物。
表1-4中給出的組分量是基于1升的總批體積。如文中例證的，1升批體積為將Premix-I和Premix-II混合后的最終體積，其中Premix-II已經(jīng)被處理成微米規(guī)?；蚣{米規(guī)模乳劑。技術(shù)人員將理解所描述的方法根據(jù)需要可以易于放大或縮小到更小或更大的批大小。
用于制備組合物的所有化學(xué)品都是基本上純的并且可以從生化藥品的許多供應(yīng)商得到。優(yōu)選地，這些化學(xué)品是USP級或相當(dāng)?shù)燃壍?。水?yīng)該是WFI(注射用水)級，優(yōu)選USP級。技術(shù)人員將理解所用的化學(xué)品任選地可以通過表現(xiàn)出相同純度和活性的基本上相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)品替代。
表1
表2A
表2B
表2C
表3
表4
制備Premix-I的方法通過將組分以有效實(shí)現(xiàn)均勻且澄清的水性組合物的順序溶解或分散，而避免不希望的反應(yīng)或者形成不溶復(fù)合體來制備Premix-I。為此，Premix-I中的組分優(yōu)選不一起混合直到所有都完全溶解或分散在水中。優(yōu)選地，如本文例證的，將表1、2A-2C和表3中所列的組分分別加工成三種不同的起始溶液，盡管技術(shù)人員將明白該基本組合物任選可以通過所例證方案的變通方案制備。
然后合并起始溶液以制備Premix-I，其組成了相1，即非乳液基本營養(yǎng)培養(yǎng)基。
制備Premix-II的方法Premix-II包括組合物的乳液形成組分。大致地，這些包括所得乳液顆粒的親水層，例如，希望在細(xì)胞內(nèi)遞送的組分。Premix-II還包括形成所得乳液顆粒的疏水層的組分，例如，親脂外層，設(shè)想其允許與活細(xì)胞膜融合以遞送親水核心內(nèi)含物，包括支持性內(nèi)分泌因子、幫助乳化的適宜試劑，例如，增濕劑和/或嵌段共聚物去污劑，以及疏水相組分，如膽固醇和/或磷來源的脂質(zhì)。優(yōu)選地，這些由上面的表4列出，并且如下面實(shí)施例描述的組合。
微流化在5000psi(344750hPa)或更高壓力下高壓勻漿的技術(shù)在本領(lǐng)域公知為“微流化”。該方法用于產(chǎn)生具有平均直徑小于200nm的均勻大小分布的脂質(zhì)體或者納粒。除了微流化，任選使用其他標(biāo)準(zhǔn)乳化方法，例如，超聲處理、閥勻漿[Thornberg E.和Lundh，G.(1978)J.Food.Sci.431553]和刀片攪拌，等等。希望將水溶性表面活性劑，優(yōu)選分子量為幾千道爾頓的兩親性嵌段共聚物，如聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物表面活性劑(例如，Pluronic F68)和/或TWEEN 80加入到水性溶液中以便穩(wěn)定所包被的顆粒防止它們聚集。表面活性劑還用于增強(qiáng)(超)聲處理的效果(如果使用該方法)。
用于微流化的優(yōu)選裝置的實(shí)例為Microfluidizer No.HC5000V(Microfluidics Corp.，Newton，Mass.)，其使用密封的空氣壓縮器提供壓縮空氣，例如，來自Sullair-Solutions(Michigan City，Indiana)的No.ES-6。上述裝置使用高壓和高剪切勻漿處理和乳化Premix-II組合物。
簡言之，使用微流化器通過高壓勻漿處理Premix-II組合物。將Premix-II連續(xù)加到微流化器池中，并強(qiáng)行通過特別設(shè)計(jì)的空穴或者相互作用腔，在那里高剪切力和空化力(cavitation forces)形成高度分散的乳液。通過幾輪，平均小滴或者脂質(zhì)體大小、分布和成分的組合產(chǎn)生所希望的終產(chǎn)物，例如，優(yōu)選的納粒。
生產(chǎn)商的操作手冊提供了微流化器Model No.HC5000V的操作細(xì)節(jié)，所述操作手冊可以從Microfluidics Corporation得到，目錄號為85.0112。
附圖簡述

圖1顯示了400倍放大下胃癌的上皮組織的腫瘤活組織檢查樣品的HES染色。樣品在切割前貯藏在水中24小時(shí)。
圖2顯示了400倍放大下胃癌的上皮組織的腫瘤活組織檢查樣品的HES染色。樣品在切割前貯藏在Liforlab中24小時(shí)。
圖3顯示了400倍放大下胃癌的上皮組織的腫瘤活組織檢查樣品的HES染色。樣品在切割前貯藏在水中72小時(shí)。
圖4顯示了400倍放大下胃癌的上皮組織的腫瘤活組織檢查樣品的HES染色。樣品在切割前貯藏在Liforlab中72小時(shí)。
實(shí)施例下面的實(shí)施例闡明了本發(fā)明。
實(shí)施例1制備液體組合物L(fēng)iforlab制備Premix-I1.制備溶液1使用適宜的天平，制備上面表1中所列的每種組分的10,000倍濃縮液。為了方便，如下所述預(yù)先制備幾種這些組分的貯存液，并將貯存液的適宜量混合到溶液1中。
100,000倍濃度的硫酸銅貯存液稱量0.130g硫酸銅并混合到1000ml WFI級水中。必要時(shí)，混合下逐滴加入5N HCl，直到完成溶解。混合直到溶解，并在-20℃保存。
10,000倍濃度的硫酸鐵、硝酸鐵、和硫酸鋅貯存液使用0.1mL/升批料(終產(chǎn)物的最終體積)。通過稱量5.0g硫酸鐵、0.5g硝酸鐵和4.3g硫酸鋅到1000mL WFI級水中制備貯存液。必要時(shí)，通過逐滴加入5N HCl降低pH以助溶解直到溶解完全。該溶液在-20℃保存。
100,000倍濃度的生物素貯存液使用0.01mL/升最終溶液。
通過稱量0.040g生物素到5mL WFI級水中制備生物素貯存液。如果需要，在攪拌期間逐滴加入5N HCl，直到溶解完成。加到1000mL，并在-20℃保存。
1000倍維生素B12和胸苷貯存液使用1mL/升最終溶液。
通過稱量0.670g維生素B12和0.370g胸苷到1000mL WFI級水中并混合直到溶解制備該貯存液，并在-20℃保存。
一旦制備了所有貯存濃縮液，將它們以與它們的濃度一致的體積加到溶液2，例如，1000倍＝1mL/升等等。然后將其他組分加入到1000mL WFI級水并在磁力攪拌器上混合直到溶解完成。將所得溶液以0.1mL/L最終批體積(終產(chǎn)物)的比例加入下述溶液2。
2.制備溶液2使用合適的天平(balance)，稱量表2A、2B和2C中所列每種組分并加入到最終批體積中WFI級水的約50％終體積，即，對于1升最終批，用約500mL WFI級水制備溶液2。將其混合直到溶解完成。
3.制備溶液3使用合適的天平，稱量表3中所列每種組分并加入到合適大小的混合容器，該容器含有5％總批體積的WFI級水?；旌蠒r(shí)，逐滴加入5N NaOH直到混合物變得澄清，表明完全溶解。
然后通過取溶液1，將其與溶液2以0.1mL/升最終批體積(終產(chǎn)物)的比例合并以形成合并的(1+2)溶液制備Premix-I，同時(shí)攪拌。然后將溶液3的完整批與(1+2)溶液混合產(chǎn)生Premix-I，其可以立即使用或者保存。
Premix-II的制備Premix-II的組分量如前面的表4給出。為了方便，首先將Premix-2的許多組分制備為貯存液，然后以合適的體積用于制備Premix-II。貯存液如下。
10,000倍的內(nèi)分泌因子貯存液使用0.1mL/升最終溶液。
通過稱量0.052g HGF、0.050g三碘代-L-甲狀腺素、0.050g VEGF和0.030g EGF到1000mL WFI級水中，攪拌直到溶解完成來制備該貯存液。以X0.1mL計(jì)算批大小并加入到步驟4/處理4的溶液中，-20℃保存。
1000×氫化可的松貯存液使用1mL/升最終溶液。
通過稱量0.95g氫化可的松到10mL 95％乙醇中，攪拌直到溶解完成來制備該貯存液。以X1mL計(jì)算批大小并將貯存液加入到下面步驟2的溶液中，2-8℃保存。
1000倍前列腺素E1貯存液(“PGE1”)使用1mL/升最終溶液。
通過稱量0.034g PGE1到1000mL WF1級水中并攪拌直到溶解完成來制備。計(jì)算的批大小為X1mL并將貯存液加入到下面步驟4的溶液中，-20℃保存。
100,000X的PDGF貯存液使用0.01mL/升最終溶液。
通過稱量0.095g PDGF到1000mL WF1級水中并攪拌直到溶解完成來制備該貯存液。計(jì)算的批大小為X0.01mL并將貯存液加入到下面步驟4的溶液中，-20℃保存。
然后通過下面的步驟使用上文表4中給出的組分制備Premix-II。
1.通過稱量1g到小于50％總批體積(按最終產(chǎn)物批為1升計(jì)算，該體積小于500ml)的WFI級水中制備Pluronic F-68溶液。將其在低熱(小于100℃)下混合約1小時(shí)。持續(xù)混合直到完成溶解。所得水性組合物在使用前冷卻到約35-40℃。
2.量取10mL 95％乙醇加入到玻璃混合容器并置于磁力攪拌盤上。根據(jù)表3稱量磷脂酰膽堿并加入該溶液，然后混合1小時(shí)。
3.根據(jù)表4稱量膽固醇、亞油酸、亞麻酸、維生素E、TWEEN 80、魚肝油、氫化可的松和油酸。優(yōu)選地，這些可以首先制備為10,000X濃縮液或者貯存液以實(shí)現(xiàn)所希望的工作濃度。將這些物質(zhì)加入到步驟2的溶液并混合1小時(shí)。
4.將步驟2和3的溶液加入到步驟1的溶液并混合1小時(shí)。所得組合物看起來不透明且混濁。
5.如所指出的稱量肝細(xì)胞生長因子(“HGF”)、三碘代-L-甲狀腺素、前列腺素E1、血管內(nèi)皮生長因子(“VEGF”)、上皮生長因子(“EGF”)、血小板衍生內(nèi)皮生長因子(“PDGF”)。優(yōu)選地，這些化學(xué)品制備為它們的工作貯存液。
6.將步驟5的成分加入到步驟4的溶液并混合1小時(shí)以產(chǎn)生Premix-II液體組合物。
Liforlab通過微流化制備基于膽固醇的納粒從如上的Premix-I和Premix-II組合物制備Liforlab溶液，如下1.打開微流化器的空氣壓縮器并將管道壓調(diào)節(jié)到100CFM下120PSI(2.83m3/分鐘下8274hPa)。這自動(dòng)將微流化器的壓力室充入壓縮空氣。
2.調(diào)節(jié)微流化器壓力到5000PSI(344750hPa)。
3.將制備的Premix-II加入到機(jī)器貯存器中并將微流化器控制調(diào)節(jié)到完全打開設(shè)定。
4.Premix-II穿過活性空穴室(active cavitation chamber)并排出到收集容器。
5.當(dāng)所有Premix-II被處理和收集時(shí)，完成一個(gè)循環(huán)。
6.重復(fù)步驟(1)-(5)四次，和/或直到所處理的液體組合物以透明外觀出現(xiàn)在收集容器中。
7.然后將液體組合物通過0.2微米濾膜無菌過濾并貯藏在4-8℃?zhèn)溆谩?br> 8.然后將上面步驟7的產(chǎn)物與所制備的Premix-I緩慢混合，以避免起泡沫和化學(xué)成分的解離。
9.基于表1-4，用WFI級水填充最終溶液到所希望的批體積。最終批體積為1升。
將pH調(diào)節(jié)到7.2±0.2。
然后最終發(fā)明性組合物通過0.2微米膜無菌過濾到無菌容器中用以貯藏。
它看起來為不透明的乳白色溶液，沒有任何顆粒物質(zhì)。小泡大小對納粒分散體的光學(xué)外觀具有顯著影響。顆粒越小，溶液將看起來越透明。
實(shí)施例2比較Liforlab和RNAlater作為貯藏腫瘤外植塊或者活組織檢查樣品的溶液相對于RNAlater(Qiagen)的保存性質(zhì)證實(shí)和評估了室溫下用于保存細(xì)胞生存力的實(shí)施例1中制備的Liforlab的功效。
樣品制備后，立即將不同腫瘤的活組織檢查樣品或者來自動(dòng)物的腫瘤外植塊貯藏在至少1ml Liforlab或者RNAlater(Qiagen，Neuss)中。如果需要，可以切割腫瘤活組織檢查樣品。組織塊優(yōu)選具有0.5cm3的最大尺寸，從而試劑可以在組織中快速擴(kuò)散。優(yōu)選地，組織具有0.125cm3的大小。
方法將腫瘤組織貯藏在溶液Liforlab或者RNAlater中限定的時(shí)間，例如，3天。
腫瘤組織與溶液一起在玻璃勻漿器或者錐形組織粉碎機(jī)(例如，來自Wheaton Science Products，NJ，USA)中機(jī)械勻漿。將勻漿后的組織轉(zhuǎn)移到15ml管中，該管含有完全培養(yǎng)基(例如，L15培養(yǎng)基，含有10％失活的FCS，1％非必需氨基酸(100×，例如，Biochrom AG，Berlin)，0.05％葡萄糖、0.0011％碳酸氫鈉，Ciprobay 200)(3×4ml)并洗滌(以150×g室溫下離心10分鐘)。
將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到具有足夠培養(yǎng)基以覆蓋底部的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(50ml，17.5cm2)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中37℃5％CO2中培養(yǎng)至少3天，不更換培養(yǎng)基。
當(dāng)培養(yǎng)基的顏色從紅色變成黃色時(shí)，視覺對照后改變培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞足夠密集時(shí)，將貼壁的細(xì)胞胰酶消化并傳代。
為了進(jìn)行胰酶消化，傾析培養(yǎng)基并用PBS沖洗仍然貼壁的細(xì)胞。加入2ml胰蛋白酶-EDTA溶液并在培養(yǎng)箱中37℃下孵育5分鐘。通過輕輕拍打底部從培養(yǎng)瓶的底部分離細(xì)胞，并將它們轉(zhuǎn)移到含有10ml培養(yǎng)基的15ml管中。用培養(yǎng)基洗滌1次后，可以再次培養(yǎng)細(xì)胞。第三次傳代后，冷凍保藏細(xì)胞。
結(jié)果貯藏在Liforlab溶液中的組織是軟的并且容易勻漿。細(xì)胞使得所得溶液均勻地混濁。貯藏在RNAlater中的組織是固體和硬的，并且難以勻漿。在溶液中可以看到細(xì)胞塊。
1周后，Liforlab細(xì)胞生長良好，而RNAlater細(xì)胞仍然漂浮在培養(yǎng)基的頂部。貯藏在Liforlab中的細(xì)胞規(guī)則地傳代6周，并且它們增殖。將細(xì)胞在冷藏瓶中冷凍。
12天后停止培養(yǎng)RNAlater細(xì)胞的嘗試，因?yàn)榧?xì)胞仍然漂浮在培養(yǎng)基頂部并且不能預(yù)期細(xì)胞仍然將生長。細(xì)胞的形態(tài)不是均勻的(碎片化細(xì)胞)。該細(xì)胞不是活的。
總結(jié)與貯藏在RNAlater中的腫瘤外植塊的細(xì)胞相比，來自貯藏在Liforlab中的腫瘤外植塊的細(xì)胞是活的并且仍然能夠增殖。
實(shí)施例3比較Liforlab和RNAlater貯藏腫瘤細(xì)胞和穩(wěn)定DNA的功效通過定量分析腫瘤組織的DNA，實(shí)驗(yàn)確定Liforlab與RNAlater一樣能夠保護(hù)DNA。
樣品制備后，立即將移植自裸鼠的HCT8細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤活組織檢查樣品貯藏在至少1ml Liforlab或RNAlater(Qiagen)中。組織塊優(yōu)選具有0.5cm3的最大尺寸，從而試劑可以在組織中快速擴(kuò)散。優(yōu)選地，組織具有0.125cm3的大小。
1.用常規(guī)方法分離DNA方法裂解將組織樣品、500μL裂解緩沖液(10mM Tris pH8，400mM NaCl，2mM Na2EDTA pH8到8.2，高壓滅菌)和20μL RNA酶A(20mg/mL)轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中并盡可能勻漿組織。將勻漿物轉(zhuǎn)移到50mL falcon管中。用500μL裂解緩沖液洗滌勻漿器兩次。該洗滌液加入到勻漿物中并溫和渦旋。加入100μL 10％SDS，溫和渦旋，然后加入25μL蛋白酶K(20mg/mL)并溫和渦旋。
混合物在55℃孵育2小時(shí)，或者更好地，37℃在水浴中過夜孵育。消化后，加入500μL 5M NaCl(對于蛋白質(zhì)的鹽沉淀，約1.2mol/L)?；旌衔镌谥械人较聹u旋約5秒。
在冷離心機(jī)(4℃)中以3410g離心14分鐘后，取出含有DNA的上清液并轉(zhuǎn)移到新的15mL聚丙烯離心管中。如果來自沉淀的任何細(xì)胞殘?jiān)恍⌒奈胍埔浩鳎敲磳悠吩俅坞x心并取出剩余上清液。
沉淀將上清液與2-2.5體積的100％乙醇混合。樣品在-20℃貯藏30到60分鐘后以3410g在4℃離心10到15分鐘。如果可以見到DNA沉淀，在-20℃貯藏不是必要的。小心傾析上清液，注意沉淀位于上壁從而其不能在傾析步驟中損失。用1mL 70％乙醇洗滌DNA。然后將其轉(zhuǎn)移到含有新的70％乙醇的高壓滅菌的1.5ml管中。樣品以3410g在4℃離心10分鐘，除去上清液，再次注意沉淀。將樣品再次在70％乙醇中洗滌，離心并取出上清液。管內(nèi)的上面區(qū)域用組織小心干燥。沉淀應(yīng)該在倒轉(zhuǎn)的管中空氣干燥。用500μL注射用水(aquainjectabila)吸收DNA。為了更好地溶解，沉淀可以在56℃孵育10分鐘。然后在4℃貯藏樣品。
2.用Qiagen分離DNA方法將多達(dá)25mg貯藏的活組織檢查樣品在清潔的載玻片上切割，記錄重量，并使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen)按照動(dòng)物組織的DNeasy方案制備組織。
DNA量的光度分析對于光度分析，制備1∶10稀釋液并測量260、280和320nm的消光。260nm處的消光與280nm處的消光之比定義DNA的純度并且應(yīng)該在1.4到1.8之間。根據(jù)下面的公式計(jì)算產(chǎn)率消光(260nm)×50μg/ml×稀釋度＝μg/ml RNA結(jié)果用常規(guī)方法制備的DNA的定量對于移植自肩部皮下位置的腫瘤，在室溫貯藏6天后然后在4℃貯藏，使用Liforlab的每毫克組織產(chǎn)率為5.56μg，使用RNAlater的為6.36μg。對于移植自腋窩皮下位置并在4℃貯藏的腫瘤，使用Liforlab的產(chǎn)率為6.44μg，使用RNAlater的為4.94μg。通過DNA凝膠電泳證實(shí)結(jié)果。
實(shí)施例4比較Liforlab和RNAlater貯藏人活組織檢查樣品和穩(wěn)定RNA的功效通過對腫瘤組織RNA的定量分析，實(shí)驗(yàn)確定Liforlab與RNAlater一樣能夠保護(hù)RNA。
樣品將來自不同人腫瘤的活組織檢查樣品制備后立即貯藏在至少1mlLiforlab或者RNAlater(Qiagen)中。組織塊優(yōu)選具有0.5cm3的最大尺寸，從而試劑可以在組織中快速擴(kuò)散。優(yōu)選地，組織具有0.125cm3的大小。
為了防止污染，向Liforlab溶液加入青霉素/鏈霉素可能是理想的。
方法1.制備為了制備，將Ultra-Turrax勻漿器的切割區(qū)在使用前在70％乙醇中超聲浴30’。用70％乙醇清潔載玻片和鑷子。在整個(gè)步驟中戴上手套。
2.將腫瘤樣品貯藏限定的時(shí)間，例如，室溫下貯藏6天然后4℃貯藏。在清潔載玻片上切下最多25mg經(jīng)貯藏的活組織檢查樣品，將其轉(zhuǎn)移到5ml冷藏瓶中并記錄重量。加入來自試劑盒的600μl RLT緩沖液，但是沒有β-巰基乙醇。樣品在ultra-turrax中在冰上勻漿3次，每次15秒，然后用水平3的超聲處理4次，每次5秒。
3.每個(gè)樣品制備完成后，用70％乙醇清潔設(shè)備。將勻漿物移液到無RNA酶的1.5ml管中并根據(jù)2002年4月Qiagen的“從動(dòng)物組織樣品分離總RNA的RNeasy mini方案”處理。在點(diǎn)5分離RNA并將其用沒有RNA酶的2×30μl水吸收。
3.RNA的定量分析用兩種方法定量分析溶液中的RNA光度分析和實(shí)時(shí)PCR。
3.1光度分析對于光度分析，制備1/100溶液(5μl樣品+495μl水)并測量260、280和320nm的消光以分析純度和產(chǎn)率。320nm處的消光必須為0。260nm∶280nm的比應(yīng)該在1.6到2.2之間。根據(jù)下式計(jì)算產(chǎn)率消光(260nm)×40μg/ml×稀釋度＝μg/ml RNA
實(shí)時(shí)PCR通過根據(jù)A.H.Elmaagacli等人(2001)，Brit.Journal ofHaematology，卷113，1072-1075)中描述的方法通過擴(kuò)增GAPDH測量管家酶GAPDH的RNA的量。
簡言之，用LightCycler(Roche，Mannheim，德國)使用最終體積為10μl的毛細(xì)管在一步中進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)和PCR。對于RT-PCR混合物，使用通過商業(yè)途徑可以得到的緩沖劑試劑盒，其包括逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶、Tris-HCl、dNTP(Superscript，Gibco LifeTecnologies，德國)、6μM MgSO4、0.14μl RNA酶抑制劑(Roche，德國)，10pmol引物和4pmol雜交探針。在55℃進(jìn)行RT反應(yīng)20分鐘。持續(xù)反應(yīng)，在95℃內(nèi)部變性20秒，然后是95℃1秒，56℃15秒，和72℃18秒的55個(gè)循環(huán)。
結(jié)果的實(shí)例在下一頁的表1中給出。
實(shí)施例5Liforlab和水貯藏腫瘤外植體/活組織檢查樣品的比較將來自人胃癌的壞死或者上皮組織的腫瘤活組織檢查樣品貯藏在水或者Liforlab中24、48、72或128小時(shí)。切割切片并用HES染色。
結(jié)果表明Liforlab穩(wěn)定組織的結(jié)構(gòu)比水強(qiáng)的多。結(jié)果的實(shí)例在圖1到4中顯示。在圖3中，在水中貯藏胃的上皮組織72小時(shí)后，特別明顯，組織是壞死和被降解的，其中在Liforlab中貯藏后，如圖4所示，組織的結(jié)構(gòu)得到保存。
表權(quán)利要求
1.貯藏細(xì)胞的方法，其中在-196℃到37℃的溫度下將細(xì)胞貯藏在含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體的組合物中，所述方法的特征是所述脂質(zhì)體含有一種或多種固醇并且所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將細(xì)胞貯藏在組合物中至少1天。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中將細(xì)胞貯藏在組合物中至少1周。
4.權(quán)利要求1到3的方法，其中細(xì)胞貯藏在組合物中至少1個(gè)月或至少幾個(gè)月。
5.權(quán)利要求1到4的方法，其中將細(xì)胞貯藏在組合物中至少1年或至少幾年。
6.權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞中的RNA和/或DNA在貯藏期間基本上不被降解。
7.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中貯藏后可以通過組織學(xué)染色或者原位雜交分析細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞在貯藏后能夠增殖。
9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中在4到37℃，優(yōu)選室溫下將腫瘤組織貯藏在組合物中。
10.權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中首先在室溫下將細(xì)胞貯藏在組合物中，隨后在-196℃到0℃的溫度下將細(xì)胞貯藏在所述組合物中。
11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中在室溫下將細(xì)胞貯藏在組合物中至少1天，隨后在-196℃到0℃的溫度下將細(xì)胞貯藏在所述組合物中至少1個(gè)月，并且細(xì)胞中的RNA和/或DNA在貯藏期間基本上不被降解。
12.冷凍細(xì)胞的方法，其中將細(xì)胞冷凍在含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體的組合物中，所述方法的特征是脂質(zhì)體含有一種或多種固醇。
13.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法，其中基本營養(yǎng)培養(yǎng)基含有氨基酸、鹽、維生素、核苷酸、糖和抗氧化劑。
14.權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法，其中基本營養(yǎng)培養(yǎng)基含有抗微生物劑。
15.權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的方法，其中脂質(zhì)體含有膽固醇。
16.權(quán)利要求15的方法，其中組合物含有至少0.00525g/L膽固醇，并且組合物富含氧。
17.權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的方法，其中脂質(zhì)體含有一種或多種生長因子，優(yōu)選地生長因子包括上皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血小板衍生的上皮生長因子和/或血管內(nèi)皮生長因子。
18.權(quán)利要求1到17中任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織。
19.權(quán)利要求18的方法，其中腫瘤組織是腫瘤活組織檢查樣品或者腫瘤外植體。
20.權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的方法，其中所述的細(xì)胞來自人或哺乳動(dòng)物。
21.權(quán)利要求18到20中任一項(xiàng)的方法，其中所述的腫瘤是實(shí)體瘤。
22.權(quán)利要求1到21中任一項(xiàng)的方法，其中a)從人獲得腫瘤活組織檢查樣品；b)在室溫下將活組織檢查樣品貯藏在含有包含膽固醇的脂質(zhì)體的組合物中1到14天；和c)隨后將活組織檢查樣品在-196℃到0℃的溫度下貯藏在所述組合物中至少1個(gè)月，優(yōu)選數(shù)年；并且其中細(xì)胞中的RNA和/或DNA在貯藏期間基本上不被降解。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞在貯藏后能夠增殖。
24.組合物用于貯藏細(xì)胞的用途，其中所述組合物含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體，所述用途的特征是所述脂質(zhì)體含有一種或多種固醇并且細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
25.組合物，其含有腫瘤細(xì)胞、基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體含有一種或多種固醇。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述的腫瘤細(xì)胞是腫瘤活組織檢查樣品。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述的腫瘤細(xì)胞是腫瘤活組織檢查樣品，所述的脂質(zhì)體含有膽固醇和一種或多種生長因子，優(yōu)選上皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血小板衍生的上皮生長因子和/或血管內(nèi)皮生長因子，所述的基本營養(yǎng)培養(yǎng)基含有氨基酸、鹽、維生素、核苷酸、糖和抗氧化劑。
28.腫瘤活組織檢查樣品文庫，其含有貯藏在不同容器中的根據(jù)權(quán)利要求27的許多不同的組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的腫瘤活組織檢查樣品文庫在診斷篩選方法、藥物功效驗(yàn)證和/或鑒定抗腫瘤藥物靶標(biāo)的方法中的用途。
30.制備用于治療腫瘤的藥物組合物的方法，其包括使用來自根據(jù)權(quán)利要求29的腫瘤活組織檢查樣品的文庫的腫瘤活組織檢查樣品來篩選抗腫瘤活性物質(zhì)和將如此鑒定的所述活性物質(zhì)與適宜的藥物添加劑或載體一起配制以得到藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及貯藏細(xì)胞的方法，其中在－196℃到37℃的溫度下將細(xì)胞貯藏在含有基本營養(yǎng)培養(yǎng)基和脂質(zhì)體的組合物中，所述方法的特征是所述的脂質(zhì)體含有一種或多種固醇并且所述的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明涉及貯藏腫瘤細(xì)胞的簡單有效的方法，其中細(xì)胞中的RNA和/或DNA基本上不被降解，從而可以在貯藏后分析RNA和/或DNA。
文檔編號A61K9/127GK1816617SQ200480018934
公開日2006年8月9日 申請日期2004年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者F·巴赫, J·費(fèi)希爾 申請人:翁科科學(xué)股份公司