專利名稱：乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用基因的分離及分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與人乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離及其分離方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特性之一就是腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)移是90％以上腫瘤患者的致死原因，而由原發(fā)性腫瘤致死是較為罕見的。然而，由于目前腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不十分清楚，關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。
腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素、序貫的復(fù)雜過程，它受許多特殊基因的調(diào)控，它們或被激活，或被抑制，相互協(xié)同或拮抗，最終影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此，對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中基因組的改變進(jìn)行全面的了解，篩選出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，在研究腫瘤轉(zhuǎn)移抗體疫苗、篩選控制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物等方面都有著十分重要的意義。
目前，在有關(guān)乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究中，主要是以手術(shù)切除的正常乳腺組織、乳腺癌組織或乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)樣本。作為實(shí)驗(yàn)樣本，要求組織新鮮，無壞死、無包膜等，但手術(shù)切除的組織只有很少一部分能達(dá)到這樣的標(biāo)準(zhǔn)；另外由于臨床手術(shù)切除的組織細(xì)胞成分復(fù)雜，不同轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞混雜，直接影響著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究。因此，建立一種高通量、高精確度的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離方法十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有高精確度、高通量、高穩(wěn)定性和重復(fù)性好、參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離方法。該方法克服了以往分離或研究方法中的上述缺點(diǎn)和不足，建立了具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系，并與其親本人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7形成配對(duì)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)樣本，不僅可隨時(shí)無限量培養(yǎng)，使實(shí)驗(yàn)樣本簡(jiǎn)單易得，為實(shí)驗(yàn)提供了極大的方便，且由于實(shí)驗(yàn)樣本的細(xì)胞成分均一，保證了分離結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性。
本發(fā)明方法還通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，比較兩種具有不同轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系基因表達(dá)譜的差異，分離出了參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。這些乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)和功能的確認(rèn)，可從分子水平深入揭示乳腺癌的轉(zhuǎn)移和發(fā)展，從而可以進(jìn)一步尋找到理想的乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物治療的靶點(diǎn)或基因治療方法。本發(fā)明的技術(shù)的公開，不僅在乳腺癌的藥物或基因治療方面，而且在用于制備腫瘤轉(zhuǎn)移芯片、制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因疫苗及建立抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選技術(shù)平臺(tái)等方面，也將有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明與人乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的分離方法，包括
1)SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中篩選和建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系；2)細(xì)胞培養(yǎng)將LM-MCF-7和MCF-7細(xì)胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸鏈霉素和100u/ml青霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)總RNA提取一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞的總RNA，用異丙醇沉淀，并過柱純化；4)cDNA反轉(zhuǎn)錄及熒光標(biāo)記取一定量總RNA，以T7-Oligo(dT)15為引物，合成雙鏈cDNA，純化；之后將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、純化；取cRNA，用Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)，9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA并純化；取cDNA，用9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物和KLENOW酶進(jìn)行熒光標(biāo)記，之后純化并抽干；標(biāo)記過程中dATP，dGTP，dTTP使用濃度為120μM，dCTP為60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP為40μM。dNTP為10mM。
5)制備人寡聚核苷酸標(biāo)準(zhǔn)基因芯片將Qiagen公司人類基因的Oligo庫中的寡聚DNA點(diǎn)制在一張75×25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上；點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括人的12個(gè)看家基因作為陽性對(duì)照，12條人工合成的與人基因沒有同源性的70個(gè)堿基的寡聚DNA作為陰性對(duì)照，以及擬南芥的3個(gè)基因作為外標(biāo)；整個(gè)點(diǎn)陣分成48個(gè)亞陣；每個(gè)亞陣有22行，22列；點(diǎn)間距為185μm，點(diǎn)的直徑約為140μm；6)雜交與洗滌將標(biāo)記的DNA溶于35μl雜交液中，放入標(biāo)準(zhǔn)基因芯片于42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，將芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液體中洗5分鐘，再在0.2×SSC中室溫洗5分鐘，最后甩干用于掃描；雜交液的組分為3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)篩選確定用ScanArray Express雙通道激光掃描儀掃描基因芯片，用GenePix Pro 4.0軟件分析芯片上每個(gè)點(diǎn)Cy3和Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，并用Lowess方法歸一化；以差異為兩倍(即比值大于2.0，小于0.5)的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。
采用本發(fā)明方法分離出的乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用的基因，如表1所示。
表1乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用的基因

附圖簡(jiǎn)要說明

圖1.總RNA甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
其中A為MCF-7細(xì)胞的總RNA，B為L(zhǎng)M-MCF-7細(xì)胞的總RNA.
圖2.基因表達(dá)譜芯片雜交圖，紅點(diǎn)和綠點(diǎn)分別代表LM-MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)和低表達(dá)的基因，黃色點(diǎn)表示該基因表達(dá)的差異不顯著。
圖3.基因表達(dá)譜芯片散點(diǎn)圖，其中X軸和Y軸分別以兩種樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度值為坐標(biāo)，圖中每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)。紅色標(biāo)記和綠色標(biāo)記的數(shù)據(jù)點(diǎn)分別表示Y/X的比值≥2和≤0.5，是屬于表達(dá)有差異的基因，黑色標(biāo)記表示Y/X的比值在0.5和2之間，表達(dá)基本無差異。
圖4.Real-time PCR 1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖。
泳道1，LM-GAPDH；泳道2，M-GAPDH；泳道3，LM-ALCAM；泳道4，M-ALCAM；泳道5，LM-ACTB；泳道6，M-ACTB；M，DL2000具體實(shí)施方式
下面提供一種本發(fā)明的實(shí)施方式，用于說明本發(fā)明方法。
實(shí)施例1)用SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中篩選和建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系。
2)細(xì)胞培養(yǎng)LM-MCF-7和MCF-7細(xì)胞應(yīng)用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸鏈霉素和100u/ml青霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)總RNA提取用Trizol(Invitrogen，USA)采用一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞的總RNA，異丙醇沉淀，并用RNeasy mini spin column kit(Qiagen，USA)過柱純化。然后用紫外分光光度計(jì)定量，甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明總RNA完整性好。結(jié)果見附圖1。
4)cDNA反轉(zhuǎn)錄并熒光標(biāo)記取10μg總RNA，以T7-Oligo(dT)15為引物，用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成雙鏈cDNA，并用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)純化。用T7RiboMAX Express LargeScale RNA Production System(Promega)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA；并用RNeasyMini Kit(Qiagen)純化。取2μg cRNA，用Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl，Invitrogen)，9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA并純化。取1μg cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物和KLENOW酶進(jìn)行熒光標(biāo)記，之后純化并抽干。
標(biāo)記進(jìn)行兩次。第一次用呈紅色的Cy5熒光素標(biāo)記LM-MCF-7細(xì)胞cDNA探針，用呈綠色的Cy3熒光素標(biāo)記MCF-7細(xì)胞cDNA探針。第二次用呈綠色的Cy3熒光素標(biāo)記LM-MCF-7細(xì)胞cDNA探針，用呈紅色的Cy5熒光素標(biāo)記MCF-7細(xì)胞cDNA探針；標(biāo)記過程中dATP，dGTP，dTTP使用濃度為120μM，dCTP使用濃度為60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，USA)使用濃度為40μM，dNTP為10mM。
5)制備標(biāo)準(zhǔn)基因芯片標(biāo)準(zhǔn)芯片選用由北京博奧生物芯片有限公司制備的人寡聚核苷酸芯片(CAP-B0006，北京博奧生物芯片公司生產(chǎn))6)雜交與洗滌將第一次和第二次標(biāo)記的DNA分別溶于35μl雜交液中，分別放入標(biāo)準(zhǔn)基因芯片于42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，將兩個(gè)芯片分別在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液體中洗5分鐘，再在0.2×SSC中室溫洗5分鐘；最后甩干后用于掃描。
雜交液的組分為3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)篩選確定用ScanArray Express雙通道激光掃描儀掃描基因芯片，用GenePix Pro 4.0軟件分析芯片上每個(gè)點(diǎn)Cy3和Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，并用Lowess方法歸一化；以差異為兩倍(即比值大于2.0，小于0.5)的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。結(jié)果見附圖2和附圖3。
驗(yàn)證以如下的Real-time PCR方法，對(duì)隨機(jī)選取的差異表達(dá)的基因(見表2)進(jìn)行SYBR GreenI Real-time PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果證明了本發(fā)明方法結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
說明ALCAM為隨機(jī)選取的基因，選自應(yīng)用本發(fā)明方法獲得的在LM-MCF-7和MCF-7中差異表達(dá)的基因，用Real-time PCR方法檢測(cè)ALCAM在LM-MCF-7和MCF-7中表達(dá)的差異水平。
選擇看家基因ACTB和GAPDH作為校準(zhǔn)基，用Roche Light Cycler PCR儀檢測(cè)其在LM-MCF-7和MCF-7中表達(dá)差異(Ct值差)分別為0.2和0.3。一般認(rèn)為兩個(gè)基因在相應(yīng)樣本中表達(dá)的Ct值差小于0.5為二者表達(dá)基本相同。上述兩個(gè)標(biāo)本Ct值差為0.1，符合小于0.5的標(biāo)準(zhǔn)，故兩個(gè)基因在相應(yīng)樣品中的表達(dá)基本相同，可任選ACTB作為校準(zhǔn)基因。
a)驗(yàn)證方法采用Trizol(Invitrogen，USA)一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞的總RNA，用異丙醇沉淀，并用RNeasy mini spin column kit(Qiagen，USA)過柱純化。用RNA free DNase I處理實(shí)驗(yàn)體系，在37℃下反應(yīng)30分鐘，然后用苯酚/氯仿處理，添加1/10體積的3M醋酸鈉，用2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀RNA，以70％乙醇清洗，干燥后溶于適量DEPC水中。取2.5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄形成1st-cDNA。使用Light Cycler PCR儀(Roche，PTC-225)，Lightcycler-faststart DNA master SYBR green I(Roche)進(jìn)行real time-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為鎂離子濃度3mM，引物濃度0.25μM，95℃變性10min；95℃ 10秒，60℃ 5秒，72℃ 15秒，重復(fù)45個(gè)循環(huán)；75℃至95℃繪制溶解曲線，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況，得到一條整齊、亮度高的電泳條帶(結(jié)果見圖4)，證明擴(kuò)增片段大小與本發(fā)明方法結(jié)果一致，基因擴(kuò)增效率和特異性均好。并采用比較閾值法對(duì)Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析，所得結(jié)果見表3。
表2 Real-time PCR

表3 Real-time PCR結(jié)果

注比值＝LM-MCF-7(LM)/MCF-7(M)；Ct(threshold cycle)＝熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)；ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct看家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct看家基因)對(duì)照組Real-time PCR結(jié)果顯示，差異基因在LM-MCF-7細(xì)胞中有高表達(dá)，差異表達(dá)的比值與本發(fā)明結(jié)果中的差異比值很接近，表明Real-time PCR結(jié)果很好的吻合了本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證實(shí)了本發(fā)明分離方法結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
權(quán)利要求
1.一種乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用基因的分離方法，其特征在于包括1)用SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中篩選和建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系；2)細(xì)胞培養(yǎng)將LM-MCF-7和MCF-7細(xì)胞用RPMI 1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸鏈霉素和100u/ml青霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)總RNA提取一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞的總RNA，用異丙醇沉淀，并過柱純化；4)cDNA反轉(zhuǎn)錄及熒光標(biāo)記取一定量總RNA，以T7-Oligo(dT)15為引物，合成雙鏈cDNA，純化；之后將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、純化；取cRNA，用Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)，9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA并純化；取cDNA，用9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物和KLENOW酶進(jìn)行熒光標(biāo)記，之后純化并抽干；標(biāo)記過程中dATP，dGTP，dTTP使用濃度為120μM，dCTP為60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP為40μM，dNTP為10mM；5)制備人寡聚核苷酸標(biāo)準(zhǔn)基因芯片將Qiagen公司人類基因的Oligo庫中的寡聚DNA點(diǎn)制在一張75×25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上；點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括人的12個(gè)看家基因作為陽性對(duì)照，12條人工合成的與人基因沒有同源性的70個(gè)堿基的寡聚DNA作為陰性對(duì)照，以及擬南芥的3個(gè)基因作為外標(biāo)；整個(gè)點(diǎn)陣分成48個(gè)亞陣；每個(gè)亞陣有22行，22列；點(diǎn)間距為185m，點(diǎn)的直徑約為140m；6)雜交與洗滌將標(biāo)記的DNA溶于35μl雜交液中，放入標(biāo)準(zhǔn)基因芯片于42℃雜交過；雜交結(jié)束后，將芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液體中洗5分鐘，再在0.2×SSC中室溫洗5分鐘，最后甩干用于掃描；雜交液的組分為3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)篩選確定用ScanArray Express雙通道激光掃描儀掃描基因芯片，用GenePix Pro 4.0軟件分析芯片上每個(gè)點(diǎn)Cy3和Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，并用Lowess方法歸一化；以差異為兩倍(即比值大于2.0，小于0.5)的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高精確度、高通量篩在乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用基因的分離方法。本發(fā)明方法通過建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM－MCF－7細(xì)胞系與其親本人乳腺癌細(xì)胞系MCF－7形成配對(duì)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)樣本，不僅可隨時(shí)無限量培養(yǎng)獲得，且由于實(shí)驗(yàn)樣本的細(xì)胞成分均一，保證了分離結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明方法還通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分離出了這些參與轉(zhuǎn)運(yùn)作用的基因，這些基因的表達(dá)和功能的確認(rèn)，在乳腺癌藥物或基因治療方面以及在用于制備腫瘤轉(zhuǎn)移芯片、制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因疫苗及建立抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選技術(shù)平臺(tái)方面，都將有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1810980SQ20051001315
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者張曉東, 葉麗虹, 吳蓮英, 尤嘉琮 申請(qǐng)人:南開大學(xué)