專利名稱：以c的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以C60為載體的骨靶向治療藥物C60-AEDP(1-氨基-1-甲基-1，1-二膦酸)及其在制備治療骨疾病的藥物中的應(yīng)用。
骨組織是一個代謝旺盛的器官。骨代謝的基本現(xiàn)象是重建，骨重建是一個復(fù)雜的過程，主要包括骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞的骨吸收。破骨細(xì)胞清除舊礦物質(zhì)，成骨細(xì)胞形成類骨質(zhì)并進(jìn)行礦化，以維持骨的形態(tài)、骨量和骨的整體強(qiáng)度。在人的一生，老的骨組織不停地被清除，新的骨組織不停地建成并替代被清除的老的骨組織。
由于年齡和疾病問題，骨的生命過程會受到影響，相應(yīng)的一系列骨類疾病發(fā)生，除炎癥及腫瘤外，發(fā)育異常、物質(zhì)代謝障礙及外傷都很常見。
對健康的年輕人來說，新骨產(chǎn)生的速度和舊骨破損的速度大致平衡，在老年人身上，這個平衡移向了舊骨被破損的一邊。因此，老年人容易患骨質(zhì)疏松癥之類的骨質(zhì)虛弱疾病。一些癌癥往往會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，最后產(chǎn)生難忍的劇痛，這主要由兩方面引起，腫瘤壓迫骨神經(jīng)，另一方面腫瘤細(xì)胞會分泌一種叫PTHrP的蛋白，這種蛋白促使破骨細(xì)胞的形成，在骨骼局部破骨細(xì)胞非?；钴S，產(chǎn)生病灶，嚴(yán)重的會引起全身性高血鈣癥。
Paget’s病則是表現(xiàn)為骨的吸收過程和骨的形成過程都特別加強(qiáng)，某一時期以骨吸收占優(yōu)勢，另一時期又以骨質(zhì)生成占優(yōu)勢，兩者交替進(jìn)行，導(dǎo)致同一骨骼內(nèi)有不同的病變，最嚴(yán)重的結(jié)果是轉(zhuǎn)變?yōu)楣侨饬觥?br> 另外還有一系列疾病會引起骨吸收和骨形成之間失去平衡，例如甲狀腺功能亢進(jìn)和骨巨細(xì)胞瘤等，患有這類疾病的人往往有共同的癥狀—骨痛。因此保持骨骼的正?；顒雍苤匾?br> 上述的條件和因素會引起負(fù)面的骨丟失和必須通過加速骨生長來替代丟失的骨。因此減少骨丟失或促進(jìn)骨形成的化合物對治療骨疾病是有用的。目前對于骨質(zhì)疏松癥、轉(zhuǎn)移性骨痛、Patet’s病及其他與骨代謝有關(guān)的疾病有許多治療方法，例如，不同種化學(xué)或激素治療已經(jīng)用于骨疾病的治療。激素如雌激素能夠促進(jìn)骨形成，但是不幸的是，因?yàn)榇萍に貢鸢┌Y和其他副作用，沒有廣泛地被指定用于骨病治療。因此使用科技發(fā)展地最新成果研制用于治療與骨代謝有關(guān)地骨疾病的新藥物引起世界各國科技工作者的高度興趣。
一項(xiàng)最近被批準(zhǔn)用于骨疾病治療的是一類二磷酸鹽類化合物。二磷酸鹽與骨結(jié)合，降低破骨細(xì)胞的活性并且促使新骨形成，其用于臨床有以下特點(diǎn)1)不僅能抑制骨吸收，還能增加骨量，使損失的骨組織恢復(fù)；2)能促使骨小梁的重建，也能減少陷窩深度?，F(xiàn)在人工合成的二磷酸鹽類藥物已有300多種，其中有十種已進(jìn)入或正在進(jìn)入臨床，用于治療骨溶解性病變。
HEDP屬于二膦酸鹽，二膦酸鹽是近二十年來發(fā)展起來的用于治療骨和鈣代謝疾病的新藥物，不僅能抑制內(nèi)源性骨吸收，還能抑制由甲狀旁腺素、前列腺素、1，25-(OH)2D3等誘導(dǎo)的骨吸收(參見陳一心，韓祖斌，丁文玉，等。中華骨科雜志，1995，15298-301)。在此類藥物中，HEDP為第一代，長期應(yīng)用會阻滯正常骨組織礦化，快速靜脈注射可能會引起腎功能下降。為了提高療效，減少毒副作用，藥學(xué)家合成了一系列二膦酸鹽，AEDP(1-氨基-亞乙基-1，1-二膦酸)為第二代二膦酸鹽，由于1位C上帶有一個氨基，發(fā)現(xiàn)對骨病的治療效果要比只帶羥基的HEDP好，而且長期應(yīng)用不會阻滯正常骨組織礦化(參見Herbert Fleisch.Drugs，1991，42(6)919-944)。其中HEDP和AEDP的結(jié)構(gòu)式如下 二膦酸鹽類藥物由于具有不同程度的刺激性，靜脈注射也會產(chǎn)生注射部位不同程度的損傷，臨床通?？诜盟?。但是它們的口服利用度很低，例如口服阿倫膦酸鈉(alendronate)后，生物利用度只有0.7％。二磷酸鹽類藥物口服生物利用度低主要是由于它們的極性大，脂溶性差，不能通過上皮細(xì)胞屏障進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，只能經(jīng)過上皮細(xì)胞間的緊密連接，經(jīng)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)途徑吸收，當(dāng)它們的分子量相對較大障礙了這種轉(zhuǎn)運(yùn)。所以增加二磷酸鹽類藥物的脂溶性及其降低二磷酸鹽在靜脈注射時對肌體的刺激和損傷有望提高利用度，從而減少用藥量，降低因高劑量造成的生物毒性，同時也能減輕病人的減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為研制新一代二磷酸鹽藥物的關(guān)鍵。
富勒烯中典型成員C60具有特殊的中空特殊結(jié)構(gòu)，其直徑為0.71nm。富勒烯的特殊結(jié)構(gòu)賦予了它們許多奇異性質(zhì)，由于富勒烯的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，預(yù)期在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。C60有30個雙鍵，通過多種反應(yīng)可與二磷酸鹽類藥物連接。C60是個非極性分子，利用C60基團(tuán)的疏水性，可望提高二磷酸鹽類藥物的脂溶性，從而提高生物利用度；其次C60衍生物對皮膚無刺激無毒性，在體內(nèi)無積累，C60載帶二磷酸鹽的復(fù)合物可能降低刺激和損傷；最后，二磷酸鹽類藥物是通過抑制破骨細(xì)胞的形成和活性，達(dá)到抑制骨吸收的。從目前揭示的證據(jù)表明，氧自由基幾乎和人類大部分疾病有關(guān)系。例如神經(jīng)系統(tǒng)中各種疾病都有氧自由基參與；致癌、促癌和癌的形成每一步都有自由基的參與，那么破骨細(xì)胞性骨吸收時有可能有自由基的產(chǎn)生。C60有很強(qiáng)的吸自由基的能力，C60可能對破骨細(xì)胞的形成和活性產(chǎn)生影響。
b.C60-AEDP的合成在石英反應(yīng)瓶中，加入1.4ml 4M NaOH，1ml 10％丁基氫氧化銨，再加50ml 1ml/mg的C60(購自武漢大學(xué))-甲苯溶液，在加熱及500W高壓汞燈(亞明照明有限公司)的照射下，滴加5ml 10mg/ml的AEDP。繼續(xù)反應(yīng)8小時，甲苯層呈無色，水相為黑棕色不透明溶液。取水相透析48小時后除去不溶物，濃縮并置于105℃下烘干。在光照反應(yīng)合成C60-AEDP過程中，有不少黑色有光澤的不溶物產(chǎn)生。有研究表明認(rèn)為富勒烯固體在激光照射下隨時間發(fā)生裂解形成石墨和無定型碳，同時發(fā)生C60的光致聚合效應(yīng)。本合成反應(yīng)是在溶液中，而且是在紫外光照射進(jìn)行的，條件是與前者有所不同，但是還是有可能發(fā)生相同的反應(yīng)，不溶物是否是石墨或無定型碳需要確定，由于合成中不溶物量很少，很難收集，目前還沒作出定論。
干燥后的樣品用ICAP-900型等離子體測產(chǎn)物中P的含量，測試條件功率1.1KW，反射功率＜5W；頻率27.120MHZ；炬焰高度16mm；霧化器直角霧化器，壓力20PSi，蠕動泵輸入，提升量1.35ml/min，冷卻氣20L/min。最后測得產(chǎn)物中的P的含量為4.846％。按每個C60接上一個AEDP來算，P的含量應(yīng)為6.904％。在激光照射下，固態(tài)C60會發(fā)生光致聚合作用，在光子激發(fā)下，C60壽命很短的單重激發(fā)態(tài)向長壽命的三重態(tài)躍遷，C60高速旋轉(zhuǎn)，當(dāng)兩個C60的雙鍵平行時，在光子作用下，能量高的C60雙鍵形成懸掛鍵，兩個C60聚合形成兩個單鍵，從而形成二聚物，隨著光照的進(jìn)行，可以形成四聚物、八聚物等等。
實(shí)施例2 C60-AEDP的合成a.AEDP的合成參照實(shí)施例1。
b.C60-AEDP的合成在石英反應(yīng)瓶中，加入1.4ml 4M NaOH，1ml 10％四甲基氫氧化銨，再加50ml 1ml/mg的C60-苯溶液，在加熱及500W高壓汞燈的照射下，滴加5ml 10mg/ml的AEDP。繼續(xù)反應(yīng)8小時，甲苯層呈無色，水相為黑棕色不透明溶液。取水相透析48小時后除去不溶物，濃縮并置于105℃下烘干，得到產(chǎn)物。
實(shí)施例399mTc-C60-AEDP的合成在反應(yīng)器中加入3ml 25mg/ml的C60-AEDP，再加入1.5ml10mg/ml的Vc和0.75ml5mg/ml的氯化亞錫，調(diào)pH至6，加入約20mCi的99mTcO4-，在沸水浴中反應(yīng)20分鐘后，調(diào)pH至7，加入3ml生理鹽水，紙層析分析結(jié)果顯示標(biāo)記體系中基本無游離的99mTcO4-存在，放射性主要其中在前沿(0.9％生理鹽水)，標(biāo)記率達(dá)90％。
實(shí)施例4取昆明種小白鼠30只，隨機(jī)分成6組，每組5只，取已標(biāo)記好的99mTc-C60-AEDP按約200μl/只，分別注入小鼠尾靜脈中。在給藥后不同的時間階段，處死并剖重要器官和組織，分別稱重并測放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器攝取的放射性活度占注射量的百分比(％ID/g)。
化合物在小鼠體內(nèi)的分布見表1，從表1可以看出標(biāo)記化合物很快隨血液傳輸?shù)叫∈笕恚饕植荚诜魏凸?，肺較骨的排泄要快的多，在0.5h肺的攝取達(dá)最高為21.901％，隨后隨著時間的推移，肺的中放射性含量降低較快，而在實(shí)驗(yàn)段內(nèi)，骨的攝取始終保持很高；腎中放射性攝取高，腸內(nèi)基本無放射性，說明化合物是通過腎排泄的；富含內(nèi)皮網(wǎng)狀組織的肝和脾對放射性的攝取很少，因此骨對化合物的攝取并不是因?yàn)轭悆?nèi)皮網(wǎng)狀組織吞噬，而是化合物本身具有親骨性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)記物中較大的顆粒(＞10μm)存在，滯留于肺部，肝脾的低攝取說明化合物中基本上沒有能被內(nèi)皮網(wǎng)狀組織識別并吞噬的小顆粒存在。靜脈注射后，標(biāo)記化合物隨血流迅速進(jìn)入肺血管，由于比血管腔大的顆粒的物理俘獲(定位)機(jī)理，顆粒大的物質(zhì)立即暫時栓塞在肺小動脈(內(nèi)徑平均30μm)和毛細(xì)血管(平均8μm)內(nèi)。
表1 C60-AEDP在小鼠體內(nèi)的分布(靜脈注射)(％ID/g，x±SD)

實(shí)施例5取昆明種小白鼠30只，隨機(jī)分成6組，每組5只，取已標(biāo)記好并且經(jīng)過過濾的99mTc-C60-AEDP，用0.22μm的Millipore過濾后清液中所剩放射性為原來的83％。按約200μl/只，分別注入小鼠尾靜脈中。在給藥后不同的時間階段，處死并剖重要器官和組織，分別稱重并測放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器攝取的放射性活度占注射量的百分比(％ID/g)。
化合物在小鼠體內(nèi)的分布見表2，從表2可以看出，大顆粒的化合物已被過濾掉，肺中無放射性積累，而骨的攝取則有所提高，其他組織普遍減少。
表2 C60-AEDP在小鼠體內(nèi)的分布(過濾后靜脈注射)(％ID/g，x±SD)

實(shí)施例6取昆明種小白鼠12只，隨機(jī)分成3組，每組4只，取已標(biāo)記好的99mTc-C60-AEDP按約200μl/只，分別皮下注入。在給藥后1、24、48小時，處死并剖重要器官和組織，分別稱重并測放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器攝取的放射性活度占注射量的百分比(％ID/g)化合物的小鼠分布見表3，分析皮下注射數(shù)據(jù)，可知肝脾無放射性滯留，骨中的高攝取是由于化合物本身的親骨性引起的。
表3 C60-AEDP在小鼠體內(nèi)的分布(皮下注射)(％ID/g，x±SD)

動物試驗(yàn)結(jié)果顯示提示1)合成C60-AEDP時，主要有兩類產(chǎn)物，單合成產(chǎn)物和大顆粒聚合物。大顆粒聚合物幾乎全部被肺滯留，其它部分化合物能很快被生物體吸收，主要分布在骨，肌肉和皮毛中較少，且不能通過血腦屏障，最后主要通過腎臟排泄。2)連接基團(tuán)在C60衍生物生物體內(nèi)分布上起主要的作用，C60只是起類似“協(xié)同”的作用。這也說明以C60作為藥物載體是可行的，C60-二膦酸復(fù)合物也是可以成為新的骨質(zhì)疏松治療藥物的。
權(quán)利要求
1.一種以C60為載體的骨靶向治療藥物，其是由AEDP在紫外光照射下與C60反應(yīng)生成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以C60為載體的骨靶向治療藥物，其特征在于，該反應(yīng)是在非均相體系中進(jìn)行的，其中相轉(zhuǎn)移劑為四丁基氫氧化銨或四甲基氫氧化銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以C60為載體的骨靶向治療藥物在制備治療骨疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以C60為載體的骨靶向治療藥物的應(yīng)用，其特征在于，該骨疾病為骨質(zhì)疏松癥、癌轉(zhuǎn)移性骨痛和Paget’s。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以C
文檔編號A61P19/00GK1390605SQ02136178
公開日2003年1月15日 申請日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者李晴暖, 李文新 申請人:中國科學(xué)院上海原子核研究所