專利名稱：使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
雖然各種治療方法不斷在進(jìn)步，心血管疾病仍然是導(dǎo)致死亡的一個(gè)主要原因。在發(fā)達(dá)國家，缺血性心臟病導(dǎo)致的死亡占由心血管疾病引起的死亡的50%以上。據(jù)美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查2005-2006年的數(shù)據(jù)，1/3或近80，000, 000的美國成年人患有一種或多種心血管疾病，其中大約有38，100，000人年齡在60或60歲以上。死亡資料顯示2005年美國以心血管疾病(包括先天性心血管缺陷)為潛在原因引起的死亡人數(shù)為864，480，占總死亡人數(shù)2，448，017的35. 3%，或者說每2. 8個(gè)死亡人數(shù)中有一個(gè)是以心血管疾病為潛在原因而死的。2005年心血管疾病的總死亡人數(shù)(1，372，000)大約占了所有死亡人數(shù)的56%。 大約每天有2，400美國人死于心血管疾病，即每30秒就有一個(gè)人死于心血管疾病。每年死于心血管疾病的人幾乎與死于癌癥、慢性下呼吸道疾病、意外和糖尿病的人一樣多(NCHS)。干細(xì)胞移植有可能修復(fù)和改善心臟狀況，從而極大地幫助降低疾病的發(fā)生率和死亡率。Dib等人證實(shí)了自體成肌細(xì)胞移植的可行性、安全性和患者的成功生存，并指出干細(xì)胞移植可能是治療末期心臟病的一個(gè)潛在的治療方法。同種異體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可以從骨髓中分離出來。它們可以通過培養(yǎng)大量增殖同時(shí)保持其多種潛能特性。它們是組織工程使用的初級(jí)細(xì)胞，可以表達(dá)多種細(xì)胞類型，組織工程是一個(gè)非常有前途有希望的領(lǐng)域，它讓我們可以重建器官，修復(fù)病變和受損的組織。同種異體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞主要有兩種造血骨髓干細(xì)胞(單核)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。人們用后肢缺血再灌注模型進(jìn)行研究，對(duì)這兩種干細(xì)胞進(jìn)行了深刻的對(duì)比。間充質(zhì)干細(xì)胞有更強(qiáng)的修復(fù)作用，因?yàn)樗鼈兎置诟嗯c血管生成有關(guān)的細(xì)胞因子。間充質(zhì)干細(xì)胞有多向分化潛能，能逃過受體免疫系統(tǒng)的檢查，甚至能降低T細(xì)胞的反應(yīng)，這使我們可以使用多種異體干細(xì)胞進(jìn)行治療。目前所記載的研究大部分都將干細(xì)胞注射到冠狀動(dòng)脈內(nèi)和肌肉內(nèi)。一個(gè)有698位病人的研究分析顯示使用冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射干細(xì)胞治療急性心肌梗塞對(duì)于恢復(fù)心臟功能和心臟變形能達(dá)到相關(guān)的臨床效果。使用細(xì)胞治療的病人其目標(biāo)血管重建的需求并沒有增加，研究發(fā)現(xiàn)治療是安全的。雖然乍一看，冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射是細(xì)胞應(yīng)用的一種方式，但放射標(biāo)記骨髓細(xì)胞顯示與肌肉內(nèi)注射相比，冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射所留下的細(xì)胞量較少。但肌肉內(nèi)注射只能對(duì)局部區(qū)域起作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明所提供的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，分為只由活性成分組成的便于存放的貯存型培養(yǎng)基和由所述貯存型培養(yǎng)基和水配成的即用型培養(yǎng)基。所述使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，其中的貯存型培養(yǎng)基， 由如下配比的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. Og-5. 0g，碳酸鈉0. llg-0. 19g，L-谷氨酰胺 0. 584g-0. 702g，二甲基亞砜100ml-130ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g_67g，胰島素5g_6. 6g，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. Olg-O. 05g。上述培養(yǎng)基中的七種物質(zhì)可獨(dú)立包裝也可混合在一起。所述培養(yǎng)基具體可由如下配比的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. 5g，碳酸鈉0. llg，L_谷氨酰胺0. 584g，二甲基亞砜100ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g，胰島素5g，堿性成纖維細(xì)胞生長因子
0. Olgo使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，其中的即用型培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖 4. Og/L-5. Og/L，碳酸鈉 0. llg/L-0. 19g/L，L-谷氨酰胺 0. 584g/L_0. 702g/L，二甲基亞砜100ml/L-130ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L_67g/L，胰島素5g/L_6. 6g/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. 01g/L-0. 05g/L，所述溶劑為注射用水。其中，所述溶質(zhì)具體由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. 5g/L，碳酸鈉0. llg/L，L-谷氨酰胺0. 584g/L，二甲基亞砜100ml/L， 轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L，胰島素5g/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. 01g/L。所述使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的兩種培養(yǎng)基，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白具體可為人轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述胰島素具體可為人胰島素，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子具體可為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子。其中，貯存型培養(yǎng)基可按照包括如下步驟的方法制備將所述七種物質(zhì)按照所述配比混合，得到貯存型培養(yǎng)基。即用型培養(yǎng)基可按照包括如下步驟的方法制備將所述溶質(zhì)中的七種物質(zhì)均溶于注射用水達(dá)到所述終濃度，得到即用型培養(yǎng)基。所述使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的兩種培養(yǎng)基可用于制備使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的試劑。所述使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的試劑包括所述使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具體可為離體的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，可使通過靜脈注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶，解決了目前通過冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射所留下的細(xì)胞量較少的問題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基制備的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的試劑可使心肌梗死的部位獲得足夠的干細(xì)胞進(jìn)而分化成新生的心肌細(xì)胞。


圖1為左心室掃描圖(上面標(biāo)注的是>=15. OmV ；下面的是<=5. OmV)A為注射由本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基配制的試劑
、r -
IlJB為注射由本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基配制的試劑后圖2為心肌梗死動(dòng)物模型心臟冠狀切片TTC染色白色區(qū)域?yàn)樾募乃绤^(qū)，粉紅色區(qū)域?yàn)檎Ｐ募　、治療組動(dòng)物注射用本發(fā)明的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶培養(yǎng)基配制的試劑7天后的心肌切片b、對(duì)照組動(dòng)物注射細(xì)胞稀釋液后7天后的心肌切片圖3為兩組動(dòng)物的心肌缺血面積比較圖4為治療組的免疫組織化學(xué)熒光染色結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 下述實(shí)施例中的人同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Mesenchymal Stem Cells，來自美國 Stemedica Cell Technologies, Inc. , MM0013. Ol0 人胰島素來自 Sigma， 10908 ；人轉(zhuǎn)鐵蛋白來自Sigma，T3309 ；人堿性成纖維細(xì)胞生長因子來自P印rotech， 100-18B。實(shí)施例1、使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑盒的制備本實(shí)施例提供的使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑盒的組成如下用于存放使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的試劑的瓶A、用于存放細(xì)胞染液的瓶B，用于存放所述細(xì)胞稀釋液的瓶C、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、用于吸取細(xì)胞懸液的吸管和用于吸取細(xì)胞懸液放入所述細(xì)胞計(jì)數(shù)板的虹吸管。1)瓶A內(nèi)盛放的物質(zhì)是使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基Ml和人同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。每瓶20ml，-80°C保存。其中，培養(yǎng)基Ml和人同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的配比為每毫升培養(yǎng)基1.5X IO7個(gè)人同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)基 Ml,由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. 5g/L，碳酸鈉0. Ilg/ L, L-谷氨酰胺0. 584g/L，二甲基亞砜100ml/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白50g/L，人胰島素5g/L，人堿性成纖維細(xì)胞生長因子0.01g/L。溶劑為注射用水。2)瓶B內(nèi)盛放的物質(zhì)是能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞染液。該細(xì)胞染液是0. 4% 的臺(tái)盼蘭溶液。每瓶0.5mL，室溫保存?；闷緾內(nèi)盛放的物質(zhì)是細(xì)胞稀釋液。該細(xì)胞稀釋液是注射用生理鹽水，即0. 9% NaCl水溶液。每瓶IOOmL,室溫保存。4)細(xì)胞計(jì)數(shù)板(滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2006第M10370號(hào))計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)經(jīng)特殊的鍍膜工藝處理，在顯微鏡下的網(wǎng)格非常清晰，大大減輕視疲勞。5)吸管1個(gè)(Model Si，上海醫(yī)療用品公司)6)虹吸管1個(gè)(Model U2，上海醫(yī)療用品公司)瓶A的包裝盒鋼精鋁質(zhì)圓筒，直徑6cm，高10cm，泡沫塑料內(nèi)架設(shè)置凹槽(直徑 2. 5cm，高8cm)安放瓶A并將瓶A完全包埋在內(nèi)架中央。此包裝盒適于_80°C保存及干冰冷凍運(yùn)輸。瓶B、瓶C、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、吸管和虹吸管均包裝在另一個(gè)盒內(nèi)，室溫保存。
實(shí)施例2、用實(shí)施例1的試劑盒治療心肌梗死一、細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞計(jì)數(shù)在實(shí)際操作中，凍存的干細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇活化的原則為快速解凍，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的-5 0°C，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)干細(xì)胞造成傷害導(dǎo)致干細(xì)胞的死亡。干細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作過程如下1.從-80°C冰箱中取出瓶A包裝，將瓶A和周圍包裹的保溫泡沫塑料一同從包裝桶中取出；操作人員應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。2.將瓶A和周圍包裹的保溫泡沫塑料迅速放入盛有36°C 37°C水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍。3.去除保溫泡沫塑料，取出瓶A，輕輕反復(fù)搖勻。用70%酒精擦拭消毒后，凈化臺(tái)上打開蓋，用吸管吸出0. 5mL干細(xì)胞母液，注入瓶B的臺(tái)盼蘭溶液中，適當(dāng)吹打使干細(xì)胞和染液充分懸浮。4.在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)專用的蓋玻片。用玻璃虹吸管吸取干細(xì)胞懸液，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹槽處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。5.置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。6活細(xì)胞不染色，而死細(xì)胞被染成藍(lán)色。只計(jì)活細(xì)胞數(shù)，按下式確定復(fù)蘇后干細(xì)胞母液的濃度母液干細(xì)胞濃度=(4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4) X IO4個(gè)/ml7.注意事項(xiàng)(1)務(wù)必使分散成單個(gè)細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)前，充分混勻細(xì)胞懸液。(2)顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)> 10%，說明細(xì)胞分散不充分；或細(xì)胞數(shù)< 200個(gè)/IOmm2或> 500個(gè)/IOmm2時(shí)，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。二、治療劑量及細(xì)胞靜脈注射液制備(1)成人同種異體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞單劑量靜脈注射劑治療缺血性心臟病的劑量是根據(jù)患者的體重來計(jì)算的。根據(jù)臨床試驗(yàn)的結(jié)果，治療缺血性心臟疾病的劑量范圍是 500, 000/kg 1，500，000/kg體重，最佳劑量是每公斤體重100萬個(gè)干細(xì)胞。但一次靜脈輸入的干細(xì)胞數(shù)量最多不能超過1億個(gè)。(2)根據(jù)成活細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，以下列公式確定從A瓶中的取出的干細(xì)胞母液量干細(xì)胞母液量=計(jì)劃靜脈輸入干細(xì)胞數(shù)+母液干細(xì)胞濃度實(shí)施例1的試劑盒的活細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果得出母液干細(xì)胞濃度是1. OX IO7個(gè)/mL， 注射1億( ο8)個(gè)干細(xì)胞就從A瓶中吸取IOmL干細(xì)胞母液。(3)將IOmL干細(xì)胞母液注入C瓶，搖勻，就制成了 IlOmL含有1億個(gè)人同種異體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的靜脈注射液。三、干細(xì)胞靜脈注射用實(shí)施例1的試劑盒治療表1中的患者，具體方法如下在第一天時(shí)，將在上肢靜脈插入靜脈點(diǎn)滴針頭，注射生理鹽水保證靜脈通暢。在一小時(shí)內(nèi)，把含有1億個(gè)的成人同種異體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的IlOml生理鹽水在50分鐘之內(nèi)完成靜脈輸入。具體的療效如表1 所示，心功能在輸入干細(xì)胞3個(gè)月之后晉升一級(jí)，接近正常(圖1)。生活質(zhì)量改善，6分鐘行走測試ECG呈現(xiàn)正常。表1、臨床實(shí)例
權(quán)利要求
1.使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，由如下配比的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. Og-5. 0g，碳酸鈉0. llg-o. 19g，L-谷氨酰胺0. 584g-0. 702g，二甲基亞砜 100ml-130ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g_67g，胰島素5g_6. 6g，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. Olg-O. 05g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于葡萄糖4.5g，碳酸鈉0. llg, L-谷氨酰胺0. 584g，二甲基亞砜100ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g，胰島素5g，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. Olgo
3.使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. Og/L-5. Og/L，碳酸鈉0. llg/L-0. 19g/L，L-谷氨酰胺 0. 584g/L-0. 702g/L，二甲基亞砜 100ml/L_130ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白 50g/L_67g/L，胰島素 5g/ L-6. 6g/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. 01g/L-0. 05g/L，所述溶劑為注射用水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述溶質(zhì)由如下終濃度的七種物質(zhì)組成葡萄糖4. 5g/L，碳酸鈉0. 118/1丄-谷氨酰胺0. 584g/L，二甲基亞砜100ml/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白 50g/L，胰島素5g/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0. 01g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述轉(zhuǎn)鐵蛋白為人轉(zhuǎn)鐵蛋白， 所述胰島素為人胰島素，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1、2或5所述的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟將所述七種物質(zhì)按照所述配比混合，得到所述培養(yǎng)基；權(quán)利要求3-5中任一所述的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟將所述溶質(zhì)中的七種物質(zhì)均溶于注射用水達(dá)到所述終濃度，得到所述培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的培養(yǎng)基在制備使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的試劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的試劑包括權(quán)利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-6中任一所述的培養(yǎng)基在制備使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的成套試劑盒中的應(yīng)用；所述成套試劑盒包括權(quán)利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、用于存放權(quán)利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的瓶A、用于存放所述細(xì)胞染液的瓶B和用于存放所述細(xì)胞稀釋液的瓶C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基，權(quán)利要求6所述的方法，權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為離體的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基及其制備方法。該使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶的培養(yǎng)基，由如下配比的七種物質(zhì)組成由如下配比的七種物質(zhì)組成葡萄糖4.0g-5.0g，碳酸鈉0.11g-0.19g，L-谷氨酰胺0.584g-0.702g，二甲基亞砜100ml-130ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白50g-67g，胰島素5g-6.6g，堿性成纖維細(xì)胞生長因子0.01g-0.05g。該培養(yǎng)基，可使通過經(jīng)脈注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向于心肌梗死灶，解決了目前通過冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射所留下的細(xì)胞量較少的問題。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102286425SQ20111015365
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者曹衛(wèi), 李戍, 焦守恕, 焦陽 申請(qǐng)人:無錫人寰生物醫(yī)藥科技有限公司