專利名稱：新的白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的肽配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作β2整聯(lián)蛋白拮抗劑的新肽，包含這些肽的藥用組合物，新肽在制備治療炎癥疾病和人類白血病和一般性抑制白細(xì)胞粘附和遷移的藥用組合物中的用途，治療或預(yù)防炎癥疾病和人類白血病的方法，及新肽作為β2整聯(lián)蛋白拮抗劑在體外生化分離和純化方法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
經(jīng)過身體和各種淋巴器官遷移的白細(xì)胞是免疫系統(tǒng)必要的元件。白細(xì)胞在血液或淋巴管中循環(huán)時(shí)處于一種靜息和低粘附狀態(tài)，然而，當(dāng)白細(xì)胞被來自于免疫系統(tǒng)的信號(hào)激活如暴露于一種免疫復(fù)合體或一種趨化因子梯度時(shí)，它們的整聯(lián)蛋白粘附受體開始被活化。整聯(lián)蛋白的活化對(duì)于白細(xì)胞的許多功能是必不可少的，這些功能包括與抗原提呈細(xì)胞結(jié)合，經(jīng)由淋巴結(jié)的再循環(huán)和從維管結(jié)構(gòu)中遷移出和穿過細(xì)胞外基質(zhì)到達(dá)炎癥位點(diǎn)等。需要嚴(yán)密地調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白的活化，因?yàn)椴贿m宜的白細(xì)胞粘附會(huì)導(dǎo)致對(duì)正常組織的嚴(yán)重傷害。
目前已知白細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白家族中四種成員之一的特定亞群β2整聯(lián)蛋白，它們具有共同的β2鏈(CD18)，但α亞基(αL或CD11a，αM或CD11b，αX或CD11c和αD或CD11d)不同(Gahmberg等，1997)。α亞基含有一保守的200個(gè)殘基的A或I結(jié)構(gòu)域，它對(duì)于大多數(shù)配體的結(jié)合是必要的。αL和αM亞基的I結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)表明存在一個(gè)被稱之為金屬-依賴性粘附位點(diǎn)的陽離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替代后中止了配體的結(jié)合(Huang和Springer，1995；Kamata等，1995)。
整聯(lián)蛋白的主要配體ICAMs屬于免疫球蛋白超家族，并且已經(jīng)描述了結(jié)合特異性有輕微差異的五種ICAMs。炎癥因子激活了ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，從而促進(jìn)了β2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附。除了ICAMs之外，纖維蛋白原和iC3b補(bǔ)體蛋白是已知的β2整聯(lián)蛋白尤其是αMβ2(Macl)的配體。
由于β2整聯(lián)蛋白對(duì)于白細(xì)胞功能很重要，所以它們的拮抗劑就成為了潛在的抗-炎癥劑。β2整聯(lián)蛋白的抗體或ICAMs在免疫紊亂的動(dòng)物模型中具有治療效果。靶向β2整聯(lián)蛋白的制劑在建立的人類白血病的治療策略中同樣具有價(jià)值(Lalancette等，2000)。然而，迄今為止僅描述了幾個(gè)小分子β2整聯(lián)蛋白的分子拮抗劑(Kallen等，1999；Kelly等，1999)，這種化合物的缺乏妨礙了對(duì)β2整聯(lián)蛋白家族每一成員在白血病傳播以及炎癥疾病中作用的進(jìn)一步研究。特別需要設(shè)計(jì)出能區(qū)別整聯(lián)蛋白非活性和活性狀態(tài)的化合物。迄今為止公開的大分子肽配體妨礙了這種小分子抑制劑的建模。線性肽游離于溶液時(shí)常常沒有一個(gè)確定的結(jié)構(gòu)。22-氨基酸長肽即P1是少量公開的β2整聯(lián)蛋白配體之一，它來源于ICAM-2(Li等，1993)，該肽保留了典型的ICAM-2白細(xì)胞整聯(lián)蛋白-激活效應(yīng)(Li等，1995；Kotovuori等，1999)?？功?整聯(lián)蛋白抗體的互補(bǔ)決定區(qū)成為獲得肽配體的另一種來源，并且一種長度為23個(gè)氨基酸的分離的肽類似于ICAM-1中的序列(Feng等，1998)。
為了產(chǎn)生指向β2整聯(lián)蛋白的較小的肽配體，發(fā)明人篩選了以絲狀噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫。之前已經(jīng)建立起了噬菌體展示技術(shù)來選擇針對(duì)整聯(lián)蛋白類型α5β1(Koivunen等，1994)、αVβ3/β5(Koivunen等，1995)和αVβ6(Kraft等，1999)的肽配體。噬菌體文庫的篩選也證實(shí)了早期的發(fā)現(xiàn)即三肽序列RGD是一種整聯(lián)蛋白亞群的共同識(shí)別序列(Pierschbacher和Ruoslahti，1984)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了明顯帶電荷的RGD類似物如RLD、KGD和NGR。白細(xì)胞整聯(lián)蛋白α4β1、α4β7是已知的對(duì)含有另一種三肽序列LDV的肽具有特異性的物質(zhì)(Komoriya等，1991)。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞-特異性β2整聯(lián)蛋白識(shí)別含有三個(gè)氨基酸的基序，αMβ2整聯(lián)蛋白偏好的三肽被證明是一種先前未知的粘附基序LLG。LLG基序存在于β2整聯(lián)蛋白主要的配體ICAM-1中，但也存在于包括馮·維勒布蘭德氏因子和膠原蛋白等的幾種基質(zhì)蛋白中。發(fā)明人生產(chǎn)了一種新的β2整聯(lián)蛋白拮抗劑肽并命名為LLG-C4，該肽具有一個(gè)通過核磁共振(NMR)確定的緊湊的二硫化物限制的結(jié)構(gòu)。尤其是該生物環(huán)狀肽是一種強(qiáng)效的白細(xì)胞粘附和遷移的抑制劑，并且是一種發(fā)展抗-炎癥劑的新的引導(dǎo)化合物。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種包含結(jié)構(gòu)LLG的新肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物，該結(jié)構(gòu)相應(yīng)于序列表中SEQ ID No.1中顯示的序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了包含結(jié)構(gòu)CXCXLLGCC的新肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物，該結(jié)構(gòu)相應(yīng)于序列表中SEQ ID No.2中顯示的序列，其中X是任一種氨基酸殘基。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了包含結(jié)構(gòu)CPCFLLGCC的新肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物，該結(jié)構(gòu)相應(yīng)于序列表中SEQ ID No.3中顯示的序列。
優(yōu)選SEQ ID No.3顯示的肽在結(jié)構(gòu)上被兩個(gè)二硫鍵約束，尤其優(yōu)選在肽的C1和C8半胱氨酸之間具有一個(gè)二硫鍵，并且在C3和C9半胱氨酸之間有一個(gè)第二個(gè)二硫鍵。
本發(fā)明還涉及新肽的醫(yī)藥用途，含有新肽和與其相連的藥學(xué)上可接受載體的藥用組合物也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
本發(fā)明還包括新肽在制備治療炎癥疾病和人類白血病和一般性抑制白細(xì)胞粘附和遷移的藥用組合物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了治療或預(yù)防性治療炎癥疾病和人類白血病的方法，該方法包括給予需要所述治療的被試者以治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明所述的新肽。
本發(fā)明所述新肽還可以用作體外生化分離和純化不同整聯(lián)蛋白種類和不同類型白細(xì)胞方法中的β2整聯(lián)蛋白拮抗劑。
以下通過參照附圖對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述。
附圖簡要說明

圖1、顯示了LLG-C4-GST九肽與β2白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的結(jié)合，而且它的I-結(jié)構(gòu)域是二價(jià)陽離子依賴性的。
圖1(A)中，來自于血細(xì)胞溶解產(chǎn)物的整聯(lián)蛋白是通過使用αM亞基抗體MEM170或OKM1或αX亞基抗體TS2/4在微量滴定孔中免疫俘獲的。加入純化的LLG-C4-GST或GST對(duì)照(2μg/孔)在沒有或含有EDTA時(shí)結(jié)合60分鐘。洗滌后，結(jié)合的GST蛋白通過使用抗-GST抗體測定。結(jié)果顯示為來自于平行三份加樣孔的平均值±SD。試驗(yàn)重復(fù)三次得到了相近的結(jié)果。
圖1(B)中，LLG-C4-GST或GST在包被有純化的αM亞基I-結(jié)構(gòu)域的微量滴定孔中溫育60分鐘。GST蛋白的濃度如標(biāo)識(shí)的。洗滌后，結(jié)合的GST蛋白通過使用抗-GST抗體測定。結(jié)果顯示為來自于平行三份加樣孔的平均值±SD。在其它兩次試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。
圖1(C)中，LLG-C4-GST(10μg/ml)在I-結(jié)構(gòu)域包被的加樣孔中溫育，其處于沒有或含有EDTA(2.5mM)或LLG-C4(1)肽(100μM)或非活性LLG-C4(2)肽(100μM)的情形中。60分鐘溫育后，洗滌加樣孔并且用抗-GST抗體測定結(jié)合。結(jié)果為來自于平行三份加樣孔的平均值±SD。
圖2、顯示了固定的LLG-C4支持β2整聯(lián)蛋白引導(dǎo)的細(xì)胞粘附。
圖2(A)中，佛波酯激活的THP-1細(xì)胞加入包被有LLG-C4-GST、GST或白蛋白的加樣孔中進(jìn)行結(jié)合60分鐘，其中包括2.5mM濃度的EDTA。結(jié)合的細(xì)胞經(jīng)由檢測細(xì)胞磷酸酶活性的實(shí)驗(yàn)測定。顯示的數(shù)據(jù)為來自于平行三份加樣孔的平均值±SD。在其它六個(gè)試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。
圖2(B)中，THP-1細(xì)胞與指示濃度為50μg/ml的抗β1、β2、β3、αL、αM、αX整聯(lián)蛋白亞基的每一抗體混合。然后將等分試樣的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包被有LLG-C4-GST的加樣孔中于37℃溫育60分鐘。洗滌后結(jié)合的細(xì)胞通過磷酸酶試驗(yàn)測定。結(jié)果為2-4個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)(每一個(gè)做平行三孔)的平均％粘附±SD。
圖2(C)中，將在TBS中濃度為40μg/ml的C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)肽包被在微量滴定孔上過夜溫育，其中沒有或含有戊二醛。所述塑料板上的自由結(jié)合位點(diǎn)用5％BSA封閉。使THP-1細(xì)胞(每孔105個(gè))在37℃結(jié)合60分鐘。用PBS洗滌后測定結(jié)合的細(xì)胞，并且結(jié)果顯示為平行三份加樣孔的平均值±SD。試驗(yàn)重復(fù)兩次。
圖2(D)中，αXβ2整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞用來結(jié)合LLG-C4-GST或GST。7E4抗體和EDTA用作競爭因子。結(jié)果平均％粘附±SD代表了三次試驗(yàn)的結(jié)果(每次做平行三份加樣孔)。與LLG-C4-GST的結(jié)合相對(duì)于與GST的結(jié)合的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＝0.016)。
圖3、顯示了環(huán)狀LLG肽活性的比較。
圖3(A)中，THP-1細(xì)胞與含有C(1-8；3-9)或C(1-9；3-8)二硫化物的肽懸浮混合。肽的終濃度如圖所示。然后細(xì)胞在包被有LLG-C4-GST的加樣孔中于37℃溫育60分鐘。洗滌加樣孔后，結(jié)合的細(xì)胞通過磷酸酶試驗(yàn)量化。結(jié)果為平行三份加樣孔的平均值±SD。在使用平行三份加樣孔的其它兩次試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。
圖3(B)中，檢測了在存在C(1-8；3-9)、CLLGC或CAAGC肽時(shí)THP-1細(xì)胞與LLG-C4-GST的結(jié)合。合成肽按指示的濃度使用。60分鐘溫育后洗滌加樣孔并通過磷酸酶試驗(yàn)測定結(jié)合的細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示了來自于平行三份加樣孔的平均值±SD并且在其它兩次試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。
圖4、顯示了通過LLG-C4肽抑制了白細(xì)胞與ICAM-1的細(xì)胞粘附。
圖4(A)中，在沒有或存在LLG-C4肽時(shí)使Jurkat細(xì)胞附著于固定在微量滴定孔中的ICAM-1-Fc。在45分鐘的溫育后，通過將微量滴定板浸入含有PBS的沉降器(decanter)中移走未結(jié)合的細(xì)胞，附著的細(xì)胞通過結(jié)晶紫(CrystalViolet)染色。結(jié)果顯示為來自于平行三份或四份加樣孔的兩次試驗(yàn)的％細(xì)胞粘附±SD。
圖4(B)中，用T細(xì)胞來結(jié)合在微量滴定孔上生長的由TNF-α-激活的Eahy內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞層，其中包含50μM濃度的LLG-C4或RGD-4C。溫育45分鐘后，通過將微量滴定板浸入PBS溶液中移走未結(jié)合的細(xì)胞，并且通過磷酸酶試驗(yàn)測定結(jié)合的T細(xì)胞。數(shù)據(jù)為平行三份加樣孔的平均值±SD。
圖5、顯示了通過LLG-C4肽如何阻斷了THP-1細(xì)胞在馮·維勒布蘭德氏因子和IV型膠原蛋白上的粘附。
圖5(A)中，在存在抗β2(7E4)、αVβ3(LM609)或αIIbβ3(P2)整聯(lián)蛋白的抗體時(shí)檢測了THP-1細(xì)胞與馮·維勒布蘭德氏因子的結(jié)合。在馮·維勒布蘭德氏因子涂覆的孔中溫育60分鐘后測定結(jié)合的細(xì)胞。數(shù)據(jù)為平行三份加樣孔的平均值±SD。試驗(yàn)重復(fù)三次。
圖5(B)中，使THP-1細(xì)胞與涂覆了馮·維勒布蘭德氏因子、IV型膠原蛋白或纖連蛋白的微量滴定孔結(jié)合，其中包括了以所述濃度存在的作為競爭劑的C(1-8；3-9)肽。通過磷酸酶試驗(yàn)測定結(jié)合的細(xì)胞。數(shù)據(jù)為平行三份加樣孔的平均值±SD并且在其它四次試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。
圖6、顯示了合成的LLG-C4肽防止了THP-1細(xì)胞在纖維蛋白原基層上的粘附和遷移。
圖6(A)中，THP-1細(xì)胞與C(1-8；3-9)或C(1-9；3-8)一起施于，或不存在肽時(shí)一起施于涂覆有纖維蛋白原的微量滴定孔中。溫育60分鐘后通過磷酸酶試驗(yàn)來測定結(jié)合的細(xì)胞。數(shù)據(jù)為平行三份加樣孔的平均值±SD并且在其它兩次試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。
圖6(B)中，為了活化整聯(lián)蛋白，用佛波酯(50nM)和RGD-4C及C(1-8；3-9)肽(每一為2.5μM)來刺激THP-1細(xì)胞1個(gè)小時(shí)。洗滌后，在存在所示濃度的C(1-8；3-9)或RGD-4C或兩種肽都存在時(shí)，使細(xì)胞結(jié)合纖維蛋白原涂覆的加樣孔。溫育30分鐘后測定結(jié)合的細(xì)胞。結(jié)果是平行三份加樣孔的平均值±SD并且在其它兩次試驗(yàn)中獲得了相近的結(jié)果。由于在某些數(shù)據(jù)點(diǎn)得到的SD值太小所以不能觀察到。
圖6(C)中，轉(zhuǎn)孔過濾器的上下表面均涂覆纖維蛋白原，或者左面沒有，然后用BSA飽和。THP-1細(xì)胞(每個(gè)過濾器5×104)置于過濾器的上表面上并處于含有10％血清的培養(yǎng)液中。C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)的濃度為200μM。培養(yǎng)18小時(shí)后，測定遷移到過濾器底部的細(xì)胞?；旌霞?xì)胞并染色，然后在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為至少三次試驗(yàn)的平均值±SD。
圖6(D)中，轉(zhuǎn)孔過濾器的雙面均涂覆有LLG-C4-GST、GST、纖維蛋白原或BSA。共計(jì)5×104的THP-1細(xì)胞施于存在于含10％血清的培養(yǎng)液中的每個(gè)過濾器。細(xì)胞培養(yǎng)了18個(gè)小時(shí)后在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移到過濾器下表面的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表示為至少三次試驗(yàn)的平均值±SD。
圖7顯示了通過NMR顯示的對(duì)環(huán)狀LLG-C4肽結(jié)構(gòu)的比較。
圖7(A)中，顯示了C(1-8；3-9)(左)和C(1-9；3-8)(右)的40種構(gòu)象的家族。二硫化物閉合的骨架的重原子在每一家族中是成階層的，因此兩個(gè)家族被分別解譯以適合于觀察。
圖7(B)中，顯示了對(duì)具有代表性的溶液結(jié)構(gòu)C(1-8；3-9)(上)和C(1-9；3-8)(下)的立體圖像。從圖上看兩種結(jié)構(gòu)在F4、L5和L6的主鏈原子上開始時(shí)是成階層的，然后轉(zhuǎn)化分離適合于觀察。在C(1-8；3-9)肽中，C1與環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的C8配對(duì)，C3與環(huán)狀結(jié)構(gòu)下的C9配對(duì)。同樣的，C(1-9；3-8)肽中，C1與環(huán)上的C9配對(duì)，C3與環(huán)下的C8配對(duì)。
發(fā)明詳述使用噬菌體展示產(chǎn)生了新的含有意外的LLG三肽結(jié)合基序的高特異性肽拮抗劑。新肽抑制白細(xì)胞粘附，而當(dāng)固定后，它們支持白細(xì)胞粘附。多數(shù)的活性拮抗劑CPCFLLGCC(所謂的LLG-C4)是一種生物環(huán)狀九肽，其受二硫鍵的結(jié)構(gòu)限制并包含了β2整聯(lián)蛋白偏好的LLG三肽結(jié)合基序。LLG-C4肽特異性地阻斷β2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的白細(xì)胞粘附和抑制白細(xì)胞與其主要配體ICAM-1的結(jié)合。此外，象典型的整聯(lián)蛋白配體一樣，當(dāng)固定在塑料上時(shí)，肽支持細(xì)胞粘附并結(jié)合白細(xì)胞系而不是缺乏β2整聯(lián)蛋白的細(xì)胞。肽的效力和白細(xì)胞特異性可以通過它與I-結(jié)構(gòu)域相互作用來說明，該結(jié)構(gòu)域是白細(xì)胞整聯(lián)蛋白中已知的活性位點(diǎn)。有趣的是，不僅僅是ICAM-1而且包括馮·維勒布蘭德氏因子和IV型膠原蛋白在內(nèi)的其他一些粘附蛋白也含有由噬菌體展示鑒定的共有的PP/XXLLG序列。我們的研究表明馮·維勒布蘭德氏因子和IV型膠原蛋白是白細(xì)胞β2整聯(lián)蛋白的潛在配體。
多數(shù)活性拮抗劑、LLG-C4九肽的活性嚴(yán)格地依賴于兩個(gè)二硫橋的正確形成。僅二硫橋排列不同的兩個(gè)生物環(huán)狀構(gòu)象在活性方面就存在20倍的差異?；钚暂^強(qiáng)的肽具有一個(gè)由于二硫鍵“交聯(lián)”排列形成的非常緊湊的結(jié)構(gòu)，如通過NMR顯示的那樣。有趣的是，亮氨酸側(cè)鏈如觸角一樣從環(huán)狀結(jié)構(gòu)突出，這表明了它們能直接與整聯(lián)蛋白互作。小的甘氨酸殘基可以調(diào)節(jié)兩條亮氨酸側(cè)鏈之間的正確距離。先前的研究表明跨越ICAM-1的LLG區(qū)域(Ross等，1992)或ICAM-2(Li等，1993)的相應(yīng)區(qū)域的合成肽被固定在塑料上時(shí)可支持白細(xì)胞粘附。處于可溶形式時(shí)，這些肽阻斷了白細(xì)胞與在內(nèi)皮細(xì)胞單層細(xì)胞上表達(dá)的ICAM-1的結(jié)合。雖然LLG-C4九肽缺乏一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基如谷氨酸，但它顯著地小于先前描述的β2整聯(lián)蛋白的肽配體并且顯示出高的活性。五肽CLLGC也抑制細(xì)胞粘附。因此，基于不帶電荷的LLG基序可能構(gòu)建β2整聯(lián)蛋白靶向配體。這與ICAM-1的第一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)模型相一致，其中LLG序列被看作是能直接與整聯(lián)蛋白I-結(jié)構(gòu)域互作的短β鏈的一部分(Casasnovas等，1998；Bella等，1998)。對(duì)ICAM-1第一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的個(gè)別氨基酸進(jìn)行丙氨酸掃描誘變的研究表明LLG結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)τ谡?lián)蛋白與ICAM-1的結(jié)合是重要的。一個(gè)亮氨酸殘基的突變可降低ICAM-1的部分結(jié)合活性而甘氨酸的突變可使結(jié)合活性完全喪失(Fisher等，1997)。由于甘氨酸-突變的ICAM-1失去了活性，所以這表明了谷氨酸殘基不是起結(jié)構(gòu)的作用而是直接地與整聯(lián)蛋白互作。ICAM-2中相應(yīng)的纈氨酸和甘氨酸突變?yōu)楸彼徇€削弱了蛋白的整聯(lián)蛋白結(jié)合活性(Casasnovas等，1999)。
馮·維勒布蘭德氏因子含有兩個(gè)能與整聯(lián)蛋白相互作用但沒有被報(bào)道過的LLG序列。馮·維勒布蘭德氏因子是一種能結(jié)合幾種蛋白質(zhì)的多功能粘附配體并能通過介導(dǎo)血小板與所暴露的下層內(nèi)皮(subendothelium)粘附而在血管損傷時(shí)抑制出血。它含有兩個(gè)RGD序列，其中至少有一個(gè)在結(jié)合血小板整聯(lián)蛋白αIIbβ3中是重要的。據(jù)發(fā)明人所知，在LLG序列中沒有已知的突變與馮·維勒布蘭德氏病中的出血紊亂相關(guān)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)佛波酯激活的白細(xì)胞能很強(qiáng)地結(jié)合馮·維勒布蘭德氏因子。由于所述結(jié)合受到β2整聯(lián)蛋白-靶向LLG肽和β2整聯(lián)蛋白封閉性抗體7E4的抑制，但不受β3整聯(lián)蛋白抗體的抑制，故從中可以看出結(jié)合主要是由LLG基序介導(dǎo)的。除了LLG序列外，馮·維勒布蘭德氏因子含有I-結(jié)構(gòu)域，類似于那些存在于β2整聯(lián)蛋白α亞基中的序列。因此，在影響蛋白折疊的LLG序列和鄰近I-結(jié)構(gòu)域之間可能存在的分子內(nèi)或分子間的相互作用。如果發(fā)生了這樣的互作，它可能部分解釋了血漿形式的馮·維勒布蘭德氏因子失活的原因。我們的結(jié)果表明白細(xì)胞能結(jié)合如存在于血管下層內(nèi)皮或其它表面的以固定形式存在的馮·維勒布蘭德氏因子，而且這些互作在炎癥的最初階段起作用。
有趣的是，我們經(jīng)過同源性檢索鑒別出的Iv型膠原蛋白α鏈上的LLGRPGEA序列與具有結(jié)合α2β1整聯(lián)蛋白的關(guān)鍵性GFOGER基序(O＝羥脯氨酸)的膠原蛋白-類肽具有序列相似性(Emsley等，2000)。在膠原蛋白-類肽與α2β1整聯(lián)蛋白I-結(jié)構(gòu)域之間復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了肽的谷氨酸殘基與金屬離子發(fā)生協(xié)同作用，這有可能是結(jié)合到整聯(lián)蛋白上時(shí)，位于LLG基序C-末端的谷氨酸起到了一種類似于在ICAM-1和膠原蛋白IV中的離子-結(jié)合作用。
LLG-C4九肽也是至今發(fā)現(xiàn)的針對(duì)β2整聯(lián)蛋白的最短和最有效的肽配體，其提供了產(chǎn)生β2整聯(lián)蛋白拮抗劑和潛在抗-炎癥劑的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。由于β2整聯(lián)蛋白在血細(xì)胞和骨髓中的血細(xì)胞前體中表達(dá)，這些整聯(lián)蛋白經(jīng)由循環(huán)的配體必須能很容易地接近目標(biāo)。然而，已知β2整聯(lián)蛋白以非活性狀態(tài)存在并僅由生化刺激物如趨化因子或經(jīng)與抗原提呈細(xì)胞接觸激活。因此，產(chǎn)生優(yōu)先與具有活化整聯(lián)蛋白的細(xì)胞結(jié)合的化合物是人們期望的和在臨床上是有益的。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)LLG-C4肽顯現(xiàn)出這種特性如固定的肽強(qiáng)力結(jié)合僅在所述整聯(lián)蛋白完全被激活后的細(xì)胞。馮·維勒布蘭德氏因子和膠原蛋白中存在的LLG-類序列預(yù)示出該蛋白在介導(dǎo)血小板和白細(xì)胞粘附于損傷血管下層內(nèi)皮基質(zhì)中的新功能。因此，通過本發(fā)明的肽對(duì)炎癥細(xì)胞和白細(xì)胞與馮·維勒布蘭德氏因子和IV型膠原蛋白的結(jié)合的抑制可能在臨床是有用的。由于ICAM-1的功能如能作為引起普通感冒的鼻病毒的受體，ICAM-1模擬肽還能幫助產(chǎn)生新的抗病毒化合物(Casasnovas等，1998；Bella等，1998)。本發(fā)明的肽還可用于治療免疫疾病，這些疾病包括但不局限于糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn′s病、牛皮癬(psoriasis)、多發(fā)性硬化癥和移植排斥。
在治療或預(yù)防性治療炎癥疾病和人類白血病的方法中，給予需要所述治療的受試者治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明肽可以根據(jù)受試者的癥狀、體重、年齡等作適當(dāng)調(diào)整。對(duì)于小鼠來說，如每天經(jīng)由靜脈或腹膜注射0.2到1mg是一個(gè)適宜有效的量，或是一周約10mg。為了在白細(xì)胞上產(chǎn)生一種即時(shí)效應(yīng)，對(duì)大些的動(dòng)物或人類的有效量為單一劑量約為10mg到100mgiv。
本發(fā)明的肽還可以用于鑒別表達(dá)β整聯(lián)蛋白的白細(xì)胞類型并對(duì)炎癥細(xì)胞分型或診斷白血病是有價(jià)值的。表達(dá)活化形式的αMβ2整聯(lián)蛋白的細(xì)胞，例如，可以使細(xì)胞群經(jīng)過一個(gè)柱表面并用EDTA或一種競爭肽洗脫細(xì)胞從血液或組織分離得到。該方法特別適用于分離表達(dá)一組整聯(lián)蛋白的淋巴細(xì)胞群的亞群。
本發(fā)明的肽還可以用來促進(jìn)表達(dá)β2整聯(lián)蛋白細(xì)胞附著于肽表面或人工肽基體。這樣的一種人工基體的作用類似于骨髓或淋巴腺并有助于產(chǎn)生組織移植物。另一方面，可溶形式的肽防止了宿主抗組織移植物的反應(yīng)，如肽抑制β2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的遷移和伴隨的炎癥反應(yīng)。
下列實(shí)施例用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，但并不以任何方式對(duì)發(fā)明進(jìn)行限定。
實(shí)施例1、噬菌體展示如前所述，通過抗體親和層析法從由芬蘭紅十字會(huì)輸血服務(wù)站獲得的淡黃色層(buffy coats)中純化出αMβ2整聯(lián)蛋白(Li等，1995)，整聯(lián)蛋白經(jīng)Tris-緩沖的鹽/1mM MnCl2稀釋后包被微量滴定孔于4℃過夜，其中首次生物淘選(biopanning)時(shí)每孔1μg，后面的淘選分別為100ng、10ng、1ng。加樣孔用含有5％BSA的TBS于22℃進(jìn)行1個(gè)小時(shí)的封閉，然后用TBS洗滌五次?；景凑找郧八龅姆椒ㄓ肅X7C和CX9C噬菌體肽文庫進(jìn)行生物淘選(Koivunen等，1994)。我們對(duì)文庫的構(gòu)建體進(jìn)行了修飾，通過僅使用反向引物的PCR 5個(gè)循環(huán)及隨后的正向和反向引物同時(shí)使用的11個(gè)循環(huán)，使編碼簡并序列的單鏈DNA轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。使用QIAGEN PCR純化試劑盒純化得到共6μg雙鏈寡核苷酸，并與42μg的Fuse5噬菌體載體連接。文庫中重組體的數(shù)量超過了109。噬菌體結(jié)合、洗脫和隨后在大腸桿菌中的擴(kuò)增重復(fù)五次，在每一淘選后，挑出細(xì)菌克隆并將之置于含有10μl體積的TBS的微量滴定孔中于-20℃保存。為了進(jìn)行克隆測序，1μl體積的等份融化的樣品用于PCR反應(yīng)，其中正向引物5′TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGATAAACCGATACAATT3′和反向引物5′CCCTCATAGTTAGCGTAACGATCT3′各10pmol，PCR條件為92℃30s、60℃30s和72℃60s，循環(huán)次數(shù)為35。PCR反應(yīng)的1μl體積的等份試樣被用來測序，其中使用的每一引物為15pmol并在ABI310儀器上進(jìn)行分析(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
在第五輪的選擇后，與背景技術(shù)相比，CX7C和CX9C文庫分別得到了600-倍與1000-倍富集的與整聯(lián)蛋白結(jié)合的噬菌體。對(duì)結(jié)合噬菌體測序顯示總共僅有七個(gè)由整聯(lián)蛋白特異性肽選擇的不同序列(表1)，其中四個(gè)包含了LLG三肽基序。最多富集的兩個(gè)序列是CPCFLLGCC(LLG-C4)和CWKLLGSEEEC，在隨機(jī)選擇的克隆中每個(gè)觀察15次，它們是在通過使用低整聯(lián)蛋白包被濃度篩選高親合力粘合劑(binders)后僅剩下的克隆。有趣的是，LLG-C4看起來象一種共有的結(jié)合序列，因?yàn)樗须木@示出與之相似的在脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸或半胱氨酸殘基上的保守性。
表1、七種與αMβ2整聯(lián)蛋白(Mac-1)結(jié)合的噬菌體序列和它們與存在于細(xì)胞粘附蛋白中的含有LLG的序列的對(duì)比CPCFLLGCC(15)CWKLLGSEEEC (15)CWHKDLLGC(4)CWSMELLGCCPPDLFWYC(4)CPEDLYFFC(3)CPEDFIFFCICAM-1 CDQPKLLGIETPL馮·維勒布蘭德氏因子-A2 TVGPGLLGVSTLG馮·維勒布蘭德氏因子-D3 GRYIILLGKALSVI型膠原蛋白-α2 PGPQGLLGAPGILIV型膠原蛋白-α44PGPPGLLGRPGEA骨橋蛋白VICFCLLGITCAI
等同于噬菌體肽的氨基酸以粗體顯示。ICAM-1序列來自于第一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域。馮·維勒布蘭德氏因子序列來自于A2和D3結(jié)構(gòu)域及I和IV型膠原蛋白序列來自于α鏈。骨橋蛋白序列包括第5-17位殘基。分離的編碼每一個(gè)肽的核苷酸序列的數(shù)目在括號(hào)中表示。
基于蛋白數(shù)據(jù)的篩選表明LLG三肽序列位于ICAM-1的第一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域，并正好在Glu-34殘基前面，該殘基對(duì)ICAM-1與αMβ2結(jié)合是至關(guān)重要的(Staunton等，1990；Stanley和Hogg，1998)。CWKLLGSEEEC肽顯示出最高的相似性，六個(gè)連續(xù)殘基中的五個(gè)等同于人類ICAM-1序列(表1)。LLG三肽序列還存在于馮·維勒布蘭德氏因子的A2和D3結(jié)構(gòu)域中，I和IV型膠原蛋白的α鏈中以及骨橋蛋白中。除了ICAM-1外這些含有LLG的序列并沒有被報(bào)道過含有潛在的細(xì)胞粘附位點(diǎn)。馮·維勒布蘭德氏因子(Savage等，1996)和骨橋蛋白(Helluin等，2000)是RGD-定向的β3整聯(lián)蛋白的蛋白配體，但它們是否也能與β2整聯(lián)蛋白結(jié)合還并不知曉。有趣的是，最近的研究表明I型膠原蛋白是αxβ2整聯(lián)蛋白的配體(Garnotel等，2000)。
實(shí)施例2、整聯(lián)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)GST和Fc融合蛋白的制備編碼LLG-C4的核苷酸序列是通過含有BamHI位點(diǎn)(5′AGGCTCGAGGATCCTCGGCCGACGGGGCT3′)和EcoRI位點(diǎn)(5′AGGTCTAGAATTCGCCCCAGCGGCCCC3′)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增噬菌體DNA得到的。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化并由兩種限制性酶消化，然后與PGEX-2TK載體(AmershamPhannacia Biotech，Uppsala，Sweden)連接。表達(dá)LLG-C4-GST的重組體通過DNA測序證實(shí)。在大腸桿菌菌株BL21中產(chǎn)生LLG-C4-GST，通過谷胱甘肽親和層析純化產(chǎn)物，然后進(jìn)行透析。含有五個(gè)ICAM-1Ig結(jié)構(gòu)域的ICAM-1-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生并由蛋白A親和層析純化。約產(chǎn)生了20mg的LLG-C4-GST，在PhastSystem儀器(Amersham Pharmacia)上經(jīng)由SDS凝膠電泳分析其純度達(dá)到了95％以上。
單克隆抗體如前所描述的抗β2亞基的抗體有7E4、11D3、3F9、1D10和2E7(Nortamoetal.，1988)?？功罫亞基的抗體是TS2/4和MEM-83(Monosan，Netherlands)?？贵wOKM1、OKM10和MEM-170是抗αM亞基的，抗體3.9是抗αX亞基(Li等，1993；Li等，1995)。整聯(lián)蛋白αIIbβ3抗體P2購自Immunotech(Marseille，F(xiàn)rance)，整聯(lián)蛋白αVβ3的抗體LM609及β1亞基的抗體6S6來自于Chemicon(Temecula，CA)。
整聯(lián)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)在覆有αM亞基抗體OKM1或MEM170、αX亞基抗體TS2/4或非特異性IgG(Dako，Carpinteria，CA)的微量滴定孔上免疫俘獲整聯(lián)蛋白。將溶于TBS的濃度為10μg/ml的抗體于4℃包被過夜。在用5％BSA飽和后，將200μl淡黃色層溶解產(chǎn)物的等份試樣溶于1％辛基糖苷/1mM MnCl2/TBS中于4℃溫育2小時(shí)。加樣孔用含有辛基糖苷的緩沖液洗滌五次。LLG-C4-GST或?qū)φ誈ST以10μg/ml的濃度在25mM的辛基糖苷/TBS/1mM MnCl2中溫育1小時(shí)。洗滌加樣孔后，通過抗-GST抗體(Amersham Pharmacia)確定結(jié)合的GST，根據(jù)廠商的說明(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)用Eu3+-螯合物對(duì)該抗體進(jìn)行標(biāo)記。Eu3+-熒光用一臺(tái)1230Arcus熒光計(jì)(Wallac)測定。為檢測I-結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，我們使用作為GST融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的重組αMI-結(jié)構(gòu)域(Ueda等，1994)。融合蛋白通過在谷胱甘肽連接的珠子上進(jìn)行親和層析純化并用凝血酶剪切釋放出表觀分子量約為23kDa的重組I-結(jié)構(gòu)域。I-結(jié)構(gòu)域以20μg/ml的濃度涂覆于微量滴定孔上并對(duì)LLG-C4-GST與GST的結(jié)合進(jìn)行研究。
我們發(fā)現(xiàn)只有LLG-C4-GST融合蛋白而不是單獨(dú)GST具有強(qiáng)效的活性并以一種二價(jià)陽離子-敏感的方式與整聯(lián)蛋白αMβ2結(jié)合，這就和典型的整聯(lián)蛋白配體一樣。陽離子-螯合的EDTA抑制了LLG-C4-GST與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，其中整聯(lián)蛋白是通過在包被有αM亞基抗體OKM1或MEM170的微量滴定孔上免疫俘獲的(圖1A)。在αLβ2上檢測到了相似的EDTA-可抑制的LLG-C4-GST的結(jié)合，該整聯(lián)蛋白是用TS2/4抗體俘獲的。當(dāng)非特異性IgG用于免疫俘獲時(shí)，LLG-C4-GST的結(jié)合與GST對(duì)照并不是不同的，并且這種結(jié)合通過EDTA是不可抑制的(未給出)。
我們還研究了肽是否能直接與整聯(lián)蛋白αMβ2的I-結(jié)構(gòu)域即已知的配體結(jié)合位點(diǎn)相互作用。以濃度為0.01-100μg/ml進(jìn)行檢測的LLG-C4-GST表現(xiàn)出與分離的αM亞基的I-結(jié)構(gòu)域濃度依賴型的結(jié)合(圖1B)，而在相同濃度的GST卻并不結(jié)合。結(jié)合LLG-C4-GST的I-結(jié)構(gòu)域的能力由添加到結(jié)合介質(zhì)中的陽離子Mn2+決定，與EDTA螯合的Mn2+阻止了結(jié)合(圖1C)。為了說明I-結(jié)構(gòu)域不但能與融合蛋白結(jié)合還能與LLG-C4九肽結(jié)合，我們合成了雙環(huán)LLG-C4肽。然而，我們很難制備一種具有活性和水溶性的肽，這顯然是因?yàn)樵诳諝?氧化中容易形成混合的二硫化物。一種LLG-C4(1)制品是具有高度活性的并且可阻斷I-結(jié)構(gòu)域與LLG-C4-GST的結(jié)合(圖1C)。相同的肽還在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中具有活性。另外一種制品LLG-C4(2)由于形成了不利的二硫鍵顯然是沒有活性的并且不能抑制LLG-C4-GST與I-結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
實(shí)施例3、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系與九肽配體的粘附Jurkat T細(xì)胞白血病(ATCC no.TIB-152)、U-937組織細(xì)胞淋巴瘤(no.CRL-1593.2)和K562紅白血病(no.45507)細(xì)胞系保存在RPMI 1640培養(yǎng)基中，在該培養(yǎng)基中添加了2mM谷氨酰酸、10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和10％的胎牛血清(FCS)。將THP-1單核白血病細(xì)胞(ATCC TIB-202)培養(yǎng)在額外含有0.05mM 2-巰基乙醇的相同的培養(yǎng)基中。如先前描述的方法培養(yǎng)非白細(xì)胞的細(xì)胞系Eahy926、HT1080、KS6717和SKOV-3(Koivunen等，1999)。在流經(jīng)尼龍柱后通過Ficoll-Hypaque離心從血液淡黃色層分離出T細(xì)胞(Valmu和Gahmberg，1995)。野生型鼠L929細(xì)胞和αXβ2整聯(lián)蛋白-轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞系獲自Dr.Y.van Kooyk(UniversityHospital，Nijmegen，NL)細(xì)胞粘附除非另有說明，纖維蛋白原、纖連蛋白、馮·維勒布蘭德氏因子、IV型膠原蛋白、GST融合蛋白、Fc融合蛋白或合成肽以2μg溶于50μl TBS的濃度被涂覆于微量滴定孔上。由Drs.J.J.Sixma和Ph.G.de Groot(UniversityMedical Center Utrecht，the Netherlands)善意提供的重組馮·維勒布蘭德氏因子和俘獲它的抗體也用于本發(fā)明。為了制備多聚肽，加入戊二醛至終濃度0.25％。加樣孔用5％BSA飽和并用PBS洗滌五次。在粘附實(shí)驗(yàn)前，用50nM4β-佛波醇12，13二丁酸鹽或200μM P1肽(Kotovuori等，1999)在無血清的培養(yǎng)基中在室溫處理細(xì)胞30分鐘來活化整聯(lián)蛋白。或者，用每一濃度為2.5μM的佛波醇酯(50nM)、C(1-8；3-9)和RGD-4C肽將細(xì)胞于37℃刺激60分鐘，然后用PBS/2.5mM EDTA洗滌除去所述肽。在沒有或存在競爭性肽、抗體或EDTA的情形下將細(xì)胞置于微量滴定孔中(每孔100000個(gè)細(xì)胞)于37℃溫育60分鐘。用PBS輕輕洗洗末結(jié)合的細(xì)胞，然后將滴定板反壓在紙巾上通過測定細(xì)胞磷酸酶活性的實(shí)驗(yàn)確定粘附的細(xì)胞。簡要地描述就是將含有1％Triton X-100和6mg/ml p-nit-rophenyl磷酸鹽的100μl 50mM的乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)加入每個(gè)孔中并于37℃溫育1小時(shí)。用50μl1M NaOH終止反應(yīng)。在微量培養(yǎng)板計(jì)數(shù)器上讀出405nm處的吸光度?；蛘甙辞笆龅姆椒ㄍㄟ^結(jié)晶紫對(duì)粘附的細(xì)胞染色(Mould等，1995)。
為了研究T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞單層的結(jié)合，Eahy926內(nèi)皮細(xì)胞以每孔5×104細(xì)胞的密度鋪于微量滴定板上培養(yǎng)三天。為了刺激ICAM-1的產(chǎn)生，讓細(xì)胞在含有濃度為10ng/ml的TNF-α的溶液中生長16小時(shí)。在4℃時(shí)T細(xì)胞(1.5×105每孔)先與Eahy926細(xì)胞結(jié)合30分鐘，后在37℃結(jié)合15分鐘。通過將微量滴定板浸入PBS中移去未粘附的T細(xì)胞。附著的細(xì)胞由磷酸酶實(shí)驗(yàn)測定。
佛波醇酯激活的THP-1單核白血病細(xì)胞與涂覆于微量滴定孔上的LLG-C4-GST有效地結(jié)合，但不與GST或肽-GST對(duì)照(CLRSGRGC-GST，CPPWWSQC-GST)結(jié)合(圖2A)。2.5mM濃度的EDTA完全阻止了LLG-C4-GST上的結(jié)合。通過一組抗整聯(lián)蛋白抗體的篩選表明LLG-C4-GST上的細(xì)胞粘附被針對(duì)β2鏈的封閉性抗體7E4完全抑制了(圖2B)。針對(duì)β1(6S6)和β3整聯(lián)蛋白的抗體沒有效應(yīng)。用β2鏈抗體11D3和3F9獲得了部分的抑制效應(yīng)。三種β2抗體效力大小的順序與先前在粒細(xì)胞聚集試驗(yàn)中獲得的結(jié)果一樣，7E4是最有活性的細(xì)胞聚集抑制劑，后面為11D3和3F9(Nortamo等，1988)。發(fā)明人還研究了能激活β2-整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的β2鏈抗體ID10、2F3和2E7，這三種抗體相應(yīng)地刺激了THP-1細(xì)胞在LLG-C4-GST上的粘附(數(shù)據(jù)未給出)。
抗白細(xì)胞整聯(lián)蛋白α亞基的抗體研究表明用αX亞基抗體3.9獲得了對(duì)粘附的顯著抑制作用。αM亞基抗體OKM10、MEM170和60.1顯現(xiàn)出微弱的抑制效應(yīng)，而αL-定向的抗體TS1/22和TS 2/4幾乎沒有效應(yīng)。THP-1細(xì)胞表達(dá)αX和αM但僅有極少量的αL，并且抗體抑制情形類似于獲得的對(duì)P1肽-刺激的THP-1細(xì)胞結(jié)合到纖維蛋白原上的抑制(Li等，1995)。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)αX抗體3.9和αM抗體OKM10一起加入時(shí)具有一種協(xié)同效應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞粘附的完全抑制。
實(shí)施例4、半胱氨酸鍵的排列對(duì)LLG-C4的活性的影響因?yàn)榇嬖谟贚LG-C4中的四個(gè)半胱氨酸理論上可以以不同方式配對(duì)，我們研究了半胱氨酸鍵的排列如何影響了活性。為了這個(gè)目的，我們制備了具有不同二硫化物結(jié)構(gòu)的合成肽。在應(yīng)用生物系統(tǒng)模型433A(Foster City，CA)上使用Fmoc-化學(xué)方法合成肽。通過在10mM重碳酸銨緩沖液(pH9)中過夜氧化形成二硫化物。然后使用HPLC以乙腈梯度純化肽。產(chǎn)生的二硫化物通過質(zhì)譜法分析證實(shí)。具有指導(dǎo)的二硫橋的C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)肽通過Anaspec(San Jose，CA)常規(guī)制備。ACDCRGDCFCG(RGD-4C)肽(Koivunen等，1995)獲自Dr.E.Ruoslahti(Burnham Institute，San Diego，CA)。
活性最強(qiáng)的肽C(1-8；3-9)通過在C1和C8半胱氨酸之間直接形成一個(gè)二硫鍵和在C3和C9半胱氨酸之間形成第二個(gè)二硫鍵獲得。肽C(1-9；3-8)在C1和C9半胱氨酸之間與C3和C8半胱氨酸之間有二硫橋。與C(1-8；3-9)含有二硫化物的肽結(jié)合的細(xì)胞卻不與具有C(1-9；3-8)二硫化物的構(gòu)象結(jié)合(圖2C)。C(1-8；3-9)肽與戊二醛的交聯(lián)進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的結(jié)合，這顯然是由于更好地包被了多聚體肽，然而對(duì)C(1-9；3-8)肽作相同的處理后卻沒有產(chǎn)生結(jié)合。一般地，C(1-8；3-9)肽特異性地支持β2整聯(lián)蛋白-表達(dá)細(xì)胞系的結(jié)合，這些細(xì)胞系如β2整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞和白細(xì)胞系THP-1、U937和Jurkat。αXβ2-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞與LLG-C4-GST的結(jié)合受到EDTA和β2整聯(lián)蛋白阻斷抗體7E4的抑制(圖2D)。不管細(xì)胞是否用佛波醇酯預(yù)處理過，不表達(dá)β2整聯(lián)蛋白的非白細(xì)胞系L929、K562、SKOV-3、KS6717和Eahy96都顯示出與肽或GGL-C4-GCT的不結(jié)合(數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例5、使用LLG-C4九肽阻斷β2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的白細(xì)胞系的粘附檢測含有-LLG的肽阻斷白細(xì)胞與含有或缺少LLG三肽序列的粘附蛋白結(jié)合的能力。THP-1細(xì)胞在LLG-C4-GST上的粘附受到了IC50為20μM的C(1-8；3-9)肽的抑制(圖3A)。其它構(gòu)象C(1-9；3-8)的活性要低于C(1-8；3-9)20倍。為了研究LLG三肽序列對(duì)于β2整聯(lián)蛋白的識(shí)別是否足夠，發(fā)明人制備了末端含有半胱氨酸的最小CLLGC肽來誘導(dǎo)二硫化物限制的結(jié)構(gòu)。在對(duì)照肽中，亮氨酸由丙氨酸代替。使用了LLG-C4-GST底物的THP-1細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)表明CAAGC是一種微弱的細(xì)胞粘附競爭劑，但是CLLGC在濃度為1mM或更高時(shí)已抑制了細(xì)胞粘附，這意味著β2整聯(lián)蛋白對(duì)LLG基序的一種特異性識(shí)別(圖3B)。
我們還檢測了含有LLG的肽抑制αLβ2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞與ICAM-1-Fc重組蛋白結(jié)合的能力，其中重組蛋白包括了第一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域和LLG序列。ICAM-1-Fc直接涂覆于微量滴定孔上或在微量滴定孔上經(jīng)由蛋白A俘獲。在這兩種情況下，發(fā)現(xiàn)了由C(1-8；3-9)肽引起的對(duì)Jurkat細(xì)胞粘附的一種濃度依賴性的抑制，其IC50約為80μM(圖4A)。C(1-9；3-8)構(gòu)象的活性要低了數(shù)倍，并且?guī)缀鯖]有產(chǎn)生任何效果。C(1-8；3-9)肽同樣地抑制了新分離T細(xì)胞與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，其中該內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)由TNF-α處理后被刺激并表達(dá)了ICAM-1(圖4B)。T細(xì)胞不能與未經(jīng)過刺激的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。作為對(duì)照，一種含有RGD的肽RGD-C4對(duì)于T細(xì)胞與內(nèi)皮ICAM-1的結(jié)合沒有效應(yīng)。
由于馮·維勒布蘭德氏因子和IV型膠原蛋白含有類LLG基序，故它們是新的潛在的β2整聯(lián)蛋白配體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由佛波醇酯激活的THP-1強(qiáng)烈地與這兩種蛋白結(jié)合。β2整聯(lián)蛋白抗體7E4阻斷了THP-1細(xì)胞與馮·維勒布蘭德氏因子的結(jié)合(圖5A)，故幾乎是與陽離子螯合劑EDTA一樣有效的抑制劑(數(shù)據(jù)未給出)。β3整聯(lián)蛋白抗體LM609和P2均沒有產(chǎn)生作用。C(1-8；3-9)肽是一種對(duì)THP-1細(xì)胞與馮·維勒布蘭德氏因子結(jié)合的有效抑制劑，該肽以約20μM的IC50進(jìn)行抑制(圖5B)。另外，CLLGC而不是CAAGC肽以500μM濃度抑制(數(shù)據(jù)未給出)。在Jurkat細(xì)胞與馮·維勒布蘭德氏因子結(jié)合時(shí)觀察到了相似的由C(1-8；3-9)肽介導(dǎo)的抑制(數(shù)據(jù)未給出)。在IV型膠原蛋白上的THP-1粘附受到了C(1-8；3-9)肽的部分抑制，IC50約為200μM。為了進(jìn)一步研究LLG肽的特異性，我們檢測了纖連蛋白與THP-1的粘附，其中纖連蛋白為一種已知的幾種β1和β3整聯(lián)蛋白的配體。C(1-8；3-9)肽并沒有顯現(xiàn)出對(duì)THP-1細(xì)胞與纖連蛋白結(jié)合的明顯抑制作用。C(1-8；3-9)肽對(duì)β1和β3整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的HT1080纖維肉瘤細(xì)胞在纖連蛋白或纖維蛋白原上的結(jié)合也沒有產(chǎn)生效應(yīng)(數(shù)據(jù)未給出)。
C(1-8；3-9)肽能夠抑制THP-1粘附于不含有LLG序列的纖維蛋白原(圖6A)。效力小一些的C(1-9；3-8)構(gòu)象對(duì)纖維蛋白原的結(jié)合沒有作用。根據(jù)抗體抑制實(shí)驗(yàn)，如前所述佛波醇酯刺激的THP-1細(xì)胞與纖維蛋白原的粘附主要是經(jīng)由整聯(lián)蛋白αMβ2、αXβ2介導(dǎo)的(Li等，1995)。C(1-8；3-9)同樣地抑制了β2整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的纖維蛋白原與U937單核細(xì)胞樣(monocytoid)白血病細(xì)胞的結(jié)合，后者表達(dá)αMβ2和αXβ2整聯(lián)蛋白(數(shù)據(jù)未給出)。由于RGD-依賴性整聯(lián)蛋白還能介導(dǎo)纖維蛋白原上的細(xì)胞附著，我們比較了一種已知的幾種β1和β3整聯(lián)蛋白的有效配體RGD-4C與C(1-8；3-9)的活性。用低濃度的C(1-8；3-9)和RGD-4C肽的活性對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激至完全激活β2整聯(lián)蛋白和RGD-依賴性整聯(lián)蛋白。在對(duì)肽進(jìn)行了預(yù)刺激后，RGD-4C要比C(1-8；3-9)更有效地抑制了THP-1細(xì)胞在纖維蛋白原上的粘附(圖6B)。為了研究C(1-8；3-9)和RGD-4C是否靶向不同的整聯(lián)蛋白，將肽同時(shí)施予細(xì)胞，C(1-8；3-9)和RGD-4C的效應(yīng)是疊加的(additive)并且肽的組合有效地阻斷了細(xì)胞的粘附。
實(shí)施例6、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)在含有10％血清但不干擾細(xì)胞粘附特性的相近生理?xiàng)l件中對(duì)THP-1細(xì)胞的遷移進(jìn)行了體外研究。上下表面孔徑均為8μm的轉(zhuǎn)孔過濾器被涂覆上濃度為40μg/ml的纖維蛋白原、LLG-C4-GST或GST于4℃過夜。通過與5％BSA/TBS溫育阻斷了游離的結(jié)合位點(diǎn)。THP-1細(xì)胞(100μl中含5×104個(gè))鋪板于含10％FCS的培養(yǎng)液的上層間隔(upper compartment)，其中含有濃度為200μM的C(1-8；3-9)或C(1-9；3-8)肽。下層間隔裝有750μl的含10％FCS的培養(yǎng)液。在37℃培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)后，將過濾器浸入甲醇中15分鐘，水中10秒和0.1％甲苯胺藍(lán)中5分鐘。然后用水洗滌過濾器3-5次直到細(xì)胞染色清晰為止。通過棉試子(cotton swab)將細(xì)胞從過濾器的上表面移走，并且在顯微鏡下對(duì)遷移到下表面的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。Student′st-檢測用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
在存在10％血清時(shí)細(xì)胞進(jìn)行了有效的遷移。濃度為200μM的C(1-8；3-9)肽完全抑制了細(xì)胞穿過過濾器并結(jié)合在其下層表面的能力(圖6C)(p＝0.005，n＝6)。C(1-9；3-8)構(gòu)象的活性要低于C(1-8；3-9)，僅有部分抑制作用(p＝0.01，n＝6)。C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)肽之間活性的差異是顯著的(p＝0.003)。細(xì)胞不能自發(fā)地通過過濾器8μm的孔徑墜入下層的分室中。培養(yǎng)一天后大部分細(xì)胞剩在了上層分室中。在一個(gè)相反的方案中過濾器被LLG-C4涂覆，這大大促進(jìn)了細(xì)胞的遷移。相對(duì)于對(duì)照GST基質(zhì)，在LLG-C4-GST基質(zhì)上約有10倍以上的細(xì)胞遷移(圖6D)。在LLG-C4-GST基質(zhì)上的細(xì)胞遷移還比在纖連蛋白或纖維蛋白原涂層上的更有效。C(1-8；3-9)在200μM濃度時(shí)完全抑制了細(xì)胞在LLG-C4-GST上的遷移(p＝0.0026，n＝6)(數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例7、肽的核磁共振(NMR)分析通過NMR光譜術(shù)對(duì)C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)肽進(jìn)行分析以確定二硫鍵的定向排列是否造成了肽構(gòu)象的差異。為了確證，將C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)肽分別溶于DMSO/H2O(90/10)和H2O中，濃度均為1-3mM。根據(jù)兩種肽的不同溶解特性來選擇不同的溶劑。根據(jù)在600和800Mhz1H-頻率時(shí)操作分光計(jì)獲得的二維光譜，我們可以鑒別出C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)肽的奧氏核增效(nuclear Overhauser enhancements)(nOes)分別為114和85。限制性干擾值(restraint violations)不高于0.2的四十種結(jié)構(gòu)選自由模擬退火(DYANA程序)產(chǎn)生的200種結(jié)構(gòu)的家族。
明確了各個(gè)九肽的結(jié)構(gòu)就可以完全確定骨架構(gòu)造。通過對(duì)全部40種結(jié)構(gòu)的計(jì)算得出C(1-8；3-9)和C(1-9；3-8)的主鏈原子的RMSD分別為0.4±0.2和0.3±0.2。兩種肽的主鏈兩面角和ψ處于拉馬線德蘭圖上有利的和允許的區(qū)域，該區(qū)域僅存在少量的限定側(cè)鏈方位的奧氏核增效(nOes)，因此尤其要分散F4、L5和L6的側(cè)鏈兩面角(圖7A)。
二硫化物以兩種方式配對(duì)相當(dāng)大地影響了九肽的結(jié)構(gòu)?！岸蚧锝徊媾帕小钡腃(1-8；3-9)肽迫使其整體結(jié)構(gòu)要比“二硫化物平行排列”的C(1-9；3-8)肽更為緊密。這是因?yàn)閺腃(1-8；3-9)肽(114)上觀察到了比C(1-9；3-8)肽(85)更大的nOes。與C(1-9；3-8)肽相比，C(1-8；3-9)肽沒有針對(duì)較短距離限制的偏好。作為兩種二硫化物配對(duì)方式的結(jié)果，在一種結(jié)構(gòu)中中發(fā)現(xiàn)了特有的間隔殘基(interresidue)nOes，C(1-8；3-9)肽中為37和C(1-9；3-8)肽中為20。
C(1-8；3-9)肽中二硫化物的交叉排列要比C(1-9；3-8)肽中的平行橋聯(lián)在拓?fù)鋵W(xué)上更復(fù)雜。在短的九肽中，硫原子的范德瓦爾斯半徑較大的相鄰二硫化物引起眾多空間排列的限制。殘基P2還限制了構(gòu)象的自由，然而G7卻有利于它。純粹的拓?fù)鋵W(xué)對(duì)于空間排列的限制的影響明顯來自于典型結(jié)構(gòu)(圖7B)。C(1-8；3-9)肽比C(1-9；3-8)肽更緊密。而且，在C(1-8；3-9)肽中存在由P2、F4和L5的脂肪族基團(tuán)組成的連續(xù)的疏水表面。在C(1-8；3-9)肽中二硫橋和F4-L6鏈?zhǔn)怯锌鄣亩贑(1-9；3-8)肽中它們是延伸的。這或許說明了C(1-8，3-9)肽具有的微弱水溶性和可能利于它的較高活性。
沒有列入正文的序列對(duì)于Seq.ID No.2可變aa，2位的Xaa可以是任何一種氨基酸可變aa，4位的Xaa可以是任何一種氨基酸。
參考文獻(xiàn)1.Bella，J.，Kolatkar，P.R.，Marlor，C.W.，Greve，J.M.and Rossmann，M.G.(1998).The structure of the two amino-terminal domains of human ICAM-1suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand.Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，4140-4145.
2.Casasnovas，J.M.，Stehle，T.，Liu，J.，Wang，J.，and Springer，T.A.(1998).A dimeric crystal structure for the N-terminal two domains of intercellularadhesion molecule-1.Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，4134-4139.
3.Casasnovas，J.M.，Pieroni，C.，and Springer，T.A.(1999).Lymphocytefunctionassociated antigen-1 binding residues in intercellular adhesionmolecule-2(ICAM-2)and the integrin binding surface in the ICAM subfamily.Proc.Natl Acad.Sci.USA 96，3017-3022.
4.Emsley，J.，Knight，C.G，F(xiàn)amdale，R.W.，Bames，M.J.，and Liddington，R.C.(2000).Structural basis of collagen recognition by integrin a2ssl.Cell 100，47-56.
5.Feng，Y.，Chung，D.，Garrar，L.，McEnroe，G.，Lim，D.，Scardina，J.，McFadden，K.，Guzzetta，A.，Lam，A.，Abraham，J.，Liu，D.，and Endemann，G.(1998).Peptides derived from the complementary-determining regions ofanti-Mac-1 antibodies block intercellular adhesion molecule-1 interaction withMac-1.J.Biol.Chem.273，5625-5630.
6.Fisher，K.L.，Lu，J.，Riddle，L.，Kim，K.J.，Presta，L.G.，and Bodary，S.C.(1997).Identification of the binding site in intercellular adhesion molecule 1 forits receptor，leukocyte function-associated antigen 1.Mol.Biol.Cell.8，501-515.
7.Gahmberg，C.G.，Tolvanen，M.，and Kotovuori，P.(1997).Leukocyteadhesion.Structure and function of human leukocyte integrins and their cellularligands.Eur.J.Biochem.245，215-232.
8.Garnotel，R.，Rittie，L.，Poitevin，S.，Monboisse，J.-C.，Nguyen，P.，Potron，G.，Maquart，F(xiàn).-X.，Randoux，A.and Gillery，P.(2000).Human blood monocytesinteract with type I collagen through Oxpz integrin(CD 11c-CD 18，gpl 50-95).J.Immunol.164，5928-5934.
9.Helluin，O.，Chan，C.，Vilaire，G.，Mousa，S.，DeGRado，W.F.，andBennett，J.S.(2000).The activation state ofavp3 regulates platelet andlymphocyte adhesion to intact and thrombin-cleaved osteopontin.J.Biol.Chem.275，18337-18343.
10.Huang，C.and Springer，T.A.(1995).A binding interface on the Idomain of lymphocyte function-associated antigen-1(LFA-1)required forspecific interaction with intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1).J.Biol.Chem.270，19008-19016.
11.Kallen，J.，Welzenbach，K.，Ramage，P.，Geyl，D.，Kriwacki，R.，Legge，G.，Cottens，S.，Weitz-Schmidt，G.，and Hommel，U.(1999).Structural basis forLFA-1inhibition upon lovastatin binding to the CD1 la I-domain.J.Mol.Biol.292，1-9.
12.Kamata，T.，Wright，R.，and Takada，Y.(1995).Critical threonin andaspartic acid residues within the I domains of ss2 integrins for interactions ofintercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)and C3bi.J.Biol.Chem.270，12531-12535.
13.Kelly，T.A.，Jeanfavre，D.D.，McNeil，D.W，Woska Jr.，J.R.，Reilly，P.L.，Mainolfi，E.A.，Kishimoto，K.M.，Nabozny，G.H.，Zinter，R.，Bormann，B.-J.，and Rothlein，R.(1999).A small molecule antagonist of LFA-1-mediated celladhesion.J.Immunol.163，5173-5177.
14.Koivunen，E.，Wang，B.，and Ruoslahti，E.(1994).Isolation of a highlyspecific ligand for the aspl integrin from a phage display library.J.Cell Biol.124，373-380.
15.Koivunen，E.，Wang，B.，and Ruoslahti，E.(1995).Phage librariesdisplaying cyclic peptides with different ring sizesligand specificities of theRGD-directed integrins.Bio/Technology 13，265-270.
16.Koivunen，E.，Arap，W.，Valtanen，E.，Rainisalo，A.，Medina，O.P.，Heikkila，P.，Kantor，C.，Gahmberg，C.G.，Salo，T.，Konttinen，Y.T.，Sorsa，T.，Ruoslahti，E.，and Pasqualini，R.(1999).Tumor targeting with a selectivegelatinase inhibitor.Nature Biotechnol.17，768-774.
17.Komoriya，A.，Green，L.J.，Mervic，M.，Yamada，S.S.，Yamada，K.M.，and Humphries，M.J.(1991).The minimal essential sequence for a major celltypespecific adhesion site(CS1)within the alternatively spliced type IIIconnecting segment domain of fibronectin is leucine-aspartic acid-valine.J.Biol.Chem.266，15075-15079.
18.Kotovuori，A.，Pessa-Morikawa，T.，Kotovuori，P.，Nortamo，P.，andGahmberg，C.G.(1999).ICAM-2and a peptide from its binding domain areefficient activators of leukocyte adhesion and integrin affinity.J.Immunol.162，6613-6620.
19.Kraft，S.，Diefenbach，B.，Mehta，R.，Jonczyk，A.，Luckenbach，G. A.，and Goodman，S.L.(1999).Definition of an unexpected ligand recognition motiffor ap6integrin.J.Biol.Chem.274，1979-1985.
20.Lalancette，M.，Aoudjit，F(xiàn).，Potworowski，E.F.，and St-Pierre，Y.(2000).Resistance of ICAM-1deficient mice to metastasis overcome by increasedaggressiveness of lymphoma cells.Blood.95，314-319.
21.Li，R.，Nortamo，P.，Valmu，L.，Tolvanen，M.，Huuskonen，J.，Kantor，C.，and Gahmberg，C.G.(1993).A peptide from ICAM-2binds to the leukocyteintegrin CD 11a/CD 18and inhibits endothelial cell adhesion.J.Biol.Chem.265，1751317518.
22.Li，R.，Xie，J.，Kantor，C.，Koistinen，V.，Altieri，D.C.，Nortamo，P.，andGahmberg，C.G.(1995).A peptide derived from the intercellular adhesionmolecule-2regulates the avidity of the leukocyte integrins CD 1 lb/CD 18andCDllc/CD18.J.Cell Biol.129，1143-1153.
23.Mould，A.P.，Akiyama，S.K.，and Humphries，M.J.(1995).Regulationof integrin as (3i-fibronectin interactions by divalent cations.Evidence fordistinct classes of binding sites for Mn2+，Mg2+，and Ca2+.J.Biol.Chem.270，26270-26277.
24.Nortamo，P.，Patarroyo，M.，Kantor，C.，Suopanki，J.and Gahmberg，C.G.(1988).Immunological mapping of the human leukocyte adhesion glycoproteingp90(CD 18)by monoclonal antibodies.Scand.J.Immunol.28，537-546.
25.Pierschbacher，M.D.，and Ruoslahti，E.(1984).The cell attachmentactivity of fibronectin can be duplicated by small fragments of the molecule.Nature.309，3033.
26.Ross，L.，Hassman，F(xiàn).，and Molony，L.(1992).Inhibition ofMolt-4-endothelial adherence by synthetic peptides from the sequence ofICAM-1.J.Biol.Chem.267，8537-8543.
27.Savage，B.，Saldivar，E.，and Ruggeri，Z.M.(1996).Initiation ofplateletadhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.Cell.84，289-297.
28.Stanley，P.，and Hogg，N.(1998).The I domain of integrin LFA-1interacts with ICAM-1domain 1 at residue Glu-34but not Gln-73.J.Biol.Chem.273，3358-3362.
29.Staunton，D.E.，Dustin，M.L.，Erickson，H.P.，and Springer，T.A.(1990).The arrangement of the immunoglobulin-like domains of ICAM-1 andthe binding sites for LFA-1and rhinovirus.Cell 61，243-254.
30.Ueda，T.，Rieu，P.，Brayer，J.，and Arnaout，M.A.(1994).Identificationof the complement iC3b binding site in the p2integrin CR3(CD 1 lb/CD 18).Proc.Natl Acad.Sci.USA 91，10680-10684.
31.Valmu，L.，and Gahmberg，C.G.(1995).Treatment with ocadaic acidreveals strong threonine phosphorylation of CD 18 after activation of CD 1/CD 18leukocyte integrins with phorbol esters or CD3antibodies.J.Immunol.155，1175-1183.
序列表<110>卡蒂菲西爾公司(Licentia Ltd)<120>新的白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的肽配體<130>37851<140>
<141>
<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3<212>PRT<213>未知生物<400>1Leu Leu Gly1<210>2<211>9<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>DOMAIN<222>(2)<223>可變氨基酸，在2位的Xaa可為任意氨基酸<220>
<221>DOMAIN<222>(4)<223>可變氨基酸，在4位的Xaa可為任意氨基酸<400>2Cys Xaa Cys Xaa Leu Leu Gly Cys Cys1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>未知生物<400>3Cys Pro Cys Phe Leu Leu Gly Cys Cys1 權(quán)利要求
1.一種含有結(jié)構(gòu)LLG(SEQ ID NO1)的肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物。
2.一種含有結(jié)構(gòu)CXCXLLGCC(SEQ ID NO2)的肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物，其中X是任一種氨基酸殘基。
3.一種含有結(jié)構(gòu)CPCFLLGCC(SEQ ID NO3)的肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物。
4.如權(quán)利要求2或3所述的肽，其中所述肽在結(jié)構(gòu)上被兩個(gè)二硫鍵約束。
5.如權(quán)利要求4所述的肽，其中所述肽在C1和C8半胱氨酸間具有一個(gè)二硫鍵并在C3和C9半胱氨酸間有第二個(gè)二硫鍵。
6.如權(quán)利要求4所述的肽，其中所述肽在C1和C9半胱氨酸間具有一個(gè)二硫鍵并在C3和C8半胱氨酸間有第二個(gè)二硫鍵。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽作為藥物的應(yīng)用。
8.一種藥用組合物，該組合物含有與藥學(xué)上可接受載體結(jié)合的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽。
9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽在制備治療炎癥疾病和人類白血病的藥用組合物中的用途。
10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽作為β2整聯(lián)蛋白拮抗劑在體外生化分離和純化不同整聯(lián)蛋白種類和不同類型白細(xì)胞方法中的應(yīng)用。
11.一種治療或預(yù)防性治療炎癥疾病和人類白血病的方法，其中包括給予需要所述治療的被試者以治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽。
12.含有三肽基序LLG的肽或其結(jié)構(gòu)或化學(xué)類似物在制備抑制白細(xì)胞粘附和遷移的藥用組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作β
文檔編號(hào)A61P29/00GK1860129SQ02806512
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2002年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月12日
發(fā)明者厄爾基·科伊武南, 卡爾·G·加姆伯格 申請(qǐng)人:Ctt癌癥靶向技術(shù)公司