與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)。本發(fā)明涉及的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽包含SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的藥物輸送系統(tǒng)包括所述配體多肽、載藥系統(tǒng)、至少一種活性或顯像物質(zhì)。所述載藥系統(tǒng)具體為脂質(zhì)體；所述至少一種活性物質(zhì)為任何需要被輸送到體內(nèi)特定位置的物質(zhì)。本發(fā)明的配體多肽具有很好的MDSCs靶向作用，該多肽與脂質(zhì)體結(jié)合可以作為靶向藥物載體，發(fā)展為針對腫瘤的靶向藥物輸送系統(tǒng)。
【專利說明】與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)多肽【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是影響人類健康的主要原因之一。從理論上說，腫瘤作為機(jī)體的非我，免疫系統(tǒng)能夠識別，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但事實(shí)上腫瘤宿主通常免疫力低下，無法產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫。近年來，有關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用的腫瘤免疫編輯假說引起了人們的關(guān)注。該假說認(rèn)為腫瘤細(xì)胞通過降低自身的免疫原性、下調(diào)細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)、釋放大量免疫抑制因子、召集多種免疫抑制細(xì)胞，形成穩(wěn)定的腫瘤免疫耐受格局，保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。也正是這種由腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受導(dǎo)致腫瘤治療的效果不佳。因此研究腫瘤免疫耐受的產(chǎn)生機(jī)制及如何打破腫瘤免疫耐受成為腫瘤學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。
[0003]髓樣抑制細(xì)胞(myeloid-derivedsuppressor cells,MDSCs)于 20 多年前就已在癌癥患者中被描述，但其對免疫系統(tǒng)的重要作用近年來才被重視?，F(xiàn)已證實(shí)，MDSCs由髓樣祖細(xì)胞、不成熟巨噬細(xì)胞、不成熟粒細(xì)胞以及不成熟樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)等不同細(xì)胞亞群共同組成，對T細(xì)胞反應(yīng)具有很強(qiáng)的抑制功能。在小鼠，MDSCs表達(dá)Gr-1和CDllb兩種特異性標(biāo)志物，故被稱作Grl+/CDllb+髓樣細(xì)胞。正常小鼠的骨髓和脾臟中分別含有20-30%和2-4%的Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞，但淋巴結(jié)中缺乏這類細(xì)胞。在正常情況下，這些不成熟的髓樣細(xì)胞會從 骨髓遷移到外周器官并分化成為巨噬細(xì)胞、DCs或粒細(xì)胞；但急/慢性炎癥、創(chuàng)傷、敗血癥以及腫瘤微環(huán)境會促使該群細(xì)胞大量擴(kuò)增和聚集，阻止其分化并誘導(dǎo)其活化，從而發(fā)揮其免疫抑制功能。
[0004]MDSCs細(xì)胞參與調(diào)節(jié)多種疾病的免疫應(yīng)答。盡管對MDSCs在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用的最初觀察以及現(xiàn)有的大多數(shù)資料都來自腫瘤研究，但越來越多的證據(jù)顯示，MDSCs也可在細(xì)菌和寄生蟲感染、急/慢性炎癥、創(chuàng)傷性應(yīng)激、敗血癥或移植中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
[0005]MDSCs最初是在荷瘤小鼠及癌癥患者中發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)對小鼠移植腫瘤或當(dāng)轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)腫瘤時(shí)，會觀察到該群細(xì)胞大量擴(kuò)增。在不同類型癌癥患者血液中的MDSCs數(shù)量會增加10倍。在荷瘤小鼠脾臟的有核細(xì)胞中，Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞的比例可高達(dá)20-40%。此外，MDSCs可浸潤于癌癥患者和荷瘤動物的腫瘤組織及淋巴結(jié)，調(diào)節(jié)宿主對癌細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前認(rèn)為，該群細(xì)胞的聚集是腫瘤免疫逃逸的一個(gè)主要機(jī)制，多個(gè)研究組均證實(shí)Gr-1+/CD1 Ib+細(xì)胞的聚集與T功能障礙有關(guān)，其數(shù)量的減少伴隨著CD8+T細(xì)胞和活化NK細(xì)胞抗腫瘤活性的升高。通過對荷瘤小鼠的研究證實(shí)，Gr-l+/CDllb+細(xì)胞可導(dǎo)致T細(xì)胞受體ζ鏈(CD3(，TCR復(fù)合體的重要組分)缺失或顯著減少；通過生成活性氧或活性氮中間產(chǎn)物抑制⑶3/⑶28誘導(dǎo)的T細(xì)胞激活/增殖；抑制⑶8+T細(xì)胞生成IFN- Y，以消除對MHC I分子所呈遞特異性肽的反應(yīng)；并阻止細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的體外發(fā)育。此外，Huang等報(bào)道稱Gr-1+/⑶I Ib+細(xì)胞可介導(dǎo)荷瘤小鼠體內(nèi)的Treg細(xì)胞發(fā)育，這可能是該群細(xì)胞抑制抗腫瘤應(yīng)答的另一機(jī)制。研究表明，共刺激分子CD80與MDSCs的免疫抑制作用有關(guān)。卵巢上皮細(xì)胞癌小鼠體內(nèi)Gr-l+/CDllb+細(xì)胞表達(dá)CD80。阻斷CD80后，該群細(xì)胞對抗原特異性免疫應(yīng)答的抑制作用減弱，導(dǎo)致腫瘤生長延緩。進(jìn)一步研究證實(shí)，Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞通過⑶80發(fā)揮的免疫抑制作用是由⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的，并需要細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞抗原 _4(cytotoxic lymphocyte antigen-4,CTLA_4*0)152)的存在。2003年Curiel等報(bào)道稱，在卵巢癌患者的髓樣樹突狀細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有共刺激分子I3D-Ll表達(dá)，用單抗阻斷I3D-Ll會增強(qiáng)該群細(xì)胞激活T細(xì)胞的能力。新近有研究發(fā)現(xiàn)，Gr-1+/⑶IIb+細(xì)胞亦可通過表達(dá)ro-Li對小鼠卵巢癌產(chǎn)生免疫抑制作用，這為宿主抗腫瘤免疫逃逸提供了新的作用途徑。
[0006]除腫瘤外，MDSCs還參與了其他疾病的免疫調(diào)控。急性克氏錐蟲感染可導(dǎo)致T細(xì)胞激活、IFN- Y生成增加以及Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞擴(kuò)增，后者可通過IFN- Y依賴性NO分泌而產(chǎn)生免疫抑制作用。除此之外，急性弓形體病、多種微生物所致敗血癥、單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌急性感染，以及蠕蟲、絳蟲、念珠菌和甲基絲裂霉素性牙齦感染也可導(dǎo)致Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞顯著增多。
[0007]MDSCs細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用的有多種途徑。研究表明，MDSCs的免疫抑制作用需要細(xì)胞間的直接或間接接觸得以發(fā)揮，提示該群細(xì)胞可能通過細(xì)胞表面受體和/或釋放可溶性介質(zhì)來發(fā)揮作用。Gr-l+/CDllb+細(xì)胞抑制T細(xì)胞功能的機(jī)制和/或作用途徑詳述如下:
[0008](I)精氨酸酶I和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。有證據(jù)顯示，Gr-1+/⑶IIb+細(xì)胞的免疫抑制功能與L-精氨酸有關(guān)。L-精氨酸是兩種酶的作用底物:一氧化氮合酶和精氨酸酶，前者催化產(chǎn)生NO和瓜氨酸；后者將精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩睾蚅-鳥氨酸。MDSCs可表達(dá)高水平的精氨酸酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),而這兩種酶對T細(xì)胞功能的直接抑制作用早已明確。Gr-1+/CD1 Ib+細(xì)胞可通過釋放上述酶對外源性或自分泌生成的IFN-Y做出反應(yīng)。新近研究提示，L-精氨酸與T細(xì)胞增殖的關(guān)系密切。MDSCs中精氨酸酶I的活性升高會導(dǎo)致L-精氨酸的分解代謝增強(qiáng)，而這種非必需氨基酸的缺乏會通過多種不同機(jī)制抑制T細(xì)胞的增殖，包括降低CD3 ζ鏈以及抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinD3和周期素依賴性蛋白激酶4的表達(dá)。此外，NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生的NO可通過抑制T細(xì)胞中JAK3和STAT5功能、抑制MHC II類分子表達(dá)和誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡等途徑來抑制T細(xì)胞的功能。
[0009](2)活性氧族。導(dǎo)致MDSCs發(fā)揮其抑制作用的另一個(gè)重要因子是活性氧族(reactiveoxygen species, R0S)。荷瘤小鼠和癌癥患者M(jìn)DSCs共有的一個(gè)主要特征是ROS生成顯著增多，體外抑制ROS生成會完全消除該群細(xì)胞的抑制作用。與抗原特異性T細(xì)胞相互作用后，Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞中的ROS顯著增多，阻斷CDllb, CD18和CD29等整聯(lián)蛋白可消除ROS的生成以及該群細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的抑制。此外，某些腫瘤源性因子，如 TGF-β、IL-13、IL-6、IL-10、血小板源性生長因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)和GM-CSF也能誘導(dǎo)MDSCs產(chǎn)生R0S。ROS和NO參與MDSCs的免疫抑制作用并不局限于腫瘤這一病癥，炎癥和微生物感染疾病中增多的Gr-l+/CDllb+細(xì)胞在與活化T細(xì)胞相互作用后也會產(chǎn)生ROS和NO ;相同的現(xiàn)象在急性弓形蟲病動物模型中也被觀察到。此外在急性克氏錐蟲感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞可通過IFN- Y依賴性NO生成來發(fā)揮其抑制功能。
[0010](3)過氧化亞硝酸鹽。研究表明，過氧化亞硝酸鹽(0N00-)是MDSCs抑制T細(xì)胞作用過程中的一個(gè)重要介質(zhì)。過氧化亞硝酸鹽是NO與超氧負(fù)離子(02-)之間化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物，是機(jī)體產(chǎn)生的一種強(qiáng)氧化劑，可誘導(dǎo)半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸發(fā)生硝基和亞硝基化。高水平過氧化亞硝酸鹽出現(xiàn)在MDSCs和炎癥細(xì)胞聚集的部位，與多種類型腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，可使T細(xì)胞對腫瘤產(chǎn)生無應(yīng)答。Bronte等研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺腺癌中浸潤有終末分化的CD8+T細(xì)胞，但卻處于無應(yīng)答狀態(tài)。在這些細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高水平的硝基酪氨酸，提示在腫瘤微環(huán)境中有過氧化亞硝酸鹽的生成。抑制惡性前列腺組織中精氨酸酶I和iNOS的表達(dá)可導(dǎo)致酪氨酸的硝基化減少，T細(xì)胞對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答得以恢復(fù)。此外有研究顯示，Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞在與T細(xì)胞接觸過程中生成的過氧化亞硝酸鹽可導(dǎo)致TCR和CD8分子發(fā)生硝基化，從而改變這些T細(xì)胞與特異性肽的結(jié)合能力并減弱其對抗原特異性刺激的無應(yīng)答，但仍能保持對非特異性刺激的應(yīng)答。這一現(xiàn)象在荷瘤小鼠體內(nèi)也可觀察到。
[0011](4)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。最近有報(bào)道稱，MDSCs具有促進(jìn)體內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞再次發(fā)育的能力。MDSCs對Treg細(xì)胞發(fā)育的誘導(dǎo)需要腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的激活以及IFN-Y和IL-1O的存在，但與NO生成無關(guān)。在卵巢癌小鼠中，Gr-1+/⑶Ilb+細(xì)胞需表達(dá)CTLA-4 (⑶152)才能實(shí)現(xiàn)其對Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)。在淋巴瘤小鼠模型中，MDSCs可通過與精氨酸酶相關(guān)的機(jī)制誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增，MDSCs可捕獲、加工和呈遞腫瘤相關(guān)抗原，該過程不需TGF-β的參與。與之相反，Movahedi等研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤生長過程中Treg細(xì)胞比例始終維持在高水平，且與MDSCs數(shù)量變化無關(guān)，提示MDSCs并未參與誘導(dǎo)Treg細(xì)胞。此外，在用抗CD28特異性抗體誘導(dǎo)大鼠對同種異體腎移植物產(chǎn)生耐受后發(fā)現(xiàn)，該模型中同時(shí)表達(dá)CD80和CD86的MDSCs對Treg細(xì)胞擴(kuò)增的作用有限。盡管目前的研究結(jié)果之間還存在矛盾，但MDSCs通過分泌細(xì)胞因子或細(xì)胞間直接作用來參與Treg細(xì)胞分化似乎是有可能的。
[0012]近年來隨著對MDSCs研究的深入，已研制出多種用于逆轉(zhuǎn)MDSCs免疫抑制功能的方法，包括:⑴、抑制MDSCs·聚集，如抑制干細(xì)胞因子表達(dá)、金屬蛋白酶9的活性及前列腺素Ε2的生成；(2)、清除MDSCs,如使用Gr-1抗體；(3)、抑制MDSCs的功能，如使用ARGl和iNOS阻斷劑。但遺憾的是由于MDSCs本身的異質(zhì)性及其所在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，上述手段并未獲得滿意的治療效果，所以深入了解MDSCs的發(fā)生發(fā)展對于徹底逆轉(zhuǎn)MDSCs的免疫抑制活性是非常必要的。目前有研究者提出既然MDSCs是一群具有較強(qiáng)可塑能力的細(xì)胞群體，即MDSCs既可以向具有正向免疫功能的DC分化，也可以繼續(xù)維持MDSCs的負(fù)性免疫功能或向其他具有免疫抑制活性的細(xì)胞如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化，那是否意味著MDSCS內(nèi)存在一個(gè)或多個(gè)參與調(diào)節(jié)其發(fā)生發(fā)展方向的調(diào)控靶點(diǎn)。故圍繞著MDSCs的調(diào)控靶點(diǎn)展開研究可能是今后腫瘤免疫研究的一個(gè)方向。
[0013]脂質(zhì)體是和生物膜雙層磷脂分子結(jié)構(gòu)類似的的人工膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部形成封閉的囊泡結(jié)構(gòu)，可以包裹水溶性的的藥物，同時(shí)在脂質(zhì)雙分子層中也可以載入脂溶性藥物。除了可以載藥之外，脂質(zhì)體還具有良好的生物相容性?？梢詫邢蚍肿樱缍嚯?，單抗等連接到脂質(zhì)體上，制成具有主動靶向性的脂質(zhì)體系統(tǒng)，能夠識別靶細(xì)胞并且與細(xì)胞膜表面的受體分子結(jié)合，有利于脂質(zhì)體內(nèi)化，以促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放，從而提高藥效。
[0014]由此，針對MDSCs篩選靶向多肽，該靶向多肽與脂質(zhì)體載藥結(jié)合，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)MDSCs分化或者殺傷MDSCs的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)。將該配體多肽與棕櫚酸連接，制成祀向合成材料，然后使用祀向合成材料進(jìn)一步制備革巴向脂質(zhì)體，測定靶向合成材料和靶向脂質(zhì)體對體外細(xì)胞的影響。
[0016]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0017]第一方面，本發(fā)明涉及一種與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽，包含SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0018]優(yōu)選地，所述配體多肽包括SEQ ID N0.1所示序列，以及在其C末端和/或N末端添加連接基團(tuán)或連接用氨基酸序列。
[0019]第二方面，本發(fā)明涉及一種上述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽形成的游離型多肽、融合型多肽、嵌合類多肽、或以配體多肽為單體的聚合物。
[0020]第三方面，本發(fā)明涉及一種上述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽在制備抗腫瘤藥物中的用途。
[0021]優(yōu)選地，所述與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽用于靶向小分子藥物、藥物載體、高分子、蛋白、寡核苷酸或基因作用于MDSCs，殺傷MDSCs，減少腫瘤部位MDSCs聚集，減少M(fèi)DSCs的腫瘤免疫 抑制作用。
[0022]第四方面，本發(fā)明涉及一種靶向藥物輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括:如權(quán)利要求1所述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽、載藥結(jié)構(gòu)和至少一種活性或顯像物質(zhì)。
[0023]優(yōu)選地，所述配體多肽被連接于藥物輸送系統(tǒng)的表面，并與MDSC細(xì)胞結(jié)合。
[0024]優(yōu)選地，所述載藥結(jié)構(gòu)為無機(jī)納米粒子、聚合物、脂質(zhì)體、囊泡、固體納米粒、膠束、碳納米管、細(xì)胞器或脂蛋白。
[0025]優(yōu)選地，所述活性物質(zhì)為抗腫瘤藥物，抗代謝藥物，細(xì)胞毒性藥物，光敏劑，激酶抑制劑，抗生素，抗菌素，抗炎藥物，免疫抑制劑，抗感染藥物，抗病毒藥物，目的基因、自殺基因、細(xì)胞因子基因、或上述基因的組合，或含有上述基因的真核表達(dá)載體DNA;所述顯像物質(zhì)為用于超聲造影、放射造影、核醫(yī)學(xué)造影的試劑。
[0026]優(yōu)選地，所述藥物輸送系統(tǒng)可以包載寡核苷酸分子。如siRNA、micr0RNA。
[0027]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0028](I)本發(fā)明的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽修飾過棕櫚算連接為合成材料，制備成的熒光脂質(zhì)體在體外與MDSC表現(xiàn)出很好的結(jié)合效果。
[0029](2)該配體多肽修飾過棕櫚酸為合成材料，制備成的全反式維甲酸脂質(zhì)體在體外促進(jìn)MDSCs的分化，減少腫瘤部位MDSCs的數(shù)量，降低MDSCs的免疫抑制作用。
[0030](3)該配體多肽修飾過棕櫚酸為合成材料，制備成的包載SiRNA的脂質(zhì)體在體外與MDSCs表現(xiàn)出良好的結(jié)合效果，并起到良好的基因沉默效果，為后續(xù)基因給藥提供基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯:[0032]圖1為噬菌體庫篩選滴度測試圖；
[0033]圖2為FITC-F7 (熒光素標(biāo)記的F7)熒光多肽質(zhì)譜分析圖；
[0034]圖3為FITC_F7(熒光素標(biāo)記的F7)熒光多肽與不同細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度示意圖，其中 a 為 MDSCs, b 為 Jurkat, c 為 H1299, d 為 4T1 ;
[0035]圖4為pF7 (棕櫚酸修飾的F7)多肽修飾脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0036]圖5為不同比例多肽脂質(zhì)的熒光脂質(zhì)體(HSPC氫化大豆磷脂)與MDSCs、單核細(xì)胞(Monocyte)結(jié)合突光強(qiáng)度示意圖；
[0037]圖6為不同比例多肽脂質(zhì)的熒光脂質(zhì)體(EPC卵磷脂)與MDSCs、單核細(xì)胞(Monocyte)結(jié)合突光強(qiáng)度示意圖；
[0038]圖7為MDSCs靶向多肽修飾膠束與MDSCs、單核細(xì)胞(Monocyte)結(jié)合熒光強(qiáng)度示意圖；
[0039]圖8為MDSCs靶向多肽修飾金納米粒子與MDSCs、單核細(xì)胞(Monocyte)結(jié)合熒光強(qiáng)度示意圖；
[0040]圖9為不同比例多肽脂質(zhì)修飾全反式維甲酸脂質(zhì)體的對體外MDSCs細(xì)胞影響考察情況不意圖；
[0041]圖10為不同比例多妝脂質(zhì)修飾阿霉素脂質(zhì)體的對MDSCs細(xì)胞毒性情況不意圖；
[0042]圖11為不同比例多肽脂質(zhì)修飾的載siRNA不同陽離子脂質(zhì)體與MDSCs、Monocyte結(jié)合熒光強(qiáng)度示意圖；
[0043]圖12為不同比例多肽脂質(zhì)修飾全反式維甲酸脂質(zhì)體的對荷瘤小鼠腫瘤部位MDSCs細(xì)胞影響考察情況示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按章制造廠商所建議的條件。
[0045]本發(fā)明涉及一種與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽，同時(shí)考察了該多肽修飾的脂質(zhì)體與MDSCs的結(jié)合能力進(jìn)行體外鑒定，確證該多肽與MDSCs特異性結(jié)合的能力。
[0046]實(shí)施例1、體內(nèi)噬菌體篩詵摶術(shù)篩詵MDSCs靶向配體候詵多狀
[0047]運(yùn)用體內(nèi)噬菌體篩選技術(shù)進(jìn)行三輪篩選得到MDSCs靶向性多肽DPPWLSW (簡稱F7，如SEQ ID N0.1所示)，具體方法如下:
[0048](一)體內(nèi)曬菌體技術(shù)篩選
[0049]第一輪篩選:
[0050]1、取荷瘤小鼠I只，尾靜脈注射100 μ I Ph.D.-7?噬菌體7肽庫(4*10npfu)。Ih后，4% μ I水合氯醛200 μ I麻醉，40mlPBS心肌灌注，然后取腫瘤組織。
[0051]2、裂解MDSCs細(xì)胞:將分選得到的MDSCs細(xì)胞加入1% NP-40細(xì)胞裂解液100 μ 1，混勻，冰上裂解5min。
[0052]3、ER2738單菌落接種至LB-Tet(LB-四環(huán)素)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)物I: 100分別稀釋至I個(gè)25ml、I個(gè)IOmlLB培養(yǎng)基的錐形瓶中。37°C，260rpm搖床上2_4h使 0D600 = 0.4。
[0053]4、拯救噬菌體:將裂解物全部轉(zhuǎn)移至lmlER2738培養(yǎng)物中，混勻，室溫30min孵育。
[0054]上述混合物全部轉(zhuǎn)移至25ml菌液錐形瓶中，37°C，260rpm搖床上5_6h。
[0055]5、將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入一離心管中(50ml), 4°C 10, OOOrpm離心lOmin。上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中(50ml)，再離心。
[0056]6、將上清的上部80%分別轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體
4°C沉淀過夜。
[0057]IA0C 10，OOOrpm離心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。
[0058]8、沉淀物重懸于Iml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C離心5min使殘余細(xì)胞沉淀。
[0059]9、上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積(約340 μ I)的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4°C離心lOmin，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸去殘余上清。
[0060]10、沉淀物重懸于200 μ ITBS中。離心Imin,沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中。此即為擴(kuò)增后的洗脫物。
[0061]11、根據(jù)上述常規(guī)Μ13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物。4°C貯存。
[0062]第二輪篩選
[0063]12、根據(jù)第一輪篩選所得滴度計(jì)算應(yīng)取尾靜脈注射的體積，取125 μ I擴(kuò)增后的洗脫物尾靜脈注射入荷瘤小鼠，Ih后，4% μ I水合氯醛200 μ I麻醉，40mlPBS心肌灌注，然后取腫瘤)。
[0064]13、重復(fù)步驟 2-12。
[0065]第三輪篩選
[0066]重復(fù)上述步驟12-13，進(jìn)行第三輪篩選。
[0067]( 二 )單克隆噬菌體收獲，擴(kuò)增，提取DNA測序
[0068]1.第三輪篩選過后，測定洗脫產(chǎn)物噬菌體滴度。
[0069]2.利用無菌槍頭挑取平板中的藍(lán)色噬菌斑，接種至Iml對數(shù)生長中期的E2738菌液中(15ml離心管)，37°C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時(shí)。
[0070]3.4°C下10，OOOrpm離心5分鐘，取上清至1.5ml離心管，再次4°C下10，OOOrpm離心5分鐘,小心取500 μ I上清至新的1.5ml離心管。
[0071]4.加入200 μ I PEG/NaCl溶液，混和均勻，室溫靜置10分鐘。
[0072]5.室溫10，OOOrpm離心10分鐘，徹底棄去上清。
[0073]6.加入100 μ I碘化物緩沖液重懸沉淀，加入250 μ I無水乙醇，室溫孵育10分
[0074]鐘，10, OOOrpm離心10分鐘，棄去上清，70 %乙醇洗滌沉淀，棄去，干燥，將沉淀重懸于30 μ I滅菌去離子水中。
[0075]7.生工，利用-96gIII 測序引物(5，-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG_3，)，SEQ IDN0.2，進(jìn)行測序。
[0076]此多肽以及為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)方便化學(xué)連接而設(shè)計(jì)的含有棕櫚酸末端的DPPWLSW-pal (簡稱pF7) ,DPPffLSffDPPffLSff-F I TC以及熒光FITC-F7多肽均由成都凱捷生物醫(yī)藥發(fā)展有限公司合成，均經(jīng)過HPLC純化和質(zhì)譜鑒定，純度大于95%，分子量與理論值相符。
[0077]效果驗(yàn)證:
[0078](I)圖1為噬菌體篩選滴度測試結(jié)果，藍(lán)斑為特異性結(jié)合的噬菌體克隆。
[0079](2)表1為噬菌體篩選得到的多肽序列(取9個(gè)克隆進(jìn)行測序)
[0080]表1
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽，其特征在于，包含SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽，其特征在于，所述配體多肽包括SEQ ID N0.1所示序列，以及在其C末端和/或N末端添加連接基團(tuán)或連接用氨基酸序列。
3.—種如權(quán)利要求1所述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽形成的游離型多肽、融合型多肽、嵌合類多肽、或以配體多肽為單體的聚合物。
4.一種如權(quán)利要求1所述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽在制備抗腫瘤藥物中的用途。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽用于靶向小分子藥物、藥物載體、高分子、蛋白、寡核苷酸或基因作用于MDSC，殺傷MDSCs，減少腫瘤部位MDSCs聚集，減少M(fèi)DSCs的腫瘤免疫抑制作用。
6.—種祀向藥物輸送系統(tǒng),其特征在于,該系統(tǒng)包括:如權(quán)利要求1所述的與MDSCs特異性結(jié)合的配體多肽、載藥結(jié)構(gòu)和至少一種活性物質(zhì)或顯像物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征在于，所述配體多肽被連接于藥物輸送系統(tǒng)的表面，并與MDSC細(xì)胞 結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征在于，所述載藥結(jié)構(gòu)為無機(jī)納米粒子、聚合物、脂質(zhì)體、囊泡、固體納米粒、膠束、碳納米管、細(xì)胞器或脂蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征在于，所述活性物質(zhì)為抗腫瘤藥物，抗代謝藥物，細(xì)胞毒性藥物，光敏劑，激酶抑制劑，抗生素，抗菌素，抗炎藥物，免疫抑制劑，抗感染藥物，抗病毒藥物，目的基因、自殺基因、細(xì)胞因子基因、或上述基因的組合，或含有上述基因的真核表達(dá)載體DNA;所述顯像物質(zhì)為用于超聲造影、放射造影、核醫(yī)學(xué)造影的試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征在于，所述藥物輸送系統(tǒng)還包載寡核苷酸分子。
【文檔編號】C07K7/06GK103626846SQ201310554489
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】徐宇虹, 司曉菲, 吳烈宜, 張金平, 陳曉龍 申請人:上海交通大學(xué)