專利名稱：復(fù)合骨髓移植材料、方法和試劑盒的制作方法
背景技術(shù)：
骨移植被廣泛用于治療骨折、骨不連合和誘導(dǎo)關(guān)節(jié)固定。自體松質(zhì)骨——從被移植者的一個(gè)部位取出并植入被移植者的另一個(gè)部位——是目前最有效的骨移植物。自體松質(zhì)骨提供了支持骨愈合反應(yīng)和生成新的軟骨或骨的祖代細(xì)胞的分布的平臺(tái)。不過，收獲自體骨會(huì)導(dǎo)致成本和發(fā)病率上升，包括瘢痕、血液損失、疼痛、手術(shù)與復(fù)原時(shí)間延長(zhǎng)和感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，移植部位的體積可能超過可利用的自體移植物的體積。
因此，已經(jīng)開發(fā)了自體移植物的替代選擇。已經(jīng)研究或開發(fā)了若干提純或合成的材料，包括陶瓷、生物聚合物、經(jīng)過加工的同種移植骨和膠原類基質(zhì)，以充當(dāng)自體移植物的代用品。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了一種多孔的源于珊瑚的合成羥磷灰石陶瓷，用于包含在有缺陷的骨內(nèi)。還批準(zhǔn)了一種提純的膠原/陶瓷復(fù)合材料，用于急性長(zhǎng)骨骨折。盡管這些材料避免了牽涉收獲自體移植物的發(fā)病，并且消除了與可利用的自體移植物數(shù)量有限有關(guān)的問題，合成材料的臨床有效性仍然普遍不及自體移植物。合成移植材料還已被用作骨髓細(xì)胞的載體。在將上述復(fù)合材料植入有缺陷的骨骼時(shí)，祖代細(xì)胞分化為骨骼組織。
在有些情形中，復(fù)合植入物是這樣制成的，將合成移植材料與相似或較少體積的、從骨髓抽吸物獲得的細(xì)胞懸液混合。不過，具有分化為軟骨、骨、肌肉、纖維組織和其他結(jié)締組織的能力的祖代細(xì)胞在骨髓中的含量非常少。存在于1ml骨髓中的祖代細(xì)胞數(shù)因患者而異，從約100個(gè)細(xì)胞至20,000個(gè)細(xì)胞。這代表了有核細(xì)胞在骨髓抽吸物中的平均比例為約1∶20,000至1∶40,000。因而，將給定體積的合成移植材料與相當(dāng)體積的新鮮骨髓混合所制成的復(fù)合植入物含有相對(duì)少的祖代細(xì)胞。
因此，以前已經(jīng)開發(fā)了一種技術(shù)，以增加祖代細(xì)胞在復(fù)合植入物中的相對(duì)濃度。這種技術(shù)牽涉平板接種骨髓細(xì)胞懸液到組織培養(yǎng)皿上，在選定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一天或多天，以實(shí)現(xiàn)祖代細(xì)胞群的提高，然后從組織培養(yǎng)皿分離出細(xì)胞，得到增加了祖代細(xì)胞群的細(xì)胞懸液。然后將合成陶瓷載體浸漬在這種富集了祖代細(xì)胞的懸液中，制成復(fù)合植入物。不幸的是，這種制備復(fù)合植入物的方法是非常費(fèi)時(shí)的。而且，如果原始的祖代培養(yǎng)細(xì)胞是源于從被移植者獲得的骨髓抽吸物的，那么被移植者必須經(jīng)歷多個(gè)侵入性程序；一個(gè)程序取出他或她的骨髓，后一個(gè)程序植入復(fù)合移植物。所以，被移植者可能面臨一次以上的麻醉。
還開發(fā)了另一種技術(shù)，以生產(chǎn)復(fù)合骨移植物基質(zhì)，它具備培養(yǎng)方法的益處，但是沒有那么費(fèi)時(shí)，并且不需要多個(gè)侵入性程序。在這種技術(shù)中，富集了祖代細(xì)胞群的復(fù)合基質(zhì)是這樣生產(chǎn)的，使特定體積的基質(zhì)材料與過量體積的骨髓抽吸物接觸(參見美國(guó)專利US5,824,084和6,049,026)。在這種技術(shù)中，使含有祖代細(xì)胞的骨髓抽吸物穿過多孔的基質(zhì)材料，后者具有選擇性與祖代細(xì)胞結(jié)合的表面，從而將祖代細(xì)胞保留在基質(zhì)內(nèi)，允許過量的其他細(xì)胞(例如血細(xì)胞和其他有核的源于骨髓的細(xì)胞)穿過。再將富集了祖代細(xì)胞的移植物基質(zhì)植入患者內(nèi)。
不過，因?yàn)樽娲?xì)胞如此強(qiáng)烈地和選擇性地與一些基質(zhì)表面(例如同種移植骨基質(zhì))結(jié)合，它們不均勻地分布在基質(zhì)內(nèi)，密集的祖代細(xì)胞離散地集中在骨髓抽吸物與基質(zhì)材料之間的最初接觸附近。所以，由這種技術(shù)制備的骨移植物受到這樣的限制，由于祖代細(xì)胞在所植入的基質(zhì)內(nèi)的不均勻分布，植入之后的骨愈合也不會(huì)均勻地發(fā)生。另外，基質(zhì)植入之后的骨愈合發(fā)生得相對(duì)緩慢。
因此需要一種制備富集了祖代細(xì)胞群的復(fù)合骨髓移植材料的新方法，該方法能夠在手術(shù)內(nèi)進(jìn)行，也就是在骨髓從被移植者取出的同時(shí)，導(dǎo)致祖代細(xì)胞在移植材料內(nèi)的均勻分布，有利于植入后的加速愈合。
發(fā)明概述所提供的復(fù)合骨髓移植材料包含多孔的生物相容性可植入基質(zhì)和凝集材料。復(fù)合骨髓移植材料具有富集了的祖代細(xì)胞群。還提供了制備復(fù)合骨髓移植材料的方法。該方法包括這樣的步驟，提供骨髓抽吸物，提供多孔的生物相容性可植入基質(zhì)，使骨髓抽吸物與基質(zhì)接觸，得到所富集的基質(zhì)，再機(jī)械性地混合所富集的基質(zhì)，得到復(fù)合骨髓移植材料，其中祖代細(xì)胞基本上均勻地分布在復(fù)合骨髓移植材料內(nèi)。
還提供了復(fù)合骨髓移植材料的制備試劑盒。該試劑盒包括基質(zhì)容器、第一端帽(endcap)和第一載入注射器。調(diào)整第一載入注射器，以匹配第一端帽，在第一載入注射器與基質(zhì)容器之間提供流體互通。第一端帽可拆裝于基質(zhì)容器上。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1是裝有端帽并且含有移植物基質(zhì)的基質(zhì)容器的透視圖。
圖2是裝有載入注射器的圖1基質(zhì)容器的透視圖。
圖2A是骨髓抽吸物的分解圖，顯示祖代細(xì)胞和源于骨髓的有核細(xì)胞。
圖3是含有移植物基質(zhì)的基質(zhì)容器的透視圖，該基質(zhì)具有不均勻分布的祖代細(xì)胞。
圖3A是已有骨髓抽吸物流經(jīng)的移植物基質(zhì)中心區(qū)域的分解圖。
圖3B是已有骨髓抽吸物流經(jīng)的移植物基質(zhì)末端區(qū)域的分解圖。
圖4是含有凝集材料和所富集的基質(zhì)材料的混合碗的透視圖。
圖5是包含混合碗、漏斗和施用注射器的組件的透視圖。
圖6是圖5組件的透視圖，它已被顛倒過來，以實(shí)施本發(fā)明的圖7是包含混合碗、漏斗、基質(zhì)容器和排放注射器的組件的透視圖，用于實(shí)施本發(fā)明的第二種優(yōu)選實(shí)施方式。
圖8是根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的透視圖。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明本文所用的范圍，例如5-25或在5與25之間，表示優(yōu)選為至少5，并且單獨(dú)和獨(dú)立地優(yōu)選為不多于25。本文所用的術(shù)語“祖代細(xì)胞”表示任意祖代細(xì)胞，例如結(jié)締組織祖代細(xì)胞和/或干細(xì)胞。這種細(xì)胞群包含多能性的(pleuripotent)細(xì)胞，能夠分化為各種組織(例如骨、軟骨、脂肪、腱、韌帶、肌肉、神經(jīng)組織、造血組織、內(nèi)皮與血管組織和肝)。
提供根據(jù)本發(fā)明的、富集了祖代細(xì)胞群的復(fù)合骨髓移植材料的方法一般包含下列步驟1、獲得骨髓抽吸物；2、使骨髓抽吸物與多孔的生物相容性可植入基質(zhì)接觸(例如使抽吸物流經(jīng)基質(zhì))，得到富集了祖代細(xì)胞的基質(zhì)，其具有所富集的祖代細(xì)胞群；3、機(jī)械性地混合所富集的基質(zhì)，使祖代細(xì)胞基本上均勻地分布其中；和4、排出基質(zhì)中的過量液體。優(yōu)選地，該方法還包括向所富集的基質(zhì)加入凝集材料的步驟。如此制備的復(fù)合骨髓移植材料可植入到患者或被移植者體內(nèi)，有效誘導(dǎo)骨愈合和/或骨再生。
上述方法步驟包含若干功能要素，現(xiàn)在將加以描述。這類功能要素包括骨髓抽吸物、多孔的生物相容性可植入基質(zhì)和優(yōu)選的凝集材料。在這些功能要素的說明之后，是制備本發(fā)明的復(fù)合骨髓移植物的優(yōu)選方法和儀器的說明。應(yīng)當(dāng)理解，下列說明僅供例證，而非限制。
骨髓抽吸物骨髓抽吸物含有血漿、有核祖代細(xì)胞(祖代細(xì)胞)、有核造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、和源于外周血的細(xì)胞，包括紅細(xì)胞和血小板。因?yàn)楣撬璩槲锖型庵苎?，?yōu)選的是將抽吸物收集在含有抗凝劑的注射器內(nèi)。適合的抗凝劑包括肝素、檸檬酸鈉和EDTA。優(yōu)選地，用在本發(fā)明方法中的骨髓抽吸物是從將接受移植的患者(被移植者)獲得的。次優(yōu)選地，骨髓抽吸物可以是從另一免疫學(xué)上可相容的供體獲得的。
多孔的生物相容性可植入基質(zhì)基質(zhì)包含多孔的生物相容性可植入基質(zhì)。優(yōu)選地，基質(zhì)具有生物活性表面。具有生物活性表面的、多孔的生物相容性可植入移植物基質(zhì)材料的實(shí)例包括陶瓷，包含磷酸鈣，例如羥磷灰石或磷酸三鈣，以及去礦化的或礦化的骨基質(zhì)。其他適合的基質(zhì)材料包括生物聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚半乳酸、聚己內(nèi)酯、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚砜、聚乙烯和聚丙烯。其他適合的基質(zhì)材料有透明質(zhì)酸、生物玻璃和膠原，透明質(zhì)酸可以是經(jīng)過提純的，具有或者沒有交聯(lián)的。
更優(yōu)選地，細(xì)胞粘連分子與基質(zhì)底物的表面結(jié)合。術(shù)語“細(xì)胞粘連分子”包括層粘素、纖連蛋白、玻連蛋白、血管細(xì)胞粘連分子(V-CAM)、細(xì)胞內(nèi)粘連分子(I-CAM)、腱生蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨粘連蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白、膠原、或任意其他有效促進(jìn)祖代細(xì)胞與底物表面的選擇性粘連的分子或組分。
優(yōu)選地，基質(zhì)具有足夠的多孔性，使可用于祖代細(xì)胞粘連的總基質(zhì)表面積增加至少2倍，優(yōu)選3倍，優(yōu)選5倍，優(yōu)選7倍，優(yōu)選10倍，相對(duì)于具有相同外部尺寸的非多孔固體而言。使用包含粉末、顆粒、纖維、其一定組合的基質(zhì)底物或單一的高多孔性底物，能夠?qū)崿F(xiàn)這樣一種總表面積的增加。優(yōu)選地，基質(zhì)的孔徑大于20、更優(yōu)選50、更優(yōu)選100、更優(yōu)選500、最優(yōu)選1000μm，目的是有利于祖代細(xì)胞穿過孔進(jìn)入基質(zhì)材料的外部體積，由此利用孔內(nèi)額外的表面積。
特別適合的基質(zhì)材料包括離體礦化松質(zhì)骨切片、礦化骨的粉末或顆粒、去礦化松質(zhì)骨切片、去礦化骨的粉末或顆粒、胍-HCl提取的去礦化骨基質(zhì)、燒結(jié)的密質(zhì)或松質(zhì)骨、珊瑚羥磷灰石(由Interpore銷售、商品名為Interpore 500或Interpore 200)、顆粒狀陶瓷(例如摻入骨移植物代用品由Zimmer出售的Collagraft)、顆粒狀或塊狀陶瓷(例如摻入移植物代用品由Orthovita出售的Vitoss)和絲狀海綿(例如由Orquest出售的由膠原制成的那些)。
優(yōu)選的基質(zhì)被制成微粒性骨材料與纖維性骨材料的組合。微粒性骨材料優(yōu)選地是源于人海綿狀骨，優(yōu)選松質(zhì)骨，例如來自人長(zhǎng)骨遠(yuǎn)端。纖維性骨材料優(yōu)選地是源于密質(zhì)骨的。微粒性與纖維性骨材料都能夠從骨庫中獲得，或者可選地從被移植者獲得。在從被移植者獲得時(shí)，在手術(shù)室中在手術(shù)期間處理骨材料，經(jīng)由已知的骨處理裝置確認(rèn)所需的微粒性與纖維性特征。
最優(yōu)選地，所提供的微粒性骨材料是同種移植物的松質(zhì)骨微粒，它們是大塊、薄片或片段的形式，平均直徑為1-15、優(yōu)選2-8mm。最優(yōu)選地，所提供的纖維性骨材料是同種移植物的去礦化密質(zhì)骨纖維，長(zhǎng)度至少5mm，更優(yōu)選至少1cm，更優(yōu)選至少2cm，更優(yōu)選至少3cm，更優(yōu)選至少4cm，最優(yōu)選至少5cm?？蛇x地，所提供的纖維性骨材料是不同長(zhǎng)度纖維的混合物，長(zhǎng)度范圍為5mm-2cm、5mm-3cm、5mm-4cm、5mm-5cm、5mm-15cm或一些其他范圍。可選地，纖維性骨材料是作為柔韌性墊而供應(yīng)的，例如可從Osteotech，Inc得到的Grafton Flex。
將微粒性與纖維性骨材料按下列方式結(jié)合構(gòu)成優(yōu)選的復(fù)合基質(zhì)。將骨纖維，優(yōu)選去礦化的密質(zhì)骨纖維，長(zhǎng)度如上所述——與微粒性骨微粒按下列優(yōu)選比例結(jié)合約225、次優(yōu)選200-300、次優(yōu)選150-375、次優(yōu)選100-450、次優(yōu)選75-500、次優(yōu)選25-1000mg干重的去礦化密質(zhì)骨纖維與約10、次優(yōu)選8-12、次優(yōu)選6-14、次優(yōu)選4-16、次優(yōu)選2-18、次優(yōu)選1-25cc(總體積)的微粒性骨微粒，后者的平均直徑為1-15、優(yōu)選2-8mm?？蛇x地，去礦化的密質(zhì)骨纖維可以從包含這類纖維的柔韌性墊獲得。在使用這樣一種墊子時(shí)，首先用等滲溶液洗去任何可能存在的有毒或高滲材料，例如甘油。然后將墊子懸浮在鹽水或其他適合的等滲溶液中，以促進(jìn)單個(gè)骨纖維的分離。將所分離的骨纖維與微粒性骨材料按下列比例結(jié)合，構(gòu)成優(yōu)選的復(fù)合基質(zhì)來自最初尺寸為2.5cm×5cm×約2.5mm(最初體積約3.1cm3)的墊子的纖維與約10cc、次優(yōu)選8-12cc、次優(yōu)選6-14cc、次優(yōu)選4-16cc(總體積)的微粒性骨微粒，后者的平均直徑為1-15、優(yōu)選2-8mm。
應(yīng)當(dāng)注意，若不同大小的移植物是必要的，可以按照本發(fā)明制備不同大小的復(fù)合基質(zhì)，以符合纖維性與微粒性骨的上述比例。例如，(假定堆積密度均勻)可以將20cc微粒性骨與450mg骨纖維結(jié)合，提供優(yōu)選的復(fù)合基質(zhì)。
凝集材料凝集材料可以是由血液形成的血塊，血液從被移植者(或免疫學(xué)上相容的供體)的靜脈或動(dòng)脈獲得。更優(yōu)選地，凝集材料是由無抗凝處理的骨髓抽吸物形成的骨髓凝塊，骨髓抽吸物最優(yōu)選地是從被移植者獲得的。優(yōu)選地，形成骨髓凝塊的骨髓抽吸物是在移植手術(shù)期間從被移植者獲得的。次優(yōu)選地，凝集材料可以是本領(lǐng)域已知的血小板凝膠、血小板濃縮物、纖維蛋白凝集材料和/或纖維蛋白膠。
向富集了祖代細(xì)胞的移植物基質(zhì)加入骨髓凝塊(從無抗血處理的骨髓抽吸物獲得)驚人地顯著提高所得復(fù)合骨髓移植材料的功效，相對(duì)于沒有凝集材料的復(fù)合移植物而言。已經(jīng)觀察到，向相似富集了的基質(zhì)加入骨髓凝塊比單獨(dú)的骨髓凝塊多呈遞50-70％的有核細(xì)胞(包括祖代細(xì)胞數(shù)量的兩倍以上)，所得移植物既優(yōu)于單獨(dú)的富集基質(zhì)，也優(yōu)于與骨髓凝塊結(jié)合的非富集基質(zhì)。因此，向富集了祖代細(xì)胞的基質(zhì)加入骨髓凝塊提高了移植物的性能。
在不希望局限于任何特定理論的同時(shí)，據(jù)信包含骨髓凝塊可以提高復(fù)合骨移植物的功效，原因是下列的一種或幾種。首先，一些對(duì)成功的骨愈合過程而言重要的細(xì)胞有可能不附著于移植物基質(zhì)，因此不會(huì)充分地集中在移植部位(甚至有可能排除在外)，導(dǎo)致該部位愈合的效率低下或無效。由凝血級(jí)聯(lián)所致纖維蛋白原聚合成纖維蛋白(進(jìn)一步解釋如下)可以提供有價(jià)值的補(bǔ)充基質(zhì)，促進(jìn)對(duì)移植部位愈合反應(yīng)而言重要的細(xì)胞的附著和移行。這類細(xì)胞包括移行性內(nèi)皮細(xì)胞，它們?cè)鲋成晒軤罱Y(jié)構(gòu)，后者對(duì)經(jīng)由血管生成作用生成血管而言是重要的前體。
第二種可能性是在移植部位形成凝塊的生理學(xué)過程為移植在該部位的成骨細(xì)胞創(chuàng)造了優(yōu)良的環(huán)境。具體而言，無抗凝處理的骨髓抽吸物的凝集導(dǎo)致其中所含有的血小板的活化，導(dǎo)致血小板的脫粒。血小板的脫粒繼而釋放生長(zhǎng)因子和親骨細(xì)胞因子，它們可能不存在于移植部位。在這種過程期間所釋放的若干重要的生物活性因子包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)。另外，作為凝血級(jí)聯(lián)的結(jié)果，從纖維蛋白原生成纖維蛋白基質(zhì)可以在直接的術(shù)后期間在移植部位提供重要的穩(wěn)定性。此外，存在于移植物植入之后前幾天內(nèi)的纖維蛋白分解活動(dòng)的過程在移植物摻入的早期階段為血管生成因子(例如本領(lǐng)域已知的纖維蛋白分裂產(chǎn)物)提供另外的來源。據(jù)信移植部位在植入之后的所得血管生成作用可以增強(qiáng)新血管在該部位中的生成，為新植入的祖代細(xì)胞和其他負(fù)責(zé)骨愈合與生長(zhǎng)的細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)來源，從而加速愈合反應(yīng)。
優(yōu)選的實(shí)施方式和儀器現(xiàn)在將描述用于提供復(fù)合骨移植物的本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式。本文所述的儀器部件優(yōu)選地是由塑料制成的，優(yōu)選地是透明的或半透明的。按照本發(fā)明的第一種優(yōu)選實(shí)施方式，并首先參照?qǐng)D1，將如上所述制備的復(fù)合的生物相容性可植入基質(zhì)10置于基質(zhì)容器內(nèi)，該容器最優(yōu)選地是柱子12(基質(zhì)10可以是緊密或松散包裝的，這取決于材料和它的結(jié)構(gòu))。所提供的柱子12可以具有多種內(nèi)部容積，適合于容納必要體積的特定移植物的基質(zhì)。本文所用的基質(zhì)的容積(或基質(zhì)容積)表示非多孔性固體的排除容積，該固體的外部尺寸等于特定的基質(zhì)。例如，可以提供內(nèi)部容積為5、10、15、20、25或30cc或一些其他內(nèi)部容積的柱子，以容納各種基質(zhì)容積。優(yōu)選地，柱子12的內(nèi)部直徑為0.5-3.0、更優(yōu)選1-2、更優(yōu)選1-1.5cm。優(yōu)選地，柱子12的長(zhǎng)度比它的內(nèi)部直徑大至少1.5、更優(yōu)選至少2、最優(yōu)選至少3倍。端帽14可拆裝于柱子12，經(jīng)由絲線連接、按鈕連接或任意其他已知的連接裝置。
可選地，所提供的端帽14可以帶有屏或膜15(見圖8)，可允許抽吸物20穿過其中，同時(shí)保留基質(zhì)10的微粒。優(yōu)選地，這樣一種膜具有開口，直徑為至少20、優(yōu)選至少30、優(yōu)選至少40μm。
骨髓抽吸物20(優(yōu)選地含有抗凝劑)是經(jīng)由已知裝置、優(yōu)選地從被移植者獲得。然后將抽吸物20裝入第一載入注射器28。最初，抽吸物20含有祖代細(xì)胞32和其他有核細(xì)胞33，比例在1∶20,000與1∶40,000之間(見圖2A)。抽吸物還含有血小板、紅細(xì)胞和血清(包括可溶于或懸浮在血清中的分子)。所提供的載入注射器28帶有注射器連接器30，適合于與端帽連接器31匹配，在載入注射器28與柱子12的各自內(nèi)部容積之間提供流體互通。所提供的第二載入注射器29類似地帶有注射器連接器30，適合于與端帽連接器31匹配。如圖2所示，然后將第一與第二載入注射器28與29經(jīng)由上述連接器附加在與端帽14相對(duì)的柱子12末端，從而在第一載入注射器28、柱子12與第二載入注射器29的內(nèi)部容積之間提供流體互通。
然后推壓第一載入注射器28，投放抽吸物20至柱子12，在那里抽吸物20流經(jīng)基質(zhì)10或者與之接觸，之后在柱子12的另一端被收集在第二載入注射器29中。使骨髓抽吸物與基質(zhì)接觸以提供富集基質(zhì)可以這樣進(jìn)行，使抽吸物流經(jīng)基質(zhì)，在抽吸物中培育基質(zhì)，或者通過本領(lǐng)域已知的其他手段。作為替代選擇，使抽吸物20與基質(zhì)10通過任意已知手段接觸，以提供富集基質(zhì)。祖代細(xì)胞有利地和選擇性地粘附于基質(zhì)10的表面，由此留在基質(zhì)內(nèi)，而過量的其他細(xì)胞、例如血細(xì)胞和其他源于骨髓的有核細(xì)胞相對(duì)自由地流經(jīng)基質(zhì)，被收集在第二載入注射器29中。為了在基質(zhì)10中富集祖代細(xì)胞群，流經(jīng)基質(zhì)10的抽吸物20的體積優(yōu)選地超過基質(zhì)容積。以這種方式，存在于抽吸物體積中的祖代細(xì)胞優(yōu)選地集中在基質(zhì)容積中，得到富集的基質(zhì)。本文所用的“富集”意味著祖代細(xì)胞與全部有核骨髓細(xì)胞之比在基質(zhì)中大于在原來的骨髓抽吸物中。優(yōu)選地，富集基質(zhì)中祖代細(xì)胞與全部源于骨髓的有核細(xì)胞之比為至少1∶20,000，更優(yōu)選為至少1∶10,000，更優(yōu)選為至少1∶5,000，反映了祖代細(xì)胞的普遍性或濃度增加了至少2倍，優(yōu)選至少4倍。更優(yōu)選地，富集基質(zhì)的祖代細(xì)胞濃度比具有骨髓凝塊的非富集基質(zhì)增加了至少5倍，更優(yōu)選至少6倍，更優(yōu)選至少8倍。優(yōu)選地，抽吸物體積與基質(zhì)容積之比為至少2∶1，更優(yōu)選為至少3∶1，更優(yōu)選為至少4∶1。例如，在使用基質(zhì)容積為15cc的基質(zhì)時(shí)，穿過基質(zhì)的抽吸物的總體積優(yōu)選為至少30cc，更優(yōu)選為至少45cc，更優(yōu)選為至少60cc。可選地，最初從柱子12投放至第二載入注射器29的流出物可以在繼續(xù)該方法之前被棄去。
可選地，通過交替推壓第一和第二載入注射器28和29，使抽吸物20在柱子12中反復(fù)流經(jīng)基質(zhì)10。根據(jù)細(xì)胞和祖代細(xì)胞與特定基質(zhì)結(jié)合的速率，這種使抽吸物20流經(jīng)基質(zhì)10的程序重復(fù)至少1次，但是優(yōu)選地可以重復(fù)至少2次，優(yōu)選至少3次，優(yōu)選至少4次?？蛇x地，在最初的骨髓抽吸物懸液和任意流出物已經(jīng)穿過基質(zhì)10之后，使洗滌溶液穿過基質(zhì)10。優(yōu)選地，洗滌溶液包含無菌的、等滲的、緩沖的溶液，pH范圍為7.3至7.5。適合的洗滌溶液包括磷酸鹽緩沖鹽水、Hank氏平衡鹽溶液、人血清和極限必需培養(yǎng)基。
上述程序之后，從端帽1 4拆下載入注射器28和29。在圖3中可以見到，留在基質(zhì)10中的祖代細(xì)胞32均勻分布在基質(zhì)10內(nèi)。具體而言，在基質(zhì)10內(nèi)存在祖代細(xì)胞濃度梯度，由此祖代細(xì)胞32集中在柱子12兩端附近的區(qū)域(見圖3A)，而骨髓抽吸物20在進(jìn)入柱子12后首先與基質(zhì)材料接觸。所以，基質(zhì)10的中心區(qū)域具有低得多的祖代細(xì)胞群(見圖3B)。這種效應(yīng)是由于祖代細(xì)胞和其他細(xì)胞在進(jìn)入柱子12后迅速粘附于基質(zhì)表面。因而，機(jī)械混合步驟可有效地形成祖代細(xì)胞分布更均勻的富集基質(zhì)。
參照?qǐng)D4，從柱子12除去端帽，在柱子12上安裝注射器轉(zhuǎn)接器13，構(gòu)成施用注射器50。注射器轉(zhuǎn)接器13包含一個(gè)活塞，它適合于推壓柱子12，并逐出其中的基質(zhì)材料。從而從柱子12中逐出富集了祖代細(xì)胞的基質(zhì)材料11，與一定體積的凝集材料18一起投放至混合碗40內(nèi)。凝集材料18優(yōu)選地是無抗凝處理的骨髓抽吸物，如上所述從已被允許凝血的被移植者獲得。可選地，可以在凝血之前將無抗凝處理的骨髓抽吸物與富集基質(zhì)結(jié)合，以便在混合過程期間和之后形成凝塊。凝集材料體積與富集了祖代細(xì)胞的基質(zhì)材料體積之比優(yōu)選為約1∶1，次優(yōu)選為大約或至少1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1或5∶1。一旦在混合碗40中結(jié)合，將富集基質(zhì)材料11與凝集材料18機(jī)械混合在一起，得到異質(zhì)的可植入復(fù)合骨移植物混合物8(見圖5)，組成基本上是均勻的。組成基本上均勻意味著復(fù)合骨移植物混合物8包含復(fù)合基質(zhì)的纖維性與微粒性骨材料、富集了的祖代細(xì)胞群、和凝集材料，它們都基本上均勻地分布在整個(gè)混合物內(nèi)，從而基本上不表現(xiàn)關(guān)于任意單一組分的體相濃度梯度。這類機(jī)械混合例如可以利用刀具38在混合碗40中進(jìn)行，或者經(jīng)由任意其他的已知機(jī)械混合裝置進(jìn)行。
參照?qǐng)D5，將漏斗41安裝于混合碗40(仍然含有復(fù)合骨髓移植材料8)，將施用注射器50安裝于漏斗41，如圖所示。隨后將如圖5所示完整的儀器倒置，如圖6所示，除去混合碗40的底蓋42?？蛇x地，可以將碗內(nèi)容物倒入或挖入附加于施用注射器50的漏斗41內(nèi)。然后將可植入復(fù)合骨髓移植材料8裝填在施用注射器50中，這可以借助刀具38?？蛇x地，刀具38在一個(gè)末端裝有適合于將材料裝填在施用注射器中的活塞，如圖所示。一旦裝填后，從漏斗41除去施用注射器50，可以用于將可植入復(fù)合骨髓移植材料8施用于患者。移植材料8有效地誘導(dǎo)移植部位的骨愈合或骨再生。可選地，復(fù)合骨髓移植材料可以通過本領(lǐng)域已知的其他機(jī)械裝置從混合碗直接轉(zhuǎn)移到患者。
根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合骨髓移植材料還可以按照下列第二種優(yōu)選實(shí)施方式加以制備。如上所述分別獲得和制備復(fù)合基質(zhì)10和骨髓抽吸物20(優(yōu)選地含有抗凝劑)，分別放置在混合碗40中，比例類似于上述第一種優(yōu)選實(shí)施方式。然后利用刀具38或一些其他已知的機(jī)械混合裝置將基質(zhì)和抽吸物機(jī)械混合在一起，得到富集基質(zhì)。然后如下從富集基質(zhì)11排出液體抽吸物20。參照?qǐng)D7，連接漏斗41與混合碗40，再連接柱子12與漏斗41，如圖所示，單一的端帽14連接在柱子12的對(duì)側(cè)末端。端帽14也裝有帶開口的膜或屏(沒有顯示)，開口適合于允許抽吸物穿過而留下富集基質(zhì)11。開口的直徑優(yōu)選為至少20、更優(yōu)選30、更優(yōu)選40μm。經(jīng)由已知的連接裝置連接流出注射器45與端帽14，從而在流出注射器45與柱子12各自的內(nèi)部容積之間實(shí)現(xiàn)流體互通。將所述完整的儀器倒置，如圖7所示，如果必要的話除去底蓋42。抽出或排出混合碗40內(nèi)的液體，經(jīng)過柱子12進(jìn)入流出注射器45。液體可以被推回到柱子12中。這種反復(fù)程序可以重復(fù)若干次，如上所述。然后棄去所排放的液體。
作為替代選擇，通過壓縮容器壁(例如混合碗40的基底)與帶開口的多孔性屏或膜(沒有顯示)之間的富集基質(zhì)，可以從富集基質(zhì)中排出液體抽吸物20，開口適合于允許抽吸物穿過其中，但是留下受容器壁壓縮的富集基質(zhì)。然后傾瀉已經(jīng)透過膜的液體抽吸物，在容器中留下被壓縮在容器壁與多孔性膜之間的富集基質(zhì)。優(yōu)選地，容器是在其出口上游裝有多孔性膜的注射器，容器壁是注射器活塞。在這種優(yōu)選的實(shí)施方式中，富集基質(zhì)的壓縮是這樣實(shí)現(xiàn)的，在注射器內(nèi)將基質(zhì)推向多孔性膜，由此通過出口逐出抽吸物，而將富集基質(zhì)留在注射器內(nèi)。
然后將富集基質(zhì)11與一定體積的凝集材料18混合，如圖4所示，并類似于上述第一種優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行該方法，得到可植入的復(fù)合骨髓移植材料8，它有效地誘導(dǎo)被移植者的骨愈合或骨再生。
可選地，上述每種優(yōu)選實(shí)施方式還可以有另外一個(gè)步驟。在可植入骨移植材料8的植入之前，可以在凝集前向移植材料8投放一定量的無抗凝處理的骨髓抽吸物(例如經(jīng)由排放)，例如移植材料8位于施用注射器50中。以這種方式，液體抽吸物將滲透移植材料8的空隙體積，最終在其中凝固。抽吸物必須在抽吸之后立即投放至移植材料8，以確保它長(zhǎng)時(shí)間保留液體足以有效滲透材料。該步驟向可植入移植材料8提供另外的源于骨髓的有核細(xì)胞(包括另外的祖代細(xì)胞)。
制備復(fù)合骨髓移植材料的本發(fā)明方法通常僅需不到60分鐘即可完成。因而，可以在骨髓供體/被移植者尚處于手術(shù)室時(shí)即可進(jìn)行本發(fā)明的方法。因此，利用本發(fā)明方法能夠減少被移植者為接受復(fù)合骨移植物而必須經(jīng)歷侵入性程序的場(chǎng)合的次數(shù)。
還提供了根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，以幫助外科醫(yī)生實(shí)施本發(fā)明的方法。參照?qǐng)D8，這樣一種試劑盒將優(yōu)選地能夠按照上述優(yōu)選實(shí)施方式之一實(shí)施該方法，并且優(yōu)選地包含至少下列經(jīng)過滅菌的器具，優(yōu)選地由塑料制成，優(yōu)選地是透明的或半透明的基質(zhì)容器(例如基質(zhì)柱子12)；至少一個(gè)端帽14，經(jīng)由已知的連接裝置可拆裝于基質(zhì)容器；端帽14上的端帽連接器31，用于與載入注射器實(shí)現(xiàn)流體連通；至少一個(gè)載入注射器28，具有注射器連接器30，用于與端帽14實(shí)現(xiàn)流體連通；混合碗40，帶有可除去的底蓋42；漏斗41，一端與混合碗40的開口端匹配，另一端與柱子12匹配；注射器轉(zhuǎn)接器13，用于從柱子12轉(zhuǎn)換至施用注射器；和刀具38。最優(yōu)選地，試劑盒進(jìn)一步包含第二載入注射器29和第二端帽14，構(gòu)造類似于上述。可選地，所提供的試劑盒帶有多孔的生物相容的植入底物，用作骨移植物基質(zhì)，和多孔性膜15，以保留基質(zhì)在基質(zhì)容器內(nèi)。可選地，本發(fā)明試劑盒可以另外包含肝素化骨髓抽吸注射器、抽吸針頭、另外的載入注射器或其他可用于骨移植領(lǐng)域的器具。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的各個(gè)方面。
實(shí)施例1有人已經(jīng)指出，具有富集基質(zhì)的骨移植材料表現(xiàn)比非富集移植物改進(jìn)了的性能(見美國(guó)專利No.5,824,084和6,049,026)。下列實(shí)驗(yàn)證明了聯(lián)合有富集基質(zhì)與抽吸骨髓凝塊(ABMC)的移植材料的其他功效。
對(duì)22只beagle犬實(shí)施脊髓后索融合術(shù)。在每只動(dòng)物中，在三個(gè)獨(dú)立的脊柱融合部位實(shí)施局灶性融合(L1-2，L3-4和L5-6)。使用松質(zhì)骨薄片作為基質(zhì)材料，制備三種類型的復(fù)合骨移植物。在11只犬中，使用去礦化的松質(zhì)骨薄片，而在其余11只犬中，使用礦化的松質(zhì)骨薄片。三種復(fù)合移植物是單獨(dú)的富集基質(zhì)、包括骨髓凝塊的非富集基質(zhì)和包括骨髓凝塊的富集基質(zhì)。將基質(zhì)材料與過量體積的抽吸物結(jié)合，如上所述實(shí)現(xiàn)富集。
使用接合得分作為初步結(jié)果參數(shù)，比較融合效果。利用CT掃描的定量分析，還評(píng)估了每個(gè)部位的骨體積，在每個(gè)部位進(jìn)行力學(xué)測(cè)試。表1和表2總結(jié)了每種復(fù)合材料在每只動(dòng)物和移植部位中分別關(guān)于礦化與去礦化基質(zhì)的接合得分。
表1每種復(fù)合材料在動(dòng)物和移植部位中關(guān)于礦化松質(zhì)骨基質(zhì)立方體的接合得分
表2每種復(fù)合材料在動(dòng)物和移植部位中關(guān)于去礦化松質(zhì)骨基質(zhì)立方體的接合得分
上述數(shù)據(jù)表明，向骨移植物基質(zhì)加入骨髓凝集材料顯著增強(qiáng)復(fù)合移植物的功效。在使用礦化的松質(zhì)骨基質(zhì)時(shí)，關(guān)于富集+ABMC組的接合得分是最大的(平均＝1.9)。此外，富集+ABMC組的接合得分顯著大于單獨(dú)的富集組(平均＝0.6，p＝0.008)。富集+ABMC組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也優(yōu)于單獨(dú)的ABMC組(平均＝1.2，p＝0.04)。這種程度的優(yōu)越性能是驚人的和意外的。關(guān)于三種復(fù)合材料富集組+ABMC組、單獨(dú)的ABMC組和單獨(dú)的富集組的總體接合率分別是11分之9(81％)、11分之7(63％)和11分之4(36％)。融合得分較高的融合部位聚集在富集+ABMC組。在富集+ABMC組中，11個(gè)融合部位有4個(gè)(36％)得分3.0或更高。相反，在單獨(dú)的富集組中11個(gè)部位只有1個(gè)(8.3％)、在單獨(dú)的ABMC組中11個(gè)部位只有2個(gè)(18％)得分近似。
在使用去礦化的松質(zhì)骨基質(zhì)時(shí)，關(guān)于富集+ABMC組的接合得分也是最高的。關(guān)于三種材料富集組+ABMC組、單獨(dú)的ABMC組和單獨(dú)的富集組的總體接合率分別是11分之7(63％)、11分之6(54％)和11分之5(45％)。融合得分更高的融合部位仍然聚集在富集+ABMC組。在富集+ABMC組中，11個(gè)融合部位有5個(gè)(45％)得分3.0或更高。相反，在單獨(dú)的富集組中11個(gè)融合部位只有2個(gè)(18％)、在單獨(dú)的ABMC組中11個(gè)融合部位只有3個(gè)(27％)得分在這個(gè)水平上。ABMC與富集骨基質(zhì)的結(jié)合提供了與富集骨基質(zhì)相比表現(xiàn)更加驚人和意外優(yōu)越的性能的骨移植物。
對(duì)全部樣本還進(jìn)行了力學(xué)測(cè)試。僅對(duì)骨接合產(chǎn)生有限屈服點(diǎn)的那些樣本計(jì)算了關(guān)于最大負(fù)載、變形失效和失效能的數(shù)據(jù)。下列表3和表4分別總結(jié)了關(guān)于去礦化與礦化樣本的力學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)。
測(cè)量了每個(gè)移植部位的強(qiáng)直度，將數(shù)據(jù)制表，得到關(guān)于礦化與去礦化骨基質(zhì)的三種類型移植物各自的平均與標(biāo)準(zhǔn)偏差值。關(guān)于礦化的骨基質(zhì)，單獨(dú)的富集、單獨(dú)的ABMC和富集+ABMC移植物分別表現(xiàn)6.9±2.4、7.9±2.3和8.2±4.2的強(qiáng)直度。關(guān)于去礦化的骨基質(zhì)，單獨(dú)的富集、單獨(dú)的ABMC和富集+ABMC移植物分別表現(xiàn)9.1±6.0、9.4±6.2和9.6±4.8的強(qiáng)直度。
關(guān)于每種復(fù)合移植物，都得到有關(guān)融合體積、融合面積和融合物內(nèi)平均骨密度的CT圖象分析數(shù)據(jù)。表3和表4分別總結(jié)了關(guān)于礦化與去礦化松質(zhì)骨基質(zhì)的數(shù)據(jù)。從表3和表4可以明顯看出，關(guān)于富集+ABMC組的融合體積和融合面積都是最大的。
表3使用礦化松質(zhì)骨基質(zhì)的每種細(xì)胞-基質(zhì)復(fù)合材料的CT數(shù)據(jù)單獨(dú)的富集單獨(dú)的ABMC富集+ABMC(n＝11)(n＝11) (n＝11)融合體積(mm3) 869±196 961±115 1006±185融合面積(mm2) 81±17 91±14 95±27骨密度 1848±62 1840±43 1824±66表4使用去礦化松質(zhì)骨基質(zhì)的每種細(xì)胞-基質(zhì)復(fù)合材料的CT數(shù)據(jù)單獨(dú)的富集單獨(dú)的ABMC富集+ABMC(n＝11)(n＝11) (n＝11)融合體積(mm3) 872±288 1010±2681115±406融合面積(mm2) 85±31 95±27 98±31骨密度 1901±35 1858±29 1854±77盡管上文所描述的發(fā)明實(shí)施方式構(gòu)成優(yōu)選的實(shí)施方式，不過應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)其進(jìn)行修飾而不背離如權(quán)利要求書所述發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合骨髓移植材料，包含多孔的生物相容性可植入基質(zhì)和凝集材料，所述復(fù)合骨髓移植材料具有富集了的祖代細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，所述祖代細(xì)胞包含結(jié)締組織祖代細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，所述祖代細(xì)胞包含干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的復(fù)合骨髓移植材料，所述干細(xì)胞包含多能性的干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述可植入基質(zhì)包含微粒性骨材料和纖維性骨材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述微粒性骨材料包含同種移植物松質(zhì)骨微粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述纖維性骨材料包含同種移植物去礦化密質(zhì)骨纖維。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述基質(zhì)包含選自下組的基質(zhì)材料陶瓷材料、生物玻璃、膠原、礦化骨、去礦化骨、透明質(zhì)酸和合成的生物聚合材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述凝集材料是從骨髓抽吸物衍生的骨髓凝塊。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述凝集材料是血液凝塊。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中所述凝集材料是選自下組的材料血小板凝膠、血小板濃縮物、纖維蛋白凝集材料和纖維蛋白膠。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中祖代細(xì)胞與全部源于骨髓的有核細(xì)胞之比為至少1∶20,000。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，所述可植入基質(zhì)與所述凝集材料在所述移植材料中的體積比為5∶1至1∶5。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，所述祖代細(xì)胞、所述凝集材料和所述基質(zhì)都基本上均勻地分布在所述復(fù)合骨髓移植材料中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，其中細(xì)胞粘連分子是與所述可植入基質(zhì)的表面結(jié)合的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，所述移植材料有效地誘導(dǎo)被移植者中的骨愈合。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合骨髓移植材料，所述移植材料有效地誘導(dǎo)被移植者中的骨再生。
18.制備復(fù)合骨髓移植材料的方法，包含下列步驟a)提供骨髓抽吸物；b)提供多孔的生物相容性可植入基質(zhì)；c)使所述骨髓抽吸物與所述基質(zhì)接觸，得到富集了的基質(zhì)；和d)機(jī)械混合所述富集基質(zhì)，得到復(fù)合骨髓移植材料，祖代細(xì)胞基本上均勻地分布在所述復(fù)合骨髓移植材料中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包含混合凝集材料與所述富集基質(zhì)的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述可植入基質(zhì)包含微粒性骨材料和纖維性骨材料。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述微粒性骨材料包含同種移植物松質(zhì)骨微粒，所述纖維性骨材料包含去礦化的密質(zhì)骨纖維。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述可植入基質(zhì)包含約1-25cc總體積的微粒性骨微粒和約25-1000mg干重的骨纖維。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，所述骨纖維的長(zhǎng)度為5mm-15cm。
24.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包含向所述富集基質(zhì)加入無抗凝處理的骨髓抽吸物的步驟。
25.用于復(fù)合骨髓移植材料制備的試劑盒，所述試劑盒包含基質(zhì)容器、第一端帽和第一載入注射器，所述第一端帽可拆裝于所述基質(zhì)容器，所述第一端帽和所述第一載入注射器適合于彼此連接，以在所述第一載入注射器與所述基質(zhì)容器之間實(shí)現(xiàn)流體互通。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含多孔的生物相容性可植入基質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含肝素化的抽吸注射器和抽吸針頭。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含注射器轉(zhuǎn)接器，適合于匹配所述基質(zhì)容器，以與之構(gòu)成施用注射器。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含帶有可除去的底蓋和漏斗的混合碗，所述漏斗適合于在其一端匹配所述混合碗的開口端，在其另一端匹配施用注射器。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含刀具，所述刀具在其一端具有活塞，所述活塞適合于裝填移植材料至所述基質(zhì)容器內(nèi)。
31.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含多孔膜，可有效保留基質(zhì)材料在所述容器內(nèi)。
32.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述基質(zhì)容器是基質(zhì)柱。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含第二載入注射器和第二端帽，所述第二端帽可拆裝于所述基質(zhì)容器，所述第二端帽和所述第二載入注射器適合于彼此連接，以在所述第二載入注射器與所述基質(zhì)容器之間實(shí)現(xiàn)流體互通。
全文摘要
提供了復(fù)合骨髓移植材料，它具有富集了的均勻分布的祖代細(xì)胞群。移植材料包括優(yōu)選從無抗凝處理的骨髓抽吸物衍生的凝集材料，它顯著提高移植物的功效。還提供了制備這類骨移植材料的方法。還提供了試劑盒，含有經(jīng)過滅菌的器具，可用于制備富集了的復(fù)合骨髓移植材料。
文檔編號(hào)A61L27/36GK1503683SQ02808675
公開日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者喬治·F·穆施勒, 喬治 F 穆施勒 申請(qǐng)人:克利夫蘭臨床基金會(huì)