專利名稱：從人多能干細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞系細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及胚胎細(xì)胞及其分化的細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。更具體說(shuō)，本發(fā)明采用特殊培養(yǎng)條件和篩選技術(shù)提供了可控制的人多能干細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞。
相關(guān)申請(qǐng)參考本申請(qǐng)要求2001年7月12日提交的美國(guó)前專利申請(qǐng)60/305,087和2001年9月10日提交的60/322695的優(yōu)先權(quán)。在美國(guó)和其它管轄范圍內(nèi)允許將此優(yōu)先權(quán)文件以及國(guó)際專利出版物WO 01/51616的全部?jī)?nèi)容納入本文參考文獻(xiàn)中。
背景心臟病是西方世界最受關(guān)注的嚴(yán)重疾病之一。據(jù)估計(jì)6100萬(wàn)美國(guó)人(幾乎每5位男性和女性有1人)患有1種或多種心血管疾病(全國(guó)健康和營(yíng)養(yǎng)研究調(diào)查III，1988-94，疾病控制中心和美國(guó)心臟病協(xié)會(huì))。廣泛散播的疾病包括冠心病(1240萬(wàn))、先天性心血管缺陷(100萬(wàn))和充血性心力衰竭(4700萬(wàn))。對(duì)于再生醫(yī)學(xué)研究的主要挑戰(zhàn)是開發(fā)能幫助在這些疾病中重建心臟功能的細(xì)胞組合物。
迄今已進(jìn)行的大多數(shù)研究工作采用嚙齒動(dòng)物模型開發(fā)的各種類型干細(xì)胞。
Maltsev、Wobus等(Mechauisms Dev.4441，1993)報(bào)道了小鼠的胚胎干細(xì)胞(ES)可通過(guò)胚胎樣聚集體體外分化為自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，Wobus等(Ann.N.Y.Acad.Sci，27460，1995)報(bào)道小鼠多能ES細(xì)胞復(fù)現(xiàn)了心肌細(xì)胞從未定型的胚胎細(xì)胞發(fā)育成為心肌(層)特有的細(xì)胞表型?？山臃N胎胚樣小體、培養(yǎng)、分離并用免疫熒光和電生理研究測(cè)定。據(jù)報(bào)道此細(xì)胞可表達(dá)心臟特異性基因和所有主要的心臟特異性離子通道。Wobus等(J.Mol.Cell.Cardiol.291525，1997)報(bào)道視黃酸可加速ES細(xì)胞的心臟分化并增加心室心肌細(xì)胞的發(fā)育。該研究所用細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)染后表達(dá)了在MLC-2V啟動(dòng)子控制下的β-半乳糖苷酶。
Kolossov等(J.Cell.Biol.1432045，1988)報(bào)道采用含有在心源性α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制下的綠熒光蛋白質(zhì)載體，分離得到小鼠ES細(xì)胞衍生的心前體細(xì)胞。膜片鉗(Patch clamp)和Ca++成象提示L型鈣通道的表達(dá)起始于胚胎樣小體發(fā)育的第7天。Narifa等(Development1223755，1996)報(bào)道GATA-4缺陷小鼠的ES細(xì)胞能分化成心肌細(xì)胞。在嵌合小鼠的心內(nèi)膜、心肌層和心外膜中發(fā)現(xiàn)了GATA-4缺陷性細(xì)胞。這些作者提出其它GATA蛋白質(zhì)可能補(bǔ)償GATA-4的缺乏。
美國(guó)專利6,015,671(Field)和Klug等(J.Clin.Invest.98216，1996)報(bào)道用基因工程方法從分化性小鼠ES細(xì)胞選出的心肌細(xì)胞形成了穩(wěn)定的心內(nèi)移植物。用α-心肌球蛋白重鏈(MHC)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)氨基葡糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶或neor，和用抗菌素G418篩選，從分化性小鼠ES細(xì)胞選出了這些細(xì)胞，將其移植入成年?duì)I養(yǎng)障礙性小鼠的心臟內(nèi)，據(jù)報(bào)告移植后長(zhǎng)達(dá)7周都發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的心肌細(xì)胞。國(guó)際專利出版物WO00/78119(Field等)提出一種通過(guò)增加細(xì)胞周期蛋白D2活性來(lái)提高心肌細(xì)胞增殖潛能的方法。
Doevendans等(J.Mol.Cell Cardiol.32839，2000)提出漂浮的胚胎樣小體中，心肌細(xì)胞的分化相當(dāng)于胚胎心肌細(xì)胞。嚙齒動(dòng)物干細(xì)胞產(chǎn)生的心肌細(xì)胞據(jù)報(bào)道可分化成為心室肌細(xì)胞并具有鈉鈣和鉀流。
Muller等(FASEB J.142540，2000)報(bào)道從用心室特異性2.1Kb肌球蛋白輕鏈2V啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子控制下的綠熒光蛋白轉(zhuǎn)染的小鼠ES細(xì)胞中，分離得到心室樣心肌細(xì)胞。電生理研究提示存在心室表型但無(wú)起搏點(diǎn)樣的心肌細(xì)胞。Gryschenko等(Pflugers Arch 439798，2000)研究了小鼠ES細(xì)胞產(chǎn)生的心肌細(xì)胞中的輸出電流。早期ES衍生心肌細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)再極化電流，是4-氨基吡啶敏感性短暫輸出電流。這些作者的結(jié)論是在早期心肌中，這些暫短的輸出電流在控制心電活動(dòng)中起著重要作用。
國(guó)際專利出版物WO 92/13066(Loyola大學(xué))報(bào)道從用致癌基因V-myc或V-ras進(jìn)行基因修飾的胎胚物質(zhì)，構(gòu)建了大鼠心肌細(xì)胞系。美國(guó)專利6,099,832和6,110,459(Mickle等，Geugyme)報(bào)道采用成年心肌細(xì)胞、兒童心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞的不同組合改進(jìn)了大鼠模型的心臟功能。美國(guó)專利5,919,449(Diacrin)報(bào)道采用豬心肌細(xì)胞治療異種個(gè)體的心功能不全，細(xì)胞獲自妊娠20-30天的豬胚。
Makino等(J.Clin.Invest.103697，1999)和K.Fukuda(Artificial Orgoms251978，2001)從中胚層干細(xì)胞產(chǎn)生了新生的心肌細(xì)胞進(jìn)行心血管組織工程改造，從骨髓基質(zhì)產(chǎn)生了心肌細(xì)胞系并培養(yǎng)了4個(gè)月以上。為了誘導(dǎo)細(xì)胞分化用5-氮脫氧胞嘧啶處理細(xì)胞24小時(shí)，引起30％的細(xì)胞形成肌管樣結(jié)構(gòu)，獲得心肌細(xì)胞標(biāo)志并開始搏動(dòng)。
大多數(shù)已建立的心肌細(xì)胞系獲自動(dòng)物組織，尚未建立可批準(zhǔn)廣泛用于人類心臟治療的心肌細(xì)胞系。
Liechty等(Nature Med 61282，2000)報(bào)道了人中胚層干細(xì)胞的移植，并證明綿羊子宮內(nèi)移植后發(fā)生了部位特異性分化。據(jù)報(bào)道移植后移植物長(zhǎng)期存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)13個(gè)月并如期望的發(fā)育成免疫活性。國(guó)際專利出版物WO 01/22978提出一種方法來(lái)改進(jìn)心力衰竭病人的心臟功能，該方法包括將自身骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植入心肌層產(chǎn)生新的肌纖維。
國(guó)際專利出版物WO 99/49105(Zymogenetics)提出分離人的非粘附多能心肌干細(xì)胞。懸浮此心肌細(xì)胞進(jìn)行密度梯度離心，培養(yǎng)并測(cè)定其心肌特異性標(biāo)志。經(jīng)過(guò)增殖和分化，所述細(xì)胞系產(chǎn)生的后代細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。
尚不清楚這些專利中例舉的細(xì)胞制品是否可以大量生產(chǎn)提供給市場(chǎng)作為再生心臟功能的治療性復(fù)合物。治療心臟病的新生細(xì)胞的一種更具前景的來(lái)源是獲自胚胎組織的人多能干細(xì)胞。
Thomson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)首先用恒河猴或狨猴作模型成功地培養(yǎng)出靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，他們隨后從人的胚泡產(chǎn)生了人的胚胎干(hES)細(xì)胞系(Science 828114，1998)Gearhart和同事從胚胎卵巢組織產(chǎn)生了人胚胎種系(hES)細(xì)胞系(Shambloot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998)國(guó)際專利出版物WO 00/70021提出分化的人胚胎樣細(xì)胞和從hES細(xì)胞產(chǎn)生它們的方法。國(guó)際專利出版物WO 01/53465概述了從hEG細(xì)胞制備胚胎樣小體衍生的細(xì)胞。
胚胎干細(xì)胞和胚胎種系細(xì)胞二者都能在體外增殖而不分化，它們保留著正常核型和分化產(chǎn)生各種成人類型細(xì)胞的能力。然而，已知道人多能干細(xì)胞的增殖和分化要遵循的規(guī)則比培養(yǎng)的嚙齒動(dòng)物干細(xì)胞發(fā)育所遵循的大不相同。
Geron公司開發(fā)了新穎的組織培養(yǎng)條件使得人的多能干細(xì)胞能在基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境中不斷增殖，參見(jiàn)澳大利亞專利AU729377和國(guó)際專利出版物WO01/51616。能在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)干細(xì)胞提供了一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)中用的細(xì)胞組合物不難按照人類治療所規(guī)定的要求來(lái)制備。
為了在人類健康和疾病的治療中發(fā)揮多能干細(xì)胞這種潛力、現(xiàn)在必須發(fā)展新的方案使這些細(xì)胞發(fā)育成為能治療重要組織類型的細(xì)胞群。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種能有效產(chǎn)生靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞的系統(tǒng)，這些靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞可從多能干細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞系細(xì)胞。
本發(fā)明一實(shí)施例是含有心肌細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞群，這些細(xì)胞具有本文所述的特殊性能。例如，它們可以是·晚期心肌細(xì)胞·能在體外增殖和能在體內(nèi)外分化成為具有上述特性之一細(xì)胞的心肌細(xì)胞前體細(xì)胞·能表達(dá)以下內(nèi)源性基因的一種或多種標(biāo)志心肌鈣蛋白I(cTnI)、和前房利鈉尿因子(ANF)·能表達(dá)本文所述的三種或多種其它表型標(biāo)志。
·能由靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞產(chǎn)生·具有與已建立的人胚胎干(hES)細(xì)胞系相同的基因組。
·表現(xiàn)出自發(fā)性的周期性收縮活性。
·表現(xiàn)出心肌細(xì)胞的其它特征，如離子通道或相應(yīng)的電生理學(xué)行為?？蓪⒈景l(fā)明的細(xì)胞群富集到約5％，約20％或約60％的細(xì)胞具有所述特征。如需要，這些細(xì)胞也可用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶作基因修飾，以擴(kuò)展復(fù)制能力，或表達(dá)生長(zhǎng)因子、向心因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
本發(fā)明的另一實(shí)施例是產(chǎn)生這類細(xì)胞群的方法，該方法包括在合適的生長(zhǎng)環(huán)境中使pPS細(xì)胞或其后代分化。在一示范性方法中將hES細(xì)胞培養(yǎng)在基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下。然后，其分化成為帶有一種或多種上述特征的心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞前體細(xì)胞。在某些情況下，此分化方法可能包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟在懸浮培養(yǎng)液中培養(yǎng)pPS細(xì)胞形成胚胎樣小體或細(xì)胞聚集物，在含有一種或多種向心因子的生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，將自發(fā)性收縮細(xì)胞與細(xì)胞群中的其它細(xì)胞分開或在含有一種或多種心肌細(xì)胞富集因子的生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。
本發(fā)明一實(shí)施例是一種篩選能影響心肌細(xì)胞的化合物的方法。此方法包括使該項(xiàng)化合物與本發(fā)明細(xì)胞群混合，然后測(cè)定該化合物所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。這可能包括檢查細(xì)胞的毒性、代謝變化或?qū)κ湛s活性的影響。
本發(fā)明又一實(shí)施例是輸送含有本發(fā)明細(xì)胞群裝置的藥物，目的是治療人體和動(dòng)物體，可將此細(xì)胞群制備成治療心肌疾病的藥物。本發(fā)明的另一實(shí)施例是重建或提供心臟組織收縮活性的方法，該方法包括使心臟組織與本發(fā)明的細(xì)胞群接觸，包括給予個(gè)體適當(dāng)劑型的本發(fā)明細(xì)胞群來(lái)治療個(gè)體的心臟病。
將從以下描述中了解本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案。本文所述的組合物、方法和技術(shù)對(duì)診斷、藥物篩選和治療應(yīng)用具有相當(dāng)好的前景。
附1顯示用免疫組化檢測(cè)人未分化胚胎干(hES)細(xì)胞的標(biāo)志表達(dá)。培養(yǎng)物按常規(guī)方法在小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上或含有胞外基質(zhì)Matrigel或?qū)诱尺B蛋白的條件培養(yǎng)液無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境中培養(yǎng)，生長(zhǎng)在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的hES細(xì)胞具有的表型標(biāo)志類似于生長(zhǎng)在原代小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的hES的表型標(biāo)志。
圖2是獲自pPS細(xì)胞的心肌細(xì)胞圖(上圖)和心肌細(xì)胞形成的動(dòng)力學(xué)圖(下圖)。實(shí)施例2提供了懸浮培養(yǎng)的hES細(xì)胞開始分化形成胚胎樣小體的說(shuō)明，懸浮培養(yǎng)4天后將胚胎樣小體轉(zhuǎn)移到明膠包被板上，分化第8天時(shí)可在培養(yǎng)物的不同區(qū)域觀察到自發(fā)性收縮，細(xì)胞再過(guò)一周數(shù)量增加至60％以上的細(xì)胞集團(tuán)含有收縮性細(xì)胞。
圖3顯示在分化自人胚胎干(hES)細(xì)胞的心肌細(xì)胞中檢測(cè)到的標(biāo)志。上圖顯示用免疫印染分析心肌鈣蛋白I(cTnI)標(biāo)志的結(jié)果。cTnI和GATA-4見(jiàn)於收縮性細(xì)胞中，但未見(jiàn)於不含收縮性細(xì)胞的其它孔中。下圖顯示發(fā)育過(guò)程中心肌球蛋白重鏈(αMHC)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。αMHC的表達(dá)至第8天很顯著，相應(yīng)于培養(yǎng)中收縮性細(xì)胞十分豐富的時(shí)間。
圖4顯示分離的和原肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白重鏈(MHC)、α-肌動(dòng)蛋白、結(jié)合蛋白、心肌鈣蛋白I(cTnI)和心肌鈣蛋白T(cTnT)染色陽(yáng)性的單細(xì)胞和細(xì)胞集落。單細(xì)胞和集落所有這些標(biāo)志染色陽(yáng)性?？捎^察到肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的條紋特征。
圖5顯示藥物對(duì)hES衍生的心肌細(xì)胞收縮活性的作用。L型鈣通道抑制劑鹽酸地爾硫卓以劑量依賴方式抵制了收縮活性。腎上腺素受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素、苯福林和克侖特羅(一種粘液溶解藥)具有變時(shí)性作用。
圖6顯示胞嘧啶類似物5-氮脫氧胞嘧啶作為心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的能力。將懸浮培養(yǎng)4天hES細(xì)胞形成的胚胎樣小體接種在明膠包被板上，于1-4天、4-6天或6-8天期間在培養(yǎng)液中加入5-氮脫氧胞嘧啶。此藥在hES細(xì)胞良好進(jìn)行分化后最有效。
圖7評(píng)價(jià)了潛在的向心因子提高細(xì)胞群中心肌細(xì)胞系細(xì)胞比率的能力，在胚胎樣小體形成期間加入活化素和某些生長(zhǎng)因子(組I)，其它生長(zhǎng)因子(組II)和在接種于明膠上后加入5-氮脫氧胞嘧啶，以及分化期后加入其它因子(組III)，以三種濃度測(cè)試了諸組合的作用，低濃度生長(zhǎng)因子聯(lián)合5-氮脫氧胞嘧啶最有效。
圖8(A)和8(B)顯示通過(guò)單獨(dú)調(diào)整各細(xì)胞因子組進(jìn)一步精心安排實(shí)驗(yàn)方案。當(dāng)采用低水平的組I和組2諸因子，然后用5-氮脫氧胞嘧啶處理時(shí)，最大量地產(chǎn)生了心肌細(xì)胞特征性α-MHC標(biāo)志。在這些條件下早期心肌細(xì)胞相關(guān)基因GATA-4的表達(dá)也得到提高。與內(nèi)胚層相關(guān)基因HNF36(其用任何生長(zhǎng)因子組合均增加，但用5-氮脫氧胞嘧啶不增加)相比，對(duì)α-MHC和GATA-4的作用是篩選性的。
圖9顯示以含有肌酸、肉堿和牛磺酸(CCT)的培養(yǎng)液培養(yǎng)含心肌細(xì)胞的細(xì)胞群1-2周實(shí)現(xiàn)了富集。每條線代表在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程一孔中見(jiàn)到的搏動(dòng)區(qū)。與用標(biāo)準(zhǔn)分化培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞相比，CCT培養(yǎng)液使培養(yǎng)物中的搏動(dòng)區(qū)數(shù)目增加了大約4倍。


圖10顯示在不連續(xù)性PercoIITM梯度上分離hES細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞群的效果，組分I在上層界面，組分II在40.5％層，組分III在下層界面，組分IV-在58.5％層，如實(shí)時(shí)RT-PCR分析所測(cè)定、心肌細(xì)胞標(biāo)志α-肌球蛋白重鏈的表達(dá)在較高密度組分中最高。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種制備和特征鑒定靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞的系統(tǒng)。
在開發(fā)獲得靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞系的大量富集細(xì)胞群路途中有許多障礙需要克服。一些障礙是由于靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干細(xì)胞相當(dāng)脆弱，培養(yǎng)困難和它們對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中存在的各種因素異常敏感和依賴。其它障礙是需要了解祖代心肌細(xì)胞的終末分化要求存在內(nèi)臟、胚胎內(nèi)胚層和胚線(Arai等Dynamucs 210344，1997)。為了使pPS細(xì)胞體外分化為祖代心細(xì)胞，必須模擬或代替所有發(fā)生在發(fā)育胚胎中這類細(xì)胞天然個(gè)體發(fā)育中的活動(dòng)。
盡管有這些障礙，但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可從pPS培養(yǎng)物中相對(duì)富含表達(dá)心肌細(xì)胞特征的細(xì)胞獲得這種細(xì)胞群。圖4顯示原肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白重鏈(MHC)、α-肌動(dòng)蛋白、結(jié)合蛋白、心肌鈣蛋白I(cTnI)和心肌鈣蛋白T(cTnT)染色陽(yáng)性的單個(gè)細(xì)胞，并顯示了肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的條紋特征。這些細(xì)胞在組織培養(yǎng)中有自發(fā)性的周期性收縮。圖5顯示其收縮活性受到L型鈣通道抑制劑鹽酸地爾琉卓的抑制，并在對(duì)腎上腺素受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素和苯福林的反應(yīng)中增強(qiáng)。
應(yīng)明白制備人多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的途徑不同于先前報(bào)道的制備小鼠心肌細(xì)胞的許多途徑。首先，未分化期的人pPS細(xì)胞增殖和準(zhǔn)備進(jìn)行心肌細(xì)胞的分化需要不同的培養(yǎng)系統(tǒng)，小鼠胚胎干細(xì)胞可簡(jiǎn)單地在培養(yǎng)液中加入白血病抑制因子(LIF)而增殖但不分化。而LIF本身不足以防止人ES細(xì)胞分化，人ES常規(guī)在原代胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上增殖(Thomson等同上)。另外，能使小鼠干細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞的因子如視黃酸(Wobus等J.Mol.Cardiol.291525，1997)和DMSO(McBurney等，Nature 299165，1982)當(dāng)在相似條件下用于人干細(xì)胞時(shí)效果差得多。
本發(fā)明通過(guò)提供一種新的可高度富集所需心肌細(xì)胞系細(xì)胞群的系統(tǒng)、解決了從人多能干細(xì)胞制備重要細(xì)胞的問(wèn)題。該系統(tǒng)不難使其自身按商品化規(guī)模實(shí)施?？捎糜谔岣咝募〖?xì)胞產(chǎn)生的方法包括1、將未分化的pPS細(xì)胞置于可啟動(dòng)分化過(guò)程的培養(yǎng)條件下形成胚胎樣小體或直接分化。
2、在據(jù)信有助于驅(qū)使pPS細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞系的一種或多種向心因子存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
3、通過(guò)密度離心或其它合適的分離方法使心肌細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。
4、在據(jù)信能有助于所需類型細(xì)胞優(yōu)先生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞富集因子存在下，培養(yǎng)含心肌細(xì)胞系的細(xì)胞群。
本文所述的這些和其它步驟可單獨(dú)應(yīng)用或有效組合應(yīng)用，如實(shí)施例9所述，這些組合方法只有幾種提供了含心肌細(xì)胞系69％以上的新的細(xì)胞群，根據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的細(xì)胞的顯著均一性和功能特性使得這些細(xì)胞對(duì)于開發(fā)新的治療藥物極有價(jià)值和可作為體外研究心臟組織的一種工具。
定義本發(fā)明的技術(shù)和組合物涉及pPS衍生的心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在本文后敘章節(jié)中提供了心肌細(xì)胞的表型特征。對(duì)于心肌細(xì)胞的前體細(xì)胞的定義沒(méi)有具體的特征，但已知道在個(gè)體發(fā)生的正常過(guò)程中未分化的pPS細(xì)胞先分化為中胚層細(xì)胞，然后經(jīng)各種前體細(xì)胞期分化為功能性(末期)心肌細(xì)胞。
因此對(duì)于本文的目的，將心肌細(xì)胞的前體細(xì)胞定義為一種能(不經(jīng)去分化或重新編程)產(chǎn)生子代細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞)和表達(dá)下列至少一種標(biāo)志(優(yōu)選至少3或5種標(biāo)志)的細(xì)胞心肌鈣蛋白I(cTnI)、心肌鈣蛋白T(cTnT)、肌原纖維節(jié)肌球蛋白重鏈(MHC)、GATA-4、NKx2.5、N-鈣粘著蛋白、β1-腎上腺素受體(β1-AR)、ANF、轉(zhuǎn)錄因子MEF-2家族，肌酸激酶MB(CK-MB)、肌球蛋白或前房利尿鈉因子(ANF)。
可將以上本文所述的技術(shù)和稱為“心肌細(xì)胞”或“心肌細(xì)胞前體細(xì)胞”的組合物同等地應(yīng)用于心肌細(xì)胞個(gè)體發(fā)生任何階段的細(xì)胞而無(wú)限制，除非另有說(shuō)明。這類細(xì)胞可以具有或不具有增殖能力或顯示收縮性活力。
本發(fā)明的某些細(xì)胞顯示自發(fā)性的周期性收縮活性，這意味它在適當(dāng)?shù)慕M織培養(yǎng)環(huán)境和適當(dāng)?shù)腃a++濃度和電解質(zhì)平衡中培養(yǎng)時(shí)，可觀察到細(xì)胞以周期方式沿細(xì)胞一條軸橫向收縮，然后放松，而不需要在培養(yǎng)液中加入任何其它成分。
原型“靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干細(xì)胞”(pPS細(xì)胞)是衍生自任何類型胚胎組織(胚胎或前胚胎組織)的多能細(xì)胞，具有在適當(dāng)條件下產(chǎn)生不同類型(所有三種胚層內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)后代細(xì)胞的能力特征，按照該領(lǐng)域所接受的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，如在8-12同齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或在組織培養(yǎng)中形成所有三種胚層的能力可鑒定此細(xì)胞。
pPS定義包括各種類型的胚胎樣細(xì)胞，例如Thomson等(Science 2821145，1998)所述的人胚胎干(hES)細(xì)胞；其它靈長(zhǎng)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞如恒河猴干細(xì)胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)、狨猴干細(xì)胞(Thomson等，Biol.Reprod.55254，1996)和人胚種系(hEG)細(xì)胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998)。這些類型的細(xì)胞可以用已建立的細(xì)胞系形式提供，或可直接從原代胚胎組織獲得并立即用于分化。其它類型的多能細(xì)胞也包括在此術(shù)語(yǔ)中，任何靈長(zhǎng)動(dòng)物起源能產(chǎn)所有三種胚層后代的細(xì)胞都包括在內(nèi)，不論它們是否衍生自胚胎樣組織、胚胎組織或其它來(lái)源。pPS細(xì)胞不能衍生自惡性腫瘤來(lái)源并要求(但不總是需要)這類細(xì)胞核型正常。
當(dāng)細(xì)胞群中高比例的干細(xì)胞質(zhì)其衍生細(xì)胞顯示未分化細(xì)胞的形態(tài)特征時(shí)，pPS細(xì)胞培養(yǎng)物描述為“未分化的”，使它們可與胚胎或成年來(lái)源的分化細(xì)胞明確相鑒別。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難識(shí)別未分化的pPS細(xì)胞，其在兩維顯微鏡視野中通常顯現(xiàn)為細(xì)胞集落，具有核/胞質(zhì)高比例和突出的核仁。已知細(xì)胞群中未分化細(xì)胞的集落常常圍繞分化的毗鄰細(xì)胞。
在細(xì)胞個(gè)體發(fā)生過(guò)程中，形容詞“分化的”是一種相對(duì)術(shù)語(yǔ)，“分化的細(xì)胞”是一種進(jìn)展到相比較該細(xì)胞發(fā)育通路更下游的細(xì)胞。因此。多能胚胎樣干細(xì)胞可分化為種系限制的前體細(xì)胞(如中胚層干細(xì)胞)，后者進(jìn)而可分化為發(fā)育通路更下游的其它類型前體細(xì)胞(如心肌細(xì)胞前體細(xì)胞)，然后發(fā)育成終末期分化細(xì)胞，在某些類型組織中起著特殊作用并可能保留或不保留進(jìn)一步增殖的能力。
術(shù)語(yǔ)“飼養(yǎng)細(xì)胞”或“飼養(yǎng)者”用于描述一種細(xì)胞類型，當(dāng)其與另一類型的細(xì)胞一起培育時(shí)，能提供第二種類型細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。如果pPS細(xì)胞分離后不在其中加入新鮮的飼養(yǎng)細(xì)胞以支持其生長(zhǎng)，而pPS細(xì)胞已生長(zhǎng)了至少一輪，就說(shuō)pPS細(xì)胞群“基本上無(wú)”飼養(yǎng)細(xì)胞。應(yīng)認(rèn)識(shí)到如果采用先前含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物作為pPS的來(lái)源進(jìn)行新的不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)，將會(huì)有一些飼養(yǎng)細(xì)胞存活于傳代物中，當(dāng)存在的存活飼養(yǎng)細(xì)胞低于5％時(shí)，該培養(yǎng)物即為基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞。更優(yōu)選含有不到1％、0.2％、0.05％或0.01％飼養(yǎng)細(xì)胞(以培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)的百分率表示)的組合物。當(dāng)同一培養(yǎng)物中的一種細(xì)胞系分化成為多種類型細(xì)胞時(shí)，應(yīng)認(rèn)為這些不同類型的細(xì)胞彼此起著本定義含義中的飼養(yǎng)細(xì)胞作用，即使它們可能以支持方式相互作用。
“生長(zhǎng)環(huán)境”是感興趣細(xì)胞能在其中體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。此環(huán)境的特征包括培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可存在生長(zhǎng)因子或分化誘導(dǎo)因子，以及支持結(jié)構(gòu)(如固相表面上的基質(zhì))。
當(dāng)通過(guò)適當(dāng)?shù)娜斯げ僮鞣椒▽⒁欢嗪塑账徂D(zhuǎn)移到某細(xì)胞內(nèi)，或當(dāng)某細(xì)胞是先前已改造而繼承了該多核苷酸的細(xì)胞的后代，就說(shuō)該細(xì)胞是基因修飾的細(xì)胞。所述多核苷酸常含有編碼某蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄序列，使該細(xì)胞表達(dá)升高水平的該蛋白質(zhì)，如果修飾細(xì)胞的后代具有相同的(基因)變化就說(shuō)這種基因修飾是可遺傳繼承的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指多克隆和單克隆抗體。該術(shù)語(yǔ)的范圍謹(jǐn)慎地不僅包括整個(gè)免疫球蛋白分子，而且包括免疫球蛋白分子的片段和衍生物(如單鏈FV結(jié)構(gòu)、雙抗體和融合結(jié)構(gòu))、可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備并保留了所需的抗體結(jié)合特異性通用技術(shù)為了進(jìn)一步詳細(xì)闡述實(shí)施本發(fā)明所用的通用技術(shù)，醫(yī)生可參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)的教課書和回顧細(xì)胞生物學(xué)、組織培養(yǎng)、胚胎學(xué)和心臟生理學(xué)。
關(guān)于組織培養(yǎng)和胚胎干細(xì)胞，讀者可能希望參考“畸胎瘤和胚胎干細(xì)胞實(shí)施方法(Teratocarcinomas and embryonic stem cellsA practical approach)”(E.J.Robertson編，LPL Press Ltd，1987)；“小鼠開發(fā)技術(shù)指南(Guide toTechniques in Mouse Development)”(P.M.Wasserman等編，Academic Press，1993)；“胚胎干細(xì)胞的體外分化(Embryonic Stem Cell Differentiation inVitro)”(M.V.Wiles，Meth.Engymol.225900，1993)；“胚胎干細(xì)胞的特性和應(yīng)用在人類生物和基因治療中的應(yīng)用前景(Properties and uses of Embryonic StemCellsProspects for Application to Humcn.Biology and Gene Therapy)”(P.D.Rathjen等，Repord.Fortil.Dev.1031，1998)。關(guān)于心臟細(xì)胞培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括“培養(yǎng)物中的心臟細(xì)胞(The Heart Cell in Cluture)”(A.Pinson編，CRC Press 1987)，“分離的成人心肌細(xì)胞(Isolated Adult Cardiomyocytes)”(第I和II卷，Piper & Isenberg編，CRC Press，1989)，“心臟發(fā)展(HeartDevelopment)”(Harvey&Rosenthal，Academic Press 1998)，“我把我的心臟留在了舊金山(I Left my Heart in San Francisco)”(T.Bennet，Sony Records，1990)和“隨Wnt而去(Gone with the Wnt)”(M.Mitchell，Scribner 1996)。
分子和細(xì)胞生物學(xué)通用方法可在以下標(biāo)準(zhǔn)教課書中找到“分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)”第三版(Sambrook等，HarborLaboratory Press2001)；“分子生物學(xué)短方案(Short Protocols in MolecularBiology)”第4版(Ausubel等編，John Wiley&Sons 1999)；“蛋白質(zhì)方法(ProteinMethods)”(Bollag等，John Wiley & Sons 1996)；“基因治療的非病毒載體(Nonviral Vectors for Gene Therapy)”(Wagner等編，Academic Press 1999)；“病毒載體(Viral Vectors)”(Kaplitt和Loewy編，Academic Press，1995)；“免疫方法手冊(cè)(Immunology Methods Manual)”(I.Lefkovits編，Academic Press，1997)和“細(xì)胞和組織培養(yǎng)生物技術(shù)中的試驗(yàn)方法(Cell and Tissue ClutureLaboratory Procedures in Biotechnolgy)”(Doyle & Griffiths，John Wiley &Sons 1998)。本文所述的基因操作的試劑、克隆載體和試劑盒可從商品供貨商如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和Clon Tech獲得。
干細(xì)胞來(lái)源實(shí)施本發(fā)明可采用各種類型的多能干細(xì)胞，特別是由胚胎組織衍生的具有產(chǎn)生所有上述三種胚層后代能力的干細(xì)胞。
用作現(xiàn)存細(xì)胞系或已建立的細(xì)胞系的例子是靈長(zhǎng)動(dòng)物(包括人)原代胚胎組織的胚胎干細(xì)胞和胚胎種系細(xì)胞。
胚胎干細(xì)胞已從靈長(zhǎng)動(dòng)物諸成員的胚泡中分離到胚胎干細(xì)胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)?？刹捎肨homson等(美國(guó)專利5,483,780，Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133，1998)和Reubinoff等Nature Biotech.18399，2000所述的技術(shù)從人胚泡制備人胚胎干(hES)細(xì)胞。
簡(jiǎn)言之，從預(yù)先植入體內(nèi)的人胚胎獲得人胚泡，或者可采用體外受孕(1VF)胚胎，或使單細(xì)胞人胚胎擴(kuò)增至胚泡期(Bongso等，Hum Reprod 4706，1989)在G1.1和G2.2培養(yǎng)其中培養(yǎng)胚胎至胚泡期(Gardner等Fertil Steril 6984，1998)通過(guò)簡(jiǎn)單接觸鏈霉蛋白酶(sigma)取出已發(fā)育的胚泡的透明帶。通過(guò)免疫外科方法使胚泡接觸1∶50稀釋的兔抗人脾細(xì)胞抗血清30分鐘。然后用DMEM洗5分鐘三次，接觸1∶5稀釋的豚鼠補(bǔ)體(Gibco)(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 725099，1975)。用DMEM再洗滌二次后，通過(guò)輕微吹打從完整的內(nèi)部細(xì)胞塊(1CM)取出溶解的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，將1CM接種在mEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上。
9-15天后通過(guò)接觸含1mMEDTA的無(wú)鈣鎂磷酸緩沖鹽水(PBS)，再接觸分解酶或胰蛋白酶或用顯微鏡移液吸管機(jī)械分離，將內(nèi)部細(xì)胞塊產(chǎn)生的長(zhǎng)出物分離成小塊，然后再接種在新鮮培養(yǎng)中的nEF上。用顯微移液吸管單個(gè)選出具有未分化形態(tài)的生長(zhǎng)集落，以機(jī)械方法分離成小塊并再接種。ES樣形態(tài)的特征是具有明顯高的核/胞質(zhì)比率和突出核仁的致密集落。然后，通過(guò)簡(jiǎn)單的胰蛋白酶處理接觸DulbeccoPBS(含苞欲放2mMEDTA)，接觸1V型膠原酶(約200U/ml，Gibco)或用顯微移液吸管挑選單個(gè)集落常規(guī)分裂產(chǎn)生的ES細(xì)胞。小塊的大小約為50-100細(xì)胞最佳。
胚胎種系細(xì)胞可從末次月經(jīng)期后約8-11周取得的人胚胎材料中存在的原始種系細(xì)胞制備人胚胎種系(hEG)細(xì)胞。合適的制備方法在Shambloff等Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和美國(guó)專利中6,090,622中有所描述。
簡(jiǎn)言之，用等滲緩沖液淋洗生殖嵴，然后放在0.1mL 0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDT鈉液(BRL)中，切成＜1mm3厚片。然后通過(guò)100μl的移液頭吹打該組織進(jìn)一步解聚細(xì)胞。37℃培育5分鐘后，加入3.5mlEG生長(zhǎng)培養(yǎng)液。EG生長(zhǎng)培養(yǎng)液是DMEM，含4500mg/L的D-葡萄糖、2200mg/L NaHC0315％ES合格的胎牛血清(BRL)，2MM谷氨酰胺(BRL)，1MM丙酮酸鈉(BRL)、1000-2000U/ml人重組白血病抑制因子(LIF，Gengyme)、1-2ng/ml人重組bFGF(Gengyme)和10μM毛喉素(用10％DMSO配)。另一方法中，用透明質(zhì)酸酶/膠原酶/DNA酶分離EG細(xì)胞。從胚胎材料中解剖得到性原基或生殖嵴和腸素膜。用PBS淋洗生殖嵴，然后，放置在0.1mlHCD消化液(0.01％透明質(zhì)酸酶V型、0.002％DNA酶1、0.1％膠原酶IV型，所有購(gòu)自Sigma，配制在EG生長(zhǎng)培養(yǎng)液中)。切碎組織37℃培育1小時(shí)或過(guò)夜，重懸于1-3mlEG生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，接種到飼養(yǎng)細(xì)胞層上。
在不含LIF、bFGF或毛喉素的改良EG生長(zhǎng)培養(yǎng)其中培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞(如STO細(xì)胞、ATCC No.CRL 1503)3天至接近鋪滿，然后用5000拉德γ射線滅活，準(zhǔn)備好96孔培養(yǎng)板。各孔中加入約0.2ml的原代胚芽細(xì)胞(PGC)懸液。將EG生長(zhǎng)培養(yǎng)液中7-10天后長(zhǎng)出的第一代從各孔轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)皿(也預(yù)先含有照射過(guò)的STO小鼠成纖維細(xì)胞)的各孔中，培養(yǎng)細(xì)胞每日更換培養(yǎng)液直到細(xì)胞形態(tài)與ES細(xì)胞所見(jiàn)到的相一致，通常需7-30天或1-4代后。
增殖非分化期的pPS細(xì)胞采用促進(jìn)增殖但不促進(jìn)分化的培養(yǎng)條件可連續(xù)培養(yǎng)增殖pPS細(xì)胞，示范性的含血清ES培養(yǎng)液用80％DMEM(如敲除的DMEM、Gibco)。20％胎牛血清(FBS，Hyclone)或血清替代品(WO 98/30679)、1％非必須氨基酸、1mML谷氨酰胺和0.1mMβ-琉基乙醇制備。應(yīng)用前刻加入4-8ng/ml的人bFGF(WO 99/20741 Geron Corp)常規(guī)將ES細(xì)胞培養(yǎng)在一層飼養(yǎng)細(xì)胞上，通常為胚胎樣或胚胎組織衍生的成纖維細(xì)胞上。采集妊娠13天的CF1小鼠的胚胎，轉(zhuǎn)移到2ml胰蛋白酶/EDTA中。細(xì)細(xì)切碎，37℃培育5分鐘，加入1％FBS使碎片沉降，細(xì)胞在90％DMEH、10％FBS和2mM谷氨酰胺液中增殖。為了準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞層，照射細(xì)胞以抑制增殖，但允許合成支持ES細(xì)胞的因子(約4000拉德γ射線)。培養(yǎng)板用0.5％明膠包被過(guò)夜，每孔接種37.5萬(wàn)個(gè)照射過(guò)的mEF細(xì)胞，接種后可用5小時(shí)至4天。接種pPS細(xì)胞前刻換上新鮮的hES培養(yǎng)液。
Geran公司開發(fā)了新的組織培養(yǎng)環(huán)境能夠在基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境中連續(xù)增殖多能干細(xì)胞，參見(jiàn)澳大利亞專利AU729377和國(guó)際專利出版物WO 01/51616。可在飼養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液或添加了如FGF和SCF等生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液中胞外基質(zhì)Matrigel或?qū)诱尺B蛋白上培養(yǎng)干細(xì)胞。能夠在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境中培養(yǎng)干細(xì)胞提供了可容易地制備遵守人類治療規(guī)范要求的細(xì)胞組合物的一種系統(tǒng)，為了實(shí)行比項(xiàng)應(yīng)用，將美國(guó)要求國(guó)際專利出版物WO 01/51616的優(yōu)先權(quán)的任何申請(qǐng)全部?jī)?nèi)容納入本文參考。
無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境包括適合的培養(yǎng)基質(zhì)，具體是例如Matrigel或?qū)诱尺B蛋白等胞外基質(zhì)。pPS細(xì)胞接種量＞15.000細(xì)胞/cm2(最佳90.000-17.000/cm2)。通常酶消化至細(xì)胞完全分散(用膠原酶IV大約5-20分鐘)。然后，將大約10-2000個(gè)細(xì)胞的小塊直接接種到基質(zhì)上無(wú)須再分散，用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液(通常為培養(yǎng)照射過(guò)的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、端粒酶處理的小鼠成纖維細(xì)胞或pPS細(xì)胞衍生的成纖維樣細(xì)胞新產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液)來(lái)支持無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，可在無(wú)血清培養(yǎng)液如添加了20％血清代用品和4ng/mlbFGF的KO DMEM中，以約5-6×104/cm2密度接種飼養(yǎng)細(xì)胞使培養(yǎng)液條件化。將經(jīng)24小時(shí)條件化的培養(yǎng)液以0.2μM濾膜過(guò)濾，再加入8ng/ml bFGF用于支持pPS細(xì)胞培養(yǎng)1-2天。
顯微鏡下，ES細(xì)胞呈現(xiàn)高的核/胞質(zhì)比率，核仁突出和由不易辨認(rèn)的細(xì)胞連接形成的致密集落。靈長(zhǎng)動(dòng)物ES細(xì)胞可表達(dá)一種或多種階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4，和用命名為抗Tra-1-60和Tra-1-81的抗體可檢測(cè)的標(biāo)志(Thomson等，Science 2821145，1998)。未分化hES細(xì)胞還通常表達(dá)Oct-4和TERT(可用RT-PCR檢測(cè))和堿性磷酸酶活性(用酶試驗(yàn)檢測(cè))。hES細(xì)胞的體外分化通常導(dǎo)致這些標(biāo)志喪失(如果存在)和SSEA-1表達(dá)增加。
制備心肌細(xì)胞的程序本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)在能富集具有所需表型細(xì)胞的特殊生長(zhǎng)環(huán)境(或者使所需細(xì)胞生長(zhǎng)或者抑制殺傷其它類型細(xì)胞)中培養(yǎng)干細(xì)胞或使其分化來(lái)獲得。這些方法可用于許多類型的干細(xì)胞特別是以上章節(jié)中所述的靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞。
通常通過(guò)形成胚胎樣小體或聚集物來(lái)啟動(dòng)分化，例如通過(guò)供者pPS細(xì)胞培養(yǎng)物的過(guò)度生長(zhǎng)或在含有低粘附性能基質(zhì)的培養(yǎng)瓶中(得以形成EB)懸浮培養(yǎng)pPS細(xì)胞。以膠原酶簡(jiǎn)單消化，收獲pPS細(xì)胞，分解成小塊，接種在非粘附性細(xì)胞培養(yǎng)板中，每隔數(shù)日飼喂聚集物，適當(dāng)時(shí)間(常為4-8天)后收獲。將收獲的聚集物接種在固體基質(zhì)上培養(yǎng)一段時(shí)間，使聚集物中的細(xì)胞采取心肌細(xì)胞表型。一般講分化總時(shí)間至少8天，可能至少10或12天。
另外，可按分化方案培養(yǎng)細(xì)胞啟動(dòng)分化過(guò)程。能誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化成為異質(zhì)性細(xì)胞群的條件，包括加入視黃酸(RA)或二甲基亞砜(DMSO)到培養(yǎng)其中或?qū)⒓?xì)胞從培養(yǎng)它們的常用胞外基質(zhì)中撤出。見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)60/312,740和國(guó)際專利出版物WO 01/51616。然而，要小心，因?yàn)槟承┣闆r下這些制劑可降低所獲得的心肌細(xì)胞比率(實(shí)施例6)。
在某些情況下，在培養(yǎng)其中加入一種或多種“向心因子”有益。這些簡(jiǎn)單的因子可單獨(dú)或聯(lián)合增強(qiáng)心肌細(xì)胞類型細(xì)胞的增殖或存活，或抑制其它類型細(xì)胞生長(zhǎng)。此作用可能是由于直接作用于心肌細(xì)胞本身或由于作用于另一類型細(xì)胞進(jìn)而有利于心肌細(xì)胞形成。例如誘導(dǎo)外胚層或內(nèi)胚層等同細(xì)胞形成的因子，或引起這些細(xì)胞產(chǎn)生其自身心肌增強(qiáng)元件的因子，所有均包括在向心因子的定義內(nèi)。
認(rèn)為能誘導(dǎo)pPS細(xì)胞分化為中胚層細(xì)胞或促進(jìn)進(jìn)一步分化為心肌細(xì)胞系細(xì)胞的因子包括如下
·能影響DNA甲基化和改變心肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的核苷類似物。
·TGF-β配體(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和下述TGF-β超家族其它成員)，這些配體能結(jié)合TGF-β受體，激活I(lǐng)型和II型絲氨酸激酶并引起Smad效應(yīng)器磷酸化。
·形態(tài)發(fā)生素如活化素A和活化素B(TGF-β超家族的成員)·胰島素樣生長(zhǎng)因子(例如1GF11)·骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(TGF-β超家族的成員、以BMP-2和BMP-4為例)·成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(以bFGF、FGF-4和FGF-8為例)和能激活胞液激酶和有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的其它配體。
·血小板衍生生長(zhǎng)因子(以PDGFβ為例)·利尿鈉因子，如前房利尿鈉因子(ANF)，腦利尿鈉肽(BNP)·相關(guān)因子例如胰島素，白血病抑制因子(LIF)上皮生長(zhǎng)因子(EGF)TGFα和Oripto基因的產(chǎn)物。
·對(duì)相同受體有激動(dòng)活性的特異性抗體或者可將所述細(xì)胞與分泌促進(jìn)心肌細(xì)胞分化因子的細(xì)胞(如各種類型的內(nèi)皮細(xì)胞)一起培育。
如實(shí)施例6所述，可有效采用能影響DNA甲基化(從而影響基因表達(dá))的核苷類似物來(lái)提高初步分化出現(xiàn)的心肌細(xì)胞系細(xì)胞的比率，例如，已發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)其中加入5-氮脫氧胞嘧啶增加了細(xì)胞群中收縮性細(xì)胞的頻率和心肌αMHC的表達(dá)。在某些情況下僅通過(guò)此步驟富集，可增加細(xì)胞群的收縮性細(xì)胞約1％至3％以上。
向心制劑的評(píng)價(jià)進(jìn)一步見(jiàn)實(shí)施例7所述。向心制劑特別有效的組合包括采用形態(tài)發(fā)生素如活化素A和多種生長(zhǎng)因子、例如在投入早期加入TGF-β和IGF家族的生長(zhǎng)因子?？扇芜x地添加其它向心素，例如一種或多種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)和血小板衍生生長(zhǎng)因子。
在精心思考本發(fā)明時(shí)，發(fā)現(xiàn)在體外分化末期刪除胰島素樣生長(zhǎng)因子11(1GF11)和相關(guān)分子事實(shí)上能提高心肌基因的表達(dá)水平。在無(wú)關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)1GF11可減少成纖維細(xì)胞的GSD3β水平(Scalia等，J.Cell.Bilchem.82610，2001)。IGF11可能加強(qiáng)培養(yǎng)液中存在的或細(xì)胞分泌的Wnt蛋白質(zhì)的作用，Wnt蛋白質(zhì)能正常穩(wěn)定胞質(zhì)分子β-連環(huán)蛋白(其含有轉(zhuǎn)錄因子TCF的一部分)并引起其核轉(zhuǎn)位。這樣就改變了多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性。缺乏Wnt時(shí)，激酶GSK3β磷酸化β-連環(huán)蛋白使其不穩(wěn)定并將其保持在胞質(zhì)中。
由于Wnt激活劑像IL-11那樣明顯限制了心肌細(xì)胞的分化，據(jù)信用Wnt拮抗劑培養(yǎng)可提高h(yuǎn)ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的程序或比率。注射編碼DKK-1或Crescent(分泌蛋白，可結(jié)合和滅活Wnt)的合成性mRNA(Schneider等，Gene Dev.15304，2001)，或用編碼DKK-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Marvin等，Genes Dev 15316，2001)，可抑制Wnt的信號(hào)傳遞?；蛘咛岣呒っ窯SK3β的活性，例如將細(xì)胞與IL-6或糖皮質(zhì)激素一起培育可抑制Wnt通路。
當(dāng)然，在本發(fā)明的分化方案中采用向心因子不一定總是需要了解其作用方式。這些化合物有效富集心肌細(xì)胞產(chǎn)生的組合方式和用量可憑經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)在培養(yǎng)環(huán)境中加入這類因子，然后依據(jù)以下列出的表型標(biāo)志測(cè)定該化全物是否增加了細(xì)胞群中心肌細(xì)胞系細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定。
已發(fā)現(xiàn)pPS衍生的心肌細(xì)胞可分成單細(xì)胞懸液分別用于再接種和擴(kuò)增、富集、克隆和表型特征測(cè)定。實(shí)施例2說(shuō)明了用膠原酶B溶液制備分離的單個(gè)心肌細(xì)胞。膠原酶II或膠原酶混合物如Blendzyme IV(Roche)也適合此項(xiàng)制備。解離后，將細(xì)胞接種在帶小室的玻片上，在分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)。重新培養(yǎng)的這種單個(gè)心臟細(xì)胞能存活并繼續(xù)跳動(dòng)。
可通過(guò)例如機(jī)械分離或細(xì)胞分棟，進(jìn)一步富集pPS衍生細(xì)胞懸液中具有所需特征的細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)采用適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行密度分離可富集收縮性細(xì)胞，提高百分率約20倍。實(shí)施例4和9說(shuō)明了等密度富集的心肌細(xì)胞群，可獲得含有至少約5％，約20％，約60％和可能90％以上的心肌細(xì)胞系細(xì)胞群。本文所述的許多研究和治療應(yīng)用得益于所獲心肌細(xì)胞的高比率，但通常不需要完全均一。
啟動(dòng)分化后(和分離步驟之前或之后，如果采用分離方法時(shí))可以在含心肌細(xì)胞富集制劑的環(huán)境中培養(yǎng)來(lái)提高心肌細(xì)胞系細(xì)胞的百分率。培養(yǎng)液中的或表面基質(zhì)上的因子可通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞系細(xì)胞增殖，或通過(guò)抑制其它類型組織的細(xì)胞生長(zhǎng)(或引起凋亡)而促進(jìn)所需類型細(xì)胞的生長(zhǎng)。上列某些向心因子適用于此目的，某些已知有益于體內(nèi)心肌細(xì)胞的化合物或其類似物也適合此目的，包括能形成高能磷酸鍵(如肌酸)的化合物、?；\(yùn)載體分子(如肉堿)和心肌細(xì)胞鈣通道調(diào)節(jié)劑(如?；撬?。
心肌細(xì)胞系細(xì)胞的特征鑒定用本發(fā)明技術(shù)獲得的細(xì)胞可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)表型的數(shù)目特征鑒定。pPS細(xì)胞系衍生的心肌細(xì)胞和前體細(xì)胞常具有其它來(lái)源心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。它們可能是紡錘形、園形、三角或多角形和具有免疫染色可檢測(cè)的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的條紋特征(實(shí)施例3)，它們可形成肌管樣結(jié)構(gòu)，當(dāng)用電鏡檢查時(shí)顯示典型的肌原纖維節(jié)和前房粒。
pPS衍生的心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞通常具有至少一種以下心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志·心肌鈣蛋白I(cTnI)，它是肌鈣蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基，提供調(diào)節(jié)橫紋肌收縮的鈣敏感分子開關(guān)。
·心肌鈣蛋白T(cTnT)·前房利尿鈉因子(ANF)，一種發(fā)育中的心臟和胚胎心肌細(xì)胞中表達(dá)的激素，但在成熟時(shí)下調(diào)，認(rèn)為是心肌細(xì)胞的一種良好標(biāo)志，因?yàn)橐愿叨忍禺愋苑绞皆谛募〖?xì)胞中但不在骨骼肌細(xì)胞上表達(dá)。
所述細(xì)胞通常還表達(dá)至少一種以下標(biāo)志·肌原纖維的肌球蛋白重鏈(MHC)·肌聯(lián)蛋白、原肌球蛋白、α-肌動(dòng)蛋白和結(jié)合蛋白·GATA-4，一種在心臟中胚層中高表達(dá)和在發(fā)育中持續(xù)存在的轉(zhuǎn)錄因子，它能調(diào)節(jié)許多心肌基因在心臟發(fā)生中起重要作用。
·NKx2.5，早期小鼠胚胎發(fā)育心臟中胚層表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子。在發(fā)育心臟中持續(xù)存在。
·MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D，心臟中胚層表達(dá)的發(fā)育心臟中持續(xù)存在的轉(zhuǎn)錄因子·N-鈣粘著蛋白，其介導(dǎo)了心肌細(xì)胞之間的粘附·間隙連接蛋白，它形成了心肌細(xì)胞之間的間隙連接·β1-腎上腺素受體(β1-AR)·肌酸激酶MB(CK-MB)和肌球蛋白，二者在心肌梗塞后血清濃度升高心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞上可能陽(yáng)性的其它標(biāo)志包括α-心肌動(dòng)蛋白，早期生長(zhǎng)反應(yīng)-1和細(xì)胞周期蛋白D2。
可采用任何適當(dāng)?shù)拿庖呒夹g(shù)檢測(cè)這些組織特異性標(biāo)志，例如流式免疫細(xì)胞化學(xué)或細(xì)胞表面標(biāo)志的親和吸附法，胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)志的免疫細(xì)胞化學(xué)(例如固定的細(xì)胞或組織切片)，細(xì)胞抽提物的免疫印染分析，和分泌到培養(yǎng)液中的細(xì)胞提取物或產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。如果在標(biāo)準(zhǔn)的免疫細(xì)胞化學(xué)或流式細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)中可檢測(cè)到明顯量的抗體與某抗原結(jié)合，就說(shuō)細(xì)胞表達(dá)的該抗原是抗體可檢測(cè)到的?？扇芜x地在該細(xì)胞固定后和任選地采用標(biāo)記的第二抗體，或其它偶聯(lián)物(如生物素-親和素偶聯(lián)物)來(lái)放大標(biāo)記。
組織特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)也可用Norther印染分析，斑點(diǎn)雜交印染分析或用序列特異性引物以標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶引起的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在mRNA水平上檢測(cè)。參見(jiàn)美國(guó)專利5,843,780詳細(xì)了解這些通用性技術(shù)。本文中列出的其它標(biāo)志的序列資料可從公眾數(shù)據(jù)庫(kù)如Gen Bank(URL www.ucbi.nlm.mih.gov80/entrez)獲得。如果在細(xì)胞樣品上按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行一項(xiàng)試驗(yàn)，在典型的受控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生清晰可辨的雜交或擴(kuò)增產(chǎn)品，就說(shuō)mRNA水平的表達(dá)是本文所述試驗(yàn)之一可檢測(cè)的。如果蛋白質(zhì)或mRNA水平檢測(cè)到的組織特異性標(biāo)志表達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞，如未分化pPS細(xì)胞或其它無(wú)關(guān)類型細(xì)胞高至少2倍，宜10或50倍以上，就認(rèn)為是陽(yáng)性。
一旦在細(xì)胞表面檢測(cè)到所需表型的標(biāo)志，可將它們用于免疫篩選，以諸如免疫淘選或抗體介導(dǎo)的熒光激活細(xì)胞選揀技術(shù)進(jìn)一步富集該細(xì)胞群。
在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中，pPS衍生心肌細(xì)胞常顯示自發(fā)性的周期性收縮活動(dòng)，這意味著當(dāng)培養(yǎng)在適當(dāng)Ca++濃度及電解質(zhì)平衡的適合組織培養(yǎng)環(huán)境中時(shí)，可觀察到這些細(xì)胞模越細(xì)胞一條軸的收縮，然后放松，無(wú)須在培養(yǎng)液中加入任何其它成分。收縮是周期性的，意味著收縮以每分大約6-20次之間，常常為大約20-90次之間的頻率，有規(guī)律或無(wú)規(guī)律地重復(fù)(圖5)，單個(gè)細(xì)胞本身可顯示自發(fā)性的周期性收縮活性，或顯示與組織中細(xì)胞聚集體或培養(yǎng)的細(xì)胞塊中相鄰的細(xì)胞協(xié)同的自發(fā)周期性收縮活動(dòng)。
可根據(jù)培養(yǎng)條件對(duì)收縮的性質(zhì)和頻率的影響，特征性分析細(xì)胞的收縮活性。能降低Ca++濃度或干擾Ca++的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物常常影響收縮活性。例如L型鈣通道阻斷劑鹽酸地爾硫卓可以劑量依賴方式抑制收縮活性(圖5)。另一方面，腎上腺素受體激動(dòng)劑如異丙腎上腺素和苯福林具有陽(yáng)性變時(shí)作用。進(jìn)一步特征鑒定細(xì)胞的功能特性可包括鑒定Na+、k+和Ca++通道?？赏ㄟ^(guò)膜片鉗分析研究心肌細(xì)胞動(dòng)作電勢(shì)的電生理學(xué)，見(jiàn)Igelmound等，Pflugers Arch 437699，1999；Wobus等，Ann.N.Y.Acad.Sci.27752，1995和Doevendans等，J.Mol.Cell Cardiol 32839，2000。
功能特性分析研究提供了體外特征鑒定細(xì)胞及其前體細(xì)胞的方法，但對(duì)本文所述某些應(yīng)用可能是不需要的。例如，富集了帶有上述某些標(biāo)志細(xì)胞的混合細(xì)胞群不是所有細(xì)胞都具有功能和電生理特性。如果將它們移植到受損傷的心臟組織可獲得體內(nèi)支持心功能所需的功能特性，或認(rèn)為它們具有治療價(jià)值。
本發(fā)明的細(xì)胞群和分離的細(xì)胞如衍生于已建立的pPS細(xì)胞系，可特征鑒定為具有與其所衍生的細(xì)胞系相同的基因組。這意味著該pPS細(xì)胞和心肌細(xì)胞(如果該心肌細(xì)胞通過(guò)正常有絲分裂過(guò)程獲自未分化細(xì)胞系)之間的染色體DNA相同性超過(guò)90％。用重組方法導(dǎo)入一轉(zhuǎn)基因(如TERT)或敲除一內(nèi)源基因的細(xì)胞仍可認(rèn)為具有與其所衍生的細(xì)胞系相同的基因組，因?yàn)槠浔Ａ袅怂形唇?jīng)操作過(guò)的遺傳無(wú)件。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如DNA指紋法，這兩種細(xì)胞群可顯示具有相同的基因組。或者通過(guò)觀察細(xì)胞分裂期間保存的記錄可確立這種關(guān)系。特征鑒定衍生自親代細(xì)胞群的心肌細(xì)胞系細(xì)胞在幾個(gè)方面有重要性，具體說(shuō)，未分化細(xì)胞群可用于產(chǎn)生含共享基因組的其它細(xì)胞——另一批心肌細(xì)胞，或可用于治療的其它類型細(xì)胞——例如可使病人預(yù)先耐受心臟異體移植的組織相容性類型的細(xì)胞群。
對(duì)于治療應(yīng)用，常需要本發(fā)明的分化細(xì)胞群基本上不含有未分化的pPS細(xì)胞。清除該細(xì)胞群中未分化干細(xì)胞的一種方法是用一種載體轉(zhuǎn)染它們。該載體中效應(yīng)基因在可引起其在未分化細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的一種啟動(dòng)子控制下。適合的啟動(dòng)子包括TERT啟動(dòng)子和OCT-4啟動(dòng)子。該效應(yīng)基因可直接裂解此細(xì)胞(例如編碼毒素或凋亡介質(zhì)的基因)?；蛘咴撔?yīng)基因能賦予細(xì)胞對(duì)外來(lái)制劑如抗體或前體藥物毒性作用的敏感性。例子有單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因，它可引起表達(dá)它的細(xì)胞對(duì)更昔洛韋敏感。WO 98/14593(Morin等)中提供了合適的pTERT-tk構(gòu)建物。
由于已證明可從pPS細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞，讀者可判斷本文所述的分化方案是否適合自己的目的。例如，讀者可通過(guò)在與獲得本文所述細(xì)胞相當(dāng)?shù)脑囼?yàn)條件下，培養(yǎng)pPS細(xì)胞或其衍生細(xì)胞和其它類型對(duì)照細(xì)胞(如原代人心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)，然后比較所獲細(xì)胞上述標(biāo)志的表型，來(lái)輕松地測(cè)試這種培養(yǎng)條件的適合性。調(diào)整培養(yǎng)和細(xì)胞分離條件以改變具體成分，是這種培養(yǎng)方法正常預(yù)期的常規(guī)優(yōu)化工作，不脫離本發(fā)明的思路。
分化細(xì)胞的基因修飾在某些藥物篩選和治療應(yīng)用中可能需要所述細(xì)胞具有復(fù)制能力和提供產(chǎn)生心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞貯備池的能力，本發(fā)明的細(xì)胞在其進(jìn)展至限制性發(fā)育系細(xì)胞或終未分化細(xì)胞前后可任選地作端粒化處理以提高它們的復(fù)制能力，端粒化處理的pPS細(xì)胞可進(jìn)入上述分化通路，或可端?；苯犹幚矸只?xì)胞。
端?；幚淼募?xì)胞通過(guò)用適當(dāng)?shù)妮d體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)；同源重組或其它適當(dāng)技術(shù)，在基因上修飾了它們，使它們表達(dá)端粒酶催化成分(TERT)，該成分通常在一種異源啟動(dòng)子調(diào)控下，這增加了端粒酶的表達(dá)超過(guò)在內(nèi)源啟動(dòng)子調(diào)控下的表達(dá)。特別適合的是人端粒酶(hTETR)的催化成分，在國(guó)際專利出版物WO 98/14592中有提供。在某些應(yīng)用中也可采用其種族同源物如小鼠TERT(WO 99/27113)。人細(xì)胞中端粒酶的轉(zhuǎn)染和表達(dá)見(jiàn)Bodnar等，Science 279349，1998和Jiang和Nat.Genet.21111，1999。在另一實(shí)施例中采用hTERT克隆(WO 98/14592)作為hTERT編碼序列的來(lái)源，將其剪接入在MPSV啟動(dòng)子控制下的PBBS 212載體的ECOR1位點(diǎn)，或剪接入在LTR啟動(dòng)子控制下的商品化pBABE逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的EcoRI位點(diǎn)。
將用載體進(jìn)行了基因修飾的分化或未分化pPS細(xì)胞，在含有8-16小時(shí)培養(yǎng)的上清液中培養(yǎng)，然后換入生長(zhǎng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-2天。用藥物篩選試劑如嘌呤霉素、G418或殺稻瘟素篩選基因已修飾的細(xì)胞，重新培養(yǎng)。然后通過(guò)RT-PCR端粒酶活性(TRAP試驗(yàn))、hTERT的免疫細(xì)胞化學(xué)染色或復(fù)制能力，評(píng)估它們的hTERT表達(dá)。下列試劑盒可從商品市場(chǎng)獲得用于研究TRAPegeXL端粒酶檢測(cè)試劑盒(目錄號(hào)s7707；Intergen co Purchase NY)和TeloTAGGG端粒酶PCRELISAplus(目錄號(hào)2,013,89；Roche Diagnostics，Indianapolis IN)。也可用FT-PCR在mRNA水平上評(píng)價(jià)TERT表達(dá)。用于研究目的的商品化試劑有LigheCycler Telo TAGA hTERT定量試劑盒(目錄號(hào)3,102,344；Roche Diagnostics)?？赏ㄟ^(guò)在支持增殖的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)來(lái)富集不斷復(fù)制的集落，并用有限稀釋法克隆具有所需表型的細(xì)胞。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，使pPS細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞前體細(xì)胞，然后作基因修飾來(lái)表達(dá)TERT，在本發(fā)明其它實(shí)施例中，基因修飾pPS細(xì)胞來(lái)表達(dá)TERT，然后分化為心肌細(xì)胞前體細(xì)胞或終末分化細(xì)胞。提高TERT表達(dá)的成功修飾可用TRAP試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，或測(cè)定細(xì)胞的復(fù)制能力是否得到提高。
取決于所用細(xì)胞，也可接受其它使細(xì)胞永生的方法，如用編碼myc SV40大T抗原或MOT-2(美國(guó)專利5,869,243，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 97/32972和WO 01/23555)的DNA轉(zhuǎn)化此細(xì)胞。當(dāng)該細(xì)胞用于治療目的時(shí)用致癌基因或致癌病毒轉(zhuǎn)染不大適當(dāng)。本發(fā)明應(yīng)用中特別感興趣的是端?；募?xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是在例如藥物篩選中和在給予病人分化細(xì)胞以加強(qiáng)心功能的治療過(guò)程中，這些細(xì)胞可增殖和保持其核型。
還可基因修飾本發(fā)明的細(xì)胞以提高它們參與組織修復(fù)的能力，或輸送治療基因至給藥部位的能力。采用所需基因的已知編碼序列設(shè)計(jì)一種載體將其與在分化細(xì)胞類型中有特異性或特異活性的啟動(dòng)子操作性連接。特別感興趣的細(xì)胞是經(jīng)基因修飾能表達(dá)一種或多種各類生長(zhǎng)因子、向心因子如前房利尿鈉因子、Cripto和心臟轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如GATA-4、Nkx2.5和MEF2-C的細(xì)胞。在給藥部位產(chǎn)生這些因子具有促進(jìn)采納功能性表型、增加被給藥細(xì)胞的有益作用，或提高相鄰于治療部位的宿主細(xì)胞的增殖或活性。
心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞的用途本發(fā)明提供了大量產(chǎn)生心肌細(xì)胞系細(xì)胞的方法，這些細(xì)胞群可用于許多重要的研究、開發(fā)和商業(yè)目的。
本發(fā)明的細(xì)胞可用于制備一種才cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)相對(duì)沒(méi)有污染在其它細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的cDNA。例如以1000rpm離心5分鐘收集心肌細(xì)胞，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法制備沉降細(xì)胞團(tuán)的mRNA(Sambrook等，同上)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后可除去該制備物中未分化pPS細(xì)胞、其它祖代細(xì)胞或心肌細(xì)胞或其它發(fā)育通路產(chǎn)生的末期細(xì)胞的cDNA。
本發(fā)明的分化細(xì)胞也可用于制備抗心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞標(biāo)志的特異性抗體，給脊椎動(dòng)物注射免疫原形式的本發(fā)明細(xì)胞可制備多克隆抗體。單克隆抗體的產(chǎn)生可參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)，如美國(guó)專利4,491,632、4,472,500和4,444,887和酶學(xué)方法73B3(1981)。也可使免疫活性細(xì)胞或病毒顆粒文庫(kù)與靶抗原接觸和培養(yǎng)選出的陽(yáng)性克隆來(lái)產(chǎn)生特異性抗體分子。見(jiàn)Marks等，New Eng.J.Med.335730，1996和McGuiness等，Nature Biotechnol.141449，1996。另一種方法是將隨機(jī)DNA片段重組裝入抗體編碼區(qū)如歐洲專利申請(qǐng)1,094,108A中所述。
通過(guò)采用本發(fā)明的特異性細(xì)胞作陽(yáng)性篩選和采用具有更廣泛分布的抗原的細(xì)胞(如具有其它表型的胚胎細(xì)胞后代)或成年心肌細(xì)胞作陰性篩選，可獲得所需特性(抗體)，這種抗體進(jìn)而可用于鑒定或拯救混合細(xì)胞群中所需表型的心臟細(xì)胞，目的是在組織樣品的免疫診斷中共同染色或分離終末分化的心肌細(xì)胞和其它系細(xì)胞的前體細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞令人感興趣的還有可用于鑒定心特肌細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄物和新合成蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，可能有助于指導(dǎo)分化通路或促進(jìn)細(xì)胞之間的相互作用。獲得分化細(xì)胞的表達(dá)模式并與對(duì)照細(xì)胞系如未分化的pPS細(xì)胞、其它類型的定型前體細(xì)胞(如pPS細(xì)胞向其它種系分化)或終末分化細(xì)胞的模式相比較。
用微陣列分析基因表達(dá)的綜述見(jiàn)Frifg等Science.288316，2000；MiceoarmyBiochip Technology，L Shi，www.Gene-Chips.com?？捎藐嚵挟a(chǎn)生儀和TM掃描實(shí)行示范性方法。先擴(kuò)增編碼待分析標(biāo)志序列的cDNA片段并直接點(diǎn)在載玻片上制備微陣列。為了比較兩種感興趣的細(xì)胞的mRNA制備物，將一制備物轉(zhuǎn)變成Cy3標(biāo)記的cDNA，同時(shí)另一轉(zhuǎn)變?yōu)镃y5標(biāo)記的cDNA。使這兩種cDNA制備物同時(shí)與微陣列玻片雜交，然后洗滌除去非特異性結(jié)合。以適合各標(biāo)記的波長(zhǎng)掃描玻片，定量測(cè)定產(chǎn)生的熒光，結(jié)果表示為該陣列上各標(biāo)志的mRNA的相對(duì)豐度。
藥物篩選本發(fā)明的心肌細(xì)胞可用于篩選能影響該細(xì)胞及其各種后代細(xì)胞特征的因素(如溶劑\小分子藥物、肽、寡核苷酸)或環(huán)境條件(如培養(yǎng)條件或操作)。
在某些應(yīng)用中，用pPS細(xì)胞(分化或未分化)篩選能促進(jìn)其成熟為后期心肌細(xì)胞前體細(xì)胞或終未分化細(xì)胞或能促進(jìn)這類細(xì)胞增殖和維持長(zhǎng)期培養(yǎng)的因子。例如將候選的成熟因子或生長(zhǎng)因子加入不同孔細(xì)胞中，然后按照進(jìn)一步培養(yǎng)和應(yīng)用這類細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定所產(chǎn)生的表型變化來(lái)測(cè)試這些因子。
本發(fā)明的其它篩選應(yīng)用涉及測(cè)試藥物化合物對(duì)維持或修復(fù)心肌組織的作用，因?yàn)樗O(shè)計(jì)的化合物對(duì)這類細(xì)胞具有藥理作用或因?yàn)樵O(shè)計(jì)的化合物可能對(duì)此類組織具有不期望的副作用而可能進(jìn)行這種篩選?？捎帽景l(fā)明的前體細(xì)胞或終未分化細(xì)胞進(jìn)行篩選。
讀者可參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)教課書“藥物研究的體外方法(In Vitro Methods inPharmacentical Research)”，Academic Press，1997和美國(guó)專利5,030,015。對(duì)候選藥物組合物的評(píng)估通常包括將本發(fā)明的分化細(xì)胞與候選化合物(單獨(dú)或再與其它藥物組合)相混合。研究人員可測(cè)定這類細(xì)胞歸因于該化合物的形態(tài)學(xué)、標(biāo)志表型或功能活性的變化(與未處理細(xì)胞或用惰性化合物處理的細(xì)胞相比較)，然后將該化合物的作用與所見(jiàn)變化相關(guān)聯(lián)。
可首先測(cè)定對(duì)細(xì)胞生命力、存活形態(tài)和某些標(biāo)志和受體表達(dá)的影響來(lái)確定細(xì)胞毒性。某藥物對(duì)染色體DNA的作用可通過(guò)測(cè)定與所述藥物作用相一致的DNA合成或修復(fù)([3H]-胸苷或BrdU摻入，特別是在細(xì)胞周期的未計(jì)劃時(shí)刻的摻入，或超過(guò)細(xì)胞復(fù)制所需水平)來(lái)確定。不良作用可能還包括罕見(jiàn)的姐妹染色體交換率(通過(guò)中期擴(kuò)散測(cè)定)。讀者可參見(jiàn)A.Vickers(藥物研究的體外方法(In Vitro Methods inPharmacentical Research)，Academic Press，1997，第375-410頁(yè))的進(jìn)一步評(píng)述。
對(duì)細(xì)胞功能的作用可用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)觀察心肌細(xì)胞的表型或活力，例如細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)或體內(nèi)的標(biāo)志表達(dá)、受體結(jié)合、收縮活性或電生理學(xué)來(lái)評(píng)估。也可測(cè)試候選藥物對(duì)收縮活性的影響，例如是否提高或降低了收縮程序和頻率。觀察這種影響時(shí)可滴定化合物的濃度以確定有效劑量中位值(ED50)。
治療應(yīng)用本發(fā)明還提供應(yīng)用心肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞來(lái)提高由于心臟代謝功能先天性缺陷、疾病所引起的或嚴(yán)重創(chuàng)作所致的、必須的心肌組織維持和修復(fù)。
為了確定細(xì)胞組合物是否適合治療給藥，可先在合適的動(dòng)物模型中測(cè)試該細(xì)胞在一種水平上評(píng)估該細(xì)胞在體內(nèi)存活和維持其表型的能力。將此細(xì)胞組合物給予免疫缺陷動(dòng)物(如裸鼠或經(jīng)化學(xué)方法或照射產(chǎn)生免疫缺陷的動(dòng)物)重生長(zhǎng)一段時(shí)間后，收集組織并評(píng)估pPS衍生細(xì)胞是否仍然存在。
這可以通過(guò)給予能表達(dá)某可檢測(cè)標(biāo)記(如綠熒光蛋白或β-米乳糖苷酸)的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，預(yù)先標(biāo)記(如用Brdo或[3H])細(xì)胞，然后檢測(cè)組成性細(xì)胞標(biāo)志(如用人特異性抗體)。所給予細(xì)胞的存在和表型，可用免疫組化或采用人特異性抗體的ELISA評(píng)估，或用能導(dǎo)致人多核苷酸(根據(jù)公布的序列資料)特異性擴(kuò)增的引物和雜交條件進(jìn)行RT-PCR來(lái)評(píng)估。
這種適合性還可通過(guò)評(píng)估因采用pPS衍生的心肌細(xì)胞治療使心臟復(fù)原的程序來(lái)確定。已有許多動(dòng)物模型用于這種測(cè)試。例如，可將預(yù)冷的鋁捧接觸左心室前壁表面，凍傷心臟(Marry等，J.Clin.Invest.98.2209，1996，Reinecke等，Circulation100193，1999；美國(guó)專利6,099,832)。對(duì)較大動(dòng)物可將液氮中冷卻的30-50mm銅園片探頭置于左心室前壁約20分鐘引起凍傷(Chiu等，Ann Thorac.Surg.6012，1995)。結(jié)扎左側(cè)主冠動(dòng)物可引起梗阻(Li等，J.Clin Invest.1001991，1997)。用本發(fā)明細(xì)胞制劑治療損傷部位，用組織學(xué)方法檢查心臟組織損傷區(qū)域是否存在此種細(xì)胞?？蓽y(cè)定左心室舒張末期壓力、產(chǎn)生的壓力，壓力上升速度和壓力下降速度等參數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)心功能。
充分檢測(cè)后，本發(fā)明的分化細(xì)胞可用于病人或需要這種治療的其它對(duì)像的組織重建或再生。這些細(xì)胞給予的方式是使其移植或遷入所需組織部位并重建或再產(chǎn)生功能缺陷區(qū)域，可得到特殊裝置將這些細(xì)胞直接給予心臟腔室、心包或心肌內(nèi)部所需部位得以重建心功能。
這類治療的用藥指征包括各種急慢性心臟病，如冠心病、心肌病、先天性心血管缺損和充血性心力衰竭。治療效果可按臨床上接受的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)，如疤痕組織面積減少；疤痕組織重新長(zhǎng)出血管；心絞痛頻率和嚴(yán)重性減輕；產(chǎn)生的壓力、收縮壓、舒張末壓力提高；Δ壓力/Δ時(shí)間、病人的運(yùn)動(dòng)和生活質(zhì)量。
本發(fā)明的心肌細(xì)胞可以藥物組合物形式提供，該組合物包含人用的在充分滅菌條件下制備的等滲賦形劑。藥物制劑的通用原則讀者可參見(jiàn)“細(xì)胞治療干細(xì)胞移植、基因治療和細(xì)胞免疫療法(Cell TherapyStem Cell Transplantation，GeneTherapy and Cellular Immunotherapy)”G.Morstyn & W.Sheridan編，CambridgeUniversity Press，1996和“造血干細(xì)胞療法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)”E.D.Ball，JLister & P.Law，Churchill Livingstone，2000。該組合物的細(xì)胞賦形劑和相伴元件的篩選將按照給藥途徑和所用裝置而定。此組合物也可含有或伴有能促進(jìn)心肌細(xì)胞移植和功能活動(dòng)的一種或多種其它成分。合適的成分包括能支持或促進(jìn)心肌細(xì)胞粘附的基質(zhì)蛋白或輔助性細(xì)胞類型特別是內(nèi)皮細(xì)胞。
該組合物任選地包裝在適合的容器中，內(nèi)有所用目的的說(shuō)明書，如重建心肌細(xì)胞功能以改善心肌的某種異常。
提供以下實(shí)施例作為進(jìn)一步非限制性地闡明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例實(shí)施例1胚胎干細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞增殖將已建立的未分化人胚胎干(hES)細(xì)胞維持在基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法(WO 01/51616)分離的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)液維持無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。用無(wú)Ca++/Mg++PBS沖洗一次并在1.5-2ml的胰蛋白酶/EDTA(Gibco)中培育5分鐘，收集T150瓶中的成纖維細(xì)胞。使成纖維細(xì)胞從瓶上脫下后，收集在mEF培養(yǎng)液(DMEM+10％FBS)中，用4000拉德照射細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以5.5萬(wàn)細(xì)胞/cm2接種于mEF培養(yǎng)液中(6孔板每孔52.5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)。
至少4小時(shí)后，用含ES培養(yǎng)液(80％敲除DMEM、Gibo BRL Rockville MD)20％敲除血清替代物(Gibco)、1％非必須氨基酸(Gibco)、1mML谷氨酰胺(Gibco)、0.1mMB硫基乙醇(Sigma St Louis MO)添加有4ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF，Gibco)的SR更換培養(yǎng)液。每平方厘米板表面積有0.3-0.4毫升培養(yǎng)液，此條件培養(yǎng)液加入hES培養(yǎng)前添加4ng/ml人bFGF。
培養(yǎng)hES細(xì)胞板的包被用Matrigel(Becton-Dickinson.Bedford MA)，以冷KODMEM 1∶30稀釋其貯存液按每孔9.6平方厘米0.75-1.0毫升分配，室溫培育1-4小時(shí)或4℃包被過(guò)夜。
以200U/ml膠原酶IV 37℃培育約5-10分鐘傳代hES培養(yǎng)物。刮下細(xì)胞然后在條件培養(yǎng)液中輕輕解離成小塊接種在Matrigel包被的板上，接種約一周后培養(yǎng)物鋪滿即可傳代。這些條件下維持培養(yǎng)物180天以上，不斷地顯示ES樣形態(tài)。將樣品與用敲除DMEM稀釋的抗SSEA-4(1∶20)，Tra-1-60(1∶40)和Tra-1-81(1∶80)第一抗體一起培育37℃30分鐘進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢查，用熱的敲除DMEM洗滌細(xì)胞并用2％多聚甲醛固定15分鐘，再用PBS洗滌，將細(xì)胞與含5％山羊血清的PBS室溫培育30分鐘，然后與FITC偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG(1∶125，Sigma)培育30分鐘。洗滌細(xì)胞，用DAPI染色并封固。
還檢查了細(xì)胞的堿性磷酸酶(未分化ES細(xì)胞的一種標(biāo)志)表達(dá)。在帶小室玻片上培育細(xì)胞，用4％多聚甲醛固定5分鐘。然后用PBS洗滌進(jìn)行此項(xiàng)檢查。然后將細(xì)胞與堿性磷酸酶底物(Vector Labe-ratories.Inc.Burlingame.CA)室溫暗處培育1小時(shí)。用100％乙醇淋洗玻片2-5分鐘然后封固。
圖1顯示組化方法所檢測(cè)到的hES細(xì)胞上標(biāo)志表達(dá)。hES集落表達(dá)了SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和堿性磷酸酶，如在飼養(yǎng)層上的細(xì)胞所見(jiàn)，但不象集落間的分化細(xì)胞表達(dá)的那樣。
用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增檢測(cè)了未分化細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)。為了用放射活性相對(duì)定量測(cè)定各基因產(chǎn)物，按廠商說(shuō)明書采用了Quantum RNATMAlternate18S內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)引物(Ambion.Austin.TX.USA)。簡(jiǎn)言之，檢查了一特定引物對(duì)的擴(kuò)增線性范圍，然后用Alternate 18S引物競(jìng)爭(zhēng)者(competimers)的適當(dāng)混合物共同擴(kuò)增產(chǎn)生具有重疊線性范圍的PCR產(chǎn)物。將Ampli TagTM(Roche)加入PCR反應(yīng)之前，將此酶與TagStartTM抗體(ProMega)按廠商說(shuō)明書一起培育。在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析放射活性PCR反應(yīng)，干燥并曝光磷成象屏(Molecular Dynamisc)12小時(shí)，用Molecular Dynamics Strom860掃描此屏并用ImageQuantTM軟件定量測(cè)定條帶強(qiáng)度。結(jié)果表示為摻入hERT或OCT-4條帶中的放射活性比率，標(biāo)準(zhǔn)化至摻入18S條帶的放射活性。該實(shí)驗(yàn)用的引物序列可在國(guó)際專利出版物WO 01/51616中找到。
轉(zhuǎn)錄因子OCT-4正常表達(dá)于未分化的hES細(xì)胞并在分化時(shí)下調(diào)，維持在條件培養(yǎng)液中Matrigel上的細(xì)胞表達(dá)了hERT或OCT-4。TRAP試驗(yàn)測(cè)到了端粒酶活性(Kim等，Science 2662011，1977；Weinrich等，Nature Genetics17498，1997)。維持在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞在培養(yǎng)180天后顯示出端粒酶活性。
無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的未分化細(xì)胞的多能性，可通過(guò)懸浮培養(yǎng)4天形成胚胎樣小體，然后在聚烏氨酸包被的板上培養(yǎng)7天來(lái)測(cè)定，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示染色模式與神經(jīng)元和心肌細(xì)胞系細(xì)胞細(xì)胞相一致，并且細(xì)胞甲胎蛋白(內(nèi)胚層的一種標(biāo)志)染色陽(yáng)性。還通過(guò)肌肉內(nèi)注射SCID小鼠測(cè)試了未分化細(xì)胞產(chǎn)生端粒酶的能力。78-84天后切下產(chǎn)生的腫瘤，通過(guò)組織學(xué)分析鑒定到所有三個(gè)胚層衍生的細(xì)胞類型。
實(shí)施例2hES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞將hES細(xì)胞系H1、H7、H9和H9.2(H9衍生的克隆系)先維持在飼養(yǎng)細(xì)胞上，然后在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下培養(yǎng)，如實(shí)施例1所述。每周用200U/ml膠原酶IV 37℃培育5-10分鐘，然后按1∶3-1∶6比率，9萬(wàn)-17萬(wàn)細(xì)胞/cm2接種在Matrigel包被板上進(jìn)行培養(yǎng)物傳代，并維持在原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液中。
圖2(上圖)顯示分化性hES細(xì)胞成為心肌細(xì)胞的時(shí)間表。培養(yǎng)懸浮的hES細(xì)胞啟動(dòng)分化形成胚胎樣小體，通過(guò)在1mg/ml膠原酶IV中37℃培育5-10分鐘使hES細(xì)胞解離成小塊，然后培養(yǎng)在分化培養(yǎng)液中形成聚集物。該分化培養(yǎng)液含80％敲除DMEM(KO-DMEM)(Gibco，BRL，Rockville MD)1mML-谷氨酰胺、0.1％mM β-琉基乙醇和1％非必須氨基酸原液(Bibco BRL Rockvill.MD)添加有20％胎牛血清。
懸浮培養(yǎng)4天后，將胚胎樣小體轉(zhuǎn)移到明膠包被板或帶小室玻片上，接種后EB貼附在表面，增殖并分化為異質(zhì)細(xì)胞群，分化第8天在培養(yǎng)物的各區(qū)域中觀察到自發(fā)性收縮細(xì)胞。
圖2(下圖)顯示隨著細(xì)胞不斷分化，接種胚胎樣小體含搏動(dòng)細(xì)胞的比率增加。長(zhǎng)至32天培養(yǎng)物中可見(jiàn)到收縮性細(xì)胞。
分化第11-14天用機(jī)械方法從生長(zhǎng)的EB中分離出中搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，收集在含低鈣培養(yǎng)液或PBS的15ml試管中，然后洗滌。測(cè)試了不同試劑包括胰蛋白酶、EDTA，膠原酶IV或B產(chǎn)生活心肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液的能力。將細(xì)胞與膠原酶B溶液一起37℃培育60-120分鐘(取決于膠原酶活性)獲得單個(gè)活的收縮性心肌細(xì)胞，重懸于KB培養(yǎng)液(85mM KCl，30mM K2HPO45mM MgSO4、1mM EGTA、5mM肌酸、20mM葡萄糖、2mM Na2ATP、5mM丙酮酸和20mM牛磺酸、緩沖至pH7.2)(Maltsev等，Circ.Res，75233，1994)。細(xì)胞在該培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)15-30分鐘，解離然后接種于帶小室玻片中，以分化培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)后單個(gè)心肌細(xì)胞存活并不斷跳動(dòng)。
測(cè)試了所有的hES細(xì)胞系，包括H1、H7、H9、H9.1和H9.2，均具有產(chǎn)生搏動(dòng)心肌細(xì)胞的能力，甚至在維持50次傳代后(約260群雙倍體)。
實(shí)施例3心肌細(xì)胞的特征鑒定分析了實(shí)施例2制備的hES衍生細(xì)胞是否存在心肌細(xì)胞特征性的表型標(biāo)志。
如下進(jìn)行EB生長(zhǎng)培養(yǎng)物或解離的心肌細(xì)胞的免疫染色用甲醇/丙酮(3∶1)-20℃固定分化培養(yǎng)物20分鐘，用PBS洗細(xì)胞2次，用5％正常羊血清(NGS)PBS封閉過(guò)夜，然后，室溫與第一抗體(用第一抗體稀釋緩沖液(Biomeda Corp.，F(xiàn)oter CityCA)作1∶20-1∶800稀釋)一起培育30-60分鐘、再洗滌細(xì)胞，用DAP1染色，用VectashiledTM(Vector Claboratories Inc.，Burlingame CA)封固。在NikonlabphotTM(裝有落射熒光裝置和SPOT CCD防凍照相機(jī))上進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。
第15天拍照H9.2細(xì)胞分化培養(yǎng)物中的各個(gè)收縮性中心，記錄收縮性區(qū)域，然后固定培養(yǎng)物，對(duì)該培養(yǎng)物作心肌鈣蛋白(cTnI)染色，與光學(xué)顯微圖相匹對(duì)，以確定cTnI染色陽(yáng)性的收縮性區(qū)域的百分率。收縮性區(qū)域100％cTnI染色陽(yáng)性，而非搏動(dòng)細(xì)胞中幾乎沒(méi)見(jiàn)染色。
如下進(jìn)行了cTnI表達(dá)的免疫印染將未分化和分化細(xì)胞用裂解緩沖液裂解，在10％SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(Schleicher & Schull)上，室溫用含有0.05％TweenTM20PBS(PBST)配的5％脫脂牛奶封閉此膜1小時(shí)。然后將此膜與用PBST配的1％脫脂牛奶作1∶8000稀釋的偶聯(lián)了辣根過(guò)氧化物酶(VectorLaboratories Inc.，Burlingame CA)的馬抗小鼠IgG(H+L)抗體一起室溫培育1.5小時(shí)?？贵w結(jié)合的信號(hào)用SuperSignalTMWest Pilo化學(xué)系統(tǒng)(Pierce，Rockford.TN)檢測(cè)。作為對(duì)照，探測(cè)了同一膜上的β-肌動(dòng)蛋白如下先作ECL檢測(cè)后用PBS洗滌此膜，曝光VectorTM-SG底片約5分鐘(Vector Laboratories Inc)然后再用抗β-肌動(dòng)蛋白(Sigma)單克隆抗體檢測(cè)。
圖3(上圖)顯示免疫印染分析的結(jié)果。含收縮性細(xì)胞的諸孔(泳道2和3)有一條約31kDa的條帶(分子量大小相應(yīng)于人cTnI)，但未分化hES細(xì)胞(泳道1)或不含收縮性細(xì)胞(泳道4)的孔無(wú)此條帶。所有泳道存在β-肌動(dòng)蛋白(蛋白質(zhì)回收的標(biāo)準(zhǔn))染色。
用LightCycler進(jìn)行了實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR，為了相對(duì)定量測(cè)定αMHC，按試劑盒說(shuō)明將RNA樣品和引物與RT-PCR反應(yīng)混合物(LightCycler RNA AmplificationRit-Hybridization Probes，Roche Molecular Biochemicals)混合。反應(yīng)條件如下55℃逆轉(zhuǎn)錄10分鐘，95℃變性30秒，擴(kuò)增45輪95℃10秒，60℃15秒，72℃13秒。用LightCycler3程序分析反應(yīng)，相對(duì)MHC水平表示為各樣品一式三份份應(yīng)的MHC和28S的比率。
圖3(下圖)顯示了結(jié)果，分化7天后αMHC水平明顯提高，但在未分化hES細(xì)胞或分化細(xì)胞早期中不能檢測(cè)到。此后表達(dá)水平不斷提高，與出現(xiàn)搏動(dòng)細(xì)胞相一致。分化期間發(fā)現(xiàn)hTERT表達(dá)降低。
用膠原酶β如實(shí)施例所述，將hES衍生的心肌細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，檢查分離的心肌細(xì)胞是否表達(dá)肌原纖維節(jié)肌球蛋白重鏈(MHC)、肌聯(lián)蛋白、原肌球蛋白、α-活化素、結(jié)合蛋白、cTnI和心肌鈣蛋白T(cTnT)。
圖4顯示了結(jié)果，單個(gè)細(xì)胞和集落所有這些標(biāo)志染色陽(yáng)性，染色的單個(gè)心肌細(xì)胞為紡錘形、圓形和三角或多角形?？梢?jiàn)肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的條紋特征，此與肌肉功能所必須的收縮裝置相一致。
GATA-4是一種在心臟中胚層高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在所有cTnI陽(yáng)性細(xì)胞的核中觀察到強(qiáng)的GATA-4免疫反應(yīng)。免疫印染表明GATA-4在含收縮性細(xì)胞的分化hES細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)(圖1泳道2和3)，但在無(wú)收縮性細(xì)胞的分化培養(yǎng)物中檢測(cè)不到(圖1泳道4)。也可在未分化細(xì)胞中檢測(cè)到弱信號(hào)(泳道1)，這可能是由于自發(fā)性分化為內(nèi)臟的內(nèi)胚層，它也表達(dá)GATA-4，或由于未分化細(xì)胞低水平表達(dá)GATA-4。
免疫細(xì)胞化學(xué)在所有cTnI陽(yáng)性細(xì)胞的核中檢測(cè)到MEF2心臟轉(zhuǎn)錄因子。心臟轉(zhuǎn)錄因子NKx2.5的半定量RT-PCR(Xu等，Dev Biol，196237，1998)表明其在含搏動(dòng)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)物中高表達(dá)，但在未分化細(xì)胞中檢測(cè)不到。粘附標(biāo)志N-鈣粘著蛋白和間隙連接標(biāo)志連接蛋白43可在鑒定為cTnI或MHC表達(dá)的心肌細(xì)胞中檢測(cè)到，但在周圍非心肌細(xì)胞中測(cè)不到。此外，我們用抗β1-腎上腺素受體(β1-AR)和cTnI抗體染色了部分解離的細(xì)胞。表面標(biāo)志的特異性染色表明這些細(xì)胞可通過(guò)基于這些標(biāo)志的選揀技術(shù)進(jìn)一步富集。
肌酸激酶MB(CK-MB)和肌球蛋白也可通過(guò)hES衍生心肌細(xì)胞與MHC共染的免疫技術(shù)染色檢測(cè)。認(rèn)為CK-MB負(fù)責(zé)高能貯備，只存于肌細(xì)胞系細(xì)胞中。肌球蛋白是一種胞質(zhì)氧結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)肌細(xì)胞中氧的貯備和擴(kuò)散，CK-MB和肌球蛋白二者可用于診斷急性心肌梗塞。在cTnI陽(yáng)性細(xì)胞膜上觀察到β1腎上腺素受體(β1-AR)的強(qiáng)免疫反應(yīng)。
前房利尿鈉因子(ANF)在hES細(xì)胞分化期間上調(diào)，可用半定量RT-PCR檢測(cè)。18％的cTnI陽(yáng)性細(xì)胞為Ki-67(一種存在于活躍分裂細(xì)胞中但不存在于靜止性G0細(xì)胞中的蛋白質(zhì))雙染色，表明表明該細(xì)胞仍有增殖能力。
綜合在一起，這些資料表明hES衍生的心肌細(xì)胞具有與早期(胚胎期)心肌細(xì)胞表型相一致的適當(dāng)基因表達(dá)模式。
實(shí)施例4“密度離心富集心肌細(xì)胞在不連續(xù)梯度PercollTM(一種含有膠體PVP包被硅料的密度分離介質(zhì))上進(jìn)行密度分離進(jìn)一步富集了心肌細(xì)胞。通過(guò)誘導(dǎo)懸浮的hES細(xì)胞分化4天，再在明脫離危險(xiǎn)包被板上分化15天，產(chǎn)生了心肌細(xì)胞。用膠原酶B37解離此細(xì)胞2小時(shí)，洗滌細(xì)胞重懸于分化培養(yǎng)液中。靜置5分鐘后將細(xì)胞懸液加到40.5％PercollTM(Pharmacia約1.05g/ml)層上，此層在58.5％PercollTM(約1.075g/ml)之上。然后以1500g離心細(xì)胞30分鐘。離心后收集PercollTM上面的細(xì)胞(組分1)和兩層PercollTM界面中的一層細(xì)胞(組分2)。洗滌收集的細(xì)胞，重懸于分化培養(yǎng)液中，心每孔104個(gè)細(xì)胞接種于帶小室玻片上。
一周后，固定細(xì)胞并染色肌球蛋白重鏈(MHC)的表達(dá)(實(shí)施例3)，計(jì)數(shù)每組分一式三孔30個(gè)圖象中的細(xì)胞來(lái)測(cè)定MHC陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以三孔細(xì)胞的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在兩組分中均看到搏動(dòng)細(xì)胞，但組分2含有更多。結(jié)果見(jiàn)表1。組分2中富集的比開始細(xì)胞群的高至少20倍。
表1 PercollTM分離hES衍生的心肌細(xì)胞組分 細(xì)胞計(jì)數(shù)增殖 搏動(dòng)細(xì)胞 MHC染色百分比1 1.92×106+++ + 2.7±3.3％2 0.56×106+ ++ 26.8±41％實(shí)施例5藥理學(xué)反應(yīng)通過(guò)測(cè)定心肌細(xì)胞對(duì)心臟活性藥物的變時(shí)性作用是否有適當(dāng)反應(yīng)，測(cè)定了hES衍生細(xì)胞的功能。
藥理學(xué)反應(yīng)的研究如實(shí)施例2所述，將EB細(xì)胞接種在明膠包被24孔板上使其分化。采用分化第15天的收縮性心肌細(xì)胞檢查藥理學(xué)反應(yīng)。在37加熱的倒置顯微鏡小室中計(jì)數(shù)維持在分蘗期經(jīng)培養(yǎng)液中搏擊動(dòng)區(qū)域的收縮速度來(lái)測(cè)定自發(fā)搏動(dòng)頻率。然后在培養(yǎng)箱中培育細(xì)胞和測(cè)試化合物20-30分鐘，并觀察收縮速度。通過(guò)逐漸加入遞增濃度的各種物質(zhì)測(cè)定其劑量依賴性作用。數(shù)據(jù)以10-20個(gè)搏動(dòng)區(qū)域測(cè)定的平均搏動(dòng)速率±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
為了證明這些細(xì)胞能表達(dá)心肌收縮中起關(guān)鍵作用的功能性L型鈣通道，我們檢查了L型鈣通道阻斷劑鹽酸地爾硫卓對(duì)hES衍生心肌細(xì)胞搏動(dòng)的影響。將分化細(xì)胞與不同濃度的此藥一起培育并計(jì)算每期分鐘搏動(dòng)數(shù)。用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，維持在分化培養(yǎng)液中24小時(shí)，觀察恢復(fù)收縮力的時(shí)間。
圖5(A)顯示鹽酸地爾硫卓以濃度依賴性方式抑制了搏動(dòng)速度。當(dāng)用10-5鹽酸地爾硫卓處理細(xì)胞時(shí)，100％的搏動(dòng)區(qū)仃止了收縮。去除此藥后24-48小時(shí)收縮恢復(fù)至正常水平。Fisher氏PLSD檢驗(yàn)測(cè)定*P＜0.05，**P＜0.005，***P＜0.0005有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該觀察表明hES衍生的心肌細(xì)胞具有功能性L鈣通道。在另一獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)克侖特羅可提高72天細(xì)胞的搏動(dòng)速率從每分鐘72跳到每分鐘98跳(1-10nM，P＜0.005)。
圖5B和5C顯示異丙腎上腺素(一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑)和苯福林(一種α-腎上腺素受體激動(dòng)劑)誘導(dǎo)的陽(yáng)性變時(shí)性作用。圖5D和5E顯示磷酸二酯酶抑制齊IBMX和β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑克侖特羅具有類似作用。因此hES衍生細(xì)胞能以心肌細(xì)胞系細(xì)胞相應(yīng)的方式對(duì)心臟活性藥物反應(yīng)。
實(shí)施例6向心因子作為分化誘導(dǎo)劑分化1-4天、4-6天或6-8天時(shí)，用5-氮脫氧胞嘧啶(一種能影響DNA甲基化，從而激活基因表達(dá)的胞嘧啶類似物)分化成為胚胎樣αMHC。TagmanTM7700序列測(cè)定系統(tǒng)采納了實(shí)施例3的RT-PCR試驗(yàn)，采用同樣的引物，擴(kuò)增40輪，9515分鐘，60℃ 1分鐘。采用TagmanTM核糖體RNA對(duì)照試劑試劑盒(Applied Biosystems)糖增18S核糖體RNA作為對(duì)照。用AB1 PrismTM7700序列測(cè)定系統(tǒng)分析反應(yīng)。
圖6顯示用5-氮脫氧胞嘧啶作為分化誘導(dǎo)劑的結(jié)果(均值±S.測(cè)定一式三份的αMHC與18S RNA的比率)。數(shù)據(jù)顯示第6-8天，1-10μM的5-氮脫氧胞嘧啶顯著提高了心肌αMHC表達(dá)，伴培養(yǎng)物搏動(dòng)區(qū)比率增加。
檢查了其它制定誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化的能力，包括＝甲基亞硯(DMSO)和所有所式視黃酸(RA)。用0.5％DMSO處理0-4天的胚胎樣小體產(chǎn)生的搏動(dòng)區(qū)比未處理培養(yǎng)物少，用0.8％或1％DMSO處理的培養(yǎng)物缺乏搏動(dòng)細(xì)胞，1.5％DMSO對(duì)細(xì)胞實(shí)際上有毒性。DMSO處理與未處理相比，也引起αMHC表達(dá)明顯降低。
以10-9和10-5M之間劑量在分化hES培養(yǎng)物中加入視黃酸，0-4天時(shí)RA對(duì)細(xì)胞有毒性，而4-8天、8-15天或4-15天與未處理培養(yǎng)物比較搏動(dòng)細(xì)胞不增加。
因此5-氮脫氧胞嘧啶是一種有效的心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，能增加細(xì)胞群中的心肌細(xì)胞比率。相反，DMSO和視黃酸抑制了心肌細(xì)胞分化，即使這些化合物能從胚胎癌或胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞(Wobus等，J.Mol.Cell.Cardiol.291525，1997；MeBurney等，Nature 299165，1982)在直接分化方案中也實(shí)現(xiàn)了心肌細(xì)胞分化。解離H7系未分化hES細(xì)胞，直接接種在明膠包被上的，無(wú)須經(jīng)過(guò)胚胎樣小體階段。在分化培養(yǎng)液(80％KO-DMEM，1mML-谷氨酰胺，0.1mMβ-琉基乙醇，1％氨基酸和20％胎牛血清)中培養(yǎng)接種細(xì)胞。第14天在用10μM5-氮脫氧胞嘧啶處理的培養(yǎng)物中，第10-12天或12-14天和更遲時(shí)間在所有培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了收縮性心肌細(xì)胞。
實(shí)施例7向心因子的有效組合此實(shí)施例是加入的生長(zhǎng)因子和5-氮脫氧胞嘧啶影響人ES細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞聯(lián)合作用的研究。
稱為H1的人ES細(xì)胞系通常在標(biāo)準(zhǔn)的胚胎樣小體方法后產(chǎn)生比H4和H9系較少的搏動(dòng)性心觀細(xì)胞。為了提高心肌細(xì)胞產(chǎn)量，將一系列生長(zhǎng)因子以及5-氮脫氧胞嘧啶加入分化性H1培養(yǎng)物中。
原理如下篩選第一組因子因?yàn)樗鼈兡茉谧畛醵ㄐ椭刑峁﹥?nèi)胚層功能。篩選第2組因?yàn)樵诤罄m(xù)發(fā)育中與第1組因子聯(lián)合能提供內(nèi)胚層功能。篩選第三組因子因?yàn)樗鼈兪切募〖?xì)胞延長(zhǎng)培養(yǎng)的存活因子。典型的工作濃度定義為“中等”水平，低4倍和高4倍定義為“低”水平和“高”水平。濃度顯示如下表2示范性向心因子

圖7(上圖)顯示采用這些因子的時(shí)間表。第48代的H1細(xì)胞用膠原酶處理然后用機(jī)械方法以5ml移液管刮，從平皿中取出H1細(xì)胞用于產(chǎn)生胚胎樣小體。將-孔10平方厘米的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到低粘附性板中的-10平方厘米孔中，在4ml含20％為FB5的DMEM中(含或不含其它因子)培養(yǎng)4天。4天后將每份胎樣小體懸液分成二等份接種在明膠包被的粘附性6孔組織培養(yǎng)板的2孔中。在4ml含20％為FB5的DMEM中(含或不含其它因子)的培養(yǎng)粘附性胚胎樣小體及基過(guò)長(zhǎng)物11天。用光學(xué)顯微鏡觀察每孔中搏動(dòng)區(qū)的數(shù)目后，收獲各孔的RNA進(jìn)行定量PCR分析。
在第0天(未分化細(xì)胞移入懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生胚胎樣小體的那一天)加入第一組因子直到第8天(胚胎樣小體種入明膠包被孔后4天)。第4天(接種時(shí)間)加入第2組因子直到第8天。第8天加入第3組因子直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第15天)。使一部分培養(yǎng)物接觸5-氮脫氧胞嘧啶48小時(shí)(第6-8天)第6.8.11和13天用加或不加因子的新鮮培養(yǎng)液飼喂培養(yǎng)物。
發(fā)現(xiàn)在對(duì)照培養(yǎng)物(維持在缺乏添加的生長(zhǎng)因子/5-氮脫氧胞嘧啶中)或維持在加有生長(zhǎng)因子但缺乏5-氮脫氧胞嘧啶的那些培養(yǎng)物中沒(méi)觀察到搏動(dòng)區(qū)，但在加入生長(zhǎng)因子和5-氮脫氧胞嘧啶混合物的所有孔中觀察到搏動(dòng)區(qū)。
圖7(下圖)顯示定量PCR分析(TagmanTM)心肌基因α肌球蛋白重鏈(αMHC)的表達(dá)相當(dāng)于正常心臟RNA的水平。在接觸生長(zhǎng)因子(GF)加5-氮脫氧胞嘧啶的細(xì)胞中其表達(dá)水平高得多，測(cè)試的最低濃度足以獲得較高的αMHC表達(dá)(比對(duì)照高30倍)。
后續(xù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)說(shuō)明了這些結(jié)果。如上所述培養(yǎng)H1細(xì)胞(第38代)例外的是a)只采用先前實(shí)驗(yàn)所用的最低濃度的生長(zhǎng)因子和b)在一組樣品中刪組去第3組因子處理，以實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)測(cè)定了相對(duì)于未分化細(xì)胞的標(biāo)志表達(dá)水平。
圖8顯示從方案中刪去第3組因子處理導(dǎo)致αMHC的RNA表達(dá)量進(jìn)一步提高3倍，還測(cè)到早期心觀細(xì)胞相關(guān)基因GATA-4表達(dá)的提高。相反在這些條件下沒(méi)有特異性誘導(dǎo)內(nèi)胚層相關(guān)基因HNF36。與內(nèi)胚層相關(guān)基因HNV3b相比對(duì)αMHC和GATA-4的作用是篩選性的。而用任何生長(zhǎng)因子的組合但不用5-氮脫氧胞嘧啶時(shí)HNF3b的表達(dá)都提高了。
這些結(jié)果表明第1組和第2組生長(zhǎng)因子提高了心肌細(xì)胞特征性搏動(dòng)細(xì)胞的比例。
實(shí)施例8在含有增多因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)通過(guò)第5天形成的懸浮胚胎樣小體H9系hES細(xì)胞發(fā)生分化，并于第12天在分化培養(yǎng)液中Matrigel包被板上進(jìn)一步分化。用含200U/ml膠原酶II(Worthington)、0.2％胰蛋白酶(Invine Scientific)和0.02％葡萄糖的PBS溶液解離這些細(xì)胞，接種在分離培養(yǎng)液中Matrigel包被板上，再培養(yǎng)14天。
然后將細(xì)胞移入含10-7M胰島素(Sigma)、0.2％牛白蛋白(Sigma)、5mM肌酸(Sigma)、2mM肉堿和5mM牛磺酸(Sigma)的”CCT”培養(yǎng)液(用Gibco培養(yǎng)液199配)中。見(jiàn)Volz等，J.Mol.Cell Cardiol.23161，1991和Li等，J.Tiss.Cult.Meth.15147，1993。為了比較，將對(duì)照培養(yǎng)物維持在含20％FBS的標(biāo)準(zhǔn)分化培養(yǎng)液中。
圖9顯示移入CCT培養(yǎng)液后搏動(dòng)區(qū)的數(shù)目(分開的線表示研究過(guò)程中各孔分離后進(jìn)行的觀察)。在CCT培養(yǎng)液中細(xì)胞生長(zhǎng)7-14天后顯示搏動(dòng)區(qū)數(shù)目增加，這表明肌酸、肉堿和?；撬岱謩e或聯(lián)合作用提高了培養(yǎng)物中心肌細(xì)胞系細(xì)胞的比例。
實(shí)施例9四相離心分離方法通過(guò)第4天形成胚胎樣小體然后在明膠包被板上增殖(不用5-氮脫氧胞嘧啶和生長(zhǎng)因子)，H7系細(xì)胞的hES細(xì)胞產(chǎn)生了心肌細(xì)胞。用膠原酶B解離細(xì)胞重懸于分化培養(yǎng)液中，然后將細(xì)胞懸液層疊到不連續(xù)梯度PercollTM上，1500g離心30分鐘。收集4個(gè)組分I.上界面層；II.40.5％層；III.下界面層；IV.58.5％層。洗滌細(xì)胞，重懸于分化培養(yǎng)液中。將免疫染色的細(xì)胞接種在帶小室的玻片上，每孔10000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2天或7天，然后固定并染色。
結(jié)果見(jiàn)表3。計(jì)算各組分一式二孔30個(gè)圖象中的MHC陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以3孔細(xì)胞的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

所有組分中均觀察到搏動(dòng)細(xì)胞，但組分III和IV含有最高百分比的搏動(dòng)細(xì)胞。
圖10顯示用H1系hES細(xì)胞進(jìn)行類似方法的結(jié)果。在分化22天用PercollTM分離細(xì)胞。實(shí)時(shí)RT-PCR分析檢測(cè)的心肌MHC水平比分離前的細(xì)胞高得多。數(shù)據(jù)顯示用18S RNA作為標(biāo)準(zhǔn)，組分III和IV按總轉(zhuǎn)錄比率而言具有最高水平的MHC表達(dá)。
表4 顯示間接免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定的細(xì)胞表型。
表4 分離的細(xì)胞群的特征鑒定表位心肌細(xì)胞系非心肌細(xì)胞系cTnI++-心肌特異性α/βMHC ++-心肌βMHC ++-肌原纖維節(jié)MHC ++-N-鈣粘著蛋白++±平滑肌肌動(dòng)蛋白 ++ 亞組肌細(xì)胞生成素- -甲胎蛋白- -β-微管蛋白 - -Ki67 亞組 亞組BrdU 亞組 亞組SSEA-4 - -Tra-1-81- -密度梯度離心分離的心肌細(xì)胞群可通過(guò)cTnI和MHC染色鑒別。肌細(xì)胞生成素、甲胎蛋白或β微管蛋白III不染色表示缺乏骨骼肌、內(nèi)胚層細(xì)胞和神經(jīng)元。缺乏SSEA-4和Tra-1-81染色證實(shí)沒(méi)有未分化的hES細(xì)胞。
據(jù)報(bào)道α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)存在于胚胎樣和胚胎心肌細(xì)胞中，但不存在于成熟心肌細(xì)胞中(Leor等，Circulation 971332，1996；Etzion等，Mol.Cell.Cardiol.331321，2001)。事實(shí)上該心肌細(xì)胞分化方案獲得的所有cTnI-陽(yáng)性細(xì)胞和cTnI-陰性細(xì)胞的一個(gè)亞組為SMA陽(yáng)性，這提示它們可能處在早期并能增殖。
將組分III和IV的細(xì)胞再接種培養(yǎng)2天，43±4％的sMHC陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)了BrdU，表明它們處在細(xì)胞周期的S期。其他實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)cTnI-陽(yáng)性細(xì)胞的一個(gè)亞組表達(dá)Ki67。這些結(jié)果表明該細(xì)胞群中大約20％或40％的心肌細(xì)胞正經(jīng)歷活躍增殖。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不脫離本發(fā)明以下權(quán)利要求書所述的思路下對(duì)本文提供的組合物和方法進(jìn)行有效的修改。
權(quán)利要求
1.一種分離的細(xì)胞群，其特征在于，該細(xì)胞群中至少約5％的細(xì)胞具有與靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞某細(xì)胞系相同的基因組；并表達(dá)至少一種內(nèi)源基因的以下標(biāo)志心肌鈣蛋白I(cTnI)、心肌鈣蛋白T(cTnT)或前房利尿鈉因子(ANF)。
2.一種分離的細(xì)胞群，其特征在于，該細(xì)胞群中至少約5％的細(xì)胞具有與靈長(zhǎng)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞某細(xì)胞系相同的基因組，并具有自發(fā)周期性收縮活性。
3.如以上兩項(xiàng)權(quán)利要求中任一所述的細(xì)胞群，其中，至少約20％的細(xì)胞表達(dá)選自以下的至少三種標(biāo)志cTnI、cTnT、肌原纖維節(jié)肌球蛋白重鏈(MHC)、GATA-4、NKx2.5、N-鈣粘著蛋白、β1-腎上腺素受體(β1-AR)、MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌球蛋白和前房利尿鈉因子(ANF)。
4.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)胞群，其中，至少約60％的增殖細(xì)胞表達(dá)心肌特異性肌球蛋白重鏈。
5.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)胞群，其中，所述細(xì)胞群能在體外培養(yǎng)中增殖同時(shí)保持所述特征。
6.如以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群含有經(jīng)基因修飾而能表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)酶的細(xì)胞。
7.一組兩種細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞群由以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)胞群和獲自未分化pPS細(xì)胞系的細(xì)胞群組成。
8.如權(quán)利要求1-6所述的細(xì)胞群，它們屬于權(quán)利要求7所述的那組細(xì)胞群。
9.一種產(chǎn)生以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述細(xì)胞群的方法，其特征在于，所述方法包括使pPS細(xì)胞及其后代細(xì)胞在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)環(huán)境中分化。
10.一種產(chǎn)生含有靈長(zhǎng)動(dòng)物心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞組合物的方法，其特征在于，所述方法包括a)在基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境中培養(yǎng)pPS細(xì)胞，b)使培養(yǎng)的細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞前體細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求9-10所述的方法，所述方法包括使懸浮培養(yǎng)的pPS細(xì)胞分化。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，所述方法還包括使接種后懸浮培養(yǎng)液中形成的聚集物在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上不斷分化。
13.如權(quán)利要求9-13所述的方法，所述方法包括使pPS細(xì)胞在含有向心因子的生長(zhǎng)環(huán)境中分化。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述向心因子是能影響DNA甲基化的核苷類似物。
15.如權(quán)利要求13-14所述的方法，其中，所述向心因子是5-氮脫氧胞嘧啶。
16.如權(quán)利要求9-15所述的方法，所述方法包括使pPS細(xì)胞在含有形態(tài)發(fā)生素和至少兩種生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)環(huán)境中分化。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述形態(tài)發(fā)生素是活化素，所述生長(zhǎng)因子包括胰島素樣生長(zhǎng)因子和TGFβ家族的一個(gè)成員。
18.如權(quán)利要求9-17所述的方法，所述方法還包括物理性分離所述細(xì)胞群中表達(dá)MHC或自發(fā)收縮的細(xì)胞與其它細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述分離包括將所述細(xì)胞群中的細(xì)胞按其密度分布并收集密度約在1.05-1.075g/ml之間的細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求9-19所述的方法，所述方法還包括在含有能形成高能磷酸鍵的化合物、?；d體分子和心肌鈣通道調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)所述細(xì)胞至少一周。
21.如權(quán)利要求9-20所述的方法，所述方法還包括在含的肌酸、肉堿或?；撬岬呐囵B(yǎng)液中培養(yǎng)所述細(xì)胞至少一周。
22.一種篩選對(duì)心肌細(xì)胞有毒性或有調(diào)節(jié)作用的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括將該化合物與權(quán)利要求1-8所述的細(xì)胞群混合(培養(yǎng))，并測(cè)定該化合物所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞素性或調(diào)節(jié)作用。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，所述方法包括監(jiān)測(cè)所述化合物對(duì)細(xì)胞群中細(xì)胞收縮活性的影響。
24.一種藥物，其特征在于，所述藥物含有權(quán)利要求1-8所述的細(xì)胞群或用權(quán)利要求9-21所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群，以及適合人類服用的藥物賦形劑。
25.如權(quán)利要求1-8所述細(xì)胞群或用權(quán)利要求9-21所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群在制備用于冶療心臟疾病的藥物中的應(yīng)用。
26.一種冶療心臟疾病的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品在一裝置中含有權(quán)利要求1-8所述的細(xì)胞群或用權(quán)利要求9-21所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群，所述裝置適合將所述細(xì)胞群輸入心肌組織或心肌組織周圍。
27.一種重建或修復(fù)心肌組織收縮活性的方法，其特征在于，所述方法包括使所述心肌組織與權(quán)利要求1-8所述的細(xì)胞群或用權(quán)利要求9-21所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群接觸。
28.一種冶療個(gè)體心臟疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給予所述個(gè)體權(quán)利要求1-8所述的細(xì)胞群或用權(quán)利要求9-21所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞群。
29.以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的產(chǎn)品、方法或用途，其中，所述pPS細(xì)胞分離自人胚泡或這類細(xì)胞的后代細(xì)胞。
30.以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的產(chǎn)品、方法或用途，其中，所述pPS細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了人心肌細(xì)胞系細(xì)胞群。通過(guò)使多能干細(xì)胞的培養(yǎng)物體外分化，然后收集具有某些表型特征的細(xì)胞而獲得這些細(xì)胞。此分化細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的特征性細(xì)胞表面標(biāo)志和形態(tài)標(biāo)志，并且它們的一部分經(jīng)歷了自發(fā)性的周期性收縮，可獲得高度富集的此種心肌細(xì)胞群和它們的復(fù)制性前體細(xì)胞，適用于各種應(yīng)用，如心臟病的藥物篩選和治療。
文檔編號(hào)A61K35/34GK1543500SQ02813927
公開日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月12日
發(fā)明者C·徐, C 徐 申請(qǐng)人:杰龍公司