一種高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備睪丸細(xì)胞懸液；步驟二，將睪丸細(xì)胞懸液按照一定密度接種到孔板中，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)；步驟三，去掉培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化培養(yǎng)不同時(shí)間的睪丸細(xì)胞，從睪丸細(xì)胞中用免疫磁珠法分選精原干細(xì)胞；步驟四，將分選的精原干細(xì)胞接種到STO滋養(yǎng)層上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。本發(fā)明通過(guò)分離→培養(yǎng)→再分離→再培養(yǎng)的方法，建立了小鼠精原干細(xì)胞系，該發(fā)明可以達(dá)到體外高效富集精原干細(xì)胞的目的，且經(jīng)濟(jì)易行。從而為珍稀動(dòng)物品種的保護(hù)及男性不育的治療提供一個(gè)方向。
【專利說(shuō)明】
一種高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 精原干細(xì)胞是雄性哺乳動(dòng)物睪丸內(nèi)維持精子發(fā)生的根源，自從1998年Brinster實(shí) 驗(yàn)室第一次成功的對(duì)小鼠的精原干細(xì)胞進(jìn)行了體外培養(yǎng)，并且證明了精原干細(xì)胞脫離曲細(xì) 精管后在體外可以長(zhǎng)期培養(yǎng)以來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)室也開始研究哺乳動(dòng)物的精原干細(xì)胞，但是小 鼠睪丸內(nèi)精原干細(xì)胞數(shù)量較少，且分離得到的精原干細(xì)胞純度也較低，即使目前認(rèn)為分離 純度較高的THY-1抗體直接分離得到的精原干細(xì)胞純度也僅為60%左右，因而會(huì)影響其培養(yǎng) 擴(kuò)增，我們通過(guò)優(yōu)化分離培養(yǎng)條件，能夠從不同周齡小鼠獲得純度較高且倍增時(shí)間較短的 精原干細(xì)胞。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)的分離小鼠精原干細(xì)胞的方法為，目前常用的分離小鼠精原干細(xì)胞方法 多數(shù)是以出生后5-7天的雄性小鼠為模型，直接用免疫磁珠法或借助流式細(xì)胞儀根據(jù)抗原 抗體反應(yīng)分選精原干細(xì)胞，但是，現(xiàn)有方法存在三個(gè)弊端:第一，實(shí)驗(yàn)對(duì)象比較局限，只能選 擇未進(jìn)入減數(shù)分裂期的小鼠，因?yàn)橐坏┻M(jìn)入減數(shù)分裂，在分選過(guò)程中就會(huì)帶入許多體細(xì)胞 及各級(jí)精母細(xì)胞，降低精原干細(xì)胞純度;第二，分離得到的精原干細(xì)胞數(shù)量少，通常分離一 只出生后5-7天的小鼠僅可獲得1 X 104-1.5 X 104個(gè)細(xì)胞/ml，分離一只成年鼠可獲得2 X 105-3 X 105個(gè)細(xì)胞/ml;第三，成本較高，由于分離得到的精原干細(xì)胞數(shù)量較少且增殖速度較 慢，要想得到更多的精原干細(xì)胞，需要長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，因此，導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的各項(xiàng)成本增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，成本 低，操作簡(jiǎn)單，可以從小鼠睪丸中高效分離出精原干細(xì)胞。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高效分離小鼠精原干細(xì) 胞的方法，包括以下步驟： (1) 收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備睪丸細(xì)胞懸液； (2) 將睪丸細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 3d更換一次培養(yǎng)液； (3 )去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，用免疫磁珠法分離出精原干細(xì)胞； (4)將分離出來(lái)的精原干細(xì)胞接種到ST0滋養(yǎng)層上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)精原干 細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。
[0006] 所述步驟(4)精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)方法為:每2天更換一次精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，5-7d傳代一次;所述傳代培養(yǎng)為:去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中消 化，離心收集細(xì)胞之后加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到新的ST0滋養(yǎng)層上培養(yǎng)。
[0007] 所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液成分包括:ΜΕΜα基礎(chǔ)培養(yǎng)基、牛血清白蛋白BSA、游離脂肪 酸FFA、L-谷氨酰胺L-Glutamine、亞硒酸鈉 Na2Se〇3、Human recombinant GDNF、Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、Human recombinant BFGF、膜島素 Insulin、車專鐵蛋白 Transf er in、腐胺 Putresc ine、HEPES、2-疏基乙醇 2-ME、雙抗 P/S 〇
[0008] 所述牛血清白蛋白的體積含量為ο. 2%-0.3%，所述游離脂肪酸的含量為e-Syeq/L， 所述L-谷氨酰胺的含量為2-3mM，所述亞硒酸鈉的含量為2X 10-8-3Χ 10-8Μ，所述⑶NF含量 為20-30ng/ml，所述GFRa-Ι含量為200-300ng/ml，所述BFGF含量為l-2ng/ml，所述胰島素的 含量為3 -5μg/ml，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為8-10μg/ml，所述腐胺的含量為55 -60μΜ，所述 HEPES的含量為7-10mM，所述β-巰基乙醇的含量為40-50μΜ，雙抗?jié)舛葹?倍-2倍。
[0009] 具體地說(shuō)，包括以下步驟： (1) 分離小鼠睪丸細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出生后5天-8周等不同周齡的雄性小鼠，用頸椎脫臼方法處死后取出雙側(cè) 睪丸，洗去血污，去掉白膜，用兩步酶消化法獲得睪丸細(xì)胞，然后用70μπι孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾 細(xì)胞懸液，將獲得的睪丸細(xì)胞按照一定密度接種到6孔板中，置于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，培養(yǎng)液為精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，3d更換一次培養(yǎng)液； (2) 制備ST0滋養(yǎng)層 在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ST0細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)，加入終濃度為17μg/ml 的絲裂霉素 C，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3小時(shí)后加入胰蛋白酶，在37 °C培養(yǎng)箱中消化收集ST0 細(xì)胞，按照需要調(diào)整細(xì)胞密度加入凍存液，分裝到凍存管中放置于_80°C過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至液氮 中長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫?(3) 接種ST0滋養(yǎng)層 在12孔板中加入含有0.2%明膠的DPBS包被過(guò)夜，次日取出放置于超凈工作臺(tái)晾干2小 時(shí)，37°C水浴復(fù)蘇用絲裂霉素 C處理后的ST0細(xì)胞，逐滴加入ST0培養(yǎng)液，用移液槍輕柔吹打 混勻后離心棄上清，再加入ST0培養(yǎng)液接種到明膠包被后的12孔板中，37°C，5% C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)12小時(shí)； (4) 分離精原干細(xì)胞 將培養(yǎng)不同時(shí)間的睪丸細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用結(jié)合有THY-1抗體的磁珠4°C孵育 20min，過(guò)分選柱，分離出精原干細(xì)胞，然后加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到含有ST0滋養(yǎng)層 的12孔板上，置于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5) 精原干細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)精原干細(xì)胞，2d更換一次培養(yǎng)液;5-7d傳代一次，傳代的方法為:去掉培養(yǎng)液，加入 胰蛋白酶，于37 °C培養(yǎng)箱中消化，離心收集精原干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度加入精原干細(xì)胞培養(yǎng) 液，將精原干細(xì)胞接種到新的含有ST0滋養(yǎng)層的12孔板中培養(yǎng)； 所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:MEMa基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積含量為0.2%的牛血清白蛋白BSA、 7.6叩9/1的游離脂肪酸FFA、2M的L-谷氨酰胺1^-611^31^1^、3\10-%的亞硒酸鈉似236〇 3、 20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的 Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、 lng/ml的Human recombinant BFGF、5μg/ml的膜島素 Insulin、10μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白 Transferin、60yM的腐胺Putrescine、lOmM 的HEPES、50yM 的2-疏基乙醇2-ME、1 倍的雙抗 P/S 〇
[0010] 本發(fā)明的有益效果是:與常用的精原干細(xì)胞分離方法相比，具有以下四個(gè)優(yōu)勢(shì):首 先，我們既可以從出生后5-7d的雄性乳鼠睪丸中分離精原干細(xì)胞，也可以從性成熟后的雄 性小鼠睪丸內(nèi)分離精原干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)對(duì)象不受限制;其次，我們通過(guò)培養(yǎng)小鼠睪丸細(xì)胞使得 睪丸內(nèi)的體細(xì)胞及各級(jí)精母細(xì)胞大量死亡，因此，可以提高精原干細(xì)胞的分離純度;再次， 在用精原干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)睪丸細(xì)胞期間，精原干細(xì)胞會(huì)大量增殖，分離一只出生后5-7天 的小鼠可獲得4X 104-5 X 104個(gè)細(xì)胞/ml，而分離一只成年小鼠可獲得8.6 X 105-1.5 X 106個(gè) 細(xì)胞/ml，比常用分離方法得到的精原干細(xì)胞數(shù)量增加4-5倍;第四，由于我們可以在短時(shí)間 內(nèi)培養(yǎng)即可獲得大量的精原干細(xì)胞，因此，節(jié)約細(xì)胞培養(yǎng)成本，經(jīng)濟(jì)易行。本發(fā)明分離方法 簡(jiǎn)便，獲得的精原干細(xì)胞數(shù)量可倍增，對(duì)于不孕不育的治療以及瀕臨滅絕物種資源的保護(hù) 具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為精原干細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖（a-e)分別為第一代到第五代的精原干細(xì)胞細(xì) 胞圖，a，c，e)標(biāo)尺:100ym;b，d)標(biāo)尺:50μηι)。
[0012] 圖2為ΑΡ染色結(jié)果圖（標(biāo)尺:25μπι)。
[0013] 圖3為培養(yǎng)6代后的精原干細(xì)胞不同表面標(biāo)記物的免疫熒光染色結(jié)果圖（注:a-d) C-KIT基因；e-h)0CT4基因；i-l)PLZF基因，其中a，e，i為明視野細(xì)胞圖，b，f，j為DAPI復(fù)染， c，g，k為GFP細(xì)胞，d，h，1為不同抗體染色結(jié)果，標(biāo)尺:25μπι)。
[0014]圖4為流式分析結(jié)果圖。
[0015] 圖5為RT-PCR電泳圖（注：從左至右依次為培養(yǎng)7d:0CT-4、DDX4、DAZL;培養(yǎng)3d: OCT-4、DDX4、DAZL;培養(yǎng)0d: OCT-4、DDX4、DAZL)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明： 本發(fā)明的高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法包括以下步驟： (1) 收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備睪丸細(xì)胞懸液； (2) 將睪丸細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 3d更換一次培養(yǎng)液； (3 )去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，用免疫磁珠法分離出精原干細(xì)胞； (4)將分離出來(lái)的精原干細(xì)胞接種到ST0滋養(yǎng)層上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)精原干 細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。
[0017] 所述步驟(4)精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)方法為:每2天更換一次精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，5-7d傳代一次;所述傳代培養(yǎng)為:去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中消 化，離心收集細(xì)胞之后加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到新的ST0滋養(yǎng)層上培養(yǎng)。
[0018] 所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液成分包括:ΜΕΜα基礎(chǔ)培養(yǎng)基、牛血清白蛋白BSA、游離脂肪 酸FFA、L-谷氨酰胺L-Glutamine、亞硒酸鈉 Na2Se〇3、Human recombinant GDNF、Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、Human recombinant BFGF、膜島素 Insulin、車專鐵蛋白 Transf er in、腐胺 Putresc ine、HEPES、2-疏基乙醇 2-ME、雙抗 P/S 〇
[0019] 所述牛血清白蛋白的體積含量為0.2%-0.3%，所述游離脂肪酸的含量為e-Syeq/L， 所述L-谷氨酰胺的含量為2-3mM，所述亞硒酸鈉的含量為2X 10-8-3Χ 10-8Μ，所述⑶NF含量 為20-30ng/ml，所述GFRa-Ι含量為200-300ng/ml，所述BFGF含量為l-2ng/ml，所述胰島素的 含量為3-5μg/ml，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為8 -10μg/ml，所述腐胺的含量為55 -60μΜ，所述 HEPES的含量為7-10mM，所述β-巰基乙醇的含量為40-50μΜ，雙抗?jié)舛葹?倍-2倍。
[0020] 具體地說(shuō)，包括以下步驟： (1) 分離小鼠睪丸細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出生后5天-8周等不同周齡的雄性小鼠，用頸椎脫臼方法處死后取出雙側(cè) 睪丸，洗去血污，去掉白膜，用兩步酶消化法獲得睪丸細(xì)胞，然后用70μπι孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾 細(xì)胞懸液，將獲得的睪丸細(xì)胞按照一定密度接種到6孔板中，置于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，培養(yǎng)液為精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，3d更換一次培養(yǎng)液； (2) 制備ST0滋養(yǎng)層 在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ST0細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)，加入終濃度為17μg/ml 的絲裂霉素 C，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3小時(shí)后加入胰蛋白酶，在37 °C培養(yǎng)箱中消化收集ST0 細(xì)胞，按照需要調(diào)整細(xì)胞密度加入凍存液，分裝到凍存管中于液氮中保存?zhèn)溆茫?(3) 接種ST0滋養(yǎng)層 在12孔板中加入含有0.2%明膠的DPBS包被過(guò)夜，第二天37 °C水浴解凍絲裂霉素 C處理 后的ST0細(xì)胞，加入ST0培養(yǎng)液，離心收集細(xì)胞，再加入ST0培養(yǎng)液接種到明膠包被后的12孔 板中。37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)； (4) 分離精原干細(xì)胞 將培養(yǎng)不同時(shí)間的睪丸細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用結(jié)合有THY-1抗體的磁珠4°C孵育 20min，過(guò)分選柱，分離出精原干細(xì)胞，然后加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到含有ST0滋養(yǎng)層 的12孔板上，置于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5) 精原干細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)精原干細(xì)胞，2d更換一次培養(yǎng)液;5-7d傳代一次，傳代的方法為:去掉培養(yǎng)液，加入 胰蛋白酶，于37 °C培養(yǎng)箱中消化，離心收集精原干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度加入精原干細(xì)胞培養(yǎng) 液，將精原干細(xì)胞接種到新的含有ST0滋養(yǎng)層的12孔板中培養(yǎng)。
[0021] 所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:ΜΕΜα基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.2%的牛血清白蛋白（BSA)、7.6μ eq/L的游離脂肪酸（FFA)、2mM的L-谷氨酰胺（L-Glutamine)、3X 10 -8Μ的亞硒酸鈉 (Na2Se〇3)、20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、lng/ml的Human recombinant BFGF、5μg/ml的膜島素（Insulin)、10μg/ml的轉(zhuǎn)鐵 蛋白（Transferin)、60μΜ的腐胺（Putrescine)、lOmM的HEPES、50yM的2-疏基乙醇（2-ME)、1 倍的雙抗(P/S)，其中GDNF因子對(duì)于精原干細(xì)胞的培養(yǎng)非常重要。 實(shí)施例
[0022] 小鼠精原干細(xì)胞的建系培養(yǎng) 步驟一，睪丸細(xì)胞的分離與培養(yǎng) (1)將出生后7天或8周齡的雄性小鼠頸椎脫臼處死后浸泡到75%酒精中消毒，然后在超 凈工作臺(tái)中取出雙側(cè)睪丸，用DPBS洗去血污，去掉組織白膜。
[0023] (2)用剪刀將組織剪碎后移至含44(^101^5的24孔板中，孔板中加入50μ1濃度為 1 mg/m 1的膠原酶IV和10μ 1濃度為7mg/m 1的DNase I，吹打混勻后在37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)消化 15min，每隔3min用移液槍吹打一次。
[0024] (3)將孔板中的液體轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，加入等體積的DPBS，4°C，600g，離心 7min，棄上清。再加入lml DPBS重懸細(xì)胞，4°C，600g，離心7min離心洗一遍。
[0025] (4)加入480μ1 含0.25%Typsin-EDTA 的 DPBS和 20μ1 濃度為 7mg/ml 的 DNasel，在 37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)消化5min，加入50μ1的FBS終止消化，收集細(xì)胞于1.5ml離心管中，再加入等體積 的DPBS，4°C，600g，離心7min，棄上清。
[0026] (5)加入lml DPBS重懸細(xì)胞，用70μπι孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，4°C，600g， 離心7min，棄上清。以IX 107個(gè)細(xì)胞/孔調(diào)整細(xì)胞密度接種于6孔板中。3天更換一次培養(yǎng)液。 [0027]步驟二，精原干細(xì)胞分離與培養(yǎng) 精原干細(xì)胞的分離 (1)小鼠睪丸細(xì)胞用精原干細(xì)胞培養(yǎng)液分別培養(yǎng)3d、7d、10d后，去掉培養(yǎng)液，加入400μ1 含0 · 05%Typsin-EDTA的DPBS消化5min，加入50μ1 的FBS終止反應(yīng)，4°C，600g離心7min，棄上 清。
[0028] (2)加入lml的DPBS重懸細(xì)胞，用40μπι孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，4°C，600g 離心7min，棄上清； (3) 30% Percoll密度梯度離心：加入5ml PBS-S重懸細(xì)胞后移入含有2ml 30% Percoll 的15ml離心管中，4°C，600g，離心7min;先用移液槍小心去除細(xì)胞碎片，然后去掉所有上清， 用2ml的PBS-S重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，4°C，600g，離心7min，棄上清； (4) 用90μ1的PBS-S重懸細(xì)胞，加入10μ1結(jié)合有抗THY-1特異抗體的磁珠，4°C孵育 30min，每lOmin彈撥混勾一次;加入1.2ml PBS-S混勾，4°C，600g離心7min，棄上清，再加入 lml PBS-S重新懸浮細(xì)胞； (5) 將MS分選柱置于磁場(chǎng)中，先用500μ1 PBS-S潤(rùn)洗分選柱一次，然后將細(xì)胞懸液加入 分選柱，再用500μ1 PBS-S洗分選柱三次;洗脫：向MS分選柱中加入lml SFM培養(yǎng)液，迅速將 分選柱移出磁場(chǎng)，用配套的柱塞緩慢推出細(xì)胞液到1.5ml離心管中，4°C，600g離心7min，棄 上清，再用lml精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重復(fù)離心洗滌2次;將細(xì)胞懸浮于lml精原干細(xì)胞培養(yǎng)液 中，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度以2X 105個(gè)細(xì)胞/孔接種于以ST0為滋養(yǎng)層的12孔板中，置于37°C， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0029]步驟三，精原干細(xì)胞培養(yǎng)液的配方 (1)配制精原干細(xì)胞培養(yǎng)液:ΜΕΜα培養(yǎng)基中加入0.2%牛血清白蛋白（BSA)在4°C過(guò)夜溶 解，次日再加入終濃度為7 Aueq/L的游離脂肪酸(FFA)、2mM的L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、 3X10-8M的亞硒酸鈉（Na2Se〇3)、20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的 Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、lng/ml 的Human recombinant BFGF、5μg/ml的膜島素 (Insulin)、10μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferin)、60μΜ的腐胺(Putrescine)、lOmM 的HEPES、 50μΜ的2-巰基乙醇（2-ME)、l倍的雙抗(P/S)。
[0030] (2)配制ST0滋養(yǎng)層培養(yǎng)液：以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加終濃度為7%的FBS， 100μπι的2-ME，10 mM的HEPES，2 mM的谷氨酰胺，1倍的雙抗;用0.2μπι的濾器過(guò)濾除菌，4°C 保存。
[0031] 步驟四，ST0滋養(yǎng)層的制備 (1)將解凍后的ST0細(xì)胞以IX 106個(gè)細(xì)胞/皿的密度均勻接種于10cm培養(yǎng)皿里，加入 l〇ml的培養(yǎng)基，于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (2 )培養(yǎng)3-4d后在顯微鏡下觀察，在細(xì)胞密度達(dá)到視野的80%-90%時(shí)，按1:10的比例傳 代； (3) 傳代后的細(xì)胞仍按照之前的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天； (4) 向培養(yǎng)皿中加入終濃度為17μg/ml的絲裂霉素 C，在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h; (5) 吸掉培養(yǎng)液，用DPBS洗3次； (6) 向培養(yǎng)皿中加入3ml含0.05% Trypsin-EDTA的DPBS，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化5min，加入 300μ1的FBS終止消化，移液槍輕輕吹打使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞，4°C，600g，離心7min，棄上 清。加入lml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，4°C，600g，離心7min，棄上清； (7 )配制凍存液:將FBS和DMSO以9:1的比例混合； (8) 將絲裂霉素處理后的STO按照需要適當(dāng)調(diào)整密度，加入凍存液分裝于凍存管中； (9) 將凍存管放入程序冷凍盒中，然后將冷凍盒放入_80°C冰箱凍存，24h后轉(zhuǎn)移到液氮 中長(zhǎng)期保存。
[0032] (10)接種密度以5 X104個(gè)細(xì)胞/cm2接種于12孔板中；接種后4天內(nèi)可以使用，使用 前更換為精原干細(xì)胞的培養(yǎng)液。
[0033]精原干細(xì)胞鑒定 (1)堿性磷酸酶染色 將精原干細(xì)胞傳至7代后接種于24孔板中，培養(yǎng)4天后即可進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定， 具體方案為： (1) 去掉培養(yǎng)液，DTOS洗3次，每次5min; (2) 加入300μ1 4%多聚甲醛固定2min，DPBS洗3次； (3 )中杉金橋的堿性磷酸酶染色試劑盒染色，其中各配方比例為AP buffer: NBT: BCIP= 100:1:1，每孔加300μ1染液，染色15min，于倒置顯微鏡下觀察，拍照。
[0034] (2)免疫熒光染色 精原干細(xì)胞傳至第6代后，接種于24孔板中，接種前在24孔板中放入消毒后的蓋玻片。 培養(yǎng)4天后即可進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，具體方案為： (1) 固定：去培養(yǎng)液，DPBS洗3次，每次5min;加入4%多聚甲醛固定lOmin，再用DPBS洗三 次，每次5min; (2) 通透:加入300μ1含0.1% Triton的超純水，靜置lOmin，DPBS洗3次，每次5min; (3) 封閉：加入300μ1含10%雞血清的DPBS室溫封閉lh; (4) 一抗孵育：用含10%雞血清的DPBS分別稀釋C-KIT、OCT-4、PLZF抗體，稀釋比例為1: 100;陰性對(duì)照為不加一抗的10%雞血清;將24孔板放入濕盒內(nèi)，4°C孵育過(guò)夜； (5) 取出24孔板，復(fù)溫30min，去掉一抗，DBPS洗3次，每次5min; (6.)二抗孵育:二抗為TR標(biāo)記的雞抗兔抗體，用10%雞封閉血清稀釋二抗，稀釋比例為 1:200;黑盒內(nèi)室溫孵育111; (7) DAPI染色：去掉二抗，用DPBS洗3次，每次5min，加入200μ1 DAPI染劑，染色3min; 去除染液，DPBS洗2次，每次5min; (8) 用抗熒光萃滅試劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照，記錄； 小鼠精原干細(xì)胞純化效率提高鑒定 流式細(xì)胞術(shù)分析 準(zhǔn)備分別培養(yǎng)0(1、3(1、7(1、10(1的小鼠睪丸細(xì)胞，加入11111含0.05°/^?8丨1140了4的0?83于 37 °C培養(yǎng)箱中消化5min，再加入lOOul的FBS終止消化，收集細(xì)胞到1.5ml離心管中，用70μπι 細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，4°C，600g離心7min，棄上清。然后完成以下步驟： (1)固定:每管加入1〇〇μ1 4%多聚甲醛室溫固定lOmin，加入lml 0?83,4°(：，60(^，離心 7min，棄上清。
[0035] (2)通透:每管加入100μΙ 0 · 05%TritonX-100，室溫通透lOmin，加入lmlDPBS，4Γ， 600g，離心7min，棄上清。
[0036] (3)封閉過(guò)氧化物酶:每管加入100μΙ 10%驢血清37°C封閉lOmin。
[0037] (4)一抗孵育：一抗為兔抗C-KIT抗體和熒光標(biāo)記的大鼠來(lái)源的SSEA-lAlexa Fluor ? 488抗體，分別用10%驢血清稀釋，稀釋比例為1:100,對(duì)照組為不加抗體的10%驢血 清。37°C孵育SOmiruDPBS洗2次。SSEA-1抗體孵育的細(xì)胞用600μ1 DPBS重懸后轉(zhuǎn)移至流式管 中，將流式管放入冰盒內(nèi)待做流式分析。
[0038] (5)二抗孵育：C-KIT孵育的細(xì)胞和對(duì)照組需要用二抗孵育，二抗為驢抗兔IgG CFL488，10%驢血清稀釋，稀釋比例為1:200，37°C孵育SOmiruDPBS洗2次。
[0039] (6)加入600μ1 DPBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中待做流式分析。
[0040] 分析 (1) 將分別培養(yǎng)〇(1、3(1、7(1的小鼠精原干細(xì)胞去掉培養(yǎng)液，每孔加入50(^1含0.05% Tryps in-EDTA 的 DPBS 在 37 °C 培養(yǎng)箱中消化 5min; (2) 每孔加入50μ1 FBS終止反應(yīng)，移液槍輕柔吹打孔板，收集細(xì)胞到1.5ml離心管中，4 °C，600g離心7min，棄上清； (3) 每孔加入lmlDPBS，4°C，600g離心7min洗一遍； (4) 提取RNA，按照QiAGEN RNA提取試劑盒上的說(shuō)明書完成。
[0041 ] (5)用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為260nm下測(cè)定RNA濃度，RNA濃度計(jì)算公式為:RNA濃度(ng/μ 1 )=0D26Qr? X 40 X 稀釋倍數(shù)/1000。
[0042] (6)提取的RNA跑1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察18s和28s條帶。
[0043] (7)將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒上的說(shuō)明完成。
[0044] (8)PCR 擴(kuò)增： PCR引物：
PCR反應(yīng)體系為：
PCR反應(yīng)條件：95°C，5min;95°C，30s; 50°C，30s; 72°C，25s，30個(gè)循環(huán)；72°C，7min，4°C， 00 O
[0045] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：有效分離精原干細(xì)胞的具體方法為:分離-培養(yǎng)-再分離-再培 養(yǎng)，即將小鼠睪丸細(xì)胞按照傳統(tǒng)的兩步酶消化法分離出來(lái)后培養(yǎng)數(shù)天，再用免疫磁珠法分 離精原干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所得到的精原干細(xì)胞數(shù)量和純度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接分離法所獲得的精 原干細(xì)胞。
[0046] 精原干細(xì)胞的研究對(duì)于不孕不育的治療以及瀕臨滅絕物種資源的保護(hù)具有重要 意義。
[0047] 以上所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi) 的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范 圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備睪丸細(xì)胞懸液； (2) 將睪丸細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，于37°C5%C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，3d更換一次培養(yǎng)液； (3 )去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，用免疫磁珠法分離出精原干細(xì)胞； (4)將分離出來(lái)的精原干細(xì)胞接種到STO滋養(yǎng)層上，加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)精原干 細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(4) 精原干細(xì)胞原代培養(yǎng)方法為:每2天更換一次精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，5-7d傳代一次;所述傳代 培養(yǎng)為:去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶，置于37 °C 5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化，離心棄上清之 后加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到新的STO滋養(yǎng)層上培養(yǎng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述精原干細(xì) 胞培養(yǎng)液成分包括:ΜΕΜα基礎(chǔ)培養(yǎng)基、牛血清白蛋白BSA、游離脂肪酸FFA、L-谷氨酰胺L-Glutamine、亞硒酉愛(ài)鈉 Na2Se〇3、Human recombinant GDNF、Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、Human recombinant BFGF、膜島素 Insul in、車專鐵蛋白 Transfer in、腐胺 Putr es c ine、HEPES、2-疏基乙醇 2-ME、雙抗 P/S 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述牛血清白 蛋白的體積含量為〇. 2%-0.3%，所述游離脂肪酸的含量為e-Syeq/L，所述L-谷氨酰胺的含量 為2-3mM，所述亞硒酸鈉的含量為2 X 10-8-3 X 10-8M，所述⑶NF含量為20-30ng/ml，所述GFR α-l含量為200_300ng/ml，所述BFGF含量為l-2ng/ml，所述胰島素的含量為3-5^^/1111，所述 轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為S-lOμg/ml，所述腐胺的含量為55-60μΜ，所述HEPES的含量為7-10mM，所 述β-巰基乙醇的含量為40-50μΜ，雙抗?jié)舛葹?倍-2倍。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分離小鼠精原干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 分離小鼠睪丸細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出生后5天-8周等不同周齡的雄性小鼠，用頸椎脫臼方法處死后取出雙側(cè) 睪丸，洗去血污，去掉白膜，用兩步酶消化法獲得睪丸細(xì)胞，然后用70μπι孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾 細(xì)胞懸液，將獲得的睪丸細(xì)胞按照一定密度接種到6孔板中，置于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，培養(yǎng)液為精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，3d更換一次培養(yǎng)液； (2) 制備ST0滋養(yǎng)層 在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ST0細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)，加入終濃度為17μg/ml 的絲裂霉素 C，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3小時(shí)后加入胰蛋白酶，在37 °C培養(yǎng)箱中消化收集STO 細(xì)胞，按照需要調(diào)整細(xì)胞密度加入凍存液，分裝到凍存管中放置于_80°C過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至液氮 中長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫? (3) 接種ST0滋養(yǎng)層 在12孔板中加入含有0.2%明膠的DPBS包被過(guò)夜，次日取出放置于超凈工作臺(tái)晾干2小 時(shí)，37°C水浴復(fù)蘇用絲裂霉素 C處理后的ST0細(xì)胞，逐滴加入ST0培養(yǎng)液，用移液槍輕柔吹打 混勻后離心棄上清，再加入ST0培養(yǎng)液接種到明膠包被后的12孔板中，37°C，5% C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)12小時(shí)； (4)分離精原干細(xì)胞 將培養(yǎng)不同時(shí)間的睪丸細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用結(jié)合有THY-1抗體的磁珠4°C孵育 20min，過(guò)分選柱，分離出精原干細(xì)胞，然后加入精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到含有STO滋養(yǎng)層 的12孔板上，置于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5 )精原干細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)精原干細(xì)胞，2d更換一次培養(yǎng)液;5-7d傳代一次，傳代的方法為:去掉培養(yǎng)液，加入 胰蛋白酶，于37 °C培養(yǎng)箱中消化，離心收集精原干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度加入精原干細(xì)胞培養(yǎng) 液，將精原干細(xì)胞接種到新的含有STO滋養(yǎng)層的12孔板中培養(yǎng)； 所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液包括:ΜΕΜα基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積含量為0.2%的牛血清白蛋白BSA、 7.6叩9/1的游離脂肪酸FFA、2M的L-谷氨酰胺1^-611^31^1^、3\10-%的亞硒酸鈉似236〇 3、 20ng/ml的Human recombinant GDNF、300ng/ml的 Rat recombinant GFRal/Fc Chimera、 lng/ml的Human recombinant BFGF、5μg/ml的膜島素 Insulin、10μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白 Transferin、60yM的腐胺Putrescine、lOmM 的HEPES、50yM 的2-疏基乙醇2-ME、1 倍的雙抗 P/S〇
【文檔編號(hào)】C12N5/076GK105969723SQ201610380984
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】姬敏, 陳鵬, 戴雁峰
【申請(qǐng)人】?jī)?nèi)蒙古大學(xué)