專利名稱：傳染性和減毒的牛病毒性腹瀉病毒克隆,其產生方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物健康的領域特別是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)領域。本發(fā)明提供傳染性BVDV克隆和產生所述BVDV克隆的方法。本發(fā)明還涉及使所述克隆減毒的方法、減毒BVDV克隆和包括所述減毒克隆的疫苗。
背景技術：
牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是牛中BVD和粘膜病的病原體(Baker，1987；Moennig和Plagemann，1992；Thiel等人，1996)。妊娠期的胎牛感染可導致胎牛重吸收、流產以及持續(xù)感染BVDV的免疫耐受性小牛的出生。這些小牛缺乏或具有非常低的中和抗體滴度，并不斷泄出大量病毒。僅次于急性感染牛，這些小牛是主要的病毒傳播源，因此在這種疾病流行病學上非常重要。BVD的主要經濟影響來自高流產率、死產、胎牛重吸收、干尸化、先天性畸形和虛弱并小于通常的小牛的出生。至于發(fā)病機理的詳細評論，可參考Moennig和Liess 1995年的論文。
已描述了二種主要的BVDV抗原組(1和2型)(Becher等人，1999)，它們表現(xiàn)出有限的交叉中和抗體反應(Ridpath等人，1994)。用于BVDV感染預防和治療的現(xiàn)有疫苗還存在不足(Oirschot等人，1999)?？沟湫虰VDV 1型的疫苗只對2型感染提供部分保護，而且接種疫苗的母畜可能生產持久感染有毒性的BVDV 2型的小牛(Bolin等人，1991，Ridpath等人，1994)。這個問題可能是由于1型和2型株間的巨大抗原差異性造成的，其主要體現(xiàn)在糖蛋白E2主要抗原中(Tijssen等人，1996)大多數(shù)抗1型株的單克隆抗體不能與2型病毒結合(Ridpath等人，1994)。
滅活疫苗(全部病毒失活)或亞單位疫苗(按常規(guī)純化或異種表達的純化病毒蛋白)在其產生全面保護免疫應答的效力上總是次于活疫苗，即使在有佐劑的情況下。
活BVDV疫苗，即使減毒的，也總是存在安全問題。如上述，它們穿過懷孕母牛的胎盤并導致胎牛臨床癥狀和/或誘發(fā)持續(xù)感染的小牛。因此，它們不能用于包括懷孕母牛的繁殖畜群。必須使懷孕母牛同接種疫苗的牛分開以保護胎牛，并且它們自身不能接種疫苗。此外，減毒的活BVDV的回復體對牛造成嚴重威脅。對其中通過常規(guī)的多次傳代而獲得減毒的常規(guī)衍生的減毒病毒，減毒的分子源和基因穩(wěn)定性仍是未知的，并且回復到有毒性的野生型也是不可預測的。
具有特定突變作為減毒基礎的活疫苗將克服目前這代減毒疫苗的缺陷。所述減毒突變的另一個優(yōu)點在于其特定分子唯一性，可使用其作為減毒瘟疫病毒的區(qū)別標記以將其和本領域的瘟疫病毒區(qū)分。
在現(xiàn)有技術中，很難了解類似于野生型病毒的特定遺傳同一性的BVDV，特別是2型BVDV。在現(xiàn)有技術中，一直需要產生這種BVDV的方法。因此，本發(fā)明下面的技術問題是提供具有特定遺傳同一性的BVDV，特別是BVDV 2型。


圖1.感染性cDNA克隆的構建。上部顯示了BVDV基因組(kB)和編碼的多蛋白。中部顯示了用于設計感染性cDNA克隆的cDNA克隆(白)、RT-PCR產物(淡灰)和PCR產物(暗灰)，下部描繪了基因組cDNA序列端(加下劃線)和在5′與3′端增加的體外轉錄用序列。
圖2重組病毒XIKE-A和野生型BVDV分離物VLS#399的生長曲線。用0.1m.o.i病毒感染MDBK細胞，并通過在指示時間點冷凍和解凍來收獲。新MDBK細胞在感染后72小時通過免疫熒光染色測定滴度。
圖3重組病毒XIKE-A和Erns突變體XIKE-B(H349Δ)和XIKE-C(H300L)的生長曲線。用0.1m.o.i病毒感染MDBK細胞，并通過在指示時間點冷凍和解凍來收獲。新MDBK細胞感染72小時后通過免疫熒光染色測定滴度。
圖4重組病毒XIKE-A(野生型序列)、XIKE-B(H349Δ)和XIKE-C(H300L)的RNAse活性的測定，并與各種病毒感染的MDBK細胞的粗細胞提取物中的野生型株new York‘93/C的比較。未被感染的MDBK細胞作為陰性對照(n.i.)。通過測量作為小RNA片段釋放到上清液的標記的OD260來測定聚(U)的酶解。
圖5.用New York‘93/C(動物#275、#612和#1610，虛線)或XIKE-A(動物#615、#377和#091，實線)感染的動物的體溫。
圖6.用New York‘93/C(動物#275、#612和#1610，虛線)或XIKE-A(動物#615、#377和#091，實線)感染的動物的白細胞(WBC)計數(shù)。
圖7.用XIKE-A(動物#387、#388和#418，虛線)或XIKE-B(動物#415、#417和#419，實線)感染的動物的體溫。
圖8.用XIKE-A(動物#387、#388和#418，虛線)或XIKE-B(動物#415、#417和#419，實線)感染的動物的白細胞(WBC)計數(shù)。

發(fā)明內容
說明書中使用術語的定義在本發(fā)明實施前，必須說明這里和所附權利要求中使用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復數(shù)引用，除非文中另外清楚指明。因此，例如，引用“aBVDV病毒”包括多個這種BVDV病毒，引用“細胞”是指一個或多個細胞和本領域那些熟練技術人員已知的其等同物，等等。除非另外定義，這里使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的意義相同。盡管與這里描述的類似或等同的任何方法和材料都可在本發(fā)明的實踐或實驗中可使用，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、設備和材料。這里提及的所有出版物以引用方式結合于本文，用于描述和揭示出版物中所報道的可與本發(fā)明結合使用的細胞系、載體和方法。這里的任何東西都不應被認為是承認本發(fā)明沒有權利根據(jù)已有發(fā)明提前進行這種公開。
這里使用的術語“BVDV”是指屬于黃病毒科瘟病毒屬中BVDV 1和BVDV 2種的所有病毒(Becher等人，1999)。較典型的BVDV 1型株和最近認識的BVDV 2型株在核苷酸和氨基酸序列中表現(xiàn)出某些有限但明顯的差異。
“克隆”為DNA載體或已引入這種載體的宿主細胞株。優(yōu)選地，DNA載體為質粒。
“感染性克隆”為能用作轉錄為RNA的模板的DNA載體，其中當RNA被引入到易感染細胞時能誘導病毒的產生。優(yōu)選通過體外轉錄產生RNA，并通過熟練技術人員已知的轉染技術將其引入細胞內。
這里使用的“BVDV粒子”或“病毒粒子”是指通過RNA由“感染性克隆”產生的BVD病毒，其中當RNA被引入到易感染細胞時能誘導所述BVDV粒子的產生。
這里使用的“減毒BVDV粒子”或“減毒病毒粒子”是指通過根據(jù)本發(fā)明的方法(見下文)減毒的BVDV粒子。
“感染性”為病毒或病毒粒子在噬斑試驗中誘導一定量噬斑的能力或在終點試驗中誘導一定TClD50數(shù)(score)的能力。
全長RNA為包括至少98％RNA序列出現(xiàn)于野生型分離物中的RNA。全長互補DNA為包括序列與至少98％出現(xiàn)于野生型分離物中的RNA互補的DNA。
這里所使用的“小?！笔侵噶慢g或更小的牛屬動物。
毒性這里使用的“真實毒性(authentic virulence)”是指對于至少一種主要臨床參數(shù)，在根據(jù)本發(fā)明的感染性BVDV粒子和野生型BVDV分離物的毒性間沒有統(tǒng)計上的顯著差異，其中由分離物得到的包含核苷酸序列與BVDV RNA優(yōu)選2型RNA互補的所述DNA分子。這些主要臨床參數(shù)的例子為腹瀉、發(fā)熱和/或致死率。
減毒這里使用的“減毒BVDV粒子”是指對于用同樣劑量優(yōu)選6×106TCID50感染的動物中的主要臨床參數(shù)腹瀉、發(fā)熱和致死率，在根據(jù)本發(fā)明的減毒BVDV粒子和衍生所述減毒BVDV粒子的野生型BVDV分離物的毒性間有統(tǒng)計上的顯著差異，所述減毒BVDV粒子通過根據(jù)本發(fā)明的方法減毒。因此，所述減毒BVDV粒子不會引起腹瀉、發(fā)熱和致命性，并因此可用于疫苗。
這里使用的“RACE”是指cDNA末端快速擴增，正如現(xiàn)有技術中已知的(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1988，858998-9002)。
這里使用的“易感染細胞”為可用BVD病毒感染或用BVDV RNA轉染的細胞，其中當將所述病毒或RNA引入所述易感染細胞時，能誘發(fā)感染性BVDV的產生。
根據(jù)本發(fā)明的“片段”為根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或感染性BVDV克隆的任何亞單位，即任何子集，特征在于它是通過比公開的仍能轉錄成RNA的核酸分子更短的核酸分子編碼而成。
根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或感染性BVDV克隆的“功能性變異體”為具有與根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或感染性BVDV克隆基本類似的生物活性(功能或結構上)的DNA分子或感染性BVDV克隆。術語“功能性變異體”還包括“片段”、“功能性變異體”、“基于退化核酸密碼的變異體”或“化學衍生物”。這類“功能性變異體”例如可帶有一個或幾個核酸交換、缺失或插入。所述交換、缺失或插入可占整個序列的10％。所述功能性變異體至少部分保留其生物活性，如起感染性克隆或疫苗株的作用，或甚至呈現(xiàn)提高的生物活性。
“基于遺傳密碼的退化特性的變異體”為源于這樣事實的變異體，即可通過幾個不同核苷酸三聯(lián)體(triplett)編碼特定氨基酸。所述變異體至少部分保留其生物活性，或甚至呈現(xiàn)提高的生物活性。
“融合分子”(fusion molecule)可為根據(jù)本發(fā)明的融合到例如指導分子(reporter)如放射性標記、化學分子如熒光標記或現(xiàn)有技術中已知任何其它分子中的DNA分子或感染性BVDV克隆。
這里所使用的根據(jù)本發(fā)明的“化學衍生物”為根據(jù)本發(fā)明的經化學修飾或包含通常不是分子一部分的另外化學單元的DNA分子或感染性BVDV克隆。這種部分可提高分子可溶性、吸收性、生物半衰期等。
如果二個分子具有基本類似的核苷酸序列或生物活性，則稱一個分子為“基本類似”于另一個分子。因此，所提出的二個分子具有類似活性，如果其核苷酸序列不同，則認為它們是變異體，其含義同這里所用術語，即使它們的生物活性不同而二個具有類似核苷酸序列的分子則認為為變異體，其含義同這里所用術語。
這里使用的術語“疫苗”是指包括至少一種能誘導動物免疫應答的免疫活性組分和可能但不一定必需的一種或多種能提高所述活性組分免疫活性的另外組分的藥物組合物。疫苗可另外包括更多的典型組分到藥物組合物中。疫苗中的免疫活性組分可包括原始形式的或作為所謂修飾活疫苗(MLV)中減毒粒子的完整病毒粒子，或在所謂滅活疫苗(KV)中通過適當方法滅活的粒子。在另外形式中，疫苗的免疫活性組分可包括所述有機體(亞單位疫苗)的適當成分，從而可通過破壞整個粒子或包含這些粒子的生長培養(yǎng)液和可任選的產生所需結構的后續(xù)純化步驟來產生這些成分，或通過包括利用基于如細菌、昆蟲、哺乳動物或其它物種的合適的系統(tǒng)的適宜操作加上可任選的后續(xù)分離和純化步驟的合成過程，或通過使用合適藥物組合物(聚核苷酸接種疫苗)直接結合遺傳物質在需要疫苗的動物中誘導所述合成過程而產生這些成分。疫苗可包括一種或同時超過一種的上述成分。
這里理解的術語“疫苗”為包括抗原物質的獸醫(yī)用疫苗，其施用是為了誘導對抗因BVDV引起疾病的特異性和主動免疫。根據(jù)本發(fā)明的BVDV克隆提供主動免疫，其可通過對抗它包含的免疫原和有時還對抗抗原性相關的生物體的母體抗體而被動轉移。
提高免疫應答的另外組分為通常提到的佐劑成分，例如氫氧化鋁、礦物或其它油，或加入到疫苗中的輔助分子，或通過因這些附加組分，類似的但不限制于干擾素、白細胞間介素或生長因子而分別誘導后的軀體所產生的輔助分子。
“藥物組合物”基本由一種或多種能生理學修飾的組分如接受給藥的生物體、生活在生物體中或生活在生物體上的生物體的免疫功能的組分。這個術語包括但不限于抗生素或抗寄蟲藥，以及其它常用成分，以達到特定的其它目的如，但不限于，處理特性(processing traits)，不育癥，穩(wěn)定性，通過腸或腸道外途徑如口、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或其它適當途徑施用組合物的可行性，用藥后的耐受性，受控制的釋放特性。

發(fā)明內容
通過說明書和以權利要求為特征的實施方案實現(xiàn)了上述技術問題的解決。
已克服了現(xiàn)有技術中長久以來對具有與毒性相關的所定義的序列和特異性的活BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)長期持久的需要。它可用于產生如疫苗中的特異性減毒BVDV。發(fā)明人首次提供一種產生具有定義的遺傳同一性并同時具有類似于野生型病毒病原性的感染性克隆及由其衍生的感染性BVDV粒子的方法。此外，發(fā)明人首次公開感染性2型克隆及其衍生的感染性2型BVDV粒子。第三，發(fā)明了具有所定義序列的活感染性BVDV粒子，發(fā)明人還發(fā)明了產生具有遺傳同一性的減毒BVDV粒子的方法，它可通過只在一個特定遺傳標記位點修飾來減毒。本發(fā)明可在基因組修飾和減毒間產生因果聯(lián)系，這對理解減毒功能機理是必需的，并因此有助于評價用作疫苗的質量。
在第一個重要實施方案中，本發(fā)明涉及包含與BVDV RNA互補的核苷酸序列的DNA分子，其中當將所述RNA引入易感染宿主細胞時，能誘導產生感染性BVDV粒子a)當用6×106TCID50劑量感染時，具有誘發(fā)小牛病毒血癥和白血球減少癥持續(xù)至少一天時間和下列包括腹瀉和/或發(fā)熱中的至少一種臨床癥狀持續(xù)至少一天的能力。
b)與衍生這種DNA分子的野生型BVDV分離物相比，具有上述的真實毒性；和/或c)當用這種粒子以6×106TCID50劑量感染BVDV首次用于實驗(naive)的小牛時，在21天時間內使這些小牛中至少30％致死；和/或d)具有不少于90％的包含一個與SEQ ID NO.1互補的序列的RNA的BVDV粒子毒性；和/或e)包括與SEQ ID NO.1互補的序列。
階段a)中的所述劑量6×106TCID50優(yōu)選按照2×106肌內(臀肌)、2×106鼻內(intranaseally)和2×106皮下(肩胛骨上)施用得到總劑量6×106。優(yōu)選應在至少三分之二的所有被感染動物中觀察到階段a)中的所述臨床癥狀。階段a)中的所述白血球減少癥優(yōu)選在至少連續(xù)兩天內減少到低于基準至少35％，其中“基準”是指感染前10天所有動物的平均值。腹瀉是BVDV感染的典型癥狀。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的上述DNA分子中，階段a)中的發(fā)熱為至少40℃。
在第二種重要實施方式中，本發(fā)明涉及能用作模板轉錄為RNA的感染性BVDV克隆，其中當將所述RNA引入易感染宿主細胞時，能誘導產生感染性BVDV粒子f)當用6×106TCID50劑量感染時，具有誘發(fā)小牛病毒血癥和白血球減少癥持續(xù)至少一天時間和下列包括腹瀉和/或發(fā)熱中的至少一種臨床癥狀持續(xù)至少一天的能力；和/或g)與衍生這種DNA分子的野生型BVDV分離物相比，具有真實毒性；和/或h)當用這種粒子以6×106TCID50劑量感染3-6月齡BVDV首次用于試驗的小牛時，在感染后21天時間內這些小牛中的至少30％致死；和/或i)具有不少于90％包含一個與SEQ ID NO.1互補序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或j)包括與SEQ ID NO.1互補的序列。
階段f)中的所述劑量6×106TCID50優(yōu)選按照2×106肌內(臀肌)、2×106鼻內和2×106皮下(肩胛骨上)施用得到總劑量6×106。優(yōu)選應在至少三分之二的所有被感染動物中觀察到階段a)中的所述臨床癥狀。階段f)中的所述白血球減少癥優(yōu)選在至少連續(xù)兩天內減少到低于基準至少35％，其中“基準”是指感染前10天所有動物的平均值。
所述感染性BVDV克隆優(yōu)選為1型或2型克隆。
重要的是所述感染性BVDV克隆具有真實毒性，用于構建這種克隆的病毒源優(yōu)選直接從現(xiàn)場(field)分離而獲得，或將其再轉移到動物，然后從臨床癥狀最嚴重的動物上再分離，并隨后在細胞培養(yǎng)中傳代不超過二次，優(yōu)選一次或沒有。實施例(實施例1)舉例說明了這些。實施例說明了病毒NY93/C的cDNA克隆，即在幾次細胞培養(yǎng)傳代后將NY93/C再轉移到牛屬動物，再次分離，并在再次分離病毒不超過二次細胞培養(yǎng)傳代后用于RNA制備和cDNA克隆。
本發(fā)明另一個重要的實施方式為，通過使用根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或BVDV克隆轉錄、使用所述RNA轉染合適細胞或細胞系和收集由所述細胞產生得到的BVDV粒子來產生BVDV粒子。還有另一個實施方式為，通過克隆根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或BVDV克隆成為適當DNA病毒基因組、然后感染適當細胞導致產生由所述細胞產生的BVDV粒子，其中這些DNA病毒為熟練技術人員所知。也優(yōu)選的是，可將根據(jù)本發(fā)明的DNA或感染性克隆轉染到隨后能制造RNA的適當細胞，如van Gennip等人(1999)揭示的能穩(wěn)定表達T7聚合酶典型豬發(fā)熱病毒(CSFV)的細胞。也優(yōu)選的是可在真核細胞中在真核啟動子的控制下表達根據(jù)本發(fā)明的DNA或感染性克隆，導致產生能從細胞中分泌的感染性BVDV粒子(如V.Racaniello和D.Baltimore證實的脊髓灰質炎病毒(1981))。
本發(fā)明一個非常重要的實施方式為感染性BVDV 2型克隆。
優(yōu)選地，所述感染性BVDV 2型克隆能作為轉錄成RNA的模板，其中當將所述RNA引入易感染宿主細胞時，它能誘導產生感染性BVDV粒子k)當用6×106TCID50劑量感染時，具有誘發(fā)小牛病毒血癥和白血球減少癥持續(xù)至少一天時間和下列包括腹瀉和/或發(fā)熱中的至少一種臨床癥狀持續(xù)至少一天的能力；和/或l)與衍生這種DNA分子的野生型BVDV分離物相比，具有真實毒性；和/或m)當用這種粒子以6×106TCID50劑量感染3-6月齡BVDV首次用于試驗的小牛時，在感染后21天時間內這些小牛中的至少30％致死；和/或n)具有不少于90％包含與SEQ ID NO.1互補的序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或o)包括與SEQ ID NO.1互補的序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及可通過以下列步驟為特征的方法獲得的BVDV 2型克隆。
aaa)分離野生型BVDV 2型株；bbb)在細胞培養(yǎng)中傳代所述野生型BVDV 2型株；ccc)用所述細胞培養(yǎng)傳代的BVDV 2型株感染牛屬動物，并從感染最嚴重的動物中再分離出BVDV株；ddd)在細胞培養(yǎng)中，使所述再分離BVDV 2型株傳代不超過2次，優(yōu)選1次；eee)反轉錄并克隆所述再分離BVDV 2型株，產生全長cDNA克隆，優(yōu)選使用RACE方法克隆5′和3′端。
然后在適當條件下將所述感染性DNA克隆轉錄成RNA，將所述RNA引入到合適細胞或細胞系，并收集得到的BVDV 2型粒子。
在非限制性實施例1中舉例說明了這種克隆，特征為cDNA序列SEQ IDNO.1。因此，優(yōu)選實施方式涉及根據(jù)本發(fā)明的特征為DNA序列SEQ ID NO.1的感染性BVDV 2型克隆或其片段、功能性變異體、基于退化核酸密碼的變異體、融合分子或其化學衍生物。實施例1提供了非限制性實施例。
本發(fā)明還涉及通過根據(jù)本發(fā)明的BVDV克隆的體外轉錄成RNA、用所述RNA轉染合適細胞或細胞系并收集由所述細胞產生得到的BVDV粒子而產生的BVDV 2型粒子。也優(yōu)選地，可將根據(jù)本發(fā)明的DNA或感染性克隆轉染到隨后能產生RNA的適當細胞，如van Gennip等人(1999)公開的典型豬發(fā)熱病毒(CSFV)，因為這些細胞能穩(wěn)定表達T7聚合酶。也優(yōu)選地可在真核細胞中在真核啟動子的控制下表達根據(jù)本發(fā)明的DNA或感染性克隆，導致產生能從細胞中分泌的感染性BVDV粒子(如V.Racaniello和D.Baltimore證實的脊髓灰質炎病毒(1981))。
本發(fā)明另一個非常重要的方面為包含與全長BVDV 2型RNA互補的核苷酸序列的DNA分子。優(yōu)選地，所述DNA分子的特征為序列SEQ ID NO.1。因此，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的特征為SEQ ID NO.1的DNA分子或其片段、功能性變異體、基于退化核酸密碼的變異體，融合分子或其化學衍生物。
實施例1提供了非限制性實施例。
更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明、包括特征為SEQ ID NO.1的序列組成的DNA分子。
本發(fā)明還涉及與根據(jù)本發(fā)明上述DNA分子或根據(jù)本發(fā)明上述BVDV克隆互補的RNA分子。
本發(fā)明還涉及可通過根據(jù)本發(fā)明上述DNA分子或根據(jù)本發(fā)明上述BVDV克隆轉錄得到的RNA分子。
本發(fā)明另一個重要的方面為由野生型BVDV分離物制備感染性BVDV克隆的方法，與所述野生型分離物相比，與RNA互補的所述BVDV克隆具有真實毒性，該方法包括步驟p)從感染動物中分離病毒粒子；優(yōu)選在合適細胞培養(yǎng)細胞中傳代不超過2次；q)由病毒粒子制備RNA；r)在RNA反轉錄后產生全長互補DNA；其中反轉錄包括在足夠的高溫下切斷或減少RNA二級結構的步驟，并在這個步驟中使用熱穩(wěn)定酶，所述酶在這些高溫下具有活性；s)在合適細胞感染時將互補DNA(cDNA)結合到質粒載體上或結合到能引導BVDV cDNA轉錄成RNA的DNA病毒上。
優(yōu)選在病毒血癥(階段k))期間分離所述病毒粒子?？蓛?yōu)選通過組裝重疊部分cDNA片段產生步驟m)中的全長互補DNA(cDNA)(也參見實施例1)。
另一優(yōu)選實施方式涉及由野生型BVDV分離物制備感染性BVDV克隆的方法，與所述野生型分離物相比，與RNA互補的所述感染性BVDV克隆具有真實毒性，該方法包括步驟ppp)從病毒血癥期間的感染動物細胞中或可任選地在殺死所述動物后從其器官中分離RNA；qqq)優(yōu)選由RNA反轉錄后的DNA片段組裝產生全長互補BVDVDNA；其中反轉錄包括在足夠的高溫下切斷或減少RNA二級結構的步驟，并在這個步驟中使用熱穩(wěn)定酶，所述酶在這些高溫下具有活性；rrr)在合適細胞感染時將互補DNA(cDNA)結合到質粒載體上或結合到能引導BVDV cDNA轉錄成RNA的DNA病毒上。
合適的細胞培養(yǎng)用細胞為Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞、RD(牛睪丸)細胞或牛鼻甲骨(BT)細胞。還有本領域技術人員所知的合適細胞。
通過根據(jù)本發(fā)明方法制備的感染性克隆為1型克隆或優(yōu)選2型克隆。
本發(fā)明另一個重要方面為由野生型BVDV分離物制備感染性BVDV克隆的方法，與RNA互補的所述感染性BVDV克隆具有不少于所述野生型分離物90％的毒性，該方法包括步驟t)從感染動物中分離病毒粒子；u)在合適細胞培養(yǎng)細胞中傳代不超過2次；優(yōu)選1次或沒有；v)由病毒粒子制備RNA；w)在RNA反轉錄后產生全長互補DNA；其中反轉錄包括在足夠的高溫下切斷或減少RNA二級結構的步驟，并在這個步驟中使用熱穩(wěn)定酶，所述酶在這些高溫下具有活性；x)在合適細胞感染時將互補DNA(cDNA)結合到質粒載體上或結合到能引導BVDV cDNA轉錄成RNA的DNA病毒上。
優(yōu)選在病毒血癥(步驟t))期間分離所述病毒粒子?？蓛?yōu)選通過組裝重疊部分cDNA片段而產生步驟x)中的全長互補DNA(cDNA)(也參見實施例1)。
在現(xiàn)有技術中，克隆感染性BVDV的5′和3′區(qū)存在特殊困難。本發(fā)明人開發(fā)了創(chuàng)造性的方法以獲得真實的5′和3′區(qū)。令人驚奇地是，通過應用RACE方法是可能的。但是，只是由本發(fā)明人對這方法的改進才導致令人驚奇和預料不到的產生真實毒性的BVDV克隆。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中使用RACE產生RNA的5′端。令人驚奇地是，只有通過使用結合熱穩(wěn)定聚合酶的RACE方法才可能成功地溶解基因組的二級結構。
標準分子生物學方法為熟練技術人員所已知，并也可在如Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York和Bertram，S.和Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)中找到。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中在具有允許反應溫度至少為48℃、優(yōu)選為50-55℃、還優(yōu)選56-60℃的熱穩(wěn)定聚合酶存在的情況下實施RACE。
在發(fā)明了具有所定義序列的活感染性BVDV粒子的同時，本發(fā)明人還發(fā)明了產生具有所定義遺傳同一性并優(yōu)選只在一個特定遺傳標記位點減毒的減毒BVDV粒子的方法。這能令人驚奇地允許簡單確定回復體或成功的減毒，因為只有存在遺傳標記位點需要通過熟練技術人員已知的分子生物學方法進行測定。實施例1中的XIKE-B和XI4KE-C是用于這種具有所定義序列的減毒BVDV粒子的非限制性實例。
本發(fā)明的另一個重要方面為通過向本發(fā)明上述DNA分子或上述的感染性BVDV克隆中引入一個或多個突變而實現(xiàn)BVD病毒減毒的方法，其中所述一個突變或多個突變導致或增加復原BVD病毒的減毒表型。
本發(fā)明的再一個重要方面為BVDV株的減毒方法，該方法包括步驟y)向根據(jù)本發(fā)明的上述DNA分子中或根據(jù)本發(fā)明的上述感染性BVDV克隆中引入一個或多個突變；z)將突變DNA引入易感染宿主細胞，其中所述DNA被轉錄成RNA，或將從所述DNA轉錄的RNA引入所述細胞；和aa)收集由這些細胞產生的病毒粒子；其中所述一個突變或多個突變引起減毒。
本發(fā)明的一個優(yōu)選方面為根據(jù)本發(fā)明上述的減毒方法，其中一個突變或多個突變?yōu)楹塑账崽鎿Q、缺失、插入、增加或其組合。
根據(jù)本發(fā)明，“突變”是指由另外一個核苷酸取代一個核苷酸(如C替換T)即所謂“替換”或任何其它突變如“缺失”或“插入”?！叭笔А笔侵赋ヒ粋€或幾個核苷酸或氨基酸。
由于根據(jù)本發(fā)明的這些感染性BVDV克隆為非常類似于野生型病毒的真實毒性并同時具有所定義基因型的病毒，所以在動物實驗中必須使用所述病毒作為陽性對照。所述感染性克隆是用于產生用于如疫苗的特異性減毒BVDV克隆的極好工具。本發(fā)明包括其中存在于糖蛋白ERNS中的RNase活性失活的BVDV克隆。優(yōu)選地，通過缺失或和/或其它突變如替換使所述RNAse活性失活。優(yōu)選地，所述失活和/或其它突變位于在295-307位置和/或在338-357位置的氨基酸。
因此，本發(fā)明更優(yōu)選的方面為根據(jù)本發(fā)明的減毒方法，其中一個突變或多個突變是在糖蛋白Erns中，并導致突變蛋白功能損害或喪失。
本發(fā)明更優(yōu)選的方面為根據(jù)本發(fā)明的減毒方法，其中突變包括bb)全部或部分糖蛋白Erns的缺失；和/或
cc)SEQ ID NO.1中在300位置的組氨酸的缺失或替換；和/或dd)SEQ ID NO.1中在349位置的組氨酸的缺失或替換。
最優(yōu)選地，還有一個重要實施方式是用于BVDV的減毒方法，包括根據(jù)本發(fā)明的BVDV克隆在300位置和/或349位置的組氨酸的突變，其中編碼三聯(lián)體缺失或被替換。
還一個重要實施方式為用于根據(jù)本發(fā)明的BVDV的減毒方法，其中亮氨酸密碼子取代了組氨酸300的密碼子。
還一個重要實施方式為用于根據(jù)本發(fā)明的BVDV的減毒方法，其中組氨酸349密碼子缺失。
本發(fā)明另一個重要實施方式為通過本發(fā)明方法可得到的減毒BVDV克隆或BVDV株。
本發(fā)明另一個重要實施方式為包含根據(jù)本發(fā)明的減毒BVDV克隆或株的疫苗，可任選地與藥物可接受載體或賦形劑組合。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的減毒BVDV克隆或株在預防和治療BVDV感染用疫苗生產中的應用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗是指如上面所定義的疫苗，其中一種免疫活性組分為活BVDV，其中其蛋白質ERNS中的RNase活性是失活的。術語“活疫苗”是指包括能復制尤其是復制活性病毒組分的粒子的疫苗。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括根據(jù)本發(fā)明的減毒BVD病毒1型、并結合根據(jù)本發(fā)明的減毒BVD病毒2型或任何其它抗原組和藥物可接受載體或賦形劑。所述疫苗可作為聯(lián)合疫苗施用。更優(yōu)選地，可首先施用根據(jù)本發(fā)明的所述減毒BVD病毒1型，然后在3-4周后施用根據(jù)本發(fā)明的減毒BVD病毒2型。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括根據(jù)本發(fā)明的其中蛋白質ERNS中的RNase活性是失活的減毒BVD病毒1型，并結合根據(jù)本發(fā)明的其中蛋白質ERNS中的RNase活性是失活的減毒BVD病毒2型，或任何其它其中蛋白質ERNS中的RNase活性是失活的抗原組，和藥物可接受載體或賦形劑。所述疫苗作為聯(lián)合疫苗施用。更優(yōu)選地，可首先施用根據(jù)本發(fā)明上述的所述減毒BVD病毒1型，然后在3-4周后施用根據(jù)本發(fā)明上述的減毒BVD病毒2型。
本發(fā)明優(yōu)選涉及使用一種用于根據(jù)本發(fā)明上述的減毒BVDV來治療BVDV感染牛屬動物的方法，其中對牛屬動物按其需要以熟練技術人員所熟悉的劑量施用所述減毒BVDV或上面公開的疫苗組合物，并監(jiān)控BVDV癥狀如病毒血癥和白血球減少癥和/或發(fā)熱和/或腹瀉的減少。優(yōu)選重復所述治療。
以下實施例用于進一步說明本發(fā)明；但不應認為這些實施例限制這里公開的本發(fā)明的范圍。
實施例1材料和方法細胞和病毒。MDBK細胞獲自American Type Culture Collection(Rockville，Md.)。在補充有10％胎牛血清(FCS；檢驗不存在瘟病毒和抗瘟病毒的抗體)和非必需氨基酸的Dulbecco′s改性Eagle′s培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
牛病毒性腹瀉株New York′93(就地分離物VLS#399)由E.J.Dubovi(NewYork State College of Veterinary Medicine，Cornell University，lthaca)提供。病毒經歷1次動物傳代并在后文中稱為“New York′93/C”。
細胞感染、免疫熒光分析和病毒過氧化物酶分析。由于瘟病毒與其宿主細胞高度有關，所以將感染細胞的溶菌產物用于培養(yǎng)細胞的再感染。感染3-5天后，通過冷凍和解凍細胞而制備溶菌產物，并在-70℃下保存。除文中另外指明外，使用0.1的多倍感染(m.o.i.)用于培養(yǎng)細胞的感染。對于免疫熒光和過氧化物酶分析，在-20℃下用冰冷的丙酮∶甲醇(1∶1)固定感染細胞15分鐘，風干并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)再水化。用直接對抗E2的抗BVDV單特異性抗體(Weiland等人，1989)的混合物培育細胞。用PBS洗滌三次后，在免疫熒光分析中用結合熒光素異硫氰酸酯(FITC)的兔抗鼠抗體(Dianova，Hamburg，Germany)檢測細胞結合性抗體。對于過氧化物酶分析，使用結合過氧化物酶的羊抗鼠抗體(Dianova)作為第二抗體。室溫培育1小時后，用由PBS洗滌細胞三次。用50mM醋酸鈉緩沖液pH5.0、1μM氨基乙基咔唑和0.1％H2O2所組成的溶液檢測細胞結合性抗體。
Northern(RNA)雜交。感染48小時后，通過以前描述的銫密度梯度離心法(Rümenapf等人，1989)制備RNA。按以前所述(Rümenapf等人，1989)進行凝膠電泳、探針放射性標記、雜交和雜交后洗滌。使用來自株New York 93/C的放射性標記PCR產物(核苷酸4301-5302)作為探針。
PCR和RT-PCR。按照廠商建議用Tfl-聚合酶(Promega，Mannheim，Germany)或用Taq-聚合酶(Appligene，Heidelberg，Germany)，并使用約50-100ng DNA模板和25pmol各種引物進行PCR。用于基因組5′端擴增的引物序列為上游T25V引物(Display Systems Biotech，Copenhagen，Denmark)；和下游，CM79CTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG用于第一輪和CM86CTCGTCCACATGGCATCTCGAGAC用于嵌套(nested)PCR。用于基因組3′端擴增的引物為上游CM46GCACTGGTGTCACTCTGTTG用于第一輪和CM80GAGAAGGCTGAGGGTGATGCTGATG用于嵌套PCR和下游nls-GACTTTCCGCTTCTTTTTAGG。采用TitanTM單管RT-PCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim，Germany)，使用2μg總RNA作為模板并按照廠商指示進行反轉錄PCR(RT-PCR)。Erns編碼區(qū)擴增用引物為上游CM28GGAGAGAATATCACCCAGTG；和下游CM21CTCCACTCCGCAGTATGGACTTGC。
通過制備的瓊脂凝膠電泳純化擴增的RT-PCR產物，并按照廠商建議用Nucleotrap試劑盒(Macherey-Nagel，Düren，Germany)洗脫。
將DNA寡核苷酸進行磷酸化并連接到RNA 3′端。為將DNA引物連接到病毒基因組3′端，磷酸化引物。在30μl激酶混合物(2mM ATP、50mMTris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇、25μg/ml牛血清白蛋白)中用5單位T4聚核苷酸激酶(New England Biolabs，Schwalbach，Germany)37℃下培育10μg寡核苷酸nls+CCTAAAAAGAAGCGGAAAGTC 40分鐘。使引物通過交聯(lián)葡聚糖凝膠(sephadex)G-15自旋柱(Sambrook等人，1989)，并進一步通過苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀進行純化。
在50μl連接酶混合物(50mM Tris-HCl pH7.8、10mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇、1mM ATP、40％聚乙二醇和50單位RNA保護劑(guard)(Amersham，F(xiàn)reiburg，Germany))中使用5μg由被感染的培養(yǎng)細胞制備的總RNA和150pmol具有20單位T4-RNA連接酶(New Enland Biolabs，Schwalbach，Germany)的磷酸化寡核苷酸在17℃下連接16小時。用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀純化產物。
單鏈DNA的合成和加尾。使用2μg來自感染細胞的總RNA和100pmol引物CM79(見“PCR和RT-PCR“)，并按照廠商指示(反應65℃10分鐘；42℃40分鐘；65℃15分鐘)，借助顯示Thermo-RT反轉錄酶(Display SystemsBiotech，Copenhagen，Denmark)產生來自病毒基因組5′端的單鏈(-)DNA。使用1/4vol的10M醋酸氨通過二次連續(xù)的苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀純化DNA(Schaefer 1995)。
按照廠商建議，在50μl TdT緩沖液中使用50％的“第一鏈”產物、50單位末端轉移酶、6.25μM dATP和1.5mM CoCl2，借助末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)向第一個cDNA鏈中加入聚-dA尾。37℃培育30分鐘后，通過苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀純化產物。
cDNA文庫的構建和核苷酸測序。通常按照前人所述進行cDNA合成、克隆和文庫篩選(Meyers等人，1991)。使用寡(oligos)BVD13、BVD14和BVD15(Meyers等人，1991)以及B22.1R(GTTGACATGGCATTTTTCGTG)、B12.1R(CCTCTTATACGTTCTCACAACG)、BVD33(GCATCCATCATXCCRTGATGAT)、N7-3-7(CAAATCTCTGATCAGTTGTTCCAC)、B23-RII(TTGCACACGGCAGGTCC)和B-3′(GTCCCCCGGGGGCTGTTAAGGGTTTTCCTAGTCCA)引發(fā)cDNA合成。用于篩選文庫的探針為來自BVDV株cp7(GenBank登錄號U63479，Meyers等人，1996b)的cDNA克隆的XhoI/AatII插入物；在52℃下進行雜交。
使用外切核酸酶III和核酸酶S1建立cDNA克隆的缺失文庫(Henikoff1987)。使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(PE Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)進行雙鏈DNA的核苷酸測序。通常，cDNA克隆的二個DNA鏈都進行測序；至少在二個克隆上對獨立cDNA克隆間的重疊進行測序?？傊治隽思s47000個核苷酸，全面覆蓋整個基因組的～3.8。使用Genetics Computer Group軟件(Devereux等人，1984)進行序列分析和排列。
全長cDNA克隆的構建。通常按照其它地方描述的(Sambrook等人，1989)進行限制、克隆和其它標準過程。限制和修飾酶獲自New England Biolabs(Schwalbach，Germany)、Pharmacia(Freiburg，Germany)、GibcoBRL(Eggenstein，Germany)和Boehringer Mannheim(Germany)。
使用來自文庫的五個cDNA克隆以構建全長cDNA克隆質粒C3/8(核苷酸35-2411)、質粒C5/11(核苷酸22-2400)、質粒8/11(核苷酸3400-7814)、質粒13/27(核苷酸4783-9910)和質粒C4/24(核苷酸8658-12322)。使用就地分離物VLS#399感染的MDBK細胞中的總RNA作為模板，通過利用引物CM29(GATGTAGACACATGCGACAAGAACC)和CM51(GCTTCCACTCTTATGCCTTG)的RT-PCR得到自核苷酸位2144延伸到位4447的片段“RT-E2”。在下面描述中，對在病毒cDNA插入物兩側的質粒限制位點加下劃線。
首先，用AatII和HindIII切割克隆C3/8，并將cDNA插入片段轉移到用同樣酶切的pACYC177。得到的質粒命名為pKANE5。在用同樣酶限制后，將RT-PCR產物“RT-E2”插入到這個質粒的NdelI/HindIIII位點；得到的質粒為pKANE8。然后，將來自克隆C5/11的AatII片段轉移到pKANE8的AatII位點，產生質粒pKANE14。
使用引入第一個cDNA核苷酸T7啟動子序列上游的引物CM87(GCTCTAGACGGCCGTAATACGACTCACTATAGGTATACGAGATTAGCTAAAGAACTCGTATATGGATTGGACGTCAAC)和CM79(見“PCR和RT-PCR”)通過PCR產生重組cDNA克隆的5′端；使用質粒C5/11作為PCR模板。將PCR產物連接進cDNA克隆C5/9的XbaI和BsrGI位點，產生質粒pKANE22。后來發(fā)現(xiàn)寡CM87包含錯誤的核苷酸，并用寡(oligos)CM88(GACGGCCGTAATACGACTCACTATAGTATACG)和CM79通過PCR修補pKANE22。用E.coil DNA聚合酶I(Klenow片段)處理PCR產物以產生平端，然后用BsrGI限制。將其克隆進pKANE22的SpeI平/BsrGI位點，產生質粒pKANE22A。
用XhoI和BamHI切割cDNA克隆8/11的插入片段，并克隆到用同樣酶切的pACYC177；得到的質粒命名為pKANE6。將cDNA克隆13/27的AvrII/BamHI片段轉移到pKANE6，產生質粒pKANE15。然后，將來自pKANE14中的EcoRV/MfeI片段插入用同樣酶消化的pKANE15。得到的質粒為pKANE21。用SacII和EcoRV消化pKANE21，并將來自pKANE14的相應片段克隆進這些位點，產生質粒pKANE24。然后將來自pKANE22A的SacII/SacII片段克隆進用同樣酶切的pKANE24。得到的質粒為pKANE28AII。
通過使用引物B2-11500(CCTAACCATGATATATGCCTTCTG)和向基因組3′端添加SrfI位點的CM81(CGGAATTCGCCCGGGCTGTTAGAGGTCTTCCCTAGT)的PCR產生基因組3′端。用BamHI和EcoRI切割PCR產物，并克隆到pACYC177，產生質粒pKANE17。然后，將cDNA克隆C4/24的SacI/Kpn2I片段轉移到pKANE17；質粒稱為pKANE20。將StuI/EcoRI片段從pKANE20切除并克隆到用EcoRI消化和用StuI部分消化的質粒pKANE21上。得到的質粒為pKANE23。最后，將來自pKANE28AII的XbaI/PshAI片段插入到用同樣酶切割的質粒pKANE23中，產生全長cDNA克隆pKANE40。
位點定向誘變。按照廠商指示通過使用QuikChange位點定向誘變試劑盒(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)的PCR產生所有突變體。用于向Erns編碼區(qū)引入突變的質粒為C5/9，一種獲自初始cDNA文庫(核苷酸50-2411)的克隆。用于產生突變體H“346”Δ的寡核苷酸為CM126(GAGTGGAATAAAGGTTGGTGTAAC)和CM127(GTTACACCAACCTTTATTCCACTC)，用于突變體H“297”L的寡體(oligos)為CM128(AACAGGAGTCTATTAGGAATTTGGCCA)和CM129(TGGCCAAATTCCTAATAGACTCCTGTT)。通過核苷酸測序證實了要求突變的存在和沒有第二位點突變。
體外轉錄和RNA轉染基本按照以前的描述(Meyers等人，1996a)進行RNA轉錄和MDBK細胞轉染。簡短地說，用SrfI使2ug相應cDNA構建進行線性化，并通過苯酚提取和乙醇沉淀純化。在有15單位RNA保護劑(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)存在情況下，在總體積為50ul的轉錄混合物(40mM Tris-HCI，pH7.5；6mMMgCl2；2mM亞精胺；10mM NaCl；ATP、GTP、CTP和UTP各0.5mM；10mM二硫蘇糖醇；100ug/ml牛血清白蛋白)中用50單位T7 RNA聚合酶進行T7RNA聚合酶(NEB，Schwalbach，Germany)轉錄。37℃培育1小時后，將反應混合物通過Sephadex G-50旋轉柱，并進一步通過苯酚提取和乙醇沉淀純化。
如果不另外指明，使用大約3×106MDBK細胞的懸浮液和約0.5μg結合于DEAE葡聚糖(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)的體外轉錄RNA進行轉染。通過將溶于100μl HBSS(每升中含5g Hepes、8g NaCl、0.37g KCl、0.125gNa2HPO4.2H2O和1g葡萄糖；pH7.05)的RNA與100μl DEAE葡聚糖(在HBSS中1mg/ml)混合而建立RNA/DEAE葡聚糖復合體，并在冰上培育30分鐘。用不含F(xiàn)CS的DMEM洗滌沉淀細胞一次，離心，然后再懸浮在RNA/DEAE葡聚糖混合物中。37℃培育30分鐘后，加入20μl二甲基亞砜，并在室溫下培育混合物2分鐘。加入2ml HBSS后，將細胞制成粒，并用HBSS洗滌一次，和用不含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基洗滌一次。將細胞再懸浮在有FCS的DMEM中，并接種到10.0cm直徑的盤上。將經過48h-72h轉染的細胞割裂并接種以適于后續(xù)分析。
使用電穿孔測定RNA的特異性感染。將0.5ml不含鎂和鈣的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的3×106個MDBK細胞與適量RNA混合，并轉移到2mm電穿孔皿中。在Hoefer PG 200 Progenetor II上用960μF、180伏的一次脈沖進行電穿孔。然后，將細胞接種到3.5cm盤上，并在約20h后用免疫熒光進行分析。
RNAse活性測定。用重組病毒感染MDBK細胞，并生長48小時。用野生型病毒感染的細胞作為陽性對照，未感染細胞作為陰性對照。按照以前描述的(Meyers等人，1999)進行細胞制備和RNAse活性測定，除了37℃下探針的培育為30分鐘而不是1小時，因為較長的培育導致MDBK細胞中大量本底放射性。
動物實驗。進行兩組動物實驗以檢測重組病毒。在第一組實驗中，以每只動物以105TCID50鼻內接種二組每組3只花斑母牛(8-10月齡)。在第二組實驗中，以每只動物5×105TCID50鼻內感染6只雄Holstein和Holstein雜交小牛(7-10周齡)。在攻擊實驗中，以5×106TCID50接種動物。感染前檢測所有動物都沒有BVDV特異性抗原和抗體。在分開的隔離區(qū)內安置不同的組。每天記錄臨床參數(shù)，如結果部分所示。在結果部分所示時間點從頸外靜脈中抽取血液，并用肝素(大約35I.U./ml)穩(wěn)定血液，除了將其用于制備血清。
為了確定血液中存在病毒，從所有血液樣品制備血沉棕黃層(buffy coat)。向肝素穩(wěn)定的血液(包含約107白細胞)等分試樣中加入5ml冰冷溶菌緩沖液，并在冰上培育10分鐘，然后離心。在將其重懸浮于2ml PBS前，用溶菌緩沖液洗滌沉淀一次，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗滌二次。用200μl血沉棕黃層制備物培育接種在24孔板中的MDBK細胞5天。通過使用BVDV E2 mAb混合物的免疫熒光顯微鏡檢測病毒抗原(見上面)。
在通過56℃培育30分鐘而失活的血清樣品中檢測到病毒中和抗體的存在。在96孔微滴度板上以1∶2為一級來稀釋血清，并在37℃下用株NewYork′93/C的懸浮液(每孔100TCID50)接種1小時。向每孔中加入101.75個MDBK細胞并培育5天。通過免疫熒光而分析感染，通過Kaerber方法(Mayr等人，1974)計算，并以中和了約100 TCID50的50％終點稀度表示。
為檢測鼻涕中病毒，在結果部分所示時間點取出鼻內藥簽，在2ml輸送緩沖液(補充有5％FCS、100I.U./ml青霉素G、0.1mg/ml鏈霉素和2.5μg/ml兩性霉素B的PBS)中稀釋并通過0.2μm過濾器。在24孔板上用100μl這種制備物接種MDBK細胞，并在5天后通過間接免疫熒光顯微術分析。
結果基因組分析。株NY′93/C為第二種已被完全測序的BVDV 2型基因組。Northern印跡分析顯示，與株890(Ridpath和Bolin 1995)相反，NY′93/C的基因組不包含大的插入或缺失(未顯示數(shù)據(jù))。核苷酸序列分析顯示，基因組為12332個核苷酸長，并包含一個編碼3913個氨基酸的聚蛋白的可讀框。
通過RACE方法測定5′未翻譯區(qū)域(位1-385)，并發(fā)現(xiàn)除了位21外，其與Topliff和Kelling(1998)公布的New York′93序列相同。與其它已知2型基因組(Ridpath 1995；Topliff和Kelling 1998)相比，株NY′93/C在這個位置具有腺嘌呤而不是胸腺激素。
用于NY′93/C感染性cDNA克隆的構建和分析。盡管已為CSFV和BVDV 1型建立了大量感染性cDNA克隆(Mendez等人1998；Meyers等人1996a和1996b；Moormann等人1996；Vassilev等人1997；Kümmerer和Meyers 2000)，但這是由BVDV 2型株感染性克隆的首次報道。設計克隆用于借助T7 RNA聚合酶的失控轉錄(runoff transcription)，產生了類基因組的RNA而沒有任何異種附加物。由四種選自初始噬菌體文庫的cDNA質粒和一種包括位2265和4301之間區(qū)域的RT-PCR產物構成全長克隆。在5′端，加入T7啟動子序列以用于體外轉錄，并向3′端加入SrfI位點以用于質粒線性化(圖1)。全長克隆命名為pKANE40A。
使用通過體外轉錄而由線性化pKANE40A模板產生的RNA轉染MDBK細胞。在NS5B編碼區(qū)上游終止19個密碼子的質粒pKANE28AII的失控轉錄產物用作陰性對照。轉染后3天，在使用來自pKANE40A的RNA轉染的細胞中，免疫熒光染色后檢測到BVDV特異性信號，但在對照中沒有。產生于感染性克隆pKANE40A的病毒命名為XIKE-A。轉染細胞傳代二次，并把第二次傳代后的原液(stock)用于所有進一步的實驗。通過RT-PCR測序分析病毒，并取在位1630處從C交換到T的核苷酸作為XIKE-A身份的證據(jù)。
測定源于pKANE40A的RNA的特異性感染，與由野生型病毒NY93′/C感染的細胞中制備的RNA作比較。為此，使用磷成象儀(phosphoimager)測定MDBK細胞轉染用樣品中的病毒RNA的濃度，與Northern印跡和雜交后體外轉錄RNA的一定數(shù)量作比較。用同樣量的兩種RNA轉染MDBK細胞，并在轉染3天后計算噬斑。按平均數(shù)計算，源于pKANE40A的RNA的感染性為4.32×102pfu/μg，而野生型RNA產生4×102pfu/μg。
通過生長曲線分析重組病毒的生長特性，在同一實驗中使用原始就地分離物VLS#399作為對照(圖2)。以0.1m.o.i.感染MDBK細胞，并在感染后2小時-96小時內的7個時間點取樣。重組XIKE-A的生長曲線比VLS#399的稍平滑，但兩種病毒都在96小時后達到106.39的滴度。因此認為XIKE-A適合進一步的實驗。
Erns突變體的構建和分析。以前關于CSFV(Meyers等人，1999)的實驗已表明，通過用亮氨酸或細胞溶素替換組氨酸297或346(數(shù)字代表在CSFV株Alfort/Tübingen中的殘基位置)或通過密碼子“H346”的缺失而可破壞糖蛋白Erns中的RNAse活性。突變體病毒是活的，但在臨床上減毒。在BVDV株NY′93/C中，二種組氨酸殘基分別位于位300和349。為檢測突變在這些位置的影響是否與BVDV 2型基因組中的CSFV類似，用密碼子“H349”的缺失或用亮氨酸替換密碼子“H300”來設計二種感染性克隆。得到的重組病毒突變體稱為XIKE-B(H349Δ)和XIKE-C(H300L)。
通過對包括Erns編碼區(qū)的RT-PCR產物的核苷酸測序進行測定時，在至少5次傳代內，兩種突變體在MDBK細胞中都是穩(wěn)定的。比較二種突變病毒與源于野生型感染性克隆XIKE-A的病毒的生長特性(圖3)。
對使用相同m.o.i.的任何一種病毒感染的細胞，在感染2天后，在細胞的粗細胞提取物中測定XIKE-A、XIKE-B和XIKE-C的RNAse活性。檢測制備物等分試樣的降解聚(U)的能力；用野生型株NY′93/C感染的細胞作為陽性對照，未感染細胞作為陰性對照。培育30分鐘后，沉淀出殘余高分子量RNA，上清液的OD260測試結果顯示了小的降解RNA片段的存在(Meyers等人1999)。在NY′93/C和XIKE-A樣品中發(fā)現(xiàn)了高的RNAse活性，而二個突變體XIKE-B和XIKE-C在與陰性對照相同的范圍內(圖4)。
關于XIKE-A和NY′93/C的動物實驗。第一個動物實驗的目的是比較源于感染性cDNA克隆的重組病毒XIKE-A與野生型株NY′93/C的毒性和致病性。用105TCID50的XIKE-A(動物#615、#377、#901)或NY′93/C(動物#275、#612、#1610)各感染二組每組三個動物(8-9月齡)中的每一個。每組安置在分開的隔離單元內。每天記錄體溫和臨床征象；在感染后第0、2-16和21天采取血液樣品，以得到白細胞計數(shù)并檢測病毒血癥。在感染后第0、7、14、21、29和35天采集所有小牛的血清，用于檢測對抗NY′93/C的中和抗體。在感染后第0、2-16和21天取出病毒分離用的鼻內藥簽。

表1來自NY′93/C或XIKE-A感染動物的血沉棕黃層制劑和鼻內藥簽的病毒分離物。+檢測到病毒，-未檢測到病毒，bac＝細菌，*在感染后第13天對動物實施安樂死二組中的所有動物逐漸表現(xiàn)出發(fā)熱(圖5)和廣譜臨床征象包括呼吸癥狀和胃腸疾病。出于公益原因，在感染后第13天殺死動物#091。二組中的所有小牛從感染后第3天開始表現(xiàn)出白血球減少癥，并持續(xù)直到感染后第15天(圖6)。在來自NY′93/C感染動物持續(xù)5天的血沉棕黃層制備物中檢測到病毒，XIKE-A則為7天。持續(xù)1或2天發(fā)現(xiàn)流鼻涕(表1)。
通過源于由所有動物血沉棕黃層制備物制備的RNA的RT-PCR產物的核苷酸測序，而檢查病毒同一性。整個Erns編碼區(qū)(位1140-1780)進行測序，發(fā)現(xiàn)分別與NY′93/C或XIKE-A的已知序列一致。從感染后第14天開始，在所有小牛的血清中發(fā)現(xiàn)中和抗體(表2)。

*在第13天對動物實施安樂死表2用New York′93/C或XIKE-A實驗性感染后，在所有小牛的血清樣品中測定的中和抗體滴度。結果以抗New York′93/C(102.07TCID50)的血清BVDV特異性中和抗體滴度的倒數(shù)表示。
這項研究的結果表明，對于在天然宿主中的致病性和免疫應答的誘導，重組病毒XIKE-A高度類似于野生型病毒New York′93/C。因此，似乎可假定對于可在基于感染性克隆pKANE40A產生的病毒突變體中觀察到的這種臨床表現(xiàn)，任何偏離都確實由期望的突變造成。
關于XIKE-B和XIKE-A的動物實驗。在第二個動物實驗中，分析RNAse陰性突變體XIKE-B的臨床和免疫特性，并與XIKE-A比較。比H300L突變體優(yōu)先給出H349Δ突變體，以使基因返組到野生型的危險最小。
二組每組三只小牛(7-10周齡)，各自接種5×105TCID50劑量的XIKE-A(動物#387、#388、#418)或XIKE-B病毒(動物#415、#417、#419)。這些組安置在分開的隔離單元內。每天監(jiān)視直腸溫度和臨床癥狀；在第-8、0、2-14、17和21天取鼻內藥簽和血液樣品。在第0、8、12/14、21、28和38/40天采集血清樣品。
感染后9-10天，XIKE-A感染的小牛開始發(fā)熱并持續(xù)高達3天；另外，動物#387在感染后第3天發(fā)熱(圖7)伴有腹瀉和呼吸癥狀。小牛#388表現(xiàn)出痙攣。出于公益原因，在感染后第12天，對處于明顯抑郁和厭食狀態(tài)下的組實施安樂死。XIKE-B感染的小牛沒有高體溫(圖7)。只在持續(xù)高達6天內觀察到溫和的呼吸癥狀。在所有動物中發(fā)現(xiàn)白血球減少癥；但是，在野生型XIKE-A感染的小牛中的白細胞數(shù)量減少比在XIKE-B組中的更明顯(圖8)。
從感染后第4天開始，在所有動物的血沉棕黃層制備物中發(fā)現(xiàn)病毒；但是，Erns突變體的病毒血癥(φ4天)比具有野生型序列的病毒(φ8天)的時間短。對于用XIKE-A的動物，可在持續(xù)高達8天內觀察到病毒的鼻泄出(φ4.7)，但對于XIKE-B動物，最高只有1天(φ0.7)(表3)。
來自棕黃層制備物的病毒分離物 來自鼻內藥簽的病毒分感染后#415#417#419#387#388#418#415#417#419#387#388#418天數(shù)-8-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --0 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --2 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --3 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --4 +- +- -- ++ ++ ++ -- -- -- -- -- --5 ++ +- +- ++ ++ ++ -- -- -- -- -- +-6 ++ +- ++ ++ ++ ++ -- +- -- ------ +-7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- +- +- -- +-8 -- +- -- ++ ++ ++ -- -- -- -- -- +-9 -- -- -- ++ +- ++ -- -- -- ++ ++ +-10-- -- -- ++ +- +- -- -- -- +- +- ++11-- -- -- ++ +- ++ -- -- -- +- -- +-12-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- ++13-- -- -- * * * -- -- -- * * *14-- -- -- * * * -- -- -- * * *17-- -- -- * * * -- -- -- * * *21* * * -- -- -- * * *總4 5 3 8 8 8 0 1 1 4 2 8φ 4 8 0.7 4.7表3來自血沉棕黃層制備物和重組病毒XIKE-A(動物#387、#388和#418)或Erns突變體XIKE-B(動物#415、#417和#419)感染動物用的鼻內藥簽的病毒分離物。+檢測到病毒，-未檢測到病毒，*在感染后第12天對動物實施安樂死此外，對包括整個Erns編碼區(qū)的RT-PCR產物的核苷酸測序，用于血沉棕黃層制備物中的病毒識別。正如所料，來自動物#387、#388和#418的分離物為野生型。證實了動物#415、#417和#419缺失“H349”密碼子。有趣地是，從來自這二只動物(#415和#419)的RT-PCR產物中發(fā)現(xiàn)另外的位點突變核苷酸位1246由鳥嘌呤變?yōu)樾叵偌に?，導致氨基酸替換Q287H。在感染后第12天，首次在以XIKE-A感染小牛的血清中檢測到中和抗體，并于感染后第14天在Erns突變體感染小牛的血清中也檢測到(表4)。

*在第12天對動物實施安樂死。
表4在用XIKE-A(野生型序列)或XIKE-B(H346？)實驗性感染后，在所有小牛血清樣品中測定的中和抗體滴度。結果以抗New York‘93/C(101.7TCID50)的血清BVDV特異性中和抗體滴度的倒數(shù)表示。
實施例2實驗設計從BVDV陰性畜群中選出12只懷孕小母牛。實驗中包括5/7只小母牛的下列組。
No. 接種 病毒組15 一次鼻內施用，每個鼻孔3mlXIKE-A組25 一次鼻內施用，每個鼻孔3mlNY-93在接種前8天，將小母牛遷移到研究實驗室中。轉入到研究實驗室后，確認妊娠狀態(tài)。在接種日，小母牛處于60-90天妊娠期內。在一個時間點，以在6ml組織培養(yǎng)上清液中加入2.5×104TCID50/ml的各種病毒對所有動物接種。
在觀察期內監(jiān)視小母牛出現(xiàn)的BVDV感染臨床征象包括流產。感染后9周結束實驗。宰殺未流產母牛，檢查并采集子宮。在常規(guī)尸體剖檢中采集胎體器官樣品，并檢查BVDV感染。
出現(xiàn)胎兒感染是主要評價參數(shù)，由BVDV相關的母牛死亡數(shù)字、BVDV相關的流產數(shù)和結束時BVD陽性胎牛數(shù)所構成。
結果組1動物號結論526 BVD流產598 BVD流產615 BVD流產618 BVD流產626 小母牛死于BVD組2動物號結論184 小母牛死于BVD203 BVD流產232 小母牛死于BVD233 胎兒BVD陽性(病毒血癥(viremic))252 BVD流產267 小母牛死于BVD306 BVD流產實施例3本研究旨在評估BVDV分離物抗胎兒感染的效力。調查了E(RNS)蛋白XIKE-B(H349Δ)中具有Rnase功能缺失的NY93感染性拷貝衍生物BVDV重組子(II型)對在異種I型攻擊后預防胎兒感染的效力。
對暴露于BVDV的胎牛來說，60到90天之間為最敏感期。因此在這個實驗中，通過單個接觸XIKE B(肌內)使來自沒有BVDV農場(并確認BVDV血清反應陰性)的小母牛免疫。此后，使小母牛受孕，并當動物在60-90天時，假定動物對BVDV胎牛感染高度敏感，用野生型就地病毒進行攻擊感染。選擇鼻內攻擊途徑，因為這是模擬野外感染的常規(guī)的最佳途徑。
實驗設計從BVDV陰性畜群中選擇小母牛。從血清和病毒上檢測這些小母牛，BVDV呈陰性。實驗中包括以下小母牛組。

直到攻擊，畜群源中的組1保持未進行預防。接種疫苗后采集血液樣品，用于血沉棕黃層制備和血清學。
對所有組免疫處理4周后開始授精。攻擊前將組1轉移到研究實驗室內。
在接種疫苗4個月零10天后攻擊小母牛。在接種日，妊娠狀況為60-90天懷孕期間。
胎牛感染的預防為主要評價參數(shù)。
過程順序和時間表

BVDV攻擊病毒在不含BVDV的合適培養(yǎng)基中生長病毒，等分試樣并在-70℃[±10℃]下冷凍。

接種疫苗在實驗設計部分描述了接種疫苗表

結果直腸溫度除一例外，溫度值均低于39℃，并且在觀察期內未發(fā)現(xiàn)異常波動。小母牛N°1249(組1)在14DPI(＝感染后天數(shù))出現(xiàn)39.1℃的溫度，次日恢復到正常值。
白細胞計數(shù)將0DPI值看作比較的單個基準。在本研究原始記錄中未限定白細胞計數(shù)的下限。但是，白細胞計數(shù)減少40％或更多，即值達到基準值(攻擊日建立)的60％或更少，可認為在生物學上顯著。
個體平均白細胞計數(shù)列于下面表1中。
表1個體平均白細胞計數(shù)組1

組2

*在感染前一天采集0天樣品所有組中的基準白細胞計數(shù)近似。組1中的二只小母牛(I型株感染)在攻擊后經歷了白細胞計數(shù)(以灰色高亮顯示值)的生物學顯著減少(最大下降記錄于4-8DPI)，而相應接種疫苗的小母牛(組2)在白細胞上沒有明顯降低。唯一的例外是小母牛N°1197，其在單日即感染后第14天表現(xiàn)出明顯降低。次日，白細胞計數(shù)恢復到被認為是正常水平的值(偏離基準小于40％)。
病毒分離數(shù)據(jù)前面的實施例中已詳細描述了病毒分離研究所用的方法。
來自血沉棕黃層的病毒分離數(shù)據(jù)(描述為用候選疫苗(XIKE B)感染后天數(shù)(＝DPI)進行描述


來自胎牛器官的病毒分離物

在接種XIKE B后，所有小母牛都未表現(xiàn)出任何BVDV感染的典型臨床癥狀。攻擊后，1組小母牛具有至少一天的病毒血癥，而在2組中，未在攻擊后的任何一天內檢測到病毒血癥。來自1組小母牛的所有胎牛均為BVDV陽性(用病毒分離測試BVDV，所有下列器官均為陽性)(腸系膜淋巴結；小腸，脾，胸腺，腎，胸骨，骨髓，小腦)；來自組2小母牛的胎牛均為BVDV陰性(在所有共同測試的器官中腸系膜淋巴結；小腸，脾，胸腺，腎，胸骨，骨髓，小腦)。
因此，對感染性拷貝衍生病毒是成功減毒，并表明可作為疫苗病毒以預防胎牛感染的潛在應用。
XIKE B病毒在抗原上屬于BVDV II型病毒，并在用屬于BVDV I型抗原組的異種攻擊病毒攻擊后對胎牛感染預防方面有效。
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序列表<110>貝林格爾.英格海姆維特梅卡迪有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)<120>感染性牛病毒性腹瀉病毒克隆<130>尚未分配<150>DE10143813.3<151>2001-09-06<160>28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12332<212>DNA<213>牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)<400>1gtatacgaga ttagctaaag aactcgtata tggattggac gtcaacaaat ttttaattgg60caacgtaggg aaccttcccc tcagcgaagg ccgaaaagag gctagccatg cccttagtag120gactagcaaa agtaggggac tagcggtagc agtgagttcg ttggatggcc gaacccctga180gtacagggga gtcgtcaatg gttcgacact ccattagtcg aggagtctcg agatgccatg240tggacgaggg catgcccacg gcacatctta acccatgcgg gggttgcatg ggtgaaagcg300ctattcgtgg cgttatggac acagcctgat agggtgtagc agagacctgc tattccgcta360gtaaaaactc tgctgtacat ggcacatgga gttgttttca aatgaacttt tatacaaaac420atataaacaa aaaccagcag gcgtcgtgga acctgtttac gacgtcaacg ggcgcccact480gtttggagag agcagtgact tgcacccgca gtcaacacta aaactaccac accaacgagg540cagcgccaac atcctgacca atgctaggtc cctaccgcgg aaaggtgact gccggagagg600
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<400>23cctaaccatg atatatgcct tctg 24<210>24<211>36<212>DNA<213>PCR引物<400>24cggaattcgc ccgggctgtt agaggtcttc cctagt 36<210>25<211>24<212>DNA<213>寡核苷酸<400>25gagtggaata aaggttggtg taac 24<210>26<211>24<212>DNA<213>寡核苷酸<400>26gttacaccaa cctttattcc actc 24
<210>27<211>27<212>DNA<213>寡核苷酸<400>27aacaggagtc tattaggaat ttggcca 27<210>28<211>27<212>DNA<213>寡核苷酸<400>28tggccaaatt cctaatagac tcctgtt 2權利要求
1.包含與BVDV RNA互補的核苷酸序列的DNA分子，其中所述RNA在引入易感染宿主細胞時，能誘導產生感染性BVDV粒子a)當用6×106TCID50劑量感染時，具有誘發(fā)小牛病毒血癥和白血球減少癥持續(xù)至少一天時間和下列包括腹瀉和/或發(fā)熱中的至少一種臨床癥狀持續(xù)至少一天的能力；和/或b)與衍生這種DNA分子的野生型BVDV分離物相比，具有真實毒性；和/或c)當用這種粒子以6×106TCID50劑量感染BVDV首次使用的小牛時，在21天時間內這些小牛中的至少30％致死；和/或d)具有不少于90％的包括一個與SEQ ID NO.1互補的序列RNA的BVDV粒子的毒性；和/或e)包括與SEQ ID NO.1互補的序列。
2.能用作模板轉錄為RNA的感染性BVDV克隆，其中所述RNA在引入易感染宿主細胞時，能誘導產生感染性BVDV粒子f)當用6×106TCID50劑量感染時，具有誘發(fā)小牛病毒血癥和白血球減少癥持續(xù)至少一天時間和下列腹瀉和/或發(fā)熱中的至少一種臨床癥狀持續(xù)至少一天的能力；和/或g)與衍生這種DNA分子的野生型BVDV分離物相比，具有真實毒性；和/或h)當用這種粒子以6×106TCID50劑量感染3-6月齡BVDV首次試驗的小牛時，在感染后21天時間內這些小牛中的至少30％致死；和/或i)具有不少于90％的包括一個與SEQ ID NO.1互補的序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或j)包括與SEQ ID NO.1互補的序列。
3.根據(jù)權利要求1的DNA分子，其中階段a)中的發(fā)熱為至少40℃。
4.一種通過以下步驟產生的BVDV粒子使用根據(jù)權利要求1或3的DNA分子或根據(jù)權利要求2的BVDV克隆進行轉錄、用所述RNA轉染合適細胞或細胞系并收集由所述細胞產生得到的BVDV粒子。
5.感染性BVDV 2型克隆。
6.感染性BVDV 2型克隆，能用作轉錄為RNA的模板，其中所述RNA在引入易感染宿主細胞時，能誘導產生感染性BVDV粒子k)當用6×106TCID50劑量感染時，具有誘發(fā)小牛病毒血癥和白血球減少癥持續(xù)至少一天時間和下列包括腹瀉和/或發(fā)熱中的至少一種臨床癥狀持續(xù)至少一天的能力；和/或l)與衍生這種DNA分子的野生型BVDV分離物相比，具有真實毒性；和/或m)當用這種粒子以6×106TCID50劑量感染3-6月齡BVDV首次試驗用小牛時，在感染后21天時間內這些小牛中至少30％致死；和/或n)具有不少于90％的包括一個與SEQ ID NO.1互補的序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或o)包括與SEQ ID NO.1互補的序列。
7.根據(jù)權利要求5或6的感染性BVDV 2型克隆，特征為DNA序列SEQID NO.1或其片段、功能變異體、基于退化核酸密碼的變異體，融合分子或其化學衍生物。
8.一種通過以下步驟產生BVDV2型粒子，根據(jù)權利要求5-7任一權利要求的BVDV克隆的體外轉錄成RNA、用所述RNA轉染合適細胞或細胞系并收集由所述細胞產生得到的BVDV粒子。
9.包含與全長BVDV 2型RNA互補的核苷酸序列的DNA分子。
10.根據(jù)權利要求9的DNA分子，特征為SEQ ID NO.1或其片段、功能變異體、基于退化核酸密碼的變異體，融合分子或其化學衍生物。
11.根據(jù)權利要求9或10的DNA分子，由特征為SEQ ID NO.1的序列組成。
12.與權利要求1或權利要求3或權利要求9-11中任一權利要求的DNA分子、或與權利要求2或權利要求4或權利要求5-7的BVDV克隆互補的RNA分子。
13.一種RNA分子，它通過權利要求1或權利要求3或權利要求9-11中任一權利要求的DNA分子、或權利要求2或權利要求4或權利要求5-7的BVDV克隆轉錄而得到。
14.由野生型BVDV分離物制備感染性BVDV克隆的方法，與所述野生型分離物相比，與RNA互補的所述BVDV克隆具有真實毒性，該方法包括步驟p)從感染動物中分離病毒粒子；q)在合適細胞培養(yǎng)細胞中傳代不超過2次；r)由病毒粒子制備RNA；s)在RNA反轉錄后產生全長互補DNA；其中反轉錄包括在足夠高的溫度下切斷或降低RNA二級結構的步驟，并在這個步驟中使用熱穩(wěn)定酶，所述酶在這些高溫下具有活性；t)在合適細胞感染時將互補DNA(cDNA)結合到質粒載體上或結合進能引導BVDV cDNA轉錄成RNA的DNA病毒中。
15.由野生型BVDV分離物制備感染性BVDV克隆的方法，與RNA互補的所述感染性BVDV克隆具有不少于90％的所述野生型分離物的毒性，該方法包括步驟u)從感染動物中分離病毒粒子；v)由病毒粒子制備RNA；w)在RNA反轉錄后產生全長互補DNA；其中反轉錄包括在足夠高的溫度下切斷或降低RNA二級結構的步驟，并在這個步驟中使用熱穩(wěn)定酶，所述酶在這些高溫下具有活性；x)在合適細胞感染時將互補DNA(cDNA)結合到質粒載體上或結合到能引導BVDV cDNA轉錄成RNA的DNA病毒中。
16.權利要求14或15的方法，其中應用RACE轉錄RNA 5′端。
17.權利要求16的方法，其中使用允許反應溫度至少為42℃的熱穩(wěn)定酶進行RACE。
18.BVDV減毒方法，或包括將一個或多個突變體引入權利要求1或權利要求3或權利要求9-11中任一權利要求的DNA分子中、或引入權利要求2或權利要求4或權利要求5-7的感染性BVDV克隆中，其中所述一個突變或多個突變導致或增加了復原BVD病毒的減毒表型。
19.BVDV株的減毒方法，該方法包括步驟y)將一個或多個突變引入權利要求1或權利要求3或權利要求9-11中任一權利要求的DNA分子中或引入權利要求2或權利要求4或權利要求5-7的感染性BVDV克隆中；z)將突變DNA引入易感染宿主細胞，其中所述DNA被轉錄成RNA，或將由所述DNA轉錄的RNA引入所述細胞；和aa)收集由這些細胞產生的病毒粒子；其中所述一個突變或多個突變引起減毒。
20.權利要求18或19的方法，其中一個突變或多個突變?yōu)樘鎿Q、缺失、插入、增加或其合并。
21.權利要求18-20中任一權利要求的方法，其中一個突變或多個突變是在糖蛋白Erns中并導致突變蛋白功能損傷或喪失。
22.權利要求21的方法，其中突變包括bb)全部或部分糖蛋白Erns的缺失；和/或cc)SEQ ID NO.1中位300處的組氨酸的缺失或替換；和/或dd)SEQ ID NO.1中位349處的組氨酸的缺失或替換。
23.通過根據(jù)權利18-22中任一權利要求的方法得到的減毒BVDV克隆或BVDV株。
24.包括根據(jù)權利23的減毒BVDV克隆或株的疫苗，可任選地結合藥物可接受載體或賦形劑。
25.根據(jù)權利23的減毒BVDV克隆或株在BVDV感染的預防和治療用疫苗生產中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物衛(wèi)生特別是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)領域。本發(fā)明提供感染性BVDV克隆和產生所述BVDV克隆的方法。本發(fā)明還涉及使所述克隆減毒的方法、減毒BVDV克隆和包括所述減毒克隆的疫苗。
文檔編號A61P31/14GK1551913SQ02817511
公開日2004年12月1日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權日2001年9月6日
發(fā)明者克努特·埃爾伯斯, 克里斯蒂安·邁耶, 馬蒂納·馮弗賴伯格, 格雷戈爾·邁耶斯, 馮弗賴伯格, 克努特 埃爾伯斯, 爾 邁耶斯, 蒂安 邁耶 申請人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡有限公司, 貝林格爾 英格海姆維特梅迪卡有限公