專利名稱：人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物制劑的制作方法
相關(guān)申請本發(fā)明要求在2001年9月7日提交的美國臨時申請序列號60/318,173的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此引入作為參考。
背景纖溶酶原激活物是一種絲氨酸蛋白酶，其將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶再將血管中阻斷血液流向重要器官的血栓降解。Collen，D.(1980)Thromb.Haemost.4377-89。因此，纖溶酶原激活物可以用于預防或治療其中需要通過纖溶酶原激活產(chǎn)生局部纖維蛋白溶解活性的疾病。該疾病包括中風，靜脈血栓形成，肺栓塞，或深靜脈和外周動脈阻塞。參見Bang，N.U.(1989)Circulation 791391-1392。
概述一方面，本發(fā)明涉及無水的不含精氨酸的制劑，其包括人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物；賴氨酸；磷酸；和非離子洗滌劑。在該制劑中，人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑的量分別為10-60mg(例如15-50mg或30-40mg)，100-700mg(例如150-500mg或200-350mg)，20-100mg(例如30-80mg或40-60mg)，和0.2-5mg(例如0.3-3mg或0.4-0.8mg)；或者為相同相對比率的量。本發(fā)明的一種制劑包括人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑，量分別為35mg，200mg，50mg，和0.5mg；或者為相同相對比率的量。非離子洗滌劑可以是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
在另一方面，本發(fā)明涉及無水的不含精氨酸的制劑，其包括5-20％(例如8-16％或10-14％)重量的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物和55-85％(例如60-80％或65-75％)重量的賴氨酸。該制劑可另外包括15-20％重量的磷酸，和0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物是人組織纖溶酶原激活物和人尿激酶纖溶酶原激活物的雜合蛋白。它可以通過重組細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)。該雜合蛋白的氨基酸序列在美國專利4,997,766，4,916,071，5,045,315，和5,047,241中公開。術(shù)語“人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物”包括剛才所述的雜合蛋白的等價物，其具有至少80％(例如90％，95％或99％)的百分比同一性，并且具有基本上相同的纖維蛋白溶解活性(±10％)。使用如在Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)中改進的Karlin和Altschul的算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268)確定兩個氨基酸序列的“百分比同一性”。該算法被結(jié)合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(1990，J.Mol.Biol.215403-410)。用NBLAST程序，得分＝100，字長＝12進行核苷酸搜索。用XBLAST程序，得分＝50，字長＝3進行BLAST蛋白質(zhì)搜索。在兩個序列間存在缺口處，如在Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)所述使用有間隙的BLAST(Gapped BLAST)。當使用BLAST和有間隙的BLAST程序時，使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/。
本文使用的術(shù)語“賴氨酸”指D-或L-形式的賴氨酸。為了保持電中性，用來自磷酸的磷酸鹽(即平衡離子)平衡本發(fā)明制劑中的賴氨酸?？梢允褂闷渌m當?shù)钠胶怆x子(例如乙酸鹽，檸檬酸鹽，琥珀酸鹽，硫酸鹽，或碳酸鹽)。
本發(fā)明的其它特征，目的，和優(yōu)勢將從下列描述和權(quán)利要求中變得明顯。
詳細描述人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物是人組織纖溶酶原激活物和人尿激酶纖溶酶原激活物，在人中發(fā)現(xiàn)的兩類纖溶酶原激活物的雜合蛋白。關(guān)于人組織纖溶酶原激活物和人尿激酶纖溶酶原激活物的DNA和氨基酸序列，參見Pennica等(1983)Nature 301214；Ny等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815355；和Verde等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814727。兩種纖溶酶原激活物都與血纖蛋白結(jié)合并作用在血栓位點。與人組織纖溶酶原激活物或人尿激酶纖溶酶原相比，雜合蛋白還是纖維蛋白溶酶活性的并提供增加穩(wěn)定性，增加的對血纖蛋白的親和力，和改善的體內(nèi)半衰期的優(yōu)勢。參見美國專利4,997,766，4,916,071，5,045,315，和5,047,241。不含精氨酸的本發(fā)明的制劑意外地保持人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的這些性能。
通過本領(lǐng)域已知的方法可以制備人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物。更具體地，使用如美國專利4,997,766，4,916,071，5,045,315，和5,047,241所述的重組DNA技術(shù)從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細胞系中可以獲得它。然后通過柱層析或其它技術(shù)可以純化人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物。通過任何適當?shù)姆椒?，例如柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，高壓液相色譜分析，或纖維蛋白溶解活性的分析可以容易地測量純度。
通過在緩沖液交換方法(例如凝膠過濾或透析)中使用剛才所述的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物和凍干包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的溶液可以制備本發(fā)明的制劑。在緩沖液交換方法中可以使用的緩沖液(即制劑緩沖液)包括0.1-0.7M的賴氨酸(例如0.15-0.5M，或0.2-0.35M)。緩沖液的pH值為6.5-7.5。另外，緩沖液包括一種或多種非離子洗滌劑，如失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，量為0.001％至1％。在緩沖液交換例如透析以后，可以將包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的溶液轉(zhuǎn)移至細頸瓶中并凍干成貯存形式。使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法和設(shè)備可以進行包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的溶液的凍干，或冷凍干燥。
用于實施本發(fā)明的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的纖維蛋白溶解活性是30,000-38,000IU/mg，例如36,000IU/mg。通過例如在美國專利4,777,043中描述的方法可以測定人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的纖維蛋白溶解活性。本發(fā)明的無水制劑包括藥物有效量的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物。藥物有效量指向治療的患者提供治療效果的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的量，如10-60mg。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員公認，取決于賦形劑的使用，給藥途徑，和與其它治療療法共使用的可能性有效量也將變化。
使用常規(guī)方法可以將本發(fā)明的無水制劑向患者給藥。通過各種注射或輸注技術(shù)可以經(jīng)腸胃外途徑給藥。無論如何，將無水制劑溶解在適當?shù)乃匀軇┲?，例如注射用水。需要適當體積的水性溶劑(例如5mL或10mL的注射用水)溶解無水制劑中的所有成分。作為制備適當劑型的實例，將10mL注射用水加至包含35mg人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，200mg賴氨酸，50mg磷酸，和0.5mg失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯的小瓶中，從而重建包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的溶液。優(yōu)選地，在用10mL注射用水重建后立即將無水制劑用于單次靜脈內(nèi)bolus給藥。
沒有另外的詳述，認為上述描述已經(jīng)足夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。因此下列具體的實施方案被認為僅僅是例證性的，無論如何不是以任何方式限制本公開的剩余。本文引用的所有出版物，包括專利，其全部內(nèi)容由此通過參考被結(jié)合。
無水制劑的制備如在例如美國專利4,916,071所述獲得轉(zhuǎn)化的C127雜合人組織類型尿激酶纖溶酶原激活物-生產(chǎn)細胞系。在補充胎牛血清(10％)，谷氨酰胺(4mM)，和慶大霉素(50μg/mL)的DMEM∶F12(1∶1)生長培養(yǎng)基(GIBCO/BRL)中維持細胞。在濕潤的37℃，5％CO2恒溫箱中將細胞培養(yǎng)物溫育1天。然后收集細胞并用10mL磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)緩沖液洗滌。加入4mL包含胰蛋白酶-EDTA的溶液以脫離細胞，并將細胞轉(zhuǎn)移至5mL生長培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)速為0.5rpm的滾桶上在37℃下溫育獲得的細胞培養(yǎng)物。2天后，用包含抑酶肽(10KIU/mL)的新鮮DMEM∶F12(1∶1)生長培養(yǎng)基替換培養(yǎng)液，保留包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的培養(yǎng)液。連續(xù)地，每2天重復替換。合并條件培養(yǎng)基(conditionmedium)并通過3.0和0.22μm濾器順序過濾。
將濾液加樣到螯合鋅的-Sepharose柱(Pharmacia，5.0cm×7.5cm)。用150mL PBS/TW緩沖液(0.02M磷酸鈉，0.15M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.4)和600mL PB緩沖液(0.02M磷酸鈉，0.3M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.4)洗滌后，用洗脫緩沖液(0.02M磷酸鈉，0.3M NaCl，0.05M咪唑，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.4)洗脫柱。收集并合并包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的級分。將合并的級分加樣到L-賴氨酸Sepharose柱(1.5cm×20cm)。在用35mL PB緩沖液和250mL洗滌緩沖液(0.05M Tris-HCl，0.3M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.5)洗滌后，用另外的洗脫緩沖液(0.05M Tris-HCl，0.5M L-精氨酸，0.3M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.5)洗脫柱。獲得在緩沖液中的純化的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物。所有上述步驟在5-8℃下進行。
將0.5mL緩沖液中純化的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物加樣在透析膜(Spectrum)中，將膜放置在包含0.5L制劑緩沖液(0.2M賴氨酸，0.1M磷酸，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.1)的透析液儲存器中。在4℃下進行透析18小時，在用1L新鮮緩沖液替換制劑緩沖液后繼續(xù)18小時，然后在供給另外1L新鮮緩沖液后另外進行16小時。從膜上去除，獲得包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物的水溶液并凍干以生產(chǎn)無水制劑。
測定人組織尿激酶纖溶酶原激活物的活性使用人組織纖溶酶原激活物(購自NIBSC組織，標記為組織纖溶酶原激活物，人，重組體，第三國際標準98/714)作為標準物，通過平板纖維蛋白溶解作用測定方法進行人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物活性的測量。通過國際合作研究測定標準物的效價并且發(fā)現(xiàn)為10,000IU/安瓿。用5mL PBS緩沖液稀釋15μL凝血酶溶液(0.5U/μL)，并與5mL包含纖溶酶原(10U)的PBS緩沖液混合。將4.5mL混合溶液和4.5mL血纖蛋白原溶液加到9mL 1％的48℃等分瓊脂糖中。攪拌如此獲得的混合物并倒在90×90mm2平板上。在冷卻的平板上打3mm的孔以制備孔。使用用PBS緩沖液(0.1mg/mL牛血清清蛋白，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯)的標準人組織纖溶酶原激活物的連續(xù)稀釋。將如上所述獲得的在制劑緩沖液中人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物樣品的10μL樣品，和標準人組織纖溶酶原激活物稀釋物加樣到孔上，在室溫下溫育20-24小時。對于每個樣品測量纖維蛋白的亮區(qū)直徑。對于標準人組織纖溶酶原激活物稀釋物，將區(qū)域直徑對稀釋物的活性單位作圖，獲得標準曲線。對于人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，將區(qū)域直徑用來測定人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物樣品的活性。
其它實施方案本說明書中公開的所有特征可以以任何結(jié)合的形式結(jié)合。本說明書中公開的每個特征可以被備選的用于相同，等價，或類似目的的特征所替代。因此，除非特別另外聲明，公開的每個特征只是一般系列的等價或類似特征中的實例。
從上述描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下可以進行本發(fā)明的各種變化和修改以使它適合于各種用途和情形。例如，可以將具有相同官能團和pKa的賴氨酸取代物用于制劑中來實施本發(fā)明。因此，其它實施方案也在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種無水的不含精氨酸的制劑，其包含人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物；賴氨酸；磷酸；和非離子洗滌劑；其中所述人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑的量分別為10-60mg，100-700mg，20-100mg，和0.2-5mg；或者為相同相對比率的量。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中所述人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑的量分別為15-50mg，150-500mg，30-80mg，和0.3-3mg；或者為相同相對比率的量。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
4.權(quán)利要求2的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
5.權(quán)利要求1的制劑，其中所述人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑的量分別為30-40mg，200-350mg，40-60mg，和0.4-0.8mg；或者為相同相對比率的量。
6.權(quán)利要求5的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
7.權(quán)利要求5的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
8.權(quán)利要求1的制劑，其中所述人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑的量分別為35mg，200mg，50mg，和0.5mg；或者為相同相對比率的量。
9.權(quán)利要求8的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
10.權(quán)利要求8的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
11.權(quán)利要求1的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
12.權(quán)利要求1的制劑，其中所述非離子洗滌劑是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
13.一種無水的不含精氨酸的制劑，其包含5-20％重量的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物和55-85％重量的賴氨酸。
14.權(quán)利要求13的制劑，其中所述制劑包含8-16％重量的人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物和60-80％重量的賴氨酸。
15.權(quán)利要求14的制劑，其另外包含15-20％重量的磷酸。
16.權(quán)利要求15的制劑，其另外包含0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
17.權(quán)利要求14的制劑，其另外包含0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
18.權(quán)利要求13的制劑，其中所述制劑包含10-14％重量人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物和65-75％重量賴氨酸。
19.權(quán)利要求18的制劑，其另外包含15-20％重量的磷酸。
20.權(quán)利要求19的制劑，其另外包含0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
21.權(quán)利要求18的制劑，其另外包含0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
22.權(quán)利要求13的制劑，其另外包含15-20％重量的磷酸。
23.權(quán)利要求22的制劑，其另外包含0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
24.權(quán)利要求13的制劑，其另外包含0.15-0.2％重量的非離子洗滌劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無水的不含精氨酸的制劑，其包括人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑，其中人組織尿激酶類型纖溶酶原激活物，賴氨酸，磷酸，和非離子洗滌劑的量分別為10－60mg，100－700mg，20－100mg，和0.2－5mg；或者為相同相對比率的量。
文檔編號A61K47/04GK1553811SQ02817532
公開日2004年12月8日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者洪伯文, 張學賢, 吳燦輝, 黃國魁 申請人:環(huán)球基因生物科技股份有限公司