專利名稱：增強(qiáng)免疫應(yīng)答的試劑的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域這項發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及不同類型佐劑的組合以輔助宿主產(chǎn)生對于病原體、哺乳動物抗原和其它臨床有意義的目標(biāo)增強(qiáng)了的體內(nèi)抗體反應(yīng)。
相關(guān)技術(shù)的描述75年前，Ramon證明通過施用含有引起發(fā)熱細(xì)菌的疫苗提高對于白喉和破傷風(fēng)的抗毒素反應(yīng)是可能的。從那時開始，就存在臨床醫(yī)師和免疫學(xué)家在努力通過佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，同時嘗試使經(jīng)常存在的阻礙它們在人類中應(yīng)用的毒性副反應(yīng)最小化。
通常，抗原通過抗原呈遞細(xì)胞“呈遞”給免疫系統(tǒng)，它包括APC表面的主要組織相容性復(fù)合分子(MHC)存在下的B-細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和的巨噬細(xì)胞。通常，認(rèn)為作為免疫原的合成和自然抗原是被APC攝取和部分消化的，使得較小片的原始完整的抗原可在細(xì)胞表面表達(dá)。
現(xiàn)在已經(jīng)明白，T-淋巴細(xì)胞對B-淋巴細(xì)胞，相對來說是不能與可溶性抗原作用的。典型的，T-淋巴細(xì)胞需要將抗原處理，然后表達(dá)在有上面提及的MHC分子存在時的APC細(xì)胞表面。T-細(xì)胞和特異性的T-細(xì)胞受體辨認(rèn)雙分子配體形式的抗原，這種配體包括所處理的抗原以及一個或多個MHC分子。已經(jīng)認(rèn)為在T-細(xì)胞有效起動之前，所述APC分子必須被激活表達(dá)共-刺激分子。
樹突狀細(xì)胞(DC)被認(rèn)為是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，顯然是唯一能在初次免疫應(yīng)答中活化天然(以前未被激活)T細(xì)胞的細(xì)胞(Banchereau和Steinman 1998 Nature392245-252)。如果一種疫苗為了產(chǎn)生全T細(xì)胞免疫和最佳的抗體反應(yīng)，激活天然T細(xì)胞是必須的。不幸的是，樹突狀細(xì)胞很少。它們在次級淋巴器官中每400個細(xì)胞中僅有1個，每500個白細(xì)胞中有1個，在大多數(shù)非淋巴組織中每1000個細(xì)胞中有1個。伴隨所述缺乏的是天然T細(xì)胞對于任何單個表位或MHC肽復(fù)合物的低頻率反應(yīng)，估計低至1/10,000(Mason 1998 Immunol.Today 19395-404)，簡而言之，產(chǎn)生最好的免疫應(yīng)答接下來就是所述抗原到達(dá)一種稀少細(xì)胞，它必須接下來和另外一種稀少免疫細(xì)胞相作用。
天然T細(xì)胞通過血流連續(xù)的再循環(huán)通過淋巴結(jié)(Gretz等1996 J Immunol 157495-499)，然而不成熟的樹突狀細(xì)胞是非淋巴器官相對穩(wěn)定的居住者(Cowing和Gilmore 1992 J Immumol.1481072-1079)。不成熟的樹突狀細(xì)胞表達(dá)低水平的表面MHC和共-刺激分子，如僅是T細(xì)胞的弱激活劑。然而，這些細(xì)胞是胞飲作用形成的并且吞噬細(xì)胞的，使得它們能夠經(jīng)常探測環(huán)境而發(fā)現(xiàn)潛在病原體的存在。當(dāng)暴露于合適的“刺激”(刺激性佐劑)時，不成熟的樹突狀細(xì)胞被動員，脫離局部組織并通過不同的淋巴系統(tǒng)遷移到淋巴結(jié)(Banchereau和Steinman 1998 Nature392245-252)。在它們遷移至淋巴結(jié)過程中，DC成熟并成為有效的T細(xì)胞激活劑。朗格罕氏細(xì)胞可能是研究最多的DC細(xì)胞。它們寄居在皮膚表皮層和黏膜，它們在其中出現(xiàn)的頻率要比在其它非淋巴器官中發(fā)現(xiàn)的不成熟樹突狀細(xì)胞高。能夠使佐劑適合每一種類型的免疫細(xì)胞，特別是朗格罕氏類型的DC會有很大的收效。
由于以上給出的原因，許多免疫原以及部分表位，包括外源和內(nèi)源的，經(jīng)常不被辨認(rèn)，或僅被免疫系統(tǒng)微弱的辨認(rèn)。很難，在一些例子中不可能誘導(dǎo)針對這樣目標(biāo)的抗體產(chǎn)生。當(dāng)處理小的半抗原或發(fā)展包含小的非免疫原肽亞單位疫苗時，這個問題經(jīng)常遇到。配制這樣疫苗的傳統(tǒng)方法是通過和蛋白質(zhì)載體結(jié)合以大分子呈遞這些抗原，所述蛋白質(zhì)載體更具有免疫原性并且是疫苗的目標(biāo)(聯(lián)合疫苗)。但是經(jīng)常是所述軛合物仍不能誘導(dǎo)對于較少量免疫原性材料的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的產(chǎn)生。在這些例子中，一種佐劑是需要的。不幸的是，現(xiàn)在許多佐劑(被證明的和在試驗中的)可增強(qiáng)免疫應(yīng)答的一些方面，但所有的都通常不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL反應(yīng)、血清反應(yīng)的必須水平，和/或表現(xiàn)出一些類型的毒性?，F(xiàn)在對于病毒感染的看法，主張保護(hù)最好是同時通過體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力而實現(xiàn)的，包括長時間記憶和細(xì)胞毒性T-細(xì)胞。
US 2001/0024649 A1描述了局部施用免疫原和一些在這項發(fā)明中歸類為興奮劑的試劑。發(fā)明者提供了對于DC成熟以及需要興奮劑的良好概述，然而沒有提及引導(dǎo)分子和興奮劑的聯(lián)合。
WO 99/43350描述了局部預(yù)處理試劑和佐劑，其中所述的一些歸類為興奮劑，但沒討論抗原目標(biāo)。輸遞途徑限于IM、口服、鼻腔和直腸。
在WO 02/11669中，本發(fā)明者描述了皂苷和α2-M和HSP的聯(lián)合。所述文獻(xiàn)列出了其它的反應(yīng)修飾成分，這項發(fā)明歸之為興奮劑。雖然沒有為促進(jìn)關(guān)系提供數(shù)據(jù)或事實，但描述了一種興奮劑(皂苷)和兩種不同引導(dǎo)分子的聯(lián)合。由于所有引導(dǎo)分子是相同受體(CD91)，本發(fā)明者不能認(rèn)識和證明兩類佐劑之間更廣泛的聯(lián)系。進(jìn)而，由于HSP和受激細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，并期待擁有“興奮劑”類型-表位，來自皂苷的作用不清楚。本發(fā)明者沒有對抗體的應(yīng)用作任何評論。
WO 99/13915討論了抗原目標(biāo)，然而缺乏對于協(xié)作的描述，它可以通過兩類佐劑的聯(lián)合而實現(xiàn)。所述工作關(guān)注DNA抗原，包含抗原和引導(dǎo)分子必須和如PEI的試劑結(jié)合。通過第一輸遞途徑僅觀察到2x的增強(qiáng)，這看上去和通過第二輸遞途徑輸遞不帶引導(dǎo)分子的抗原是相匹配的。如早些時候在這項申請中所討論的，DNA抗原如傳統(tǒng)免疫原仍需要興奮劑。所述WO文獻(xiàn)列出了其它引導(dǎo)分子，它們中的一些歸在了這項發(fā)明中。US出版的申請20020022034講述了一種輸遞帶有目標(biāo)分子的基因輸遞復(fù)合體的方法，同時進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療。
從另外一個角度來看，也需要減少動物所暴露的毒性，當(dāng)研究者和試劑研發(fā)者嘗試制造體內(nèi)和活體外應(yīng)用的抗體時。1985年，美國公共健康服務(wù)建立了授權(quán)動物機(jī)構(gòu)建立實驗動物保護(hù)和應(yīng)用委員會(IACUC)。IACUC任務(wù)之一是確保減少動物實驗中使用的毒性試劑如的完全弗氏佐劑。直到現(xiàn)在，還沒有一種物質(zhì)可替代CFA的效力但不表現(xiàn)出一些水平的毒性，無論是局部還是系統(tǒng)的。
在歷史上，引導(dǎo)分子和興奮劑是分開應(yīng)用的，因為免疫學(xué)家認(rèn)為一類佐劑會包含其它類。實際上，許多抗原的引導(dǎo)方法特別是為了回避興奮劑的需要，興奮劑如單磷酰脂A(MPL)曾經(jīng)被竭力推薦作為完全弗氏佐劑的獨立選擇。在這項發(fā)明中，有意的將免疫原和興奮劑和引導(dǎo)(呈遞)抗體和/或α2-巨球蛋白一起運用。
需要有佐劑和選擇這樣佐劑的方法，它可以促進(jìn)稀少的未成熟的抗原呈遞細(xì)胞(APC)捕捉抗原，APC的成熟和裝載，并最終增加APC和抗原-特異T細(xì)胞的作用。這些佐劑的作用對于傳統(tǒng)的免疫原是需要的，就和更新的DNA/RNA免疫原一樣(Iwasaki等1997.J.Imminol.15911)，它們也受相同的限制。和僅僅充當(dāng)一種作用的佐劑結(jié)合的抗原不會辨認(rèn)最可能的免疫應(yīng)答。
有需要有和完全弗氏佐劑(CFA)的佐劑性相競爭以及理想的超過它，但沒有和CFA相關(guān)聯(lián)的毒性的試劑。需要有新的能和大范圍輸遞途徑和微裝置基礎(chǔ)的設(shè)備相容的佐劑形式。需要新的佐劑和較少的免疫原和目標(biāo)一起發(fā)揮作用，其免疫原性是弱的，除了“加入和混合”不需要任何處理，能夠耐受冷凍，可能被凍干而不喪失活性。因此，接下來的工作將有意避免儲存例如脂質(zhì)體和油，它們也會限制佐劑混合物的效果，這是受體介導(dǎo)的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物以及制造和應(yīng)用所述組合物的方法。
所述免疫原性組合物包含引導(dǎo)分子、興奮劑和免疫原。所述興奮劑和引導(dǎo)分子在化學(xué)上是不同的。所述興奮劑和免疫原以相關(guān)的量存在而導(dǎo)致免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，這是和免疫原和引導(dǎo)分子或興奮劑之一導(dǎo)致的結(jié)果是相關(guān)的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及不含導(dǎo)致可見外部毒性或過敏癥狀試劑的免疫原性組合物。優(yōu)選的所述組合物是沒有明礬的。不存在必要將所述成分裝入膠囊或運用脂質(zhì)體。所述組合物可在冷凍或凍干狀態(tài)下保存?？捎幸獾膶⒌谝蛔魟┖偷诙魟┗旌稀Ｈ绻枰?，所述組合物可包括另外的不是免疫原特異的抗體或片段。更清楚的所述組合物包括另外的抗體或片段，其中互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是對免疫原、APC和/或興奮劑特異的。相比之下，CDR對于APC、興奮劑或免疫原特異不是必須的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的組合物。所述抗體適合診斷、研究和治療應(yīng)用。所述組合物可以用作疫苗。在這點上，任何藥學(xué)上可接受的載體可加入所述組合物。所述組合物可運用任何常規(guī)的給藥方式，如黏膜，來對受試者給藥。
附圖簡述

圖1顯示了由本發(fā)明的組合物以1∶5,000稀釋刺激產(chǎn)生的活性，未進(jìn)行任何優(yōu)化，例如改變抗體、抗原抗體比例或免疫途徑。
圖2顯示了預(yù)先采集的血，對于涂層的HCG抗原沒有任何活性。HCG單獨以1∶3,333稀釋運用3x背景標(biāo)準(zhǔn)不能被稱之為陽性。HCG+皂苷的聯(lián)合要比HCG單獨有改善。HCG+α2-巨球蛋白會有進(jìn)一步的改善，但最好的明顯是HCG(免疫原)+α2-巨球蛋白(引導(dǎo)分子)+皂苷(興奮劑)的聯(lián)合。本發(fā)明的聯(lián)合也超過HCG和弗氏佐劑的聯(lián)合(未顯示數(shù)據(jù))。
圖3顯示了HCG和引導(dǎo)分子(α2-M)聯(lián)合不會在所分析的最低稀釋中產(chǎn)生活性(3x背景)。HCG+興奮劑(Qiagen公司的CpG)的聯(lián)合顯示活性，但僅僅稀釋至1∶270。對比之下，HCG和引導(dǎo)分子(α2-M)或興奮劑(CpG)的聯(lián)合產(chǎn)生了對于應(yīng)用單克隆抗體足夠的功能性效價。
圖4顯示了一種動物代表性的實驗采血，這種動物沒有接受在任何稀釋時都沒有活性的胰腺膜抗原(非免疫的)。來自免疫接種過胰腺膜抗原和CpG小鼠的血清池幾乎不能和任何濃度時的非免疫性相區(qū)別。對比之下，胰腺膜抗原和引導(dǎo)分子(CK19抗體)興奮劑(CpG)的聯(lián)合產(chǎn)生1∶30K的效價，最低限度的比包含CpG和胰腺抗原的接種體有250x的增強(qiáng)。
圖5顯示了一種動物代表性的實驗采血，這種動物沒有接受在任何稀釋時都沒有活性的未激活的衣原體抗原(非免疫的)。以2x bkgd+0.30D作為截止標(biāo)準(zhǔn)，將接觸衣原體和CFA的動物血清滴定至10K。對比之下，來自免疫接種過包含衣原體EBs、L1AB和皂苷動物的血清池滴定至90K。有9x的增強(qiáng)。
圖6顯示了每個動物在1∶8篩選稀釋時的單個組織液體反應(yīng)。三個動物沒有接受任何免疫原(非免疫-3)并作為陰性對照。剛接受衣原體EB微粒的5個動物沒有一個產(chǎn)生陽性信號(2x bkgd+0.30D)。接受衣原體EB微粒和皂苷的5個動物都是陰性的。所有接受衣原體EB微粒和L1抗體的5個動物也都是陰性的。相比之下，接受包含衣原體EB微粒、L1AB和皂苷的5個動物中的3個產(chǎn)生令人信服的特異性IgA信號。
圖7顯示了每個動物在1∶8篩選稀釋時的單個組織液體反應(yīng)。三個動物沒有接受任何免疫原(非免疫-3)并作為陰性對照。所有5個接受包含衣原體EB微粒、L1AB和皂苷接種體的動物都產(chǎn)生令人信服的特異性IgA信號(2x bkgd+0.30D)，正如接受包含衣原體EB微粒、α2-巨球蛋白和皂苷接種體的所有5個動物一樣。
發(fā)明詳述根據(jù)發(fā)明者的觀點，“佐劑”是含義較廣的名詞，通過它們的功能分類看上去至少包括三類材料。一類材料是那些用作存儲的物質(zhì)。存儲物的例子包括明礬和完全弗氏佐劑，它們保持免疫原濃縮，并控制釋放。另外一類是興奮劑，其中來自有機(jī)體如C.Parvum的表面抗原和植物提取物興奮抗原呈遞細(xì)胞并最終導(dǎo)致更廣泛的免疫應(yīng)答。第三類是免疫原引導(dǎo)或抗原目標(biāo)分子，它們能幫助將抗原集中在免疫抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面，從而提高攝取。第三種類型物質(zhì)的例子是分子例如抗體和α2-巨球蛋白。雖然所有佐劑都有可認(rèn)識的初級功能，但一些還有不是顯而易見的次級特性。例如一些油主要用做存儲劑，較小程度上用做興奮劑。名詞如弱、中和強(qiáng)經(jīng)常用來描述佐劑的效能，它在歷史上和毒性相關(guān)聯(lián)。
篩選免疫原免疫原可以是任何天然或合成的和任何病原體、癌癥以及其它臨床上有意義的目標(biāo)相關(guān)聯(lián)或衍生而來的抗原。更優(yōu)選的抗原材料包括全細(xì)胞、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類或DNA。全細(xì)胞“抗原”包括衣原體，尤其是沙眼、肺炎或鸚鵡衣原體。如果合適或需要，可以運用各種類型的免疫原，例如多價疫苗。
選擇5種不同的免疫原來證明當(dāng)合適的配對兩類佐劑時會發(fā)生的增效反應(yīng)。將人類絨毛膜促性腺激素(HCG)的純凈蛋白質(zhì)制劑和α2-M聯(lián)合。所述全細(xì)胞免疫原，沙眼衣原體原粒體用三種獨立的方法使之失活，并與特異和非特異的鼠抗體匹配來證明了特定的處理對于引導(dǎo)分子的選擇有影響。進(jìn)而，配制包含衣原體、皂苷和非特異性抗體的接種體，并通過三種獨立的途徑輸遞來顯示效果的變化，這可隨著不同的組織發(fā)生。最終，哺乳動物膜蛋白的混合物從人類島祖代細(xì)胞提取，并和商業(yè)上應(yīng)用的抗體結(jié)合來證明現(xiàn)存的抗體是如何產(chǎn)生有相似和不同性質(zhì)的新抗體的。
抗原尋靶和興奮劑抗原瞄準(zhǔn)成為一種避免從最強(qiáng)佐劑體驗到的毒性效應(yīng)的常用方法，例如完全弗氏佐劑和TiterMax，它們都沒有被證明可應(yīng)用于人類。許多工作都是在18世紀(jì)70年代后期開始的，主要關(guān)注的是增強(qiáng)單克隆抗體技術(shù)，這是由Kohler和Milstein在1975提出的。雖然反應(yīng)增強(qiáng)了，毒性消除了，效價總的提高卻很少。奇怪的是，自從那以后，許多實驗室的努力都集中在獨立應(yīng)用引導(dǎo)分子而不考慮增效作用，它是將引導(dǎo)分子和不表現(xiàn)或表現(xiàn)有限的毒性癥狀的特定“較弱的佐劑”結(jié)合產(chǎn)生的結(jié)果。
許多“較弱的佐劑”都可以歸為興奮劑，不導(dǎo)致產(chǎn)生持續(xù)的壞死性皮炎或可觸知的腫塊或皮膚潰瘍，正如廣闊的為CFA提供證明。單獨應(yīng)用這些較弱佐劑就會發(fā)現(xiàn)有應(yīng)用的限制。免疫學(xué)家典型的采取這樣的佐劑和油結(jié)合或混合脂質(zhì)體來提高效力。不幸的是，這些混合劑需要更多的處理，很少可以被冷凍或凍干(為了廣泛的商業(yè)化)，和更少的輸遞途徑/裝置相容，在一些例子中，由于佐劑混合劑變得更復(fù)雜而使得毒性增加。
抗原被不同APC攝取的容量看上去和呈遞的效力(Stockinger，B.1992)相關(guān)，可包括抗原集中或細(xì)胞內(nèi)的信號。通常，抗原瞄準(zhǔn)APC表面看來增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。抗原對于APC的瞄準(zhǔn)已經(jīng)在活體外和體內(nèi)廣泛的研究。為了回顧抗原瞄準(zhǔn)見Fossum，S.等，1992?！翱乖瓕ぐ锌乖蔬f細(xì)胞(Targeting Antigens to Antigen PresentingCells)”Semin.In Immunol.4275，更近的(Chattergoon M.A.等，2000)通過利用細(xì)胞凋亡級聯(lián)將抗原直接瞄準(zhǔn)樹突狀細(xì)胞來提高抗原呈遞。
所述興奮劑選自常規(guī)佐劑，有以下特性，例如CpG DNA、核酸、皂苷、皂苷衍生物或有必備活性的皂苷成分。皂苷衍生物包括化合物，例如有皂苷結(jié)構(gòu)和興奮活性的鹽。皂苷成分是那些有天然化合物相同興奮活性的皂苷部分，即使所述活性在程度上是不同的。所述皂苷類是可以合成的。
皂苷類和特定的三萜烯糖苷皂苷是天然存在的物質(zhì)，可以收獲于Quillaja肥皂草屬。它們作為佐劑的性質(zhì)已被文獻(xiàn)證明過了，包括誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，刺激產(chǎn)生對于T-依賴和T-獨立抗原的強(qiáng)反應(yīng)(Kensil R.C.，1996)。
由于它所能興奮的反應(yīng)范圍以及用最粗的提取物觀察到的相對低水平的毒性，皂苷選自興奮類佐劑。由于這項工作用提純的皂苷、更嚴(yán)格的預(yù)備和合成形式實施，性能提高了使得它們通過了臨床試驗，例如Stimulon QS-21。
CpG是短序列的DNA(寡核苷酸)，它包含在特定堿性環(huán)境中的未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤雙核苷酸。哺乳動物的免疫系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化到能認(rèn)出這些序列，它們自然會在細(xì)菌DNA中發(fā)現(xiàn)，作為感染的指示劑。
GM-CSF、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、單磷酰脂A(MPL)、3-Q-去乙酰(desacyl)-4’-單磷酰脂A(3D-MLA)、IL-1β163-171肽(Sclavo肽)、25-二羥維生素D3、降鈣素基因調(diào)節(jié)肽、脫氫表雄酮(DHEA)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，二甲基聯(lián)十八烷基(dioctadecyla)或二硬脂基溴化銨(DDA)/L-脯氨酸鋅、胞壁酰二肽(MDP)、甲?；?Met-Leu-Phe(fMLP)、N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(蘇氨酰-MDP)、N-乙酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-(羥基-磷酰氧)乙酰胺單鈉鹽(MTP-PE)、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3、Nac-Mur-L-Thr-D-異Gln-sn-二二棕櫚酰甘油、Nac-Mur-D-Ala-D-異Gln-sn-二棕櫚酰甘油、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-辛-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala-二棕櫚酰甘油(DTP-GDP)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺(DTP-DPP)、γ干擾素、7-烯丙基-8-氧鳥苷、聚-腺苷酸-聚-尿苷酸復(fù)合物、MIP-1a、MIP-3a、二丁基鄰苯二甲酸酯、二丁基鄰苯二甲酸酯的類似物和C5a雖然興奮劑的例子在糖苷、皂苷和核酸、CpG范圍之內(nèi)，但其它類型的分子也可以預(yù)期以相似的方式和引導(dǎo)分子一起起作用，特殊的GM-CSF、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、如單磷酰脂A(MPL)、3-Q-去乙酰(desacyl)-4’-單磷酰脂A(3D-MLA)、甲酰化的-Met-Leu-Phe(fMLP)和IL-1β163-171肽(“Sclavo肽”)。前面所有的都描述為“刺激”、“刺激的”、“免疫刺激的”、“刺激”或“興奮劑”。此外，預(yù)計25-二羥維生素D3(骨化三醇)、降鈣素基因調(diào)節(jié)肽、脫氫表雄酮(DHEA)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)/二甲基聯(lián)十八烷基(dioctadecyla)或二硬脂基溴化銨(DDA)/L-脯氨酸鋅、胞壁酰二肽(MDP)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)、N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(蘇氨酰-MDP)、N-乙酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-(羥基-磷酰氧)乙酰胺單鈉鹽(MTP-PE)、Nac-Mur-D-Ala-D-Gln-OCH3、Nac-Mur-L-Thr-D-異Gln-sn-二棕櫚酰甘油、Nac-Mur-D-Ala-D-異Gln-sn-二棕櫚酰甘油、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-辛-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala-二棕櫚酰甘油(DTP-GDP)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺(DTP-DPP)、γ干擾素、7-烯丙基-8-氧鳥苷、聚-腺苷酸-聚-尿苷酸復(fù)合物、MIP-1a、MIP-3a、RANTES和二丁基鄰苯二甲酸酯以及二丁基鄰苯二甲酸酯的類似物和C5a和引導(dǎo)分子協(xié)同起作用。以上的是各種化合物組，每個都有佐劑的性質(zhì)(單獨)并在水中是可溶的。在一些情況中，以上的興奮劑將自發(fā)的在水溶液中形成聚集或微膠粒，并可以用來配制脂質(zhì)體。然而，本文中應(yīng)用的濃度始終是低于臨界微膠粒濃度(CMC)，接下來的皂苷例子就是這個情況。不追求處理實施包裝是因為先前描述的沉淀限制。C5a補(bǔ)體和片段是預(yù)期的，但不是優(yōu)選的，因為補(bǔ)體蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示出擁有象抗體一樣的調(diào)理素作用性質(zhì)。如下面所討論的，同時擁有瞄準(zhǔn)和興奮性質(zhì)的天然物質(zhì)可以和在一個方面有專門作用的材料相競爭。每種作用有獨特的分子將提供最好的調(diào)諧。用來支持這種推理的事實被包含進(jìn)來，正如在有效建立的佐劑被論證后有空前的250x血清Ig增強(qiáng)。
這里所述興奮劑的特點描述為它們和人類的關(guān)系，其中CpG和皂苷是外源性興奮劑的例子。IL-2和GM-CSF是內(nèi)原性興奮劑的例子，是免疫級聯(lián)的一部分并在人類中產(chǎn)生。
皂苷和CpG被選擇進(jìn)行這些研究是因為它們都有較好的溶解性，它們是大大不同的分子并且因此成功證明了存在于興奮劑和目標(biāo)分子之間的廣泛關(guān)系，這時它們兩者是合適配對的。
本發(fā)明進(jìn)一步定義興奮劑為對于APC脫離組織、APC遷移至淋巴結(jié)和APC成熟有貢獻(xiàn)的物質(zhì)。所述興奮劑常常是細(xì)胞活素以及更特定的是化學(xué)激活素或具有化學(xué)引誘劑的性質(zhì)。
用抗體尋靶抗原每個引導(dǎo)分子和其在抗原呈遞細(xì)胞上的相應(yīng)受體被預(yù)期以不同的效率結(jié)合，接著以不同的率推動免疫級聯(lián)反應(yīng)。一些引導(dǎo)分子在多種類型的APC上有受體，并且每種類型細(xì)胞上的受體頻率預(yù)期是唯一的。如先前所討論的呈遞細(xì)胞的類型和數(shù)目可隨著組織的類型而改變。同樣，每種免疫原和引導(dǎo)分子之間的作用將是不同的。因此，選擇引導(dǎo)分子將是一個仔細(xì)的過程，因為推動攝取的能力將隨著免疫原和給藥途徑而變化。興奮劑的選擇也同樣如此。
存在關(guān)于利用抗體瞄準(zhǔn)抗原的出版物的長列表。以前的抗體作用包括天然和合成的系鏈步驟，例如交聯(lián)抗原瞄準(zhǔn)表面蛋白質(zhì)(Kawamura和Berzofsky，1986)和形成由FcR辨認(rèn)的免疫復(fù)合物(Manca等，1991)。在先前研究中的免疫原模型包括鏈球菌M糖肽(Bahr等，1985)其中應(yīng)用佐劑成分的抗體(抗胞壁酸二肽)，肝炎抗原(Balsap等，2000)其中包括抗原特異性IgM，瘧疾抗原(Harte等1983)也和特異的IgM結(jié)合。最早的抗原瞄準(zhǔn)工作主要集中在制造單克隆抗體(MAB)試劑，現(xiàn)在使蛋白質(zhì)和特異性抗體人化的能力使得抗原瞄準(zhǔn)(通過疫苗)疫苗的希望更接近現(xiàn)實。以下是FDA批準(zhǔn)的有不同程度的人化的抗體治療Orthoclone(抗CD3)，ReoPro(抗-11b/111a)，Rituxan(抗-CD20)，Zenapax(抗-IL2受體)，Herceptin(抗-Her2受體)，Remicade(抗-TNF)，Synagis(抗-RSV)，Simulect(抗-IL2)，Mvlotara(抗-CD33)，Campath(抗CD52)。
本發(fā)明所述的組合物或制劑可以用來誘導(dǎo)抗體。將所述組合物施用給受試者的任何部位來誘導(dǎo)抗體形成。免疫原的量可以低至每次40ng或甚至更低，例如每次約8ng。如果需要，一種或多種組合物成分可以分別施用給受試者，或如果一種成分存在于受試者的理想部位，可以修飾所述組合物這樣就能達(dá)到理想的效果。誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的Ka值在104-1013分子/升并可以從受試者重新獲得。重新獲得的抗體然后做對于表位的親和力分析。進(jìn)一步，就獲得了保護(hù)性的抗體效價。所述組合物可以用做為疫苗。在這點上任何藥學(xué)上可接受的組合物都可以加入組合物。所述組合物可以運用任何傳統(tǒng)的給藥方式施用給受試者，包括黏膜給藥。進(jìn)一步，給藥可以通過多于一種的途徑，多于一種的途徑是同時或連續(xù)的。一系列的接種是可能的。
用α2-巨球蛋白進(jìn)行抗原尋靶這里所應(yīng)用的引導(dǎo)分子包括通過不同方法配制的α2-巨球蛋白(α2-M或A2M)和各種特性不同純度的抗體。補(bǔ)體和其它調(diào)理分子(oposonizing molecule)是期望的。能夠結(jié)合免疫原的這些分子的片段也被視為引導(dǎo)分子。所述引導(dǎo)分子不需要對于組合物中存在的免疫原有特異性。這里抗體的例子是對免疫原特異性的或非特異性。所述引導(dǎo)分子是對APC受體有特異性的。作為選擇，所述瞄準(zhǔn)分子可以直接或間接和APC受體連接。雖然抗體和α2-M是優(yōu)選的引導(dǎo)分子，那些和轉(zhuǎn)鐵球蛋白、甘露糖(manose)和唾液酸糖蛋白受體結(jié)合的是期望的。哺乳動物熱休克蛋白是期望的但不是優(yōu)選的，因為已經(jīng)很好建立了HSP是應(yīng)激蛋白并且可懷有“興奮”表位。同時擁有瞄準(zhǔn)和興奮性質(zhì)的天然物質(zhì)可以和專有一種作用的材料競爭。如先前所詳述的，每種作用有獨特的分子將提供最好的調(diào)諧。
B細(xì)胞擁有Ig的特異性抗體(Rock等，1984)，巨噬細(xì)胞和其它非B細(xì)胞，APC細(xì)胞知道應(yīng)用其它機(jī)制，包括吞噬作用和內(nèi)吞作用。由巨噬細(xì)胞攝取和呈遞的可溶性抗原沒有完全理解。然而已知α2-巨球蛋白和CD91的受體介導(dǎo)機(jī)制(Binder，R.J.等，J of Immunol，2001，1664968-4972)，熱休克蛋白使用了相同的受體。
在免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞是特別重要的，因為它們在廣泛的免疫系統(tǒng)中起的關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)廣泛免疫作用的能力部分是因為它們表達(dá)1a表面抗原。膜1a表面抗原的表達(dá)對于誘導(dǎo)特異的T-細(xì)胞抗原反應(yīng)是必需的(Unanvel，1981)。由于這些原因，α2-巨球蛋白系統(tǒng)現(xiàn)在受到了許多關(guān)注，并且利用α2-M產(chǎn)生的增強(qiáng)和先前利用抗體產(chǎn)生的抗原瞄準(zhǔn)數(shù)據(jù)相當(dāng)。
人類α2-M在血漿中(2-5mg/ml)是豐富的蛋白質(zhì)。它包括4個相同的亞單位組合形成一個雙面的分子“陷阱”。當(dāng)酶或甲胺激活高度易伸長的氨基酸時，“誘餌區(qū)域“，導(dǎo)致可追蹤的構(gòu)象變化，陷阱就被觸發(fā)(Barret和Starkey，1973)。所導(dǎo)致的受體-辨認(rèn)α2-M有效的被巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其它表達(dá)α2-M受體的細(xì)胞內(nèi)在化(Pizzo等，1984)。到此為止，將α2-M結(jié)合至非蛋白水解的蛋白質(zhì)，天然或合成的看來不會影響APC導(dǎo)致的內(nèi)在化，但是大小和電荷會影響結(jié)合的程度。α2-M看來很可能在今后的抗原-瞄準(zhǔn)應(yīng)用中有廣泛的應(yīng)用。
選擇抗體和α2-M進(jìn)行這些研究是因為它們都在正常條件下高濃度的存在于系統(tǒng)循環(huán)和組織中，因此并不期望它們擁有會混淆結(jié)果的興奮類型表位。此外，α2-M和抗體結(jié)構(gòu)是大大不同的分子并應(yīng)用不同的APC受體，因此成功證明了存在于興奮劑和瞄準(zhǔn)分子之間的廣泛關(guān)系，當(dāng)它們合適的配對時。
實施例抗體引導(dǎo)分子，全細(xì)胞免疫原(衣原體EB)和皂苷興奮劑三種感染人類的衣原體種類是沙眼、肺炎和鸚鵡衣原體。眼和生殖器對于沙眼衣原體的感染是世界范圍主要發(fā)病的原因，并且治療是昂貴的。生產(chǎn)一種能夠預(yù)防感染或嚴(yán)重疾病的疫苗提供了特殊的挑戰(zhàn)，但是控制衣原體疾病最有效的長期選擇。
肺炎衣原體(TWAR)第一次從呼吸系統(tǒng)感染中分離出來大約是在15年前，接著就顯示是肺炎、氣管炎、竇炎和咽炎的普通病因。近來，冠狀動脈粥樣硬化中肺炎衣原體的存在使得許多藥物公司采用傳統(tǒng)的疫苗方法來治療動脈粥樣硬化。由于衣原體類是血清學(xué)相似的，就有可能單一的疫苗可以提供對于直接和間接的衣原體疾病的保護(hù)。
衣原體已經(jīng)出現(xiàn)侵入免疫系統(tǒng)的能力。大多數(shù)人認(rèn)為對于這些病原體的保護(hù)需要一種強(qiáng)的激素和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。在理解這些感染的病理學(xué)和保護(hù)上已經(jīng)取得了進(jìn)展。最有希望的數(shù)據(jù)已經(jīng)由全細(xì)胞、主要外膜蛋白質(zhì)(MOMP)和MOMP DNA產(chǎn)生。如果選擇一種疫苗途徑，全細(xì)胞免疫原通常比亞單位疫苗更具有免疫性。這對于衣原體也是真的；然而，當(dāng)全衣原體微粒未激活時，它在歷史上就已經(jīng)失去了免疫原性。例1顯示未激活的衣原體微粒是如何通過結(jié)合引導(dǎo)分子和興奮類佐劑增強(qiáng)免疫原性的。
實施例1免疫原＝ 全細(xì)胞(沙眼衣原體)引導(dǎo) ＝ 抗體(鼠的，對于衣原體LPS特異)分子興奮劑＝ 皂苷免疫原的配制將大約108福爾馬林固定的沙眼衣原體(L2血清型)主要部分(EBs)分配入100μlHBSS。對于EB原料，以25μl磷酸緩沖鹽加入90mg提純的#403鼠抗體。最后，加入2μl 10μg的提純皂苷。將以上的混合，并在室溫下溫浴10分鐘。然后將體積變?yōu)?ml使得每個動物接受200μl所配制的接種物。
免疫接種指定5只balb/c小鼠進(jìn)行傳統(tǒng)CFA免疫接種，指定5只進(jìn)行新佐劑聯(lián)合以及作為對照的每種可能的成分聯(lián)合。所有動物以2×107，200μl Hanks緩沖鹽接受4次IP免疫接種，緩沖液是在兩周前隔開的?？偟慕臃N物量總是200μl。
表1
在第四次IP注射后采試驗血，并與固態(tài)相ELISA中的CTL2感染MeCoy細(xì)胞對比滴定。
用來量化衣原體免疫原抗體水平的方法和材料材料PVC平皿，L2沙眼衣原體(CT)MeCoy溶解產(chǎn)物，牛血清白蛋白，磷酸緩沖鹽(PBS)，碳酸鹽緩沖液，有0.5％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS-T)，有20％血清的DMEM培養(yǎng)基，5ml玻璃管，在第40天采自每個籠子的試驗血池，山羊抗-小鼠IgG(全分子)HRP Sigma A-4416，磷酸-檸檬酸鹽緩沖膠囊Sigma p-4922，OPD底物30mg片劑Sigma p-8412，4.5mol硫酸
ELISA步驟1.以106沙眼衣原體微粒/ml涂布PVC平皿，每100μl/孔，pH9.5碳酸緩沖液，在37℃下1小時。
2.通過用PBS中3％BSA沖孔并在37℃下溫育來去掉涂層并封閉一小時。
3.去除封閉并通過沖孔用PBS-T漂洗2次。
4.加入50μl每種試驗/采血前稀釋液，并在37℃下溫育1小時。每種稀釋液由90％PBS-T和20％是血清的10％DMEM培養(yǎng)基構(gòu)成。
5.丟棄并通過每次沖洗孔而洗滌3次。
6.加入50μl用PBS-T以1∶10K稀釋的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下溫育1小時。
7.丟棄并通過每次沖洗孔而洗滌3次。
8.加入50μl是2mg/mlOPD的檸檬酸-磷酸緩沖液，并保溫直至當(dāng)在495nm處掃描時最高稀釋反應(yīng)的最低稀釋液估計達(dá)到10D。
9.用50μl 4.5mol硫酸終止反應(yīng)并用Titertek平板閱讀器在495nm讀出最終結(jié)果。
衣原體結(jié)果的總結(jié)在一系列的實驗中，當(dāng)一種興奮劑(提純的皂苷“Quil A”)和未激活的沙眼衣原體(CT)微粒聯(lián)合C-LPS特異性抗體混合時，發(fā)現(xiàn)它會產(chǎn)生即刻并且持久的血清效價的上升。所述結(jié)果更奇怪的是，由于所述增強(qiáng)超過完全弗氏佐劑，不超過單獨免疫原。
出版的文章顯示了小鼠(免疫接種后)和人類(感染后)衣原體的效價大約為1∶500。由以上所述的新組合刺激產(chǎn)生的效價，在圖1中追蹤為1∶5,000或沒有優(yōu)選而超過，例如變化抗體、抗原抗體比例或免疫接種途徑。
稀釋一開始是1∶100，并和預(yù)采血以及代表性的CFA反應(yīng)作比較。所述預(yù)采血對于1∶100的CT抗體是陰性的，CFA處理僅可以在最低稀釋時被稱為是陽性的，通過將量化值降至最大信號的30％。值得注意的是，特異性抗體和免疫原聯(lián)合不顯示超過弗氏佐劑。同樣的，Quil-A和免疫原聯(lián)合不顯示超過弗氏佐劑。
α2-巨球蛋白引導(dǎo)分子，提純的蛋白質(zhì)免疫原(HCG)和皂苷興奮劑HCG是一種分子量為38,000道爾頓的糖蛋白。它包含2個亞單位，α和β鏈。所述α亞單位包括92-aa序列，它和垂體糖蛋白是相同的FSH、LH和TSH。所述β亞單位，N-末端115-aa片是和β-LH亞單位是相同的；然而，C-末端30-aa序列是獨特的，經(jīng)常指分子的交易末端。HCG由胎盤分泌，它的水平在懷孕頭三個月上升。
HCG是一個用來評價伴隨HCG-A2M免疫原的增強(qiáng)優(yōu)秀的候選物。在過去的20年中，許多學(xué)院和診斷實驗室已經(jīng)追蹤到了HCG在產(chǎn)生OTC懷孕試驗試劑的過程中的效價，因此創(chuàng)造了許多可對比的血清效價數(shù)據(jù)。
α2-巨球蛋白可提供另外一種好處。一旦抗原被APC內(nèi)在化，在核內(nèi)體中就發(fā)生部分蛋白水解降解，處理過的抗原肽片段變成和MHC分子相連。然而，雖然抗原的部分蛋白水解降解對于產(chǎn)生合適的MHC和結(jié)合其肽片段的T-細(xì)胞是必要的，但是，過量的降解證明對免疫應(yīng)答有損害。完全蛋白水解不是必要的處理，α2-M的掩蓋可以保護(hù)需要中和和保護(hù)的主要表位。
直到現(xiàn)在，還沒有證明α2-M對于產(chǎn)生帶有診斷應(yīng)用的必要Ka值(從104-1013mol/l)的抗體有貢獻(xiàn)，但避免了典型的對于實驗室動物的毒性。進(jìn)一步，由于所揭示的佐劑制劑，以低濃度給予的免疫原可以刺激產(chǎn)生功能性抗體的效價。名詞“功能性效價”在每一領(lǐng)域有不同的意思。由Kohler和Milstein發(fā)明的那些作為單克隆抗體工具的功能性效價通常是1∶10,000。效價少于10,000的動物典型的不是用來輸注的初級B-細(xì)胞的好來源。這里也通過抗體質(zhì)量描述了功能性效價，例如包括中和或保護(hù)性抗體。
實施例2免疫原 ＝ 提純蛋白質(zhì)(HCG)引導(dǎo)分子 ＝ 巨球蛋白(鼠的，α2)興奮劑 ＝ 皂苷免疫原的配制HCG從4240Hollis街，Emeryville CA 94608的BioPacific獲得，提供為來自50mM碳酸銨溶液的凍干粉末。
一些實驗室已經(jīng)經(jīng)歷了將物質(zhì)結(jié)合至α2-M。也可以應(yīng)用通常的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)連接，自Pierce Chemicals應(yīng)用簡單的服從指導(dǎo)。協(xié)同疫苗有限公司是“IncubatorCompany”位于Becton Dickinson’s RTP，NC機(jī)構(gòu)，選擇它來實施結(jié)合步驟。
免疫接種和血清取樣以兩個星期的間隔腹膜內(nèi)給予所有的免疫接種。同樣，選擇IP途徑這樣就創(chuàng)造了一種對于以后收獲的脾B-細(xì)胞以及用于個體抗體分析的MAB產(chǎn)生的選擇。每個動物接受200μl Hanks緩沖鹽溶液中1μg HCG/增強(qiáng)。血清樣品采自試驗組的每個動物，集中做滴定。
表2
量化HCG抗體血清水平的方法和材料材料PVC平皿，牛血清白蛋白，磷酸緩沖鹽(PBS)，碳酸鹽緩沖液，有0.5％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS-T)，有20％血清的DMEM培養(yǎng)基，5ml玻璃管，在第33天采自每個籠子的試驗血池，山羊抗-小鼠IgG(全分子)HRP Sigma A-4416，磷酸-檸檬酸鹽緩沖膠囊Sigma p-4922，OPD底物30mg片劑Sigma p-8412，4.5mol硫酸。
步驟1.用100μl pH9.5碳酸緩沖液中的HCG以1μg/ml涂布PVC平皿，在37℃下溫育1小時。
2.通過用PBS中3％BSA沖孔并在37℃下溫育來去掉涂層并封閉一小時。
3.去除封閉并通過沖孔用PBS-T漂洗2次。
4.加入50μl每種試驗/采血前稀釋液，并在37℃下溫育1小時。每種稀釋液由90％PBS-T和20％是血清的10％DMEM培養(yǎng)基構(gòu)成。
5.丟棄并通過每次沖洗孔而洗滌3次。
6.加入50μl用PBS-T以1∶10K稀釋的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下溫育1小時。
7.丟棄并通過每次沖洗孔而洗滌3次。
8.加入50μl是2mg/mlOPD的檸檬酸-磷酸緩沖液，并保溫直至當(dāng)在495nm處掃描時最高稀釋反應(yīng)的最低稀釋液估計達(dá)到10D。
9.用50μl 4.5mol硫酸終止反應(yīng)并用Titertek平板閱讀器在495nm讀出最終結(jié)果。
效價和毒性試驗圖2顯示了對于涂上的HCG抗原沒有活性的預(yù)采血。HCG單獨在運用3x背景標(biāo)準(zhǔn)的1∶3,333稀釋時不能被稱為陽性。HCG+皂苷的聯(lián)合比HCG單獨有提高。HCG+α2-巨球蛋白會有進(jìn)一步的改善，但最好的明顯是HCG(免疫原)+α2-巨球蛋白(引導(dǎo)分子)+皂苷(興奮劑)的聯(lián)合。本發(fā)明的聯(lián)合也超過HCG和弗氏佐劑的聯(lián)合(沒顯示數(shù)據(jù))。
更重要的是，給予組1和3(上面)的接種物再次配制，對第二組5只小鼠皮下輸遞，唯一的目的是監(jiān)測毒性。再次，所有的動物接受200μl接種物，然而，這次所述材料在6個部位劃分。然后監(jiān)測所述動物兩周，察覺到四頭肌和腳中產(chǎn)生的結(jié)果。表3總結(jié)了觀察報告。
表3
如表3所示，接受HCG+α2-M+皂苷的動物和接受乳化在弗氏佐劑中的HCG的動物相比，不顯示任何局部毒性征象，后者產(chǎn)生有很好文件證明的膿腫。
α2-巨球蛋白引導(dǎo)分子，提純的蛋白質(zhì)免疫原(HCG)和CpG興奮劑實施例3免疫原 ＝ 提純蛋白質(zhì)(HCG)引導(dǎo)分子＝ 巨球蛋白(鼠的，α2)
興奮劑＝ CpG DNA免疫原的配制在這個實施例中所應(yīng)用的CpG興奮劑是ImmunoEasyTM購自Qiagen有限公司，28159 Stanford Avenue Valencia CA 91355。CpG興奮劑是一條較短的DNA，它包含未甲基化的胞嘧啶和在特殊堿性內(nèi)容物中的鳥嘌呤二核苷酸。再次，HCG由BioPacific提供并進(jìn)一步在室內(nèi)處理。如先前所述，HCG+α2-M復(fù)合物由SynergyVaccines有限公司配制。
免疫接種和血清取樣由于先前的創(chuàng)造功能性效價的實施例都是IP注射，這項工作僅包括皮下(SQ)免疫接種，因此證明本發(fā)明不局限于特定的途徑。每個動物每周接受40ngHCG，以200μl體積。當(dāng)需要稀釋時，應(yīng)用Hanks緩沖鹽水。血清樣品采自試驗組的每個動物，集中做滴定。
表4
量化HCG抗體血清水平的方法和材料和實施例2中說明的相同。
血清效價結(jié)果圖3顯示了HCG和引導(dǎo)分子(α2-M)的結(jié)合不能在所測定的最低稀釋時產(chǎn)生活性(3x背景)。HCG+興奮劑(Qiagen公司的CpG)的結(jié)合顯示活性，但僅僅是在擴(kuò)大為1∶270稀釋。相比之下，HCG和引導(dǎo)分子(α2-M)的結(jié)合和興奮劑(CpG)一起產(chǎn)生足夠單克隆抗體應(yīng)用的功能性效價。
鼠細(xì)胞角蛋白抗體(DIR.MOL.)和用來增強(qiáng)胰腺細(xì)胞膜抗原反應(yīng)的CpG DNA興奮劑胰腺細(xì)胞膜抗原(PCMA)是從人類胰腺細(xì)胞收集來的蛋白質(zhì)復(fù)合體，主要包括導(dǎo)管和腺泡類型的細(xì)胞。嘗試應(yīng)用干細(xì)胞或祖代細(xì)胞來治療如糖尿病等疾病的公司正應(yīng)用這些膜蛋白質(zhì)來監(jiān)測和指導(dǎo)島祖代細(xì)胞進(jìn)化為功能性的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞。這些膜蛋白標(biāo)記物，如許多癌標(biāo)記物經(jīng)常是瞬時表達(dá)，并在高峰產(chǎn)生期間也僅僅以低濃度存在。由于它是來源于人類，瞬間表達(dá)并且在高峰產(chǎn)生期間也僅僅以低濃度存在，因此使得它很難，或常常不可能制造這樣目標(biāo)的抗體。因此，人類PCMA是另外一種評價來自于組合興奮劑和引導(dǎo)分子類型佐劑增強(qiáng)的優(yōu)秀后選物。任何由免疫接種產(chǎn)生的抗體都將可能成為有價值的研究和/或那些致力于島細(xì)胞治療的研發(fā)試劑。
實施例4免疫原 蛋白質(zhì)復(fù)合物(胰腺細(xì)胞膜抗原)引導(dǎo)分子 抗體(鼠，對CK19特異)興奮劑 CpG免疫原的配制配制用來試驗的總免疫原和對照免疫接種時間表來自于一個單1502cm燒瓶(培養(yǎng)2天后)的人類胰腺細(xì)胞。包含血清的培養(yǎng)基從粘附細(xì)胞的燒瓶抽吸并且在把細(xì)胞從表面刮下之前用HBSS沖洗燒瓶內(nèi)部4x。收集到的細(xì)胞放在一個50ml的圓錐管中，并以2,000rpms離心5分鐘。丟棄上清，應(yīng)用20mls新鮮HBSS重懸浮細(xì)胞。重復(fù)所述步驟3次而去除任何殘留的培養(yǎng)基成分。在第四次旋轉(zhuǎn)后，在10mls pH8的溶解緩沖液中懸浮顆粒狀物，緩沖液包括10mM HEPES、1mM MgCl2、1mM EDTA和1mM PMSF。將所述混合物簡單的旋轉(zhuǎn)，使其在冰上保溫10分鐘。接著，所述溶解產(chǎn)物以3,000rpms離心10分鐘。去除上清，再以100xg離心90分鐘。丟棄上清，應(yīng)用1,300μl溶解緩沖液溶解顆粒狀物。通過Lowry蛋白質(zhì)分析來測定通常的終濃度14.3μg/ml。在這個實施例中所應(yīng)用的CpG興奮劑是ImmunoEasyTM購自Qiagen有限公司。所述CK19鼠抗體由Biogenex Cat.AM246-5M獲得，并在全腹水形式中應(yīng)用。
免疫接種5只Balb/c小鼠接受免疫原加CpG，5只接受免疫原加新型的CpG和CK19抗體的佐劑化合物。兩組每周接受IP免疫接種，持續(xù)4周，接著在第5次增強(qiáng)后3天試驗性的采血。試驗性采血后，動物在第40天和第46天進(jìn)行免疫接種。在第49天為了融合去除脾臟。試驗和對照組中的每只動物接受20μl或286ng全蛋白/增強(qiáng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步證實了所述PCMA是至少10種單獨的蛋白質(zhì)或平衡比例抗原的混合物，表明每種免疫接種的蛋白質(zhì)大約都是以28ngs存在。CpG動物接受一種如上所述的包含50μl Qiagen CpG、150μl hanks緩沖鹽水和20μl免疫原存貨的混合物。接受本發(fā)明混合劑的動物接受50μl Qiagen CpG、10μl Biogenex腹水(在10μg和100μgCK19特異性抗體之間)，120μlHBSS和20μl免疫原存貨。
表5
應(yīng)用預(yù)先準(zhǔn)備在固相ELISA中的相似胰腺細(xì)胞膜滴定第31天的試驗采血。
量化胰腺細(xì)胞膜抗原血清抗體水平的方法和材料材料PVC平皿，胰腺細(xì)胞膜抗原，牛血清白蛋白，磷酸緩沖鹽(PBS)，碳酸鹽緩沖液，有0.5％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS-T)，有20％血清的DMEM培養(yǎng)基，5ml玻璃管，在第31天采自每個籠子的試驗血池，山羊抗-小鼠IgG(全分子)HRP SigmaA-4416，磷酸-檸檬酸鹽緩沖膠囊Sigmap-4922，OPD底物30mg片劑Sigma p-8412，4.5mol硫酸。
ELISA步驟1.用胰腺細(xì)胞膜抗原以3.34μg/ml涂布PVC平皿，100μl/孔pH9.5碳酸緩沖液，37℃下1小時。
2.去掉涂層并通過用PBS中3％BSA沖孔封閉一小時并在37℃下溫育。
3.去除封閉并通過沖孔用PBS-T漂洗2次。
4.加入50μl每種試驗/采血前稀釋液，并在37℃下溫育1小時。每種稀釋液由90％PBS-T和20％是血清的10％DMEM培養(yǎng)基構(gòu)成。
5.丟棄并通過每次沖洗孔而洗滌3次。
6.加入50μl用PBS-T以1∶10K稀釋的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下溫育1小時。
7.丟棄并通過每次沖洗孔而洗滌3次。
8.加入50μl是2mg/mlOPD的檸檬酸-磷酸緩沖液，并保溫直至當(dāng)在495nm處掃描時最高反應(yīng)的最低稀釋液估計達(dá)到10D。
9.用50μl 4.5mol硫酸終止反應(yīng)并用Titertek平板閱讀器在495nm讀出最終結(jié)果。
PEG融合和稀有目標(biāo)MABS的回收雖然效價數(shù)據(jù)沒有證明應(yīng)該追蹤來自CpG安排的MAB，但脾細(xì)胞還是從CpG和CpG-Ck19安排收集。大約2×108的脾細(xì)胞從每個表融合。10天過后，對每個表的平皿(10)進(jìn)行全雜種和雜種產(chǎn)生特異性抗體數(shù)量的篩選。
表6
血清效價和融合結(jié)果圖4顯示所述CpG興奮劑不能在所測定的最低稀釋時產(chǎn)生活性(3x背景)。相比之下，引導(dǎo)分子(鼠CK19抗體)和興奮劑(CpG)的聯(lián)合會導(dǎo)致產(chǎn)生1∶30K的效價(3xBkgd)很容易滿足用來努力前進(jìn)移動以回收單克隆抗體的室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(1∶10K)。在表6中，雖然幾乎5x所述雜種從CpG初始細(xì)胞篩分出來，但沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生特異性PCMA抗體的雜種。相比之下，產(chǎn)生特異性抗體的四種克隆在篩分98種雜種后被標(biāo)記。進(jìn)一步，所有四種雜交瘤細(xì)胞都是穩(wěn)定的IgG同種型。
在先前的實施例中，所述新型佐劑混合物產(chǎn)生的效價足夠單克隆抗體從第一次增強(qiáng)開始的一個月內(nèi)應(yīng)用。這個關(guān)于PCMA免疫原的實施例使得不容質(zhì)疑本發(fā)明混合劑可產(chǎn)生理想目標(biāo)的抗體(單克隆和多克隆)，這時傳統(tǒng)佐劑不能。最有意義的是，所述CK19抗體在應(yīng)用前不需要純化，因為它以全腹水的形式加入接種物。全血清形式的抗體、全組織培養(yǎng)上清液形式或半-純化形式預(yù)期也是同樣有效的。
應(yīng)用作為引導(dǎo)分子的非特異性抗體和皂苷興奮劑來增強(qiáng)對于衣原體微粒的血清反應(yīng)到目前為止，單基因或基因產(chǎn)物不能和由全衣原體細(xì)胞獲得的保護(hù)相比(R.C.Brunham等，2000.J.of Infectious Di sease 538-543)。更特別的是，大多數(shù)出版物表明僅僅活的衣原體才產(chǎn)生保護(hù)性效價(J.J Donnelly，等1997.Ann.Review of Immunology 15617-648)。雖然許多實驗室正在追求減少的衣原體鏈，來自這樣努力的產(chǎn)物看上去至少還得等10年。如實施例1所描述的，一種無活性的衣原體典型的失去其免疫原的特征。實施例1、5和6顯示了一種無活性的衣原體微粒的免疫原性是怎樣通過結(jié)合引導(dǎo)分子和興奮劑類的佐劑而恢復(fù)的。
下面的實施例顯示了無活性的衣原體微粒，當(dāng)和興奮劑和抗體(不是對免疫原特異的)結(jié)合時可以產(chǎn)生高血清Ig效價。
實施例5免疫原 沙眼衣原體感染MeCoy細(xì)胞，溶解產(chǎn)物引導(dǎo) 抗體(鼠，對免疫原非特異)分子興奮劑 皂苷免疫原的配制將大約36μgUV無活性的沙眼衣原體(LGV類型2)MeCoy細(xì)胞溶解產(chǎn)物輸遞一個1ml的Nunc小瓶中。90mg的提純LI特異性鼠抗體加入到77μl的體積中，接著是2μl 10μg的提純皂苷。將上述混合并使其在室溫中保溫10分鐘。然后用HBSS使體積為1ml，使得5只動物每個都接受200μl的配制接種物。所述衣原體從MicrobixBiosystems有限公司(341 Bering Avenue Toronto Ontario Canada M8Z 3A8)獲得。所述提純的皂苷從Superfos Specialty Chemical(a/s Frydenlundsvej 30，DK-2950 Vedbaek，丹麥)獲得。所述L1特異性抗體在室內(nèi)產(chǎn)生，并在應(yīng)用前用蛋白質(zhì)-A樹脂親和提純。L1是在腦組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞粘附分子。所述L1細(xì)胞粘附分子，起初是在小鼠中確認(rèn)和描述為一種介導(dǎo)神經(jīng)元-神經(jīng)元和神經(jīng)原-施旺氏細(xì)胞粘附的細(xì)胞表面糖蛋白。一種L1轉(zhuǎn)錄本已經(jīng)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤(IM-32)和視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Y-79)細(xì)胞索中發(fā)現(xiàn)。L1也表達(dá)于橫紋肌肉瘤細(xì)胞索(RD)和A-204(R.A.Reid和J.J.Hemperly，1992.J of Mol Neuroscience 3127-135)。注意在這個實施例中所應(yīng)用的衣原體用UV輻射使其失活，在先前的衣原體實施例中(實施例1)，衣原體微粒由福爾馬林使其失活。在這個實施例中所應(yīng)用的衣原體不是提純的(作為宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)物存在)并且所述L1抗體對于衣原體不是特異的。
免疫接種5只Balb/c小鼠用CFA免疫接種，5只接受興奮劑和引導(dǎo)分子的新型佐劑聯(lián)合。所有動物接受3次初始IP免疫接種，間隔為2周。在第39天獲取試驗性的采血。
表7
第3次IP注射后獲取的試驗采血，對固相ELISA中的提純CT EBs滴定。
量化衣原體免疫原抗體水平的方法和材料材料Nunc Maxisorb 96孔平皿，LGV2沙眼衣原體，培養(yǎng)在人類Hep2中(Cat#V501-D3271)從East Coast Biologics獲得，脫水牛奶粉末、磷酸緩沖鹽水(PBS)、碳酸緩沖液、Tween-20、5ml玻璃管、試驗采血、TMB基質(zhì)Sigma T-8665、硫酸、山羊抗-小鼠IgG(1、2A、2B和3)，來自Accurate Chemical用來滴定血清樣品的HRP復(fù)合物。
ELISA步驟1.以約1×107EBs/孔用East Coast衣原體微粒涂布Nunc Maxi sorb平皿，37℃下約1小時。
2.去掉涂層溶液并通過用250μl/孔 PBS/Tween-20中5％牛奶粉末在37℃下封閉2小時。
3.去除封閉并用PBS-Tween20漂洗3次。
4.加入100μl稀釋在0.5％-0.75％脫水牛奶粉末種的每種血清樣品，并在37℃下溫育1小時。。
5.用PBS/Tween20漂洗3次。
6.加入100μl用PBS-Tween20以4-10K稀釋的山羊抗-小鼠IgG HRP并在37℃下溫育45分鐘。
7.用PBS/Tween20漂洗3次。
8.每孔加入100μlTMB基質(zhì)并保溫30分鐘(不在直接光照下)。
9.用100μl 0.5mol硫酸終止反應(yīng)并用平板閱讀器在450nm處讀出結(jié)果。
樣品收集和處理所有血清樣品通過用來自VWR Scientific Cat.53432-921的100μl微吸液管眼眶采血而獲得。所述血清樣品可以過夜凝結(jié)，接著離心而在凍結(jié)前去除細(xì)胞。測定稀釋范圍是從1∶123-1∶90K。
血清結(jié)果圖5顯示了弗氏佐劑對于10K血清效價的貢獻(xiàn)，以及包含非特異性抗體和皂苷的佐劑混合物對于90K效價(＞3x背景)的貢獻(xiàn)。如所預(yù)期的，非免疫血清對照是陰性的。上述結(jié)果沒有在任何嘗試使免疫原劑量最優(yōu)化的條件下獲得的，也不考慮佐劑和免疫原的比例，輸遞途徑或樣品采集的時間。
衣原體結(jié)果的總結(jié)在一系列的實驗中，一種興奮劑(提純的皂苷“Quil A”)，當(dāng)它和無活性的沙眼衣原體(CT)微粒以及一種L1非特異性抗體混合時，會產(chǎn)生超過相同免疫原和弗氏佐劑混合產(chǎn)生的血清效價。所述血清抗體增強(qiáng)估計在9x。結(jié)果由粗衣原體預(yù)備物獲得表明可以不用提純的免疫原獲得增強(qiáng)。值得注意的是，當(dāng)實施例1中所述的衣原體特異性抗體和UV無活性的微粒(對比福爾馬林處理)以及皂苷結(jié)合時，然后通過IP輸遞，僅僅包含衣原體微粒和皂苷的接種物上沒觀察到增強(qiáng)。同樣當(dāng)上述接種物(UV-衣原體-L1AB-皂苷)IM和ID輸遞時，僅僅包含衣原體微粒和皂苷的接種物上沒觀察到增強(qiáng)(沒顯示數(shù)據(jù))。最后的兩個結(jié)果強(qiáng)調(diào)了需要使得混合劑/免疫原以及輸遞途徑變得合適。
用非特異性抗體作為引導(dǎo)分子以及一種皂苷興奮劑來產(chǎn)生陰道粘膜中的衣原體特異性IgA在設(shè)計疫苗時，主要考慮的是感染部位。由于衣原體典型的感染粘膜組織，因此需要粘摸免疫接種來獲得最好的保護(hù)。因此下面的實驗設(shè)計用來測定本發(fā)明中描述的新型佐劑當(dāng)輸遞粘膜時是否會顯示增強(qiáng)。
無一例外的是，科學(xué)文章都指出局部(陰道)抗-衣原體Ig和特殊的IgA和感染的結(jié)果相符合(R.P.Morrison等，1995.Infection and Immunity 4661-4668)和(A..L.Baron等.，1984 Infection and Immunity 82-85)。
用無活性的衣原體微粒獲得的增強(qiáng)對于衣原體的局部抗體反應(yīng)的機(jī)制將為普通人提供很大益處，并且可能降低美國每年將近1百萬新發(fā)病例。
實施例6顯示了怎樣鼻腔內(nèi)輸遞無活性的衣原體微粒，當(dāng)它和興奮劑和引導(dǎo)分子佐劑結(jié)合時，可產(chǎn)生陰道粘膜IgA效價。
實施例6免疫原沙眼衣原體感染MeCoy細(xì)胞，溶解產(chǎn)物引導(dǎo) 抗體(鼠，對免疫原非特異)分子興奮劑皂苷免疫原配制將大約36μgUV無活性的沙眼衣原體(LGV類型2)MeCoy細(xì)胞溶解產(chǎn)物輸遞埃彭道夫管中。加入45mg的提純L1特異性鼠抗體，接著是5μg提純皂苷?？傮w積是35μl，每個動物接受7μl的配制接種物。所述衣原體溶解產(chǎn)物、皂苷和L1抗體的來源如先前所述。
免疫接種5只Balb/c小鼠僅接受衣原體抗原，5只接受有皂苷的衣原體抗原，5只接受有L1抗體的衣原體抗原，5只接受包括衣原體、皂苷、L1抗體的接種物。所有動物接受四次免疫接種持續(xù)2個月時間，接著2周后陰道沖洗。鼻腔免疫接種通過應(yīng)用約3.5μl到每個鼻孔末端來實施。
表8
通過用25μl Hanks緩沖鹽水沖洗穹窿2x而獲得陰道樣品。在50μl樣品中加入12.5μl 20μg/ml的抑肽酶和12.5μl的0.01M DTT。立即將陰道樣品渦旋和冷凍。在分析的那天，將樣品解凍并以10K rpm離心凈化。
量化衣原體特異IgA水平的方法和材料將所述陰道液樣品對提純的CT EBs滴定如實施例5所描述的，僅僅有以下例外一種單一的1∶8篩選稀釋液應(yīng)用于陰道液樣品，所述接下去的混合物換為山羊抗-小鼠IgA HRP cat1040-05來自Southern Biotech。稀釋液在包含0.5％的脫水牛奶粉末和是20％血清的10％培養(yǎng)基的稀釋劑中制成。
陰道液結(jié)果圖6顯示5組小鼠的各自反應(yīng)。粘膜樣品篩選顯示3/5的接種過感染細(xì)胞溶解產(chǎn)物-L1抗體-皂苷的動物產(chǎn)生衣原體特異的IgA。包含接種物、和皂苷混合的免疫原以及和L1抗體混合的免疫原的接種物不能在1∶8篩選稀釋時產(chǎn)生陽性信號(＞2x背景和0.30D)。三種非免疫樣品作為背景。
衣原體結(jié)果的總結(jié)在一系列的鼻腔內(nèi)輸遞實驗中，僅一種包含興奮劑(提純皂苷“Quil A”)無活性的沙眼衣原體感染細(xì)胞溶解產(chǎn)物和L1抗體(免疫原非特異性的)的接種物產(chǎn)生陰道IgA效價。結(jié)果由粗衣原體預(yù)備物獲得表明可以不用提純的免疫原獲得增強(qiáng)。上述結(jié)果沒有在任何嘗試使免疫原劑量最優(yōu)化的條件下獲得的，也不考慮佐劑和免疫原的比例，樣品采集的時間或免疫接種的間隔。值得注意的是能夠在粘膜中產(chǎn)生IgA反應(yīng)的佐劑混合物首先是在實施例5中提出，一個IP給予接種物的實驗。實施例5和6提供了一個事實就是這樣的用作粘膜應(yīng)用的佐劑混合物可以在腹膜中篩選，其中反應(yīng)在血清中測定并且有更好的精確性。
用α2-巨球蛋白作為引導(dǎo)分子以及一種皂苷興奮劑來產(chǎn)生陰道粘膜中的衣原體特異性IgA在實施例7中，鼻內(nèi)輸遞一種包含預(yù)先凍干的鼠α2-M、皂苷和無活性的預(yù)先凍干的衣原體微粒的制劑。所述制劑產(chǎn)生和那些由包含抗體的接種物獲得的相似陰道IgA水平。
實施例7
免疫原的配制在埃彭道夫管中輸遞大約8×108的UV-補(bǔ)骨脂素，無活性的沙眼衣原體(LGV類型2)，20μg提純的皂苷和115μg提純的L1鼠抗體或10μg鼠α2-巨球蛋白?？傮w積是50μl，每個動物接受10μl的配制接種物。所述皂苷和L1抗體的來源如先前所述。所述衣原體EBs從East Coast Biologics獲得，和實施例5、6、7的ELISA中應(yīng)用的材料是相同的。所述鼠α2-巨球蛋白在室內(nèi)配制，通過將采自Balb/c小鼠的全血清通過帶有固定兔抗鼠α2-巨球蛋白的親和樹脂。所述衣原體微粒、α2-M、L1抗體和皂苷預(yù)先凍干，并在剛好在配制接種物前水合。所述α2-M如實施例2和3中所做的那樣不和免疫原結(jié)合。
免疫接種5只Balb/c小鼠接受包括衣原體、皂苷和L1抗體的接種物。另外一組5只接受包含衣原體、皂苷和α2-巨球蛋白的接種物。兩組都接受3次鼻腔內(nèi)免疫接種持續(xù)1個月的時間，接著8天后陰道沖洗。鼻免疫接種通過應(yīng)用約5μl到每個鼻孔末端來實施。
表9
如實施例6所述將所述陰道液樣品收集、處理、稀釋和對提純的CT EBs滴定。
陰道液結(jié)果圖7顯示了2組小鼠的各自反應(yīng)。每一條是兩個ELISA孔的平均值。免疫接種包含α2-M接種體的5個免疫動物也產(chǎn)生衣原體特異性IgA。樣品為了篩選再次稀釋為1∶8，當(dāng)觀察到信號＞2x背景和0.3OD時樣品才稱之為陽性。如信號密度顯示，包含α2-M的接種體產(chǎn)生的效價和那些由對照組產(chǎn)生的不相上下。3個非免疫樣品作為背景。
衣原體結(jié)果的總結(jié)在先前的實施例6中，鼻輸遞的帶有皂苷和L1抗體的衣原體抗原導(dǎo)致產(chǎn)生陰道IgA效價。實施例7表明α2-M可以替代抗體。結(jié)果由凍干和無活性的衣原體預(yù)備物獲得，使得這些制劑更有益于商品化。
這里的數(shù)據(jù)顯示6中不同的興奮劑和引導(dǎo)分子的組合通過各種途徑輸遞會導(dǎo)致血清抗體效價附加的和協(xié)同的增強(qiáng)，而沒有毒性的征象。
總而言之，所提供的實施例顯示當(dāng)興奮劑和引導(dǎo)分子組合時，會有意想不到的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。所述實施例包括5種不同的免疫原，4種不同的引導(dǎo)分子，兩種獨特的興奮劑，6種佐劑對(7個實施例都包括引導(dǎo)分子和興奮劑)以及3條不同的途徑。這些興奮劑和引導(dǎo)分子之間的陽性作用表明其中包含了明朗可預(yù)知的機(jī)制，并且可以簡單的運用于其它免疫原。進(jìn)而，任何引導(dǎo)分子(在APC上有受體的)應(yīng)該會產(chǎn)生相似的增強(qiáng)。雖然所述實施例共同的是皮下、腹膜內(nèi)和鼻腔內(nèi)；通過陰道、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)(沒顯示數(shù)據(jù))，靜脈內(nèi)、局部、血管內(nèi)和其它粘膜例如口和直腸途徑預(yù)期也適合本發(fā)明的實施。利用病毒微粒和分裂的病毒顆粒也已經(jīng)獲得成功(沒顯示數(shù)據(jù))。
通過各種途徑接受安全的包含興奮劑和引導(dǎo)分子的混合物可產(chǎn)生疫苗的增強(qiáng)，其中沉積物如明礬排除在外。這些新的混合物可能會更適合新微針和微研磨裝置，其中明礬和其它大微粒是有限制的。
在其它實驗室的早期工作顯示沉積物和引導(dǎo)分子，或沉積物和興奮劑的聯(lián)合僅僅會比他們的成分產(chǎn)生“附加的增強(qiáng)”。這里，聯(lián)合引導(dǎo)分子和興奮劑會產(chǎn)生如實施例1所表明的協(xié)同增強(qiáng)。
在實施例2中，引導(dǎo)分子和興奮劑的聯(lián)合使得產(chǎn)生功能性的效價而沒有毒性。由于效價協(xié)同性的增強(qiáng)，興奮劑的濃度可以減少到安全水平，其中任何局部或系統(tǒng)的毒性征象消失。
最后，單獨應(yīng)用引導(dǎo)分子或特定興奮劑的擁護(hù)者要求他們的試劑需要更少的免疫原。然而，實施例3清楚的表明商業(yè)上應(yīng)用的α2-M和CpG DNA單獨應(yīng)用，在有40ng免疫原時不能誘導(dǎo)產(chǎn)生功能性的效價。相比之下，所述的聯(lián)合可產(chǎn)生的效價足夠單克隆抗體從第一次增強(qiáng)開始的一個月內(nèi)應(yīng)用。這種能和超低量免疫原一起起作用的能力提高了產(chǎn)生僅小量存在的臨床目標(biāo)的抗體的前景。
通過各種途徑的沙眼衣原體的成功為相關(guān)的有機(jī)物例如肺炎衣原體和鸚鵡衣原體提供了清晰的策略。通過鼻施用衣原體和在陰道穹隆獲得IgA而獲得的穿粘膜結(jié)果是特別有價值的，因為鼻免疫接種需要較少的技術(shù)并且一次性使用物中不包括針。腹膜的成功使得腹腔中的惡性物是這里本發(fā)明佐劑混合物的主要候選?？贵w機(jī)構(gòu)和學(xué)院實驗室可舍棄完全弗氏佐劑和其它毒性物質(zhì)，它們典型的是用來產(chǎn)生研究和商業(yè)等級的抗體試劑。
例如，當(dāng)產(chǎn)生單克隆抗體試劑時，醫(yī)生也許希望選擇一種佐劑混合物和途徑，能夠灌注脾臟，體內(nèi)最大的B-細(xì)胞單一來源。如果目標(biāo)是產(chǎn)生對于較淺粘膜抗原的保護(hù)，那么醫(yī)生也許希望選擇一種佐劑混合物，當(dāng)其鼻輸遞時(經(jīng)過粘膜)會產(chǎn)生陰道IgA效價。
這項發(fā)明將教導(dǎo)免疫學(xué)家期待每種興奮劑和引導(dǎo)分子以各種效率起作用，這依賴于免疫原、免疫原的處理、輸遞途徑和所追逐的免疫應(yīng)答的類型。然而，效果最好的佐劑總是擁有興奮劑和引導(dǎo)分子的特性。這項發(fā)明將商業(yè)上應(yīng)用的材料放進(jìn)了基于功能的有用類別中，并教導(dǎo)如何將每個類別的后選物配對而獲得優(yōu)良的結(jié)果。這里的實施例提供了關(guān)于免疫原純度水平和用來認(rèn)識結(jié)果的引導(dǎo)分子純度的細(xì)節(jié)。多種類型的免疫原、引導(dǎo)分子和興奮劑的濃度和建議的比例一起提供，從而獲得理想的免疫應(yīng)答。
在回顧了本發(fā)明中的實施例以后，文中那些技術(shù)人員將意識到增強(qiáng)的重要，同時也將明白單一一對引導(dǎo)分子/興奮劑類型的佐劑不會對于所有的免疫原和應(yīng)用產(chǎn)生最佳效果。
任何用來配制免疫原或疫苗組合物的傳統(tǒng)方法也可以用來配制所述組合物。理想的是配制一種免疫原和引導(dǎo)分子符合物來增強(qiáng)所述組合物的有益作用。
如預(yù)期的所述疫苗或接種物將產(chǎn)生增強(qiáng)的保護(hù)和/或治療。進(jìn)而，所述組合物的應(yīng)用提高了發(fā)現(xiàn)頻率和用來診斷與治療的抗體的質(zhì)量，它們是由已經(jīng)建立的單克隆、多克隆和重組技術(shù)產(chǎn)生的，但對于人類和動物無毒性副作用。
如預(yù)期的同時擁有興奮劑和引導(dǎo)特性的佐劑也會提高局部輸遞。正如Mitragotri等報導(dǎo)的在這里所述佐劑大小范圍內(nèi)的分子可以應(yīng)用低頻超聲誘導(dǎo)其穿過角質(zhì)層(Mitragotri等1995 Science 269850-853)。
權(quán)利要求
1.一種包括免疫原的免疫原性組合物，一種起引導(dǎo)分子作用的第一佐劑和一種起興奮劑作用的第二佐劑，其特征在于，所述第一和第二佐劑是化學(xué)上不同的分子，所述免疫原和第一、第二佐劑存在的量足以產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，這是與免疫原僅和第一或第二佐劑之一產(chǎn)生的反應(yīng)相比較而言。
2如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑是弱興奮劑。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，不包括會導(dǎo)致可見外部毒性或過敏癥狀的試劑。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，適合鼻腔內(nèi)、腹膜內(nèi)，或皮下、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、陰道、直腸、口腔、局部或粘膜輸遞。
5.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑是皂苷或其包含皂苷成分的衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的免疫原性組合物，其中，所述皂苷是合成的。
7.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑是CpG DNA、核酸、細(xì)胞因子或趨化因子。
8.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述免疫原是抗原。
9.如權(quán)利要求8所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原是核酸的表達(dá)產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求8所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原是全細(xì)胞、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)混合物、膜提取物、哺乳動物細(xì)胞、病毒或細(xì)菌。
11.如權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物，其中，所述細(xì)菌是衣原體。
12.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中，所述衣原體是沙眼、肺炎或鸚鵡衣原體。
13.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中，所述衣原體是原生小體。
14.如權(quán)利要求13所述的免疫原性組合物，其中，所述沙眼原生小體是無活性的。
15.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子是α2-巨球蛋白(α2-M)或A2M的CD19結(jié)合片段。
16.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子是抗體或其免疫原特異片段。
17.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體或其片段對于抗原呈遞細(xì)胞(APC)受體特異。
18.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體或其片段具有能夠結(jié)合APC受體的表位。
19.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體或其免疫原特異片段對于免疫原是非特異的。
20.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)對于APC、免疫原或興奮劑特異。21.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體CDR對于APC、免疫原或興奮劑不是特異的。
22.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體對于興奮劑特異。
23.如權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述抗體對于興奮劑不是特異的。
24.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子結(jié)合運鐵蛋白、甘露糖(manose)、脫唾液酸糖蛋白受體或CD91。
25.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子是補(bǔ)體或熱休克蛋白或其能夠結(jié)合APC的片段。
26.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子是調(diào)理分子。
27.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子包含一種直接或間接和APC受體結(jié)合的分子。
28.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述引導(dǎo)分子和免疫原形成復(fù)合體。
29.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物是疫苗。
30.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物是冷凍、凍干、冷凍干燥或其它可復(fù)水的。
31.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，它基本上不含脂質(zhì)體。
32.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，它基本上不含明礬。
33.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，還包括至少一種對于免疫原特異或非特異的抗體或其片段。
34.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑選自GM-CSF、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、單磷酰脂A(MPL)、3-Q-去乙酰(desacyl)-4’-單磷酰脂A(3D-MLA)、IL-1β 163-171肽(Sclavo肽)、25-二羥維生素D3、降鈣素基因調(diào)節(jié)肽、脫氫表雄酮(DHEA)、N-乙酰葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，二甲基聯(lián)十八烷基(dioctadecyla)或二硬脂基溴化銨(DDA)/L-脯氨酸鋅、胞壁酰二肽(MDP)、甲?；?Met-Leu-Phe(fMLP)、N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(蘇氨酰-MDP)、N-乙酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-(羥基-磷酰氧)乙酰胺單鈉鹽(MTP-PE)、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3、Nac-Mur-L-Thr-D-異Gln-sn-二棕櫚酰甘油、Nac-Mur-D-Ala-D-異Gln-sn-二棕櫚酰甘油、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-辛-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala-二棕櫚酰甘油(DTP-GDP)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺(DTP-DPP)、γ干擾素、7-烯丙基-8-氧鳥苷、聚-腺苷酸-聚-尿苷酸復(fù)合物、MIP-1a、MIP-3a、二丁基鄰苯二甲酸酯、二丁基鄰苯二甲酸酯的類似物和C5a。
35.一種通過在受試者的理想部位施用免疫原性組合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其中，所述免疫原性組合物包含免疫原，起引導(dǎo)分子作用的第一佐劑和起興奮劑作用的第二佐劑，其中，所述第一和第二佐劑是化學(xué)上不同的分子，所述免疫原和第一、第二佐劑存在的量足以產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，這是與免疫原僅和第一或第二佐劑之一產(chǎn)生的反應(yīng)相比較而言。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生抗體。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，還包括從受試者回收抗體的步驟。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述抗體的Ka值在104-1013mol/l之間。
39.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑有助于APC遷移。
40.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑有助于APC成熟。
41如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述興奮劑吸引APC。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫原性組合物以及制造和使用所述組合物的方法。所述免疫原性組合物包含。所述興奮劑和引導(dǎo)分子在化學(xué)上是不同的。所述興奮劑和免疫原以相關(guān)的量存在而導(dǎo)致免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，這是和免疫原和引導(dǎo)分子或興奮劑之一導(dǎo)致的結(jié)果是相關(guān)的。
文檔編號A61K39/02GK1604792SQ02820220
公開日2005年4月6日 申請日期2002年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者R·L·坎普貝爾, J·A·米克斯塔 申請人:貝克頓迪肯森公司