專利名稱：從牝馬尿中獲得雌激素的方法
說明書本發(fā)明涉及從妊娠牝馬尿中獲得結合型雌激素的天然混合物。
雌激素在醫(yī)學中用于激素替代治療。尤其是將雌激素混合物用于治療和預防婦女在自然絕經(jīng)或人為絕經(jīng)后出現(xiàn)的更年期癥狀。已經(jīng)證明，天然結合型雌激素混合物，例如存在于妊娠牝馬尿液中的，對此特別有效且具有良好的耐受性。
溶解在妊娠牝馬尿液(＝pregnant mares urine，以下簡稱為“PMU”)中的固體含量可以通常在較大的范圍內(nèi)變動，一般為每升40-90克干物質(zhì)。PUM的固體含量中，除尿素和其它常見的尿容物之外，酚類成份含量大約為干物質(zhì)的2-5重量％。這些酚類成份中有甲酚和以HPMF著稱的二氫-3，4-雙[(3-羥基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它們可以以游離或結合的形式存在。PMU中含有雌激素的天然混合物，很大程度上以結合的形式例如作為硫酸半酯-鈉鹽(以下簡稱為“硫酸鹽”)存在。結合型雌激素的含量(以雌激素硫酸鹽計算)為干物質(zhì)的0.3-1重量％。
從WO 98/08526中已知一種合適的方法，采用該方法可在半極性(特別是非離子型半極性)聚合物吸附樹脂上進行的固相提取，從而可以獲得一種混合物，該混合物酚類尿容物貧乏的，甚至沒有甲酚和HPMF的，實際上完全含有PMU的天然雌激素成份的混合物。該提取物適合作為用于生產(chǎn)含有天然結合型雌激素混合物作為活性物質(zhì)成份的藥物的原料。
然而為了可以在藥物中用作為活性物質(zhì)成份，所獲得的結合型雌激素的天然混合物必須符合一定的藥物規(guī)格，例如符合在USP(美國藥典)或歐洲藥典中規(guī)定的標準。此外，以干物質(zhì)計的游離型雌激素的含量不應超過一定的極限值。通常根據(jù)WO 98/08526的方法從PMU獲得的結合型雌激素混合物符合所提出的藥物規(guī)格要求。
可是結果表明，當使用“老化的”尿例如經(jīng)較長時間和/或可能于較高溫度儲存或運輸?shù)腜MU來獲得結合型雌激素的天然混合物時，常常不能遵守所要求的藥物規(guī)格例如前述的游離型雌激素的最大可耐受含量的極限值。PMU的老化可能歸咎于以下原因，即依照儲存和/或運輸條件，結合型雌激素的含量會隨著時間或者于較高的溫度而減少，同時不希望的游離型雌激素的含量則由此增加。因此，相對于新鮮的尿的雌激素的天然混合物的原始組成會在老化的尿中發(fā)生不利的變化。對于用WO 98/08526的方法獲得的天然結合型雌激素混合物，在老化的最初產(chǎn)品的可能發(fā)生變化的組成方面常常存在有這樣的危險，即該獲得的提取物不再能夠遵守所要求的藥物規(guī)格，特別是不能夠再遵守游離型雌激素的最大可耐受含量。從而下面的情況是特別不利的，即從老化的PMU獲得的并含有本身寶貴的結合型雌激素混合物的活性物質(zhì)提取物的材料不能再用于生產(chǎn)藥物制劑，而因此必須將其廢棄。由于昂貴的和只在確定的妊娠期能夠進行的PMU的收集以及與之相聯(lián)系的在運輸儲存實踐中的邊界條件，并且從經(jīng)濟的觀點來看，損失寶貴的天然藥物活性物質(zhì)是非常不能令人滿意的。
因此，本發(fā)明的任務在于開發(fā)出一種在技術和經(jīng)濟上理想的方法用于從PMU中獲得酚類尿容物貧乏的結合型雌激素的天然混合物，在該方法中也是可以使用老化的PMU作為最初產(chǎn)品，即經(jīng)較長的時間和/或于較高的溫度儲存或運輸?shù)腜MU，在這種PMU中可能具有增加的游離型雌激素的比例，但是可以確保沒有廢品，以及特別是在該方法中從PMU中獲得的結合型雌激素的天然混合物具有良好的活性物質(zhì)含量，并且在特別是還考慮到游離型雌激素的最大可耐受含量的情形下符合所要求的藥物規(guī)格。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了一種方法，采用這種方法可以令人驚異的簡單方式也從老化的PMU(即特別是從游離型雌激素的比例可能增加了的PMU)中也能獲得結合型雌激素混合物，此處獲得的結合型雌激素混合物具有高的產(chǎn)品質(zhì)量，并且一定符合藥物規(guī)格的要求，特別是還考慮到游離型雌激素的最大可耐受含量。
根據(jù)本發(fā)明的方法以WO 98/08526中所描述的方法為出發(fā)點，該方法用于從PMU中獲得酚類尿容物貧乏的結合型雌激素的天然混合物。據(jù)此本發(fā)明涉及一種方法用于從妊娠牝馬尿中獲得酚類尿容物貧乏的結合型雌激素的天然混合物，在該方法中a)視情況去除黏液物質(zhì)和固體物質(zhì)、該尿液的經(jīng)濃縮的濃縮物或者通過該尿液的膜過濾而獲得的經(jīng)濃縮的尿滯留物，與足夠用于吸附尿液中含有的結合型雌激素混合物的數(shù)量的半極性聚合物吸附樹脂進行接觸，然后將上載了結合型雌激素混合物的半極性聚合物吸附樹脂與剩余的尿液分離開；b)用調(diào)整pH范圍至至少12.0特別是12.5-14.0的洗滌水洗滌上載了結合型雌激素混合物的半極性聚合物吸附樹脂；c)將經(jīng)洗滌的吸附樹脂與足夠用于解吸在其上面吸附的結合型雌激素混合物的數(shù)量的洗脫液進行接觸，該洗脫液為可與水混合的有機溶劑選自可與水混合的醚、低級烷醇和低級脂族酮，或者為由可與水混合的有機溶劑和可能調(diào)整至堿性的水所組成的混合物，然后將含有天然結合型雌激素混合物的洗脫物與吸附樹脂分離，如果可能并進行濃縮；此處根據(jù)本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術水平的方法相比，其特征在于，在處理步驟b)和c)之間進行中間洗滌，在該洗滌中用水洗滌上載了結合型雌激素混合物的半極性吸附樹脂。
加樣的準備、本身已知的處理步驟a)、b)和c)以及處理步驟c)中所獲得的含有天然結合型雌激素混合物的洗脫物的使用大體上在國際專利申請WO 98/08526中已經(jīng)進行了描述，因此專業(yè)人員可以從該出版的專利申請中來熟悉它們。出于公開的目的，WO 98/08526的內(nèi)容也是本申請的主題。在本申請的實施例部分總結了對于一般性處理方式的進一步細節(jié)和可使用的材料。例如，根據(jù)WO 98/08526可以使用半極性(特別是非離子型半極性)吸附樹脂。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以令人驚異地將根據(jù)本發(fā)明的中間洗滌步驟一起來使用于其他可能的吸附樹脂，而不會影響到產(chǎn)品質(zhì)量或者應當遵守的藥物規(guī)格。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以使用的吸附樹脂將在下文描述中進行更詳細的解釋。
根據(jù)本發(fā)明，將處理步驟a)中上載了結合型雌激素混合物的半極性吸附樹脂在緊隨處理步驟b)之后的中間洗滌步驟用水進行洗滌。洗滌水的數(shù)量可以如此進行選擇，即在緊接著的處理步驟c)中所獲得的洗脫物含有結合型雌激素混合物，其符合游離型雌激素最高含量的要求從而可以用于藥物的活性物質(zhì)成份。經(jīng)證實，每1個柱床體積的吸附樹脂使用2-8個優(yōu)選地為3-5個柱床體積的洗滌水是適當?shù)?。此處合適的是將洗滌水以這樣的流速引導通過含有吸附樹脂的反應器，即每小時每1個體積份的吸附樹脂通過3-10個優(yōu)選地為5-7個體積份的洗滌水。
必須作為特別驚異的事進行說明的是，正如根據(jù)本發(fā)明所確定的，即使應用老化的PMU用水進行被認為是簡單的且于處理步驟b)與c)之間施行的對于吸附樹脂的洗滌，也能使獲得的作為活性物質(zhì)提取物的天然結合型雌激素混合物的藥物規(guī)格達到最佳化。特別地，非常令人驚異的是，能夠如此確定地降低主要在老化的PMU中可能含有的增加了的游離型雌激素比例，從而可以在處理步驟c)中獲得天然結合型雌激素混合物作為洗脫物，該混合物符合藥物規(guī)格的高要求，例如根據(jù)USP或歐洲藥典所制訂的要求，特別是也可以從老化的PMU中獲得含有天然結合型雌激素混合物并在質(zhì)量與數(shù)量上都具有高數(shù)值的活性物質(zhì)提取物。該活性物質(zhì)提取物可遵守游離型雌激素最大可耐受的最高含量，而確保不受PMU的年齡和來源的影響，因此證明其可作為用于生產(chǎn)藥物的有利或者寶貴的最初產(chǎn)品。由此，也可以在復雜的條件下避免對于寶貴的藥物原料造成不希望的和經(jīng)濟上不利的損失，例如此處來自天然結合型雌激素的混合物。
以下特點經(jīng)證實是根據(jù)本發(fā)明的方法的進一步優(yōu)點，即在處理步驟c)中獲得的洗脫物與現(xiàn)有技術水平相比較具有以干物質(zhì)計的增加了的總激素含量。由此可獲得例如在活性物質(zhì)含量方面明顯改善的高質(zhì)量產(chǎn)品。
在根據(jù)本發(fā)明的方法有利的實施方案中，于室溫以下的溫度特別是0℃-10℃的溫度進行中間洗滌，因為事實表明通過附加的中間洗滌步驟可能減少特定的激素或活性物質(zhì)的損失。通常將環(huán)境溫度看作是室溫，例如位于20℃-30℃的溫度。非常合適的是該方法于實際上0℃或者接近0℃的溫度來實施。因此，推薦在實踐中于比0℃稍高的溫度進行操作，并采取相應的措施以便設法遵守上述的溫度范圍。為此可以采用本身常用的措施用于降低溫度，例如使用冷卻的反應器、冷卻的材料和/或冷卻的原材料如PMU。從實踐角度來看，可以將0℃至大約5℃，特別是0℃至大約3℃的溫度看作是0℃或者接近0℃的溫度。
為了將在中間洗滌期間可能的激素損失盡可能控制在低水平，根據(jù)本發(fā)明的這種變化形式，將在中間洗滌步驟中和/或也在處理步驟b)中使用的調(diào)整至堿性的洗滌水預冷卻至室溫以下的溫度特別是0℃-10℃的溫度。進一步合適的或者優(yōu)選的溫度范圍是如上指出的0℃至大約5℃的溫度，特別是0℃至大約3℃的溫度。于0℃或者接近0℃的溫度來操作是優(yōu)選的，即優(yōu)選地將在中間洗滌步驟中和/或也在處理步驟b)中使用的調(diào)整至堿性的洗滌水預冷卻至比0℃稍高的溫度。通過在步驟b)中使用冷卻的并調(diào)整至堿性的洗滌水，可實現(xiàn)這樣的特性，即預冷卻吸附樹脂或者保持已經(jīng)進行的吸附樹脂的冷卻，從而例如在對于中間洗滌使用冷卻的洗滌水時可避免其發(fā)生不希望的再次升溫。因此，中間洗滌步驟和前述的處理步驟b)這兩者優(yōu)選地于同一溫度范圍施行，例如于室溫以下的溫度，特別是于0℃-10℃的溫度，或者優(yōu)選地如于上面給出的溫度范圍。
在前述的本發(fā)明的變化形式中于室溫以下的溫度施行該方法，在該變化形式中可值得希望的是，以預冷卻的方式來應用所有使用的裝置，如用于接受半極性吸附樹脂的反應器或者已經(jīng)含有半極性吸附樹脂的反應器和/或應用所使用的PMU，這是相應地預冷卻至室溫以下的溫度，特別是預冷卻至0℃-10℃的溫度，或者預冷卻至上面給出的優(yōu)選的溫度范圍。
聚合物吸附樹脂適于作為根據(jù)本發(fā)明的方法的吸附劑。特別地，優(yōu)選的吸附樹脂為半極性(特別是非離子型半極性)聚合物吸附樹脂。在根據(jù)本發(fā)明的方法中可用作為吸附劑的半極性聚合物吸附樹脂優(yōu)選地為多孔的有機非離子型聚合物，其不同于非極性疏水型聚合物吸附樹脂而具有中等極性(＝例如樹脂活性表面的偶極矩在1.0-3.0德拜的范圍內(nèi)，特別是1.5-2.0德拜)和稍微親水的結構，例如聚羧酸酯樹脂。合適的是使用大孔型半極性樹脂，其優(yōu)選地具有大網(wǎng)狀結構，以及具有在50-150埃優(yōu)選為70-100埃的范圍內(nèi)的平均孔徑大小和在300-900m2/g優(yōu)選為400-500m2/g的范圍內(nèi)的比表面。經(jīng)證實特別合適的是大孔型交聯(lián)脂族聚羧酸酯樹脂，特別是交聯(lián)聚丙烯酸酯樹脂如Rohm & Haas公司的Amberlite XAD-7R，其是非離子型半極性吸附樹脂。
除了所述優(yōu)選的吸附劑之外也可以使用其他的吸附樹脂。非極性的、半極性的以及極性的吸附樹脂適合作為在此所述的吸附樹脂。在此首先依據(jù)各自的吸附器容量來確定可抽吸至吸附器之上的尿的量?？墒褂玫奈綐渲膶嵗秊樯虡I(yè)上慣用的型號如聚合物Amberlite吸附劑，其具有苯乙烯二乙烯基苯主鏈(例如型號XAD-1180、XAD-2、XAD-4、XAD-16)、具有丙烯酸酯主鏈(例如XAD-7)或者具有含有氮和氧的高極性主鏈(如XAD-12)。其他的吸附樹脂為Dowex-樹脂(苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物)，例如Dowex 112、Dowex Optipore、Dowex Optipore V 493；Lewatite(交聯(lián)聚苯乙烯)，例如Lewatit OC 1064、Lewatit OC 1066或LewatitOC 1163；聚胺陰離子交換樹脂如Dowex-樹脂。有利的吸附樹脂特別地為XAD-7、XAD-16(型號HP)、XAD118和Dowex Optipore(優(yōu)選地為Dowex Optipore V 493)，以及Lewatit OC 1064、OC 1066和OC 1163。
正如以上詳細描述的，根據(jù)本發(fā)明的方法相對于現(xiàn)有技術具有一系列優(yōu)點和改善。如此，使本發(fā)明也能使用可能增加游離型雌激素的比例的老化的PMU，而不會危機到所遵守的藥物規(guī)格。根據(jù)本發(fā)明的方法還具有經(jīng)濟上的優(yōu)點，因為明顯減少了在不能遵守制藥學規(guī)格(例如不可接受的游離型雌激素的含量)的情況下?lián)p失高價值的活性物質(zhì)的危險。根據(jù)本發(fā)明的方法提供了質(zhì)量上經(jīng)改善的活性物質(zhì)成份，其具有基于干物質(zhì)含量提高的激素含量。該活性物質(zhì)成份特別適合于制備含有天然雌激素的混合物作為活性物質(zhì)的藥物。
以下實施例應能進一步描述本發(fā)明，而并非限制本發(fā)明的范圍。
實施例在下面的實施例中給出了用于從PMU中獲得活性物質(zhì)提取物的一般性操作規(guī)程，該提取物含有在PMU中含有的結合型雌激素的天然混合物，并大大地減少了酚類尿內(nèi)容物。經(jīng)證明，根據(jù)本發(fā)明也從游離型雌激素的比例可能增加了的老化的PMU中可以獲得具有高活性物質(zhì)含量的優(yōu)質(zhì)提取物。
WO 98/08526的方法對于根據(jù)本發(fā)明的方法，同樣可以使用如根據(jù)WO 98/08526使用這樣的PMU、即通過濃縮而獲得的濃縮物或者由此通過膜過濾而獲得的滯留物。收集得到的尿首先以本身已知的方式從黏液物質(zhì)和固體物質(zhì)中釋放出來。合適的是讓固體物質(zhì)和黏液物質(zhì)沉積，然后采用本身已知的分離方法來分離它們，例如傾析、離析和/或過濾。因此PMU例如可以導入到本身已知的分離裝置如離析器、過濾器或者沉淀器之上。例如砂床可作為分離裝置，或者可以使用商購常見的離析器如噴嘴離析器或室式離析器。如果希望也可以使用微過濾裝置或者超過濾裝置，在使用這些裝置的同時可以將經(jīng)過濾的PMU進一步地去除病菌和病毒。
視需要可以在尿中添加防腐劑、殺微生物劑、殺菌劑和/或驅(qū)蠕蟲劑。
如果應當使用經(jīng)濃縮得到的PMU滯留物來代替PMU，可以通過本身已知的膜過濾從PMU中獲得這些滯留物。滯留物的固體物質(zhì)含量和其組成可以依據(jù)所使用的PMU和用于膜過濾的膜如其孔徑以及過濾的條件而變化。例如可以在使用納米過濾膜的時候?qū)τ赑MU滯留物中的雌激素成份進行幾乎無損失的濃縮，同時去除直至50重量％的低分子量的PMU內(nèi)容物。對于根據(jù)本發(fā)明的方法可使用PMU滯留物，該PMU滯留物濃縮至了大約1∶10的比例例如大約1∶7的比例，因此其體積可縮減至最初PMU體積的大約1/10例如大約1/7。
在處理步驟a)中可使用的半極性聚合物吸附樹脂為多孔的有機非離子型聚合物，其不同于非極性疏水型聚合物吸附樹脂而具有中等極性(＝例如樹脂活性表面的偶極矩在1.0-3.0德拜的范圍內(nèi)，特別是1.5-2.0德拜)和稍微親水的結構，例如聚羧酸酯樹脂。合適的是使用大孔型半極性樹脂，其優(yōu)選地具有大網(wǎng)狀結構，以及具有在50-150埃，優(yōu)選為70-100埃的范圍內(nèi)的平均孔徑，和在300-900m2/g，優(yōu)選為400-500m2/g的范圍內(nèi)的比表面。經(jīng)證實特別合適的是大孔型交聯(lián)脂族聚羧酸酯樹脂，特別是交聯(lián)聚丙烯酸酯樹脂如Rohm & Haas公司的Amberlite XAD-7R。
結合型雌激素在半極性吸附樹脂上的吸附可以根據(jù)WO 98/08526，也如根據(jù)本發(fā)明的方法，通過將PMU或者其滯留物與吸附樹脂接觸來進行，這即是將尿液導入含有吸附樹脂的反應器中，并使尿液在其中與吸附樹脂保持接觸對于吸附雌激素成份足夠的時間。在結合型雌激素成功吸附于半極性吸附樹脂上之后，可以本身已知的方式將上載了結合型雌激素混合物的吸附樹脂與剩余的尿液分離開。合適的是可以將尿液以這種流速引導通過含有吸附樹脂的柱，即使得接觸時間足夠用于雌激素成份的吸附。例如這樣的流速是合適的，即該流速相當于每小時每1個體積份的吸附樹脂流過3-10個優(yōu)選地為5-7個體積份的PMU。尿液通過反應器的流速可以合適地通過對于微小的超壓或負壓進行操作來控制。所用半極性吸附樹脂的數(shù)量可以根據(jù)所使用的吸附樹脂的特性和尿液中固體物質(zhì)的含量而變化。當使用PMU時，例如可以將1個體積份的吸附樹脂如交聯(lián)脂族聚羧酸酯吸附樹脂用直至80個體積份的預先處理的PMU進行上載，而不會在流出的尿液中發(fā)現(xiàn)有顯著數(shù)量的雌激素。當使用PMU濃縮物或者PMU滯留物時，吸附樹脂的上載容量自然應當按濃縮的比例而減少。因此，例如1個體積份的交聯(lián)脂族聚羧酸酯吸附樹脂可以用數(shù)量相當于20-80個優(yōu)選的為30-50個體積份的PMU的尿液來上載。
上載了結合型雌激素混合物的半極性吸附樹脂在處理步驟b)中用洗滌水進行洗滌，該洗滌水已調(diào)整至至少12.0的pH范圍之內(nèi)，特別是12.5-14的pH范圍，優(yōu)選的是大約12.5-13.5的pH范圍?？梢允褂迷谀蛞褐锌扇艿亩栊詨A性物質(zhì)的水溶液作為洗滌水，該堿性物質(zhì)足夠強從而達到至少12.5的pH值。作為對于半極性聚合物吸附樹脂惰性的且水溶的堿性物質(zhì)，水溶性無機堿優(yōu)選地是合適的，如堿金屬氫氧化物或者堿土金屬氫氧化物，特別是氫氧化鈉。該洗滌水合適地只含有大約這一數(shù)量的堿性物質(zhì)，即該數(shù)量對于達到所希望的PH值優(yōu)選的為pH13是足夠的。洗滌水的數(shù)量可以如此進行選擇，即其足夠用于盡可能地去除酚類尿容物，而與此同時不會洗去值得注意的量的結合型雌激素。經(jīng)證實，例如每1個柱床體積的吸附樹脂使用2-10個特別是4-6個柱床體積的洗滌液是適當?shù)?。在此合適的是將洗滌水以這樣的流速引導通過含有吸附樹脂的反應器，即每小時每1個體積份的吸附樹脂通過3-10個優(yōu)選地為5-7個體積份的洗滌水。
緊接著在處理步驟c)中，將經(jīng)洗滌的上載了結合型雌激素混合物的吸附樹脂用足夠用于洗脫結合型雌激素混合物的數(shù)量的洗脫液進行處理，從而獲得含有PMU中結合型雌激素的天然混合物的洗脫物。根據(jù)本發(fā)明而使用的洗脫液為可與水混合的有機溶劑選自可與水混合的醚、低級烷醇和低級脂族酮，或者為由這些可與水混合的溶劑和可能的調(diào)整至堿性的水所組成的混合物?？膳c水混合的環(huán)狀醚如四氫呋喃或二噁烷適合作為洗脫液的醚成份，但可與水混合的開鏈醚如乙二醇二甲醚(＝Monoglyme)、二乙二醇二甲醚(＝Diglyme)或乙氧乙氧基乙醇(＝卡必醇)也是合適的?？膳c水混合的具有1-4個優(yōu)選的為1-3個碳原子的烷基醇適合作為低級烷醇，特別是乙醇或異丙醇?？膳c水混合的具有3-5個碳原子的酮適合作為低級脂族酮，特別是丙酮。經(jīng)證實，其中的有機溶劑為乙醇的洗脫液是特別有利的。合適的是使用由前述的可與水混合的有機溶劑和可能調(diào)整至堿性的水所組成的混合物作為洗脫液。這種含水洗脫劑的pH值位于pH13以內(nèi)的中性至堿性范圍之內(nèi)，并可以有利地總計為大約10-12?？蛇x擇在所使用的pH范圍之內(nèi)穩(wěn)定的溶劑作為含水洗脫液中的溶劑成份。在具有大約10-12的pH值的含水堿性洗脫液中，低級烷醇適合作為溶劑成份，優(yōu)選的為乙醇。所希望的含水洗脫劑的pH值可通過添加相應數(shù)量的水溶的惰性堿性物質(zhì)來調(diào)節(jié)，優(yōu)選的為無機堿，例如堿金屬氫氧化物或者堿土金屬氫氧化物，特別是氫氧化鈉。在含水的洗脫液中，可與水混合的有機溶劑和水的體積比可以位于40∶60-20∶80的范圍之內(nèi)，優(yōu)選的為大約30∶70。所使用的洗脫劑的數(shù)量總計可為每1個柱床體積的吸附樹脂使用大約3-10個特別是大約4-6個柱床體積的洗脫劑。合適地可將洗脫液以這樣的流速引導通過含有上載了雌激素混合物的吸附樹脂的反應器，即可以獲得能夠完全洗脫下結合型雌激素混合物的接觸時間。當使用體積比為30∶70的乙醇與水的混合物時，例如合適的流速為每小時每1個體積份的吸附樹脂通過3-10個優(yōu)選地為5-7個體積份的洗滌液。這一洗滌過程合適地于室溫至大約60℃的溫度范圍之內(nèi)進行，優(yōu)選地于大約40-50℃。如果希望可以通過在稍微升高的壓力下例如在直至0.2巴的超壓下進行操作來調(diào)節(jié)流速，并在多個級分中接收洗脫物。各個洗脫級分中的結合型雌激素以及酚類尿容物如甲酚和HPMF的含量可以本身已知的方式通過高效液相色譜法(＝high performance liquid chromatography，縮寫為“HPLC”)來測定。
在進行洗脫時，首先獲得淺色至無色的且實際上無雌激素的初級分，其數(shù)量一般相當于大約1個柱床體積。結合型雌激素的主要數(shù)量例如存在于最初PMU中的結合型雌激素的80-99％位于隨后的深黃色至深褐色的主洗脫級分之中，其數(shù)量一般為2-4個柱床體積。在隨后的后級分中，一般只含有微量的結合型雌激素。如果獲得這樣的后級分，即該級分中結合型雌激素的含量仍高于重量10重量％(基于干物質(zhì))和含有低于0.6重量％(基于干物質(zhì))的甲酚與HPMF，則可以將該級分與富含雌激素的主洗脫物合并以便進一步處理。
實施例1(對比實施例)a)PMU的雌激素成份在半極性聚丙烯酸酯吸附樹脂上的吸附在高220mm、直徑40mm的柱中裝填入300ml于水中泡漲的半極性聚丙烯酸酯吸附樹脂(＝Rohm & Haas公司的Amberlite XAD-7，粒度為0.3-1.2mm，偶極矩為1.8德拜，平均孔徑為80埃，比表面在干燥時為大約450m2/g)。將10.5L(＝35個柱床體積)通過超濾裝置而過濾的PMU(通過HPLC測定的雌激素硫酸鹽和甲酚的含量見下面的實施例表)于室溫以平均每分鐘24ml(＝每小時4.8個柱床體積)的流速引導通過柱。PMU的雌激素成份完全吸附在經(jīng)如此上載的半極性吸附樹脂柱上。流出的尿液通過HPLC對于其中的結合型雌激素含量(折算為雌激素硫酸鹽)進行檢測從而證實其實際上不含雌激素。將流出液丟棄。
b)洗滌經(jīng)上載的吸附樹脂柱將經(jīng)上載的吸附樹脂柱用1.5L pH值為13的氫氧化鈉水溶液進行洗滌。為此，該堿性洗滌水以平均每分鐘24.6ml(＝每小時4.9個柱床體積)的流速引導通過柱。流出的洗滌液通過HPLC對于其中的雌激素硫酸鹽和甲酚的含量進行檢測。該檢測表明，在洗滌階段期間洗滌下的雌激素低于柱上所給出的雌激素總量的5％。
c)結合型雌激素從經(jīng)洗滌的吸附樹脂柱上的解吸將1.5L洗脫液(乙醇/水30∶70)以每分鐘25ml(＝每小時5.0個柱床體積)的流速引導通過于實施例表中指定的洗脫溫度預熱的柱。以5個級分接收流出的洗脫物。這些級分總計各為300ml(＝1個柱床體積)，并通過HPLC對于其中的雌激素硫酸鹽和甲酚的含量進行檢測。
第一個級分只含有微量的雌激素硫酸鹽。該洗脫物顯現(xiàn)為無色至淺黃色。在隨后的級分2至4中含有柱上所吸附的結合型雌激素總量的大約80-98％。所述洗脫物在此具有濃厚的深褐色色調(diào)。最后的級分仍只含有微量的雌激素硫酸鹽，可以看到顏色強度也明顯地減退了。
對于含有主要數(shù)量的結合型雌激素的級分，在下面的表中給出了各個以重量％表示的TS含量以及通過HPLC測定的雌激素硫酸鹽和甲酚的含量。這些級分為適合于醫(yī)用的進一步處理的提取物。
d)吸附樹脂柱的再生為了再生，將柱首先用600ml含有50％乙醇的乙醇/水混合物進行洗滌，然后用600ml含有70％乙醇的乙醇/水混合物洗滌，緊接著用600ml10％檸檬酸鈉水溶液洗滌，最后用600ml蒸餾水洗滌。全部的再生過程于45℃的溫度進行。柱可以多次例如直至40次進行上載和重新再生。
實施例2(根據(jù)本發(fā)明的方法)再次施行實施例1，但其具有根據(jù)本發(fā)明的于處理步驟b)和c)之間的中間洗滌步驟。
中間洗滌步驟將經(jīng)上載的吸附樹脂柱用900ml水進行洗滌。為此將中性的洗滌水以平均每分鐘25.0ml(＝每小時5.0個柱床體積)的流速引導通過柱。
流出的洗滌液通過HPLC對于其中的雌激素硫酸鹽和甲酚的含量進行檢測。該檢測表明，在該洗滌階段期間洗滌下的雌激素只占柱上所給出的雌激素總量的很少部分(最多只是大約百分之幾)。但在施行根據(jù)本發(fā)明的方法時，游離型雌激素的比例也根據(jù)本發(fā)明而減少了(見實施例4)。
表I對照實施例1和根據(jù)本發(fā)明的實施例2的結果
實施例3(具有冷卻步驟的根據(jù)本發(fā)明的方法)在中性洗滌期間激素損失的減少如在實施例1和2中進行操作，但要在冷卻條件下。冷卻是為了在中間洗滌期間盡量減少激素損失。中間洗滌不是于室溫而是用冰水來施行，這樣可以將激素的損失減少直至大約50％左右，特別是當在處理過程中溫度為實際的0℃或者接近0℃時。在此推薦不只提供冰水，而更確切地說是將整個柱冷卻至0℃，這是因為冰水會由于以室溫存在的柱內(nèi)含物而相對快速地變暖。
實施試驗對于中間洗滌所需的0℃的柱溫度可通過在先進行的堿性洗滌的冷卻而實現(xiàn)，即堿性洗滌已經(jīng)于0℃進行。當堿性洗滌的時候，提供5個柱床體積的0℃的洗滌液在此足夠用于將柱內(nèi)含物從室溫冷卻至0℃。然后，緊接著的中間洗滌就可以于0℃進行。除了盡量減少激素損失外，也一起檢測在堿性洗滌期間對于甲酚的分離可能出現(xiàn)的溫度影響。
為了直接的對比可進行兩個實驗。
實施例3a于室溫進行堿性洗滌和中間洗滌。
實施例3b于0℃進行堿性洗滌和中間洗滌。
所有的其他步驟以如上面對于WO 98/08526中描述的方法而規(guī)定的或者在實施例1和2中規(guī)定的標準方法來施行。
試驗結果表III給出了試驗參數(shù)以及于室溫和于0℃的溫度的試驗結果。
試驗結果使得可以清晰地看出a)將溫度降低至0℃不會影響堿性洗滌即甲酚的去除。甲酚的分離定量地進行。表III作了概括。
b)降低溫度可將在中間洗滌期間的激素損失減少大約50％左右。表III作了概括。
表II激素損失和通過干0℃施行中間洗滌而盡量減少其損失
因此，在堿性洗滌期間給予溫度調(diào)至大約0℃的氫氧化鈉溶液提供了一種簡單的可能性，即通過同樣地于大約0℃進行操作來減少中間洗滌步驟中的激素損失而不會影響甲酚的分離。
在中間洗滌期間降低溫度至大約0℃使得能夠盡量減少激素損失，即可以將通過附加的中間洗滌步驟而無法避免的激素損失減少直至大約50％左右。
如果在中間洗滌之前實施的堿性洗滌同樣于大約0℃進行，那么在中間洗滌期間的柱溫度調(diào)節(jié)可以簡單的方式來達到。降低溫度不會對于在堿性洗滌中發(fā)生的甲酚的分離產(chǎn)生負面影響。
表III于室溫和在冷卻條件下施行根據(jù)本發(fā)明的方法
實施例4(游離激素含量的減少)依照上述實施例1-3中的處理方式可以研究出當使用根據(jù)本發(fā)明的方法時游離激素的含量是如何減少的。結果在下面的表IVa(無中間洗滌步驟的對照試驗)和IVb(有中間洗滌步驟的根據(jù)本發(fā)明的試驗)中進行了描述。
表IV游離激素的最小化表IVa無中間洗滌步驟的對照試驗濃縮物中游離型雌激素 濃縮物中以干物質(zhì)含量的含量 計的結合型雌激素的總含量(重量％) (重量％)試驗1 3.21 3.2試驗2 3.67 4.4試驗3 2.38 9.2試驗4 4.14 12.2試驗5 4.03 9.9表IVb有中間洗滌步驟的試驗(根據(jù)本發(fā)明)濃縮物中游離型雌激素 濃縮物中以干物質(zhì)含量的含量 計的結合型雌激素的總含量(重量％) (重量％)試驗6 0.0 25.2試驗7 0.77 17.2試驗8 0.35 23.9試驗9 0.20 29.3試驗10 0.0 27.權利要求
1.從妊娠牝馬尿中獲得酚類尿容物貧乏的天然結合型雌激素混合物的方法，在該方法中a)視情況去除黏液物質(zhì)和固體物質(zhì)、該尿液的經(jīng)濃縮的濃縮物或者通過該尿液的膜過濾而獲得的經(jīng)濃縮的尿滯留物，與足夠用于吸附尿液中含有的結合型雌激素混合物的數(shù)量的聚合物吸附樹脂進行接觸，然后將上載了結合型雌激素混合物的聚合物吸附樹脂與剩余的尿液分離開；b)用調(diào)整pH范圍至至少12.0的洗滌水洗滌上載了結合型雌激素混合物的半極性聚合物吸附樹脂；和c)將經(jīng)洗滌的吸附樹脂與足夠用于解吸在其上面吸附的結合型雌激素混合物的數(shù)量的洗脫液進行接觸，該洗脫液為可與水混合的有機溶劑選自可與水混合的醚、低級烷醇和低級脂族酮，或者為由可與水混合的有機溶劑和可能調(diào)整至堿性的水所組成的混合物，然后將含有天然結合型雌激素混合物的洗脫物與吸附樹脂分離，并視情況進行濃縮，其特征在于，在處理步驟b)和c)之間進行中間洗滌，在該洗滌中用水洗滌上載了結合型雌激素混合物的聚合物吸附樹脂。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，中間洗滌步驟于室溫以下的溫度進行，特別是于0℃-10℃的溫度，優(yōu)選于比0℃稍高的溫度下進行。
3.根據(jù)前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，將用于中間洗滌步驟的洗滌水預冷卻至室溫以下的溫度，特別是0℃-10℃的溫度，優(yōu)選比0℃稍高的溫度。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，將在處理步驟b)中所使用的調(diào)整至堿性的洗滌水預冷卻至室溫以下的溫度，特別是0℃-10℃的溫度，優(yōu)選比0℃稍高的溫度。
5.根據(jù)前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，中間洗滌步驟和先施行的處理步驟b)于室溫以下的溫度進行，特別是0℃-10℃的溫度，優(yōu)選比0℃稍高的溫度。
6.根據(jù)前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，所使用的裝置如用于裝載聚合物吸附樹脂的反應器或者已經(jīng)含有聚合物吸附樹脂的反應器和/或所使用的PMU，相應地預冷卻至室溫以下的溫度進行使用，特別是預冷卻至0℃-10℃的溫度，優(yōu)選預冷卻至比0℃稍高的溫度。
7.根據(jù)前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，使用半極性吸附樹脂作為聚合物吸附樹脂，優(yōu)選使用非離子型半極性吸附樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及從妊娠牝馬尿(PMU)中獲得結合型雌激素的天然混合物的提取物的方法。根據(jù)本發(fā)明所獲得的提取物符合涉及結合型雌激素相關的藥物規(guī)格，和將游離型雌激素的含量減少到最低程度，甚至是當使用老化的和/或于較高溫度儲存或運輸?shù)娜焉镪蝰R尿的時候。從PMU中獲得含有結合型雌激素混合物的提取物可以通過在半極性吸附樹脂上的固相提取來進行。
文檔編號A61K31/56GK1589150SQ02822923
公開日2005年3月2日 申請日期2002年11月27日 優(yōu)先權日2001年12月1日
發(fā)明者H·H·拉施爾, O·魯普 申請人:索爾瓦藥物有限公司