專利名稱：可用于治療的三甘醇膽甾烯基寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膽甾烯基-偶聯(lián)的寡核苷酸組合物，及其用于抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，修飾細(xì)胞周期進(jìn)程和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的用途。
背景技術(shù)：
增殖是通過細(xì)胞周期進(jìn)行的細(xì)胞發(fā)展的頂點(diǎn)，導(dǎo)致了一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞周期的五個(gè)主要時(shí)期是G0，G1，S，G2，和M期。在G0期，細(xì)胞是靜止的。體內(nèi)的大部分細(xì)胞在某一時(shí)間是處在這一階段的。在G1期，細(xì)胞根據(jù)信號(hào)進(jìn)行分裂，產(chǎn)生DNA合成所必需的RNA和蛋白質(zhì)。在S-期(SE，早S-期；SM，中S-期；和SL，晚S-期)，細(xì)胞復(fù)制它們的DNA。在G2期，蛋白質(zhì)在致力于細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備。在有絲分裂(M)期，細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期進(jìn)程的改變出現(xiàn)在所有癌癥中，并且可能是由基因的超量表達(dá)，調(diào)節(jié)基因的突變，或DNA損傷關(guān)卡的取消所導(dǎo)致的(Hochhauser D.，Anti-CancerChemotherapeutic Agents，8903，1997)。
細(xì)胞程序死亡或編程性細(xì)胞死亡是殺傷和去除不希望的細(xì)胞的生理學(xué)過程，并且是化療劑殺傷癌細(xì)胞的機(jī)制。細(xì)胞程序死亡的特征是細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特的形態(tài)學(xué)改變，所述改變包括核染色質(zhì)的凝聚，細(xì)胞收縮，核分解，質(zhì)膜起泡，以及膜結(jié)合的細(xì)胞程序死亡體的形成(Wyllie等，Int.Rev.Cytol.，68251，1980)。磷脂酰絲氨酸從質(zhì)膜內(nèi)表面向外表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，與染色質(zhì)的凝聚吻合，并且被認(rèn)為是細(xì)胞程序死亡的標(biāo)志(Koopman，G.等，Blood，841415，1994)。已知細(xì)胞程序死亡的機(jī)制是通過激活被稱為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶家族而介導(dǎo)的。
天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶將三種主要肽序列認(rèn)作底物(Thomberry等，J.Biol.Chem.27217907，1997)(i)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1，-4)，(ii)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-2，-3和-7)，和(iii)Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-8和-10)。蛋白質(zhì)目標(biāo)中的序列識(shí)別導(dǎo)致了所述目標(biāo)的有限的和特異性的蛋白水解，如通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-7，包括但不局限于核纖層蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)目標(biāo)的降解，或包括但不局限于多腺苷二磷酸核糖聚合酶的酶的激活。據(jù)報(bào)導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3能夠根據(jù)促-細(xì)胞程序死亡信號(hào)，切割成它的具有催化活性的亞基(17和13kDa)，從而導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡(Susin等，J.Exp.Med.18625，1997)。
在細(xì)胞程序死亡期間，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活導(dǎo)致了多種底物的蛋白水解切割。多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)——一種參與DNA修復(fù)的核內(nèi)酶，是在細(xì)胞程序死亡期間由天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3切割的一種眾所周知的底物。它的切割被認(rèn)為是細(xì)胞程序死亡的標(biāo)志(O′Brien等，Biotechniques 30886，2001)。
細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能影響正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的行為(Radisky等，Seminars Cancer Biol.，1187，2001)。因此，當(dāng)將腫瘤細(xì)胞鋪平板在ECM上時(shí)，腫瘤細(xì)胞和ECM成分之間的相互作用將激活模擬體內(nèi)腫瘤的若干種生物病理學(xué)特征的信號(hào)傳導(dǎo)事件，如細(xì)胞-細(xì)胞接觸的調(diào)節(jié)(Weaver等，J.Cell Biol.，137231，1997)。
合成的寡核苷酸是聚陰離子序列，所述序列被內(nèi)在化到細(xì)胞中(Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta，1119795，1994)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，合成的寡核苷酸能選擇性地與核酸結(jié)合(Wagner，R.，Nature，372333，1994)，與特殊的細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合(Bates等，J.Biol.Chem.，27426369，1999)，以及與特殊的核蛋白質(zhì)結(jié)合(Scaggiante等，Eur.J.Biochem，252207，1998)，以便抑制癌細(xì)胞的增殖。
業(yè)已描述了具有膽甾烯基部分的寡核苷酸的合成和物理學(xué)特征。膽甾烯基部分與反義寡核苷酸的3’末端的連接能增強(qiáng)它們的活性(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866553，1989；Boutorin等，F(xiàn)EBS Letter，254129，1989；Corrias等，J.Neurooncol.31171，1997；美國(guó)專利號(hào)4,958,013；WO專利號(hào)9714440)。膽甾烯基部分與3′-末端的連接能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)反義分子的攝取(Corrias等，J.Neurooncol.31171，1997)，并且增強(qiáng)體內(nèi)反義血管保持(Fleser等，Circulation 921296，1995)。業(yè)已描述了通過氨基磷酸酯鍵與磷連接的核苷間膽甾烯基側(cè)鏈?zhǔn)且环N能增強(qiáng)反義分子活性的修飾(美國(guó)專利號(hào)4,958,013)。發(fā)現(xiàn)在5′-末端具有膽甾烯基部分的15個(gè)胞苷或胸苷殘基的均聚物，能調(diào)節(jié)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平，而在5′-末端具有膽甾烯基部分的雜聚序列或膽甾烯基修飾過的硫代磷酸序列是無活性的(Saxon等，Antisense Res.Dev.2243，1992)。已顯示由15個(gè)具有交替的胞嘧啶和腺苷殘基的硫代磷酸脫氧核苷酸組成的雜聚物或具有15個(gè)胞嘧啶或胸苷均聚物，在膽甾烯基團(tuán)與它的5′-末端連接時(shí)，是氨甲蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)的有效抑制劑(Henderon等，Nucl.Acids Res.253726，1995)。在5’-末端具有膽甾烯基部分的10個(gè)堿基的同型胞苷硫代磷酸寡核苷酸的共價(jià)修飾通過抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶，阻斷了受HIV-1或HIV-2感染的T淋巴細(xì)胞中的合胞體的形成(Stein等，Biochemistry 52439，1991)。
膽甾烯基部分與寡核苷酸的附著對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有最小的作用(Henderon等，Nucl，Acids Res.253726，1995)。細(xì)胞程序死亡的一般特征未在用3′-末端膽甾烯基寡核苷酸處理的癌細(xì)胞系中觀察到(Corrias等，J.Newooncol.31171，1997)。
業(yè)已證實(shí)大部分抗癌治療，無論是針對(duì)增殖抑制，細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，免疫系統(tǒng)的刺激還是細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，更不適合臨床應(yīng)用。這些治療方法中的很多是無效的或有毒的，具有明顯的副作用，導(dǎo)致抗藥性或免疫致敏的形成，并且使受體衰弱。
因此，一直需要能在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的新型組合物和方法，在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的方法，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供一種組合物滿足了這一需要，其中，將一個(gè)三甘醇(TEG)膽甾烯基部分與合成的寡核苷酸序列SEQ ID NO1(5′OH-GGGTGG-OH 3′)，SEQ ID NO2(5′OH-GGGAGG-OH 3′)，SEQ ID NO3(5′OH-CCACCC-OH 3′)，或SEQ ID NO4(5′OH-GTG-OH 3′)的3’末端附著，得到了相應(yīng)的5′-OH，3′TEG膽甾烯基新型合成的寡核苷酸序列SEQ ID NO5(5′OH-GGGTGG(TEG-膽甾烯基)3′)，SEQ ID NO6(5′OH-GGGAGG(TEG-膽甾烯基)3′)，SEQ ID NO7(5′OH-CCACCC(TEG-膽甾烯基)3′)，或SEQ ID NO8(5′OH-GTG(TEG-膽甾烯基)3′)。本發(fā)明還提供了使用所述新型合成的寡核苷酸序列的方法，包括將所述序列與可以接受的載體組合，以便制備一種組合物，并且體外或體內(nèi)使用所述組合物。給包括人類的動(dòng)物施用所述組合物，以便在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)一種反應(yīng)。所述反應(yīng)包括，但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。誘導(dǎo)所述反應(yīng)的一種優(yōu)選細(xì)胞是癌細(xì)胞或滑膜細(xì)胞?？梢杂帽景l(fā)明的組合物治療以不希望的細(xì)胞增殖為特征的任何疾病或狀況。以不希望的細(xì)胞增殖為特征的所述疾病或狀況包括，但不局限于自身免疫病，炎癥，淋巴增殖性疾病，關(guān)節(jié)炎和癌癥。
本發(fā)明還提供了將所述新型合成的寡核苷酸序列用于制備藥物的用途。所述藥物可用于治療以不希望的細(xì)胞增殖為特征的疾病或狀況，包括，但不局限于自身免疫病，炎癥，淋巴增殖性疾病，關(guān)節(jié)炎或癌癥。
可以將本發(fā)明的一種或多種新型序列與可以接受的載體組合，并且作為一種組合物在體外用于培養(yǎng)中的細(xì)胞或組織，或在體內(nèi)用于動(dòng)物或人類。另外，本發(fā)明的組合物可以與一種或多種治療劑一起使用。本發(fā)明組合物的使用可以在使用醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的一種或多種治療劑之前，期間或之后。醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的可用于治療疾病的任何治療劑都可與本發(fā)明的新型序列組合使用。所述組合使得可以使用較低劑量的治療劑，從而減弱不希望的副作用。
給動(dòng)物或人類施用包括有效量的一種或多種本發(fā)明序列的組合物是一種治療方案，它能預(yù)防，治療或消除以不需要的細(xì)胞增殖為特征的疾病或狀況。所述疾病或癥狀為醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知，并且包括，但不局限于癌癥，炎癥，關(guān)節(jié)炎，淋巴增殖性疾病，哮喘和血管成形術(shù)之后的動(dòng)脈再狹窄。癌癥包括，但不局限于鱗狀細(xì)胞癌，纖維肉瘤，類肉瘤癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌，腎癌，骨肉瘤，皮膚黑素瘤，基底細(xì)胞癌，胰腺癌，膀胱癌，腦癌，卵巢癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，和由此產(chǎn)生的腫瘤轉(zhuǎn)移。
給動(dòng)物和人類施用治療劑的方法和途徑為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，并且可用于施用包括本發(fā)明序列和可以藥用的載體的組合物。
膽甾烯基-TEG亞磷酰胺部分與功能性情性3′-OH寡核苷酸的3′-氧共價(jià)附著之后抑制癌細(xì)胞和滑膜細(xì)胞增殖，在癌細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，在癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，以及改變癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的出人預(yù)料的和驚人的能力，解決了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域長(zhǎng)期需要的和未得到滿足的需要，并且給包括人類的動(dòng)物提供了重大利益。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種包括5′-OH，3′-TEG膽甾烯基合成序列的新型組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能有效治療包括人類的動(dòng)物中疾病的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能有效治療以不希望的細(xì)胞增殖為特征的疾病或癥狀的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能有效治療癌癥的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能有效治療關(guān)節(jié)炎的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能在細(xì)胞中誘導(dǎo)一種反應(yīng)的組合物和方法，包括，但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活的誘導(dǎo)，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能在癌細(xì)胞或滑膜細(xì)胞，包括抗藥癌細(xì)胞或滑膜細(xì)胞中誘導(dǎo)一種反應(yīng)的組合物和方法，所述反應(yīng)包括，但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活的誘導(dǎo)，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能在細(xì)胞中誘導(dǎo)不依賴于BCR-ABL(22號(hào)染色體上的BCR基因和9號(hào)染色體上的ABL基因的融合體)的細(xì)胞程序死亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能在細(xì)胞中誘導(dǎo)不依賴于p53突變的細(xì)胞程序死亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種便于制備的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種對(duì)受體具有最低毒性的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供將所述新型合成寡核苷酸序列用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療以不希望的細(xì)胞增殖為特征的疾病或癥狀。
通過閱讀下面所披露的非限定實(shí)施方案和所附權(quán)利要求書的詳細(xì)說明，可以理解本發(fā)明的其他目的，特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.在僅用常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)或添加了SEQ ID NO1或SEQ IDNO5的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)之后，在MATRIGEL上的MCF-7，MDA-MB-231(MDA-231)，Hs578T和Mpanc-96細(xì)胞生長(zhǎng)的照片。
圖2.在僅用常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)，用添加了SEQ ID NO4或SEQ IDNO8的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)之后，在MATRIGEL上生長(zhǎng)的人類乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的照片。
圖3.在MATRIGEL-包被的孔上生長(zhǎng)48小時(shí)之后，MCF-7細(xì)胞的照片。然后，讓所得到的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)接觸單獨(dú)的常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)，或接觸添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺、SEQ ID NO3或SEQ ID NO7的培養(yǎng)基。
圖4.在MATRIGEL-包被的孔上生長(zhǎng)48小時(shí)之后，MDA-231細(xì)胞的照片。然后，讓所得到的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)接觸單獨(dú)的常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)，或接觸添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺、SEQ ID NO3或SEQ IDNO7的培養(yǎng)基。
圖5.以類球體形式生長(zhǎng)的并且接觸添加或沒有添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺(chol-TEG)，SEQ ID NO3，SEQ ID NO7的常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)，或接觸相應(yīng)的對(duì)照(RCM+水(RCMW)和RCM+乙腈(RCMA))3天時(shí)間的Hs578T細(xì)胞的照片。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包括5′-OH，3′-TEG膽甾烯基合成序列的新型組合物，其中，所述序列是SEQ ID NO5(5′OH-GGGTGG(TEG-膽甾烯基)3′)，SEQ ID NO6(5′OH-GGGAGG(TEG-膽甾烯基)3′)，SEQ ID NO7(5′OH-CCACCC(TEG-膽甾烯基)3′)或SEQ ID NO8(5′OH-GTG(TEG-膽甾烯基)3′)。
本發(fā)明還提供了使用所述新型組合物的方法。本發(fā)明的組合物在以能在細(xì)胞中有效誘導(dǎo)一種反應(yīng)的量給動(dòng)物或人類施用時(shí)可用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)一種反應(yīng)。所述反應(yīng)包括但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活，在所述細(xì)胞中多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。在一種實(shí)施方案中，所述動(dòng)物或人類患有癌癥或關(guān)節(jié)炎。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是滑膜細(xì)胞。
本發(fā)明的組合物可用于治療以不希望的細(xì)胞增殖為特征的疾病或狀況。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是以能有效治療動(dòng)物或人類的癌癥的量給患有癌癥的動(dòng)物或人類施用的。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是以能有效治療動(dòng)物或人類的關(guān)節(jié)炎的量給患有關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物或人類施用的。
3′-TEG膽甾烯基寡核苷酸抑制增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，或在細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，或在細(xì)胞中誘導(dǎo)所述反應(yīng)的組合的出人預(yù)料的和驚人的能力，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域滿足了長(zhǎng)期期待的、未滿足的需要，并且為動(dòng)物和人類提供了重大利益。
在本文中，術(shù)語“序列”表示3′-OH，5′-OH合成寡核苷酸，包括SEQ ID NO1(5′OH-GGGTGG-OH 3′)，SEQ ID NO2(5′OH-GGGAGG-OH3′)，SEQ ID NO3(5′OH-CCACCC-OH 3′)，或SEQ ID NO4(5′OH-GTG-OH 3′)，或表示5′-OH，3′-TEG膽甾烯基合成寡核苷酸，包括SEQ ID NO5(5′OH-GGGTGG(TEG-膽甾烯基)3′)，SEQ ID NO6(5′OH-GGGAGG(TEG-膽甾烯基)3′)，SEQ ID NO7(5′OH-CCACCC(TEG-膽甾烯基)3′)，或SEQ ID NO8(5′OH-GTG(TEG-膽甾烯基)3′)。
在本文中，術(shù)語“3′-TEG膽甾烯基寡核苷酸”和“3′-TEG膽甾烯基合成寡核苷酸”表示3′-三甘醇膽甾烯基-修飾過的寡核苷酸，即在3’末端具有連接的TEG膽甾烯基部分的5′-OH寡核苷酸。為了進(jìn)行說明，下面示出了SEQ ID NO7的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它是5′-OH，3′-TEG膽甾烯基合成寡核苷酸的一種例子。
在本文中，術(shù)語“反應(yīng)”表示一種反應(yīng)的誘導(dǎo)，包括但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，細(xì)胞中細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。
在本文中，短語“在反應(yīng)細(xì)胞中有效的”表示一種序列誘導(dǎo)一種反應(yīng)的能力，包括，但不局限于所述序列抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活，誘導(dǎo)多腺苷二磷酸核糖聚合酶切割，在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，或調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，或它們的組合的能力。
在本文中，短語“治療性處理”，“有效量”和“能有效…的量”表示一種序列有效誘導(dǎo)一種反應(yīng)的量，包括，但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，切割多腺苷二磷酸核糖聚合酶，在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，或它們的組合。
在本文中，術(shù)語“疾病”表示一種狀況，其中，身體的健康受到破壞。
在本文中，短語“治療劑”是得到一個(gè)國(guó)家或政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典(U.S.Pharmacopoeia)或其他公認(rèn)的藥典中所列舉的制劑的任何制劑，包括輻射，所述制劑可用于治療包括人類的動(dòng)物的疾病。
在本文中，短語“化療藥物”是得到一個(gè)國(guó)家或政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典(U.S.Pharmacopoeia)或其他公認(rèn)的藥典中所列舉的可用于治療包括人類在內(nèi)的動(dòng)物疾病的任何制劑。
在本文中，短語“抗關(guān)節(jié)炎藥物”是得到一個(gè)國(guó)家或政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典(U.S.Pharmacopoeia)或其他公認(rèn)的藥典中所列舉的可用于治療包括人類在內(nèi)的動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎的任何制劑。
在本文中，術(shù)語“抗腫瘤”表示抑制癌細(xì)胞的，發(fā)展，進(jìn)展，增殖或擴(kuò)散。
給動(dòng)物或人類施用有效量的本發(fā)明的組合物是一種治療方案，它能誘導(dǎo)一種反應(yīng)，預(yù)防，治療或消除疾病或它們的組合。所述反應(yīng)包括，但不局限于細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，或它們的組合。所述疾病包括，但不局限于癌癥，關(guān)節(jié)炎，淋巴增殖性疾病或炎癥。癌癥包括，但不局限于鱗狀細(xì)胞癌，纖維肉瘤，血管肉瘤，淋巴管肉瘤，橫紋肌肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肉瘤，軟骨肉瘤，類肉瘤癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌，腎癌，骨肉瘤，皮膚黑素瘤，基底細(xì)胞癌，胰腺癌，膀胱癌，腦癌，卵巢癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤和由它們衍生的轉(zhuǎn)移瘤。關(guān)節(jié)炎的形式包括，但不局限于幼年性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
一種序列的治療效果可以通過包括，但不局限于下列方法的方法增強(qiáng)化學(xué)修飾堿基，糖或磷酸主鏈，使用包括合適序列的細(xì)菌質(zhì)?；瘜W(xué)補(bǔ)充或通過生物技術(shù)擴(kuò)增所述序列，讓所述序列與生物學(xué)或化學(xué)載體復(fù)合，或讓所述序列與組織類型或細(xì)胞類型定向配體或抗體偶聯(lián)。
包括一種或多種序列和可以藥用的載體的組合物是通過讓所述序列和可以藥用的載體均勻而且緊密地結(jié)合而制備的。在本文中，術(shù)語“可以藥用的載體”或“可以藥用的媒介物”被用于表示，但不局限于任何液體，固體或半固體，包括，但不局限于水或鹽水，凝膠，乳劑，藥膏，溶劑，稀釋劑，流體軟膏基料，軟膏，糊劑，植入物，脂質(zhì)體，膠束，和大膠束等，這些制品適合用于與活的動(dòng)物或人類組織接觸，而又不會(huì)導(dǎo)致負(fù)面生理學(xué)反應(yīng)，并且，它們不會(huì)與所述組合物中的其他成分以有害的方式相互作用。為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他可以藥用的載體或媒介物可用于制備用于送遞本發(fā)明寡核苷酸序列的組合物。液體載體是含水載體，無水載體或這兩者，并且包括，但不局限于含水懸浮液，二甲基亞砜，乙醇，油類乳液，油包水乳液，水包油包水乳液，位點(diǎn)特異性乳液，長(zhǎng)效乳液，粘性乳液，微型乳液和納米乳液。固體載體是生物學(xué)載體，化學(xué)載體或這兩者，并且包括，但不局限于病毒載體系統(tǒng)，顆粒，微顆粒，納米顆粒，微球體，納米球體，小型泵，細(xì)菌細(xì)胞壁提取物和可生物降解的或不可生物降解的天然或合成聚合物，這些聚合物能夠進(jìn)行所述序列的持續(xù)釋放?？梢詫⑷橐?，小型泵和聚合物植入需要送遞的部位附近。用于使序列與固體載體復(fù)合的方法包括，但不局限于直接吸附到所述固體載體的表面，與所述固體載體的表面共價(jià)偶聯(lián)，直接結(jié)合或通過連接部分結(jié)合，并且將與所述聚合物的共價(jià)偶聯(lián)或靜電偶聯(lián)用于制備固體載體。任選地可以通過添加非離子型或離子型聚合物，如聚氧乙烯山梨糖醇酣單油酸酯(Tweens)，透明質(zhì)酸或氫氧化鋁使序列穩(wěn)定化。可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的其他載體。
優(yōu)選的含水載體包括，但不局限于水，鹽水和可以藥用的緩沖液。優(yōu)選的無水載體包括，但不局限于礦物油或中性油類，包括，但不局限于甘油二酯，甘油三酯，磷脂，脂質(zhì)，油類和它們的混合物，其中，所述油類包括多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的合適的混合物。其例子包括，但不局限于豆油，低芥酸菜子油，棕櫚油，橄欖油和myglyol，其中，所述脂肪酸可以是飽和的或不飽和的。任選地?zé)o論是否用可以藥用的載體將所述序列呈遞給效應(yīng)細(xì)胞，都可以添加賦形劑。所述賦形劑包括，但不局限于抗氧化劑，緩沖液和抑菌劑，并且可以包括懸浮劑和增稠劑。
本發(fā)明的序列可以與可以藥用的載體組合，并且作為組合物體外給培養(yǎng)中的細(xì)胞或組織施用，或在體內(nèi)給動(dòng)物或人類施用。施用的形式包括，但不局限于注射，溶液，乳劑，凝膠，植入物，泵，軟膏，乳液，懸浮液，微球體，顆粒，微顆粒，納米顆粒，脂質(zhì)體，糊劑，膏貼，片劑，經(jīng)皮送遞裝置，噴霧劑，氣溶膠，或其他為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的形式。所述可以藥用的載體為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍公知。本發(fā)明的藥用制劑可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法，使用眾所周知的和便于獲得的成分制備。例如，所述化合物可以與常用賦形劑，稀釋劑或載體配制，并且制成片劑，膠囊，懸浮液，和粉末等。適用于所述制劑的賦形劑，稀釋劑和載體的例子包括以下成分填充劑和補(bǔ)充劑(例如，淀粉，糖，甘露糖醇和硅衍生物)；粘合劑(例如羧甲基纖維素和其他纖維素衍生物，藻酸鹽，明膠和聚乙烯吡咯烷酮)；濕潤(rùn)劑(例如甘油)；崩解劑(例如碳酸鈣和碳酸氫鈉)；用于延緩溶解的試劑(例如石蠟)；再吸收加速劑(例如季銨化合物)；表面活性劑(例如鯨蠟醇，單硬脂酸甘油酯)；吸附載體(例如高嶺土和皂土)；乳化劑；防腐劑；增甜劑；穩(wěn)定劑；著色劑；加香劑；增香劑；潤(rùn)滑劑(例如，滑石，硬脂酸鈣和硬脂酸鎂)；固體聚乙二醇；和它們的混合物。
所述制劑可以是這樣構(gòu)成的，它們只能或優(yōu)選在特定位點(diǎn)，可能在一定的時(shí)間，釋放所述活性成分。所述組合還提供了用于控制釋放動(dòng)力學(xué)的其他機(jī)制。例如，可以用聚合物質(zhì)或蠟制備包被劑，包膜和保護(hù)性基質(zhì)。
一種或多種序列可以單獨(dú)施用，或者與其他治療劑形式組合，包括，但不局限于化療劑，抗關(guān)節(jié)炎制劑，免疫治療劑，抗微生物劑，或抗病毒劑，或與放射治療組合，或它們的任意組合。化療劑包括，但不局限于抗代謝物，DNA損傷，微管脫穩(wěn)定，微管穩(wěn)定化，肌動(dòng)蛋白解聚，生長(zhǎng)抑制，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制，HMG-CoA(3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A)還原酶抑制，嘌呤合成抑制，嘧啶合成抑制，金屬蛋白酶抑制，CDK(依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶)抑制，血管發(fā)生抑制，分化增強(qiáng)，和免疫治療劑?？龟P(guān)節(jié)炎制劑包括，但不局限于，抗炎制劑，包括非甾族類抗炎制劑(NSAIDs)，止痛劑，生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，疾病調(diào)理抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)，抗代謝劑，促細(xì)胞程序死亡，DNA損傷，微管去穩(wěn)定化，微管穩(wěn)定化，肌動(dòng)蛋白解聚，生長(zhǎng)抑制，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制，嘌呤合成抑制，嘧啶合成抑制，金屬蛋白酶抑制，CDK抑制，或血管生成抑制劑。NSAIDs包括，但不局限于傳統(tǒng)的NSAIDs，如雙氯芬酸鉀，雙氯芬酸鈉，具有米索前列醇的雙氯芬酸鈉，雙氟尼酸，依托度酸，苯氧苯丙酸，氟吡咯芬鈣，布洛芬，吲哚美辛，酮洛芬，甲氯滅酸，甲滅酸鈉，美洛昔康，萘丁美酮，萘普生，萘普生鈉，噁丙嗪，吡羅昔康，舒林酸，和甲苯酰吡酸鈉，環(huán)加氧酶-2(COX-2)抑制劑，如celecoxib和rofecoxib，水楊酸鹽，如阿司匹林，膽堿水楊酸鹽，水楊酸鎂，雙水楊酸酯和水楊酸鈉。止痛劑包括，但不局限于對(duì)乙酰氨基酚，具有可待因的對(duì)乙酰氨基酚，具有對(duì)乙酰氨基酚的氫可酮，羥氫可待酮，鹽酸丙氧芬，和曲馬朵。生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括，但不局限于etanercept和infliximab。糖皮質(zhì)素包括，但不局限于可的松，地塞米松，氫化可的松，甲基強(qiáng)的松龍，強(qiáng)的松龍磷酸鈉和強(qiáng)的松去炎松。DMARDs包括，但不局限于金諾芬(口服金)，硫唑嘌呤，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢菌素，硫酸基羥氯喹，來氟米特，氨甲蝶呤，二甲胺四環(huán)素，青霉胺，柳氮磺吡啶，金硫葡糖和硫代蘋果酸金鈉。
施用途徑為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，并且包括但不局限于口服(例如，臉頰或舌下)，直腸，如栓劑或灌腸劑，局部的，腸胃外，皮下，經(jīng)真皮，真皮下，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，囊泡內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，顱內(nèi)，損傷內(nèi)，鞘內(nèi)，腫瘤內(nèi)，眼內(nèi)，眼部，氣溶膠，肺內(nèi)，脊柱內(nèi)，前列腺內(nèi)，舌下，放入體腔內(nèi)，鼻腔吸入，肺吸入，印入皮膚和電穿孔，子宮內(nèi)，陰道，進(jìn)入體腔，在腫瘤或內(nèi)部損傷的部位手術(shù)使用，直接進(jìn)入腫瘤，進(jìn)入器官腔體或?qū)嵸|(zhì)，和進(jìn)入骨髓。在上述各種施用形式中使用的方法包括，但不局限于局部使用，攝入，手術(shù)施用，注射，噴霧，經(jīng)真皮送遞裝置，滲透泵，直接電沉積在需要的部位，或?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的其他方法。使用的部位可以是外部，如在表皮上，或內(nèi)部，例如，關(guān)節(jié)囊，腫瘤，胃潰瘍，手術(shù)區(qū)域，或其他部位。
本發(fā)明的組合物能夠以乳劑，凝膠，溶液，懸浮液，脂質(zhì)體，顆粒，或組合物制備和送遞技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他方式使用。超細(xì)粒度可用于吸入送遞治療劑。用于皮下使用的合適制劑的某些例子包括，但不局限于植入物，儲(chǔ)存裝置，針頭，膠囊和滲透泵。用于陰道內(nèi)使用的合適制劑的某些例子包括，但不局限于乳劑，栓劑，海綿，凝膠，泡沫和環(huán)。用于口服的合適制劑的某些例子包括，但不局限于藥丸，膠囊，液體，糖漿，和懸浮液。用于經(jīng)真皮和經(jīng)粘膜施用的合適制劑的某些例子包括，但不局限于乳劑，糊劑，膏貼，噴霧劑和凝膠。用于皮下施用的合適送遞機(jī)制的某些例子包括，但不局限于植入物，儲(chǔ)存裝置，針頭，膠囊，和滲透泵。適合腸胃外施用的制劑包括，但不局限于含水和無水無菌注射溶液，該溶液可以包括抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑，和使得該制劑與預(yù)期受體的血液等滲的溶質(zhì)，以及含水和無水無菌懸浮液，它可以包括懸浮劑和增稠劑。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的無菌粉末，顆粒，和片劑制備。
本發(fā)明的序列可以與一種或多種可以藥用的載體或賦形劑組合，以便制成組合物。所述組合物可以方便地以單位劑量形式存在，并且可以通過常規(guī)制藥技術(shù)制備。所述技術(shù)包括以下步驟使含有所述活性成分的組合物和藥用載體或賦形劑結(jié)合。一般，所述制劑是通過讓活性成分與液體載體均勻而且緊密地結(jié)合而制成的。優(yōu)選的單位劑量制劑是含有所施用的成分的一定劑量或單位的制劑，或它的合適的部分。應(yīng)當(dāng)理解的是，除了上面具體提到的成分之外，包括本發(fā)明組合物的制劑可以包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的其他制劑。
施用體積可以根據(jù)施用途徑而改變。所述體積為給動(dòng)物或人類施用組合物的技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知。根據(jù)施用途徑，每個(gè)劑量的體積優(yōu)選為大約0.001-100毫升，更優(yōu)選為大約0.01-50毫升，最優(yōu)選為大約0.1-30毫升。每個(gè)劑量所施用的序列的量?jī)?yōu)選為大約O.001-100毫克/千克體重，更優(yōu)選為大約0.01-10毫克/千克，最優(yōu)選為大約0.1-5毫克/千克。所述序列，序列的組合，和/或其他治療劑能夠以單一劑量治療形式施用，通過多個(gè)劑量治療施用或根據(jù)一種方案用適合要治療的疾病，受體的狀況和施用途徑的一定時(shí)間連續(xù)輸液。另外，所述序列可以在施用所述治療劑之前，同時(shí)，或之后施用。所施用的具體序列和具體治療劑，每個(gè)劑量的用量，以及施用途徑應(yīng)當(dāng)由醫(yī)生采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確定，并且取決于要治療的疾病或狀況，例如，癌癥的類型，癌癥的嚴(yán)重程度，癌癥的部位以及其他臨床因素，如患者的身高，體重和體能狀況。另外，可以任選性地采用各種體外和體內(nèi)測(cè)定，以便有助于確定施用的序列和序列加治療劑的最佳范圍。
給患有癌癥或關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物或人類施用能有效增強(qiáng)化療劑的抗腫瘤作用或抗關(guān)節(jié)炎制劑的抗關(guān)節(jié)炎作用的用量的與治療劑，例如，化療劑或抗關(guān)節(jié)炎制劑組合的序列。所施用的每個(gè)劑量的治療劑的量任選為大約0.001-1000毫克/平方米體表面或大約0.01-1000毫克/千克體重，更優(yōu)選為大約0.01-500毫克/平方米或大約0.01-500毫克/千克，最優(yōu)選為大約0.1-100毫克/平方米或大約0.1-100毫克/千克。所施用的特定序列和特定治療劑，每個(gè)劑量的用量，用藥方案和施用途徑應(yīng)該由醫(yī)生采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法確定，并且取決于疾病的類型，疾病的嚴(yán)重程度，疾病的位置和其他臨床因素，如患者的身高，體重和體能狀況。另外，可以選擇性地采用體外和體內(nèi)測(cè)定，以便有助于確定序列和序列加治療劑施用的最佳范圍。在PCTCA00/01467(WO01/44465)中描述了可用于這一目的的各種測(cè)定。在以下資料中描述了用于評(píng)估本發(fā)明序列的效力，以及用于評(píng)估與其他治療劑組合的所述序列的效力的其他測(cè)定Oncogene ResearchProducts，P.O.Box 12087，La Jolla，California，92039(ApoptosisCatalog and Technical Guide 2002-2003，特別是5-295頁)。所述測(cè)定包括為了分析DNA斷裂，細(xì)胞程序死亡，線粒體標(biāo)記，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記，游離核小體，核基質(zhì)蛋白質(zhì)，許多天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶和相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和活性而設(shè)計(jì)的測(cè)定，所述蛋白包括，但不局限于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1-14，谷胱甘肽，超氧化物歧化酶，bc1-2家族的成員，F(xiàn)as/TNR-R超家族，PARP相關(guān)產(chǎn)物的分析，細(xì)胞程序死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物的分析，包括死亡受體，Apo2，decoy受體在內(nèi)的各種信號(hào)傳導(dǎo)受體的分析，細(xì)胞程序死亡膜蛋白質(zhì)，神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞程序死亡標(biāo)記，細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的各種標(biāo)記，有絲分裂激酶的分析，溴脫氧尿苷測(cè)定，和p53測(cè)定。本發(fā)明序列的效力還可以根據(jù)其他制劑評(píng)估，包括治療劑，包括，但不局限于抗關(guān)節(jié)炎制劑，或在以下資料中描述的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑和細(xì)胞同步化制劑Oncogene Research Products，P.O.Box 12087，La Jolla，California，92039(Apoptosis Catalog and Technical Guide2002-2003，特別是99-104和214-255頁)。所述制劑包括，但不局限于放線菌素D，amphidocolin，A23187，咖啡因，喜樹堿，放線菌酮，地塞米松，阿霉素，5-氟尿嘧啶，羥基脲，紫杉醇，星形孢菌素，胸苷，長(zhǎng)春花堿，視黃酸，依托泊苷，岡田酸，長(zhǎng)春花新堿和氨甲蝶呤。
為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的各種體外和體內(nèi)測(cè)定，可用于評(píng)估序列本身或與治療劑組合之后用于治療關(guān)節(jié)炎的效力和最佳劑量范圍。動(dòng)物模型包括，但不局限于佐劑疾病模型，油性佐劑誘導(dǎo)的模型，微生物以及它們的細(xì)胞壁成分-誘導(dǎo)的模型，軟骨成分誘導(dǎo)的模型。轉(zhuǎn)基因和剔除模型，非免疫學(xué)骨關(guān)節(jié)炎模型，和部分綜合癥模型，正如在以下文獻(xiàn)中所描述的Waxman，B.H.，Scand.J.Immunol.，5612，2002。模型動(dòng)物包括，但不局限于大鼠，小鼠，靈長(zhǎng)類，豚鼠和兔子。
為了確定細(xì)胞周期的階段，可以采用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的各種測(cè)定和方法。一種這樣的方法使用CYCLETESTTMPLUS DNA商業(yè)試劑盒(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。簡(jiǎn)單地講，來自細(xì)胞的細(xì)胞核是通過以下方法獲得的在非離子去污劑中溶解細(xì)胞膜，用胰蛋白酶消除細(xì)胞骨架和核蛋白質(zhì)，用RNase消化細(xì)胞RNA，以及用精胺穩(wěn)定核染色質(zhì)。將碘化丙錠添加到細(xì)胞核中，并且用裝配有電子雙重分辨能力的流式細(xì)胞計(jì)分析它們的熒光(FACSCalibur，Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。在細(xì)胞周期的G0/G1期，早S(SE)期，中S(SM)期，晚S(SL)期或G2/M期的細(xì)胞積累，可以采用MODFIT LT軟件(Verity Software House Inc.，Topsham，MA)，或其他合適的軟件分析。
可以利用各種體外和體內(nèi)測(cè)定評(píng)估細(xì)胞外微環(huán)境對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞行為的影響。所述測(cè)定可以采用MATRIGEL(BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，它是從Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤中提取的溶解的基底膜制劑。
多細(xì)胞類球體(MS)是一種具體的體外測(cè)定的例子，其中，腫瘤細(xì)胞是以三維方式培養(yǎng)的，以便形成“腫瘤樣”結(jié)構(gòu)。在該系統(tǒng)中，存在一種細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的強(qiáng)化，這種強(qiáng)化模擬了實(shí)體瘤的惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境狀況。在這種類型的分析中，不添加細(xì)胞外基質(zhì)成分。在MS系統(tǒng)中培養(yǎng)的細(xì)胞不同于二維系統(tǒng)中的細(xì)胞(單層培養(yǎng)條件)。所述差別中的某一些與腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能性分化，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期改變，“多細(xì)胞抗藥性”，以及藥物通過腫瘤細(xì)胞層擴(kuò)散和侵入的改變相關(guān)(參見以下文獻(xiàn)中的綜述Green等，Anticancer Drug Des.14153，1999)。
下面的實(shí)施例將用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，不過，與此同時(shí)，這些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。相反，應(yīng)當(dāng)清楚地理解的是，在不背離本發(fā)明精神的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本文的說明之后，可以提出各種其他實(shí)施方案，改進(jìn)和等同方案。
實(shí)施例1核苷酸序列的制備使用Abacus區(qū)段合成技術(shù)，通過Sigma-Genosys(Woodlands，TX，美國(guó))制備磷酸二酯合成核苷酸序列和偶聯(lián)的3’-TEG膽甾烯基合成核苷酸序列。在TEG CPG支持物上合成其3’末端為TEG膽甾烯基的序列(Glen Research，Sterling，VA，美國(guó))。在即將使用之前，將該序列分散在水中或分散在二甲基亞砜(DMSO)中。
實(shí)施例2細(xì)胞所有細(xì)胞系都是從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC，Rockyille，MD)獲得的，并且是在由ATCC推薦的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。乳腺癌細(xì)胞系是在由ATCC推薦的培養(yǎng)基或描述于公開文獻(xiàn)中的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的(Herrera-Gayol and Jothy，Int.J.Exp.Path.，82193，2001)。表1表示在有關(guān)文獻(xiàn)中描述的細(xì)胞系，細(xì)胞系的來源和它們的生物病理學(xué)特征(Hackett等，Cancer Inst.，581795，1977；Price等，Cancer Res.，50717，1990；Thompson等，J.Cell Physiol.，150534，1992；和Peiper M等，Int.J.Cancer 71993，1997)。
表1細(xì)胞系
*非貼壁細(xì)胞**貼壁細(xì)胞實(shí)施例3通過SEQ ID NO5和SEQ ID NO6誘導(dǎo)MEG-01細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。
質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸的重分配是發(fā)生細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的一種特征(Martin等，J.Exp.Med.，1821545，1995)。在細(xì)胞程序死亡期間，磷脂酰絲氨酸在質(zhì)膜中的重分配是采用FITC(熒光素異硫氰酸酯)-偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V(BD Pharmingen，San Diego，CA)，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的。將費(fèi)城染色體陽性，并且具有BCR-ABL基因融合的人類慢性骨髓白血病細(xì)胞系MEG-01細(xì)胞，以2.5×105細(xì)胞/ml的濃度與最終濃度為5.3，26.5和53.0μM的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和膽甾烯基-TEG亞磷酰胺分子一起培養(yǎng)48小時(shí)。在表2中報(bào)道了在進(jìn)行SEQ ID NOs1，2，5，6，或膽甾烯基-TEG亞磷酰胺處理之后，發(fā)生細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的百分比。未處理過的MEG-01細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡的百分比為12％。
表2MEG-01細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸陽性細(xì)胞(細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞)的百分比
如表2所示，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和膽甾烯基-TEG亞磷酰胺對(duì)MEG-01是無活性的。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO1的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO5，而在SEQ ID NO2的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ IDNO6，賦予所述惰性寡核苷酸誘導(dǎo)MEG-01細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡的能力，這種活性是通過磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)衡量的。
實(shí)施例4通過SEQ ID NO7誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡將鼠類T淋巴瘤細(xì)胞系EL-4細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/ml的濃度與0.53，5.3和53.0μM濃度的SEQ ID NO3，SEQ ID NO7或膽甾烯基-TEG亞磷酰胺一起培養(yǎng)24小時(shí)。在表3中報(bào)道了在進(jìn)行SEQ IDNO3，SEQ ID NO7或膽甾烯基-TEG亞磷酰胺處理之后，細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的百分比。未處理過的EL-4細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡百分比為7％。
表3EL-4細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸陽性細(xì)胞(程序死亡的細(xì)胞)的百分比
如表3所示，SEQ ID NO3或膽甾烯基-TEG亞磷酰胺都不能導(dǎo)致EL-4細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO3的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO7，賦予所述惰性寡核苷酸誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡的能力，這種能力是通過磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)衡量的。
實(shí)施例5通過SEQ ID NO7激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3將EL-4細(xì)胞(2.5×105細(xì)胞/ml)與0μM(對(duì)照)，53μM的SEQ IDNO3或53μM的SEQ ID NO7一起培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)之后，洗滌、固定、透化對(duì)照細(xì)胞和處理過的細(xì)胞，并且與藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)的能識(shí)別天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的活性催化單位的抗體(克隆C92-605；BD Pharmingen，San Diego，CA，美國(guó))一起培養(yǎng)，使用由生產(chǎn)商推薦的條件。在FACSCALIBUR上，采用CellQUEST程序(均來自Becton Dickinson，San Jose，CA，美國(guó))，通過流式細(xì)胞術(shù)，分析與活性天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3相關(guān)的熒光。在表4中報(bào)道了在用53μM的序列處理過的EL-4細(xì)胞中含有活性天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的細(xì)胞的百分比。
表4EL-4細(xì)胞中含有活性天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的細(xì)胞的百分比
如表4所示，SEQ ID NO3對(duì)EL-4是沒有活性的。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO3的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO7，賦予所述惰性寡核苷酸誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的能力，這種能力是通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的激活衡量的。
實(shí)施例6由SEQ ID NO7切割多腺苷二磷酸核糖聚合酶將EL-4細(xì)胞(2.5×105細(xì)胞/ml)與0μM(對(duì)照)，53μM的SEQ IDNO3或53μM的SEQ ID NO7一起培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)之后，洗滌、固定、透化對(duì)照細(xì)胞和處理過的細(xì)胞，并且與FITC-偶聯(lián)的能特異性識(shí)別切割的PARP的85kDa片段的抗體(BioSource，Camarillo，CA，美國(guó))一起培養(yǎng)，使用生產(chǎn)商推薦的條件。在FACSCalibur上采用CellQUEST程序(均來自Becton Dickinson)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析與切割的PARP相關(guān)的熒光。在表5中報(bào)道了在用53μM的最終濃度的序列處理過的EL-4細(xì)胞中含有切割的PARP的細(xì)胞的百分比。
表5EL-4細(xì)胞中含有切割的PARP的細(xì)胞的百分比
如表5所示，SEQ ID NO3對(duì)EL-4是沒有活性的。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO3的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO7，賦予所述惰性寡核苷酸誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的能力，這種能力是通過PARP的切割衡量的。
實(shí)施例7SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，和SEQ ID NO8對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響以1.0×105細(xì)胞/ml的濃度，將滑膜細(xì)胞系——貼壁的HIG-82細(xì)胞與53μM(最終濃度)的SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO8一起培養(yǎng)48小時(shí)。通過二甲基噻唑-二苯基-四唑(MTT)還原測(cè)定細(xì)胞增殖(Mosman等，J.Immunol.Methods 6555，1983)。MTT是在570nm的波長(zhǎng)下，使用多重分光光度計(jì)讀數(shù)儀測(cè)定的(ELX800，Bio-TEK，Instruments Inc.，Winooski，VT)。在表6中示出了HIG-82細(xì)胞增殖的抑制百分比，該百分比是通過以下公式計(jì)算的
表6HIG-82細(xì)胞增殖的抑制(％)
如表6所示，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4不能抑制滑膜HIG-82細(xì)胞的增殖。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，分別得到了SEQ ID NO6，7和8，賦予它們抑制HIG-82細(xì)胞的細(xì)胞增殖的能力。
實(shí)施例8通過SEQ ID NO5和SEQ ID NO6誘導(dǎo)增殖的滑膜細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。
以1.0×105細(xì)胞/ml的濃度將貼壁HIG-82細(xì)胞與53μM最終濃度的SEQ ID NO1，SEQID NO2，SEQ ID NO5，或SEQ ID NO6一起培養(yǎng)48小時(shí)。由于在諸如胰蛋白酶消化的貼壁細(xì)胞收獲技術(shù)之后，細(xì)胞程序死亡的磷脂酰絲氨酸/膜聯(lián)蛋白V檢測(cè)不可靠(vanEngeland，Cytometry，311，1998)，所以使用流式細(xì)胞儀通過檢測(cè)斷裂的DNA評(píng)估分析HIG-82細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡，該方法通過采用商業(yè)化測(cè)定(APO-BRDUTM試劑盒；BD Pharmingen)，進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的溴脫氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)。測(cè)定含有核DNA斷裂的細(xì)胞的百分比。在24小時(shí)之后，未處理過的HIG-82細(xì)胞對(duì)于核DNA斷裂來說基本是陰性的。
表7HIG-82細(xì)胞中含有DNA斷裂的細(xì)胞(細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞)的百分比
如表7所示，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)的滑膜細(xì)胞是無活性的。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO1，和SEQ ID NO2的3’末端添加膽甾烯基-TEC亞磷酰胺，分別得到了SEQ ID NO5和6，賦予它們誘導(dǎo)HIG-82細(xì)胞程序死亡的能力。這種能力是通過具有斷裂的核DNA的細(xì)胞的百分比衡量的。
實(shí)施例9SEQ ID NO6對(duì)細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)將指數(shù)生長(zhǎng)的MEG-01細(xì)胞(2×105細(xì)胞/ml)與0μM(對(duì)照)，53μM的SEQ ID NO2或53μM的SEQ ID NO6一起培養(yǎng)24小時(shí)。收集所述細(xì)胞，離心，并且確定細(xì)胞周期階段。
表8通過SEQ ID NO6誘導(dǎo)MEG-01白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯
如表8所示，與未處理過的對(duì)照細(xì)胞相比，SEQ ID NO2對(duì)MEG-01是無活性的。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO2的3’-末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO6，賦予它在MEG-01細(xì)胞的SL+G2/M7期誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的能力。
實(shí)施例10SEQ ID NO3和SEQ ID NO7對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。
將20×103MDA-MB-231(MDA-231)或Hs578T鋪平板到24孔平板的每一個(gè)孔的常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)中，所述培養(yǎng)基有或沒有(對(duì)照)53μM(最終濃度)的SEQ ID NO3，SEQ ID NO7，53μM膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，或相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基(SEQ ID NO3的常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)，具有與所添加的SEQ ID NO7相同量的水的RCM，和具有與所添加的膽甾烯基-TEG亞磷酰胺相同量的乙腈的RCM)。將細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)，用胰蛋白酶消除，并且采用臺(tái)盼蘭排除技術(shù)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)量計(jì)數(shù)。在表9中示出了三次獨(dú)立測(cè)定的結(jié)果(與對(duì)照相比，變化百分比的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差(s.d.))。
表9培養(yǎng)3天的MDA-231和Hs578T人類乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖變化百分比*。
*“陽性+”變化表示增殖的刺激，而“陰性-”變化表示增殖的抑制，它是通過以下公式計(jì)算的
**在對(duì)方差進(jìn)行重復(fù)測(cè)定分析(RM ANOVA)之后，通過Dunnett′s多重比較測(cè)試獲得的p值。
如表9所示，SEQ ID NO3與膽甾烯基-TEG亞磷酰胺不會(huì)顯著影響細(xì)胞增殖。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO3的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO7，賦予它對(duì)兩種高度侵入性人類乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的抑制能力。
實(shí)施例11在MATRIGEL腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過SEQ ID NO5誘導(dǎo)的三維結(jié)構(gòu)形成的改變。
分別在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)MCF-7，MDA-MB-231(MDA-231)，Hs578T和Mpanc-96細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，并且計(jì)數(shù)。在37℃下，在最終濃度為53μM的SEQ ID NO1，53μM的SEQ ID NO5或RCM中，分別預(yù)培養(yǎng)100×103的MDA-231細(xì)胞，100×103的Hs578T細(xì)胞，150×103的MCF-7細(xì)胞和150×103的Mpanc-96細(xì)胞1小時(shí)，并且在MATRIGEL包被的平板(MATRIGEL基底膜基質(zhì)包被的cellware 24-孔平板)的頂部平板培養(yǎng)3天時(shí)間。用10％的福爾馬林固定平板。采用與Nikon倒置顯微鏡型號(hào)TMS連接的Nikon Coolpix 990數(shù)碼相機(jī)(NikonCorporation，Tokyo，日本)拍攝24孔平板上的細(xì)胞的數(shù)碼照片。盡管SEQ ID NO1不會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)，但SEQ ID NO5抑制了類似于當(dāng)細(xì)胞在MATRIGEL上的常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)所形成的三維結(jié)構(gòu)的形成(參見圖1)。
如表1所示，SEQ ID NO1是無活性的，不過，出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO1的3’-末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQID NO5，賦予它抑制形成類似于當(dāng)細(xì)胞在MATRIGEL上的常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)所形成的三維結(jié)構(gòu)的形成的能力。據(jù)信，SEQ ID NO5干擾了細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附機(jī)制。
實(shí)施例12在MATRIGEL(Beckton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，由SEQ ID NO8誘導(dǎo)的三維結(jié)構(gòu)形成的改變。
在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDA-MB-231(MDA-231)和Hs578T，用胰蛋白酶消化，并且計(jì)數(shù)。在37℃下，在最終濃度為53μM的SEQ ID NO4，53μM的SEQ ID NO8或RCM中將100×103的MDA-MB-231細(xì)胞或100×103的Hs578T細(xì)胞分別預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)，并且在MATRIGEL包被的平板鋪平板3天時(shí)間。用10％的福爾馬林固定平板。采用與Nikon倒置顯微鏡型號(hào)TMS連接的Nikon Coolpix 990數(shù)碼相機(jī)(NikonCorporation，Tokyo，日本)拍攝24孔平板上的細(xì)胞的數(shù)碼照片。盡管SEQ ID NO4不會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)，但SEQ ID NO8破壞了在MATRIGEL上鋪平板的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)形式(參見圖2)。
如圖2所示，SEQ ID NO4是無活性的，不過，出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO4的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQID NO8，賦予它抑制類似于當(dāng)細(xì)胞在MATRIGEL-包被的孔上的常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)所形成的三維結(jié)構(gòu)的形成的能力。據(jù)信，SEQ IDNO8干擾了細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)了腫瘤細(xì)胞和ECM成分之間的相互作用。
實(shí)施例13在MATRIGEL生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，由SEQ ID NO9誘導(dǎo)的MCF-7的三維結(jié)構(gòu)形成的改變。
在常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)中培養(yǎng)培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，并且計(jì)數(shù)。將150×103的MCF-7細(xì)胞放在用350μL MATRIGEL包被的24孔平板的孔中培養(yǎng)。在沒有任何處理的48小時(shí)期間形成三維結(jié)構(gòu)之后，更換培養(yǎng)基，并且讓所述結(jié)構(gòu)接觸最終濃度53μM的SEQ ID NO5，53μM的SEQ ID NO7，53μM的膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，RCM或它們各自的對(duì)照培養(yǎng)基(具有水的RCM，具有DMSO的RCM，或具有乙腈的RCM)。每隔3-4天重復(fù)所述處理，直到達(dá)到最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為19-20天。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。使用與Nikon倒置顯微鏡型號(hào)TMS連接的NikonCoolpix 990數(shù)碼相機(jī)拍攝24孔平板中的細(xì)胞的數(shù)碼照片。盡管各自的對(duì)照培養(yǎng)基(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，SEQ ID NO3和膽甾烯基-TEG亞磷酰胺與對(duì)照相比不影響三維結(jié)構(gòu)，但SEQ ID NO7破壞了所述結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)形式，從而影響了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用(參見圖3)。
如圖3所示，SEQ ID NO3和膽甾烯基-TEG亞磷酰胺是無活性的，不過，出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO3的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO7，賦予它破壞預(yù)先形成的三維結(jié)構(gòu)的能力。
實(shí)施例14在MATRIGEL生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，由SEQ ID NO7誘導(dǎo)的MDA-MB-231的三維結(jié)構(gòu)形成的改變。
在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDA-MB-231(MDA-231)細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，并且計(jì)數(shù)。將100×103的MDA-231細(xì)胞鋪平板到用350μLMATRIGEL包被的24孔平板的孔中的常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)中。在不進(jìn)行任何處理的情況下，在48小時(shí)期間形成三維結(jié)構(gòu)之后，更換培養(yǎng)基，并且讓所述結(jié)構(gòu)接觸最終濃度為53μM的SEQ ID NO3，53μM的SEQID NO7，53μM的膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，RCM，或它們各自的對(duì)照培養(yǎng)基(具有水的RCM，具有DMSO的RCM，或具有乙腈的RCM)。每隔3-4天重復(fù)所述處理，直到達(dá)到最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為17-21天。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。使用與Nikon倒置顯微鏡型號(hào)TMS連接的Nikon Coolpix990數(shù)碼相機(jī)拍攝24孔平板中的細(xì)胞的數(shù)碼照片。盡管各自的對(duì)照培養(yǎng)基(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，SEQ ID NO3和膽甾烯基-TEG亞磷酰胺不影響類似于在RCM(負(fù)對(duì)照培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)，但SEQ ID NO7破壞了所述結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)形式，從而影響了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用(參見圖4)。
如圖4所示，SEQ ID NO3和膽甾烯基-TEG亞磷酰胺是失活的，不過，出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO3的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO7，賦予它通過干擾細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用破壞三維結(jié)構(gòu)的能力。
實(shí)施例15當(dāng)Hs578T細(xì)胞以多細(xì)胞類球體形式培養(yǎng)時(shí)，通過SEQ ID NO7誘導(dǎo)的細(xì)胞周期的改變?cè)诖嬖?0μM最終濃度的SEQ ID NO3，SEQ ID NO7，53μM的膽甾烯基-TEG亞磷酰胺(cholTEG)或相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基(常規(guī)培養(yǎng)基(RCM)，含有與所添加的SEQ ID NO7相同量的水的RCM(RCMW)，和含有與所添加的膽甾烯基-TEG亞磷酰胺相同數(shù)量的乙腈的RCM(RCMA))的條件下，培養(yǎng)大約100×103Hs578T細(xì)胞/類球體。將每一種實(shí)驗(yàn)條件的5個(gè)類球體培養(yǎng)72小時(shí)。然后，采用FACScalibur流式細(xì)胞計(jì)(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，通過碘化丙錠(PI)染色(Calbiochem，Novabiochem Corporation，San Diego，CA)，評(píng)估細(xì)胞周期進(jìn)展。用MODFITLT軟件(Verity Software HouseInc)分析在細(xì)胞周期的不同階段的細(xì)胞的百分比變化。結(jié)果如圖5所示。
如圖5所示，與僅接觸常規(guī)培養(yǎng)基的類球體相比，SEQ ID NO3，膽甾烯基-TEG亞磷酰胺或?qū)φ张囵B(yǎng)基不會(huì)顯著改變細(xì)胞周期進(jìn)展。出人預(yù)料的是，接觸SEQ ID NO7增加了G2M和S-期的細(xì)胞的百分比，并且減少了G0/G1期細(xì)胞的百分比(p＜0.05，通過卡方檢驗(yàn))。添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺賦予在MS分析中測(cè)定的無活性的寡核苷酸改變復(fù)雜的三維系統(tǒng)中細(xì)胞周期進(jìn)展的能力，這種進(jìn)展類似于體內(nèi)腫瘤的若干種生物病理學(xué)特征。
實(shí)施例16與SEQ ID NO5一起培養(yǎng)時(shí)，MDA-MB-231人類乳腺癌細(xì)胞釋放的核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的改變?cè)诟髯缘膶?duì)照培養(yǎng)基中，將MDA-MB-231細(xì)胞與53μM最終濃度的SEQ ID NO1或53μM最終濃度的SEQ ID NO5一起培養(yǎng)72小時(shí)。將核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的釋放用作細(xì)胞程序死亡的衡量指標(biāo)。采用商業(yè)化ELISA試劑盒(Oncogene，Cambridge，MA)，按照生產(chǎn)商的方法測(cè)定NuMA。結(jié)果如表10所示，并且以與各自的對(duì)照相比，基于光密度測(cè)定的NuMA釋放的百分比增加形式表示。
表10在MDA-MB-231人類乳腺癌細(xì)胞中，核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)釋放的改變
如圖10所示，在細(xì)胞與SEQ ID NO5一起培養(yǎng)之后，核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的釋放增加了430％。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO1的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，得到了SEQ ID NO5，賦予它誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的能力。
實(shí)施例17在與SEQ ID NO6一起培養(yǎng)時(shí)，Hs578T人類乳腺癌細(xì)胞釋放的核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的改變將Hs578T細(xì)胞在陰性對(duì)照條件下或與53μM最終濃度的SEQ IDNO2，53μM最終濃度的SEQ ID NO6一起以單細(xì)胞層培養(yǎng)72小時(shí)。將核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的釋放用作細(xì)胞程序死亡的衡量指標(biāo)。采用商業(yè)化ELISA試劑盒，按照生產(chǎn)商的方法測(cè)定NuMA。結(jié)果如表11所示，并且以與對(duì)照條件相比，基于光密度測(cè)定的NuMA釋放的百分比增加形式表示。
表11Hs578T人類乳腺癌細(xì)胞釋放的核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的改變
如圖11所示，在細(xì)胞與SEQ ID NO6一起培養(yǎng)之后，核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的釋放增加了288％。出人預(yù)料的是，在SEQ ID NO2的3’末端添加膽甾烯基-TEG亞磷酰胺，賦予無活性的寡核苷酸誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的能力。
實(shí)施例18SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO5，和SEQ ID NO6對(duì)無胸腺裸鼠中MEG-01細(xì)胞的影響按以前描述的方法，將MEG-01細(xì)胞皮下接種到無胸腺裸鼠體內(nèi)(Takeo等，Leukemia 71286，1993)。將所述小鼠分成13個(gè)組，每組10只小鼠。在第0天，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO1，第3組小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO1，第4組小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO1，第5組小鼠接受1mg/kgSEQ ID NO2，第6組小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO2，第7組小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO2，第8組小鼠接受1mg/kg SEQ IDNO5，第9組小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO5，第10組小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO5，第11組小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO6，第12組小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO6，而第13組小鼠接受100mg/kgSEQ ID NO6。在處理4周之后，處死所述小鼠，并且測(cè)定腫瘤質(zhì)量。與第1-7組的小鼠相比，第8-13組的小鼠具有較小的腫瘤質(zhì)量。第8-13組的小鼠表現(xiàn)出劑量依賴形式的較小的腫瘤質(zhì)量。
實(shí)施例19SEQ ID NO3，和SEQ ID NO7對(duì)小鼠中淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按以前描述的方法，將EL-4鼠T淋巴瘤細(xì)胞皮下植入到C57/BL6小鼠體內(nèi)(Krawczyk等，Cancer Immunol.Immunother.40347，1995)。將所述小鼠分成7個(gè)組，每組10只小鼠。在第0天，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO3，第3組小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO3，第4組小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO3，第5組小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO7，第6組小鼠接受10mg/kgSEQ ID NO7，第7組小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO7。在處理4周之后，宰殺所述小鼠，并且測(cè)定腫瘤質(zhì)量。與第1-4組的小鼠相比，第5-7組的小鼠具有較小的腫瘤質(zhì)量。第5-7組的小鼠以劑量依賴形式表現(xiàn)出較小的腫瘤質(zhì)量。
實(shí)施例20SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6對(duì)患有鏈球菌細(xì)胞壁-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的大鼠的影響在LEW/N大鼠體內(nèi)，由鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎類似于局限性腫瘤，所述腫瘤部分由成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖性和侵入性群體組成(Yocum等，Am.J.Pathol.13238，1988)。通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射來自A型釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的鏈球菌細(xì)胞壁(SCW)在LEW/N大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。將大鼠分成13個(gè)組，每組10只大鼠。在第0天，第1組大鼠接受SCW，第2組大鼠接受SCW+1mg/kg SEQ IDNO1，第3組大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO1，第4組大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO1，第5組大鼠接受SCW+1mg/kg SEQID NO2，第6組大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO2，第7組大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO2，第8組大鼠接受SCW+1mg/kgSEQ ID NO5，第9組大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO5，第10組大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO5，第11組大鼠接受SCW+1mg/kg SEQ ID NO6，第12組大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO6，第13組大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO6。用2周時(shí)間，每天監(jiān)測(cè)關(guān)節(jié)炎癥。第8-13組大鼠表現(xiàn)出比1-7組大鼠更弱的炎癥。第8-13組大鼠具有較弱的劑量依賴形式的炎癥。
實(shí)施例21當(dāng)癌細(xì)胞以單細(xì)胞層形式在MATRIGEL上生長(zhǎng)或以多細(xì)胞類球體形式生長(zhǎng)時(shí)，與TEG膽甾烯基偶聯(lián)的序列對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞周期的影響以單細(xì)胞層形式在MATRIGEL包被的孔上或以多細(xì)胞類球體(MS)形式培養(yǎng)來自乳腺，胰腺，結(jié)腸，卵巢和前列腺的不同類型的惡性腫瘤細(xì)胞系。用有和沒有偶聯(lián)的膽甾烯基-TEG亞磷酰胺的具有不同長(zhǎng)度(3和6個(gè)堿基)的寡核苷酸序列，分別處理細(xì)胞至少1-3天。所述序列包括，但不局限于SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO3，SEQ ID NO7；SEQ IDNO4，或SEQ ID NO8。研究了細(xì)胞增殖/壞死(通過臺(tái)盼蘭排除方法測(cè)定)，細(xì)胞程序死亡(通過流式細(xì)胞儀，核有絲分裂器蛋白質(zhì)(NuMA)的釋放，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶酶-介導(dǎo)的溴脫氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)斷裂的DNA測(cè)定)，通過流式細(xì)胞儀研究的細(xì)胞周期進(jìn)展(PI染色)和在MATRIGEL-包被的孔上鋪平板的或作為多細(xì)胞類球體(MS)的腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。
當(dāng)細(xì)胞以MS形式或在MATRIGEL-包被的平板上培養(yǎng)時(shí)，與膽甾烯基-TEG偶聯(lián)的寡核苷酸序列能增強(qiáng)細(xì)胞死亡(壞死和程序死亡)，改變細(xì)胞周期進(jìn)展，并且當(dāng)細(xì)胞以MS形式或在MATRIGEL-包被的孔上培養(yǎng)時(shí)，可以改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)。未偶聯(lián)的寡核苷酸是無活性的。
實(shí)施例22SEQ ID NO3和SEQ ID NO7對(duì)MDA-MB-231異種移植腫瘤的影響將MDA-MB-231細(xì)胞皮下異種移植到裸鼠體內(nèi)。將所述小鼠分成7個(gè)組，每組10只小鼠。當(dāng)腫瘤的直徑達(dá)到5毫米時(shí)，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受0.5mg/kg SEQ ID NO3，第3組小鼠接受5mg/kg SEQ ID NO3，第4組小鼠接受50mg/kg SEQ ID NO3，第5組小鼠接受0.5mg/kg SEQ ID NO7，第6組小鼠接受5mg/kg SEQID NO7，第7組小鼠接受50mg/kg SEQ ID NO7。每隔3天進(jìn)行靜脈內(nèi)治療，最多使用6個(gè)劑量。當(dāng)腫瘤的直徑達(dá)到1厘米時(shí)，在出現(xiàn)任何痛苦的跡象或在研究結(jié)束時(shí)(從細(xì)胞注射開始3個(gè)月時(shí)間)宰殺小鼠。進(jìn)行全面尸體解剖。測(cè)定腫瘤質(zhì)量，侵入和轉(zhuǎn)移腫瘤的存在。第5-7組具有比第1-4組小鼠較小的腫瘤質(zhì)量。第5-7組的小鼠表現(xiàn)出較弱的劑量依賴形式的腫瘤質(zhì)量。
實(shí)施例23SEQ ID NO3和SEQ ID NO7對(duì)MDA-MB-231異種移植腫瘤的影響將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞皮下異種移植到裸鼠體內(nèi)(1×107細(xì)胞)。將所述小鼠分成7個(gè)組，每組10只小鼠。當(dāng)腫瘤的直徑達(dá)到5毫米之后，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受0.4mg/kg SEQ IDNO3，第3組小鼠接受4mg/kg SEQ ID NO3，第4組小鼠接受40mg/kg SEQ ID NO3，第5組小鼠接受0.4mg/kg SEQ ID NO7，第6組小鼠接受4mg/kg SEQ ID NO7，第7組小鼠接受40mg/kg SEQID NO7。每隔3天進(jìn)行靜脈內(nèi)治療，最多使用6個(gè)劑量。當(dāng)腫瘤的直徑達(dá)到1厘米時(shí)，在出現(xiàn)任何痛苦的跡象或在研究結(jié)束時(shí)(從細(xì)胞注射開始3個(gè)月時(shí)間)宰殺小鼠。進(jìn)行全面尸體解剖。測(cè)定腫瘤質(zhì)量，侵入和轉(zhuǎn)移腫瘤的存在。第5-7組具有比第1-4組較小的腫瘤質(zhì)量和轉(zhuǎn)移。第5-7組的小鼠表現(xiàn)出較弱的劑量依賴形式的腫瘤質(zhì)量和轉(zhuǎn)移。
上面所引用的所有專利，出版物和摘要都以它們的全文形式引入作為參考。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解的是，上文所述僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且，在不背離由所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行多種改進(jìn)和改變。
序列表<110>拜奧尼茨生命科學(xué)公司安德烈亞.克里斯蒂娜.赫雷拉—蓋奧爾<120>可用于治療的三甘醇膽甾烯基寡核苷酸<130>02811-0271WP 42368-278475<150>US 60/326,884<151>2001-10-03<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>1gggtgg 6<210>2<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2gggagg 6<210>3<211>6<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>3ccaccc 6<210>4<211>3<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>4gtg 3<210>5<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_特征<223>3’-三甘醇(TEG)膽甾烯基合成寡核苷酸<400>5gggtgg 6<210>6<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_特征<223>3’-三甘醇(TEG)膽甾烯基合成寡核苷酸合成寡核苷酸<400>6gggagg 6<210>7<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_特征<223>3’-3’-三甘醇(TEG)膽甾烯基合成寡核苷酸合成寡核苷酸<400>7ccaccc 6<210>8<211>3<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_特征<223>3’-三甘醇(TEG)膽甾烯基合成寡核苷酸合成寡核苷酸<400>8gtg 權(quán)利要求
1.一種包括5′-OH，3′-TEG膽甾烯基合成序列的組合物，其中，所述序列是SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7或SEQID NO8。
2.如權(quán)利要求1的組合物，還包括可以藥用的載體。
3.如權(quán)利要求1的組合物，還包括一種治療劑。
4.一種方法，包括給動(dòng)物或人類施用能在細(xì)胞中有效誘導(dǎo)一種反應(yīng)的量的權(quán)利要求2的組合物。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述反應(yīng)是細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活，細(xì)胞中多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞和滑膜細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述動(dòng)物或人類患有疾病。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述疾病是關(guān)節(jié)炎或癌癥。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中，所述癌癥是淋巴瘤，白血病，或乳腺癌。
10.將權(quán)利要求1的組合物用于制備藥物的用途。
11.如權(quán)利要求10的用途，其中，所述藥物能在細(xì)胞中有效誘導(dǎo)一種反應(yīng)。
12.如權(quán)利要求10的用途，其中，所述藥物可用于給動(dòng)物或人類施用。
13.如權(quán)利要求10，11或12的用途，其中，所述反應(yīng)是是細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活，細(xì)胞中多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，或細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。
14.如權(quán)利要求13的用途，其中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞和滑膜細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求10，11，或12的用途，其中，所述藥物能有效治療疾病。
16.如權(quán)利要求15的用途，其中，所述疾病是癌癥或關(guān)節(jié)炎。
17.如權(quán)利要求16的用途，其中，所述癌癥是淋巴瘤，白血病，或乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包括5′－OR，3′－TEG膽甾烯基合成序列和可以藥用的載體的組合物，其中，所述序列是SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8。本發(fā)明還提供了將該組合物用于制備藥物的方法，以及利用該組合物誘導(dǎo)細(xì)胞中的反應(yīng)的方法，所述反應(yīng)包括，但不局限于癌細(xì)胞和/或滑膜細(xì)胞中細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活的誘導(dǎo)，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)或細(xì)胞外基質(zhì)－細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或它們的組合。
文檔編號(hào)A61P19/02GK1599627SQ02824191
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2002年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月3日
發(fā)明者安德烈亞·克里斯蒂娜·赫雷拉－蓋奧爾, N·C·菲利普斯, M·C·菲利安 申請(qǐng)人:拜奧尼茨生命科學(xué)公司