專利名稱：抑制器官移植排異反應(yīng)的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物，其包含與染色體上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的位點(diǎn)特異結(jié)合的化合物(例如，核酸及其同系物(homolog))及其使用方法。更特別的，本發(fā)明涉及一種包含誘餌化合物(decoy compound)的組合物及其使用方法。
背景技術(shù)：
急性同種異體移植排異反應(yīng)(acute allogenic rejection)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫學(xué)現(xiàn)象，其中涉及大量的炎癥介質(zhì)和粘附分子(Hancock，1983)。此復(fù)雜事件的發(fā)作需要多種轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同激活(Shannon，1995)。
NF-κB是編碼在炎癥和免疫中起重要作用的基因產(chǎn)物的基因的轉(zhuǎn)錄因子之一(Baeuerle，1994)。NF-κB對(duì)多種胞外信號(hào)發(fā)生反應(yīng)并從細(xì)胞質(zhì)迅速移動(dòng)到細(xì)胞核，在一些細(xì)胞因子和粘附分子基因的協(xié)同反式激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Cooper等證明NF-κB的DNA結(jié)合活性存在時(shí)間依賴性的增加，同種異體心臟移植模型發(fā)生排異前三天有一個(gè)峰值(Cooper，1998)。但是，施用潛在的NF-κB抑制劑PDTC在所述模型中降低了NF-κB活性峰值，顯著延長(zhǎng)了受者的存活。
新的免疫抑制劑，F(xiàn)K506和CsA，通過抑制鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)(一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)磷酸酶，其是NF-κB激活中的關(guān)鍵因素)上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄(Mattila，1990；McCaffrey，1994；Kanno，1995)。已知另一種主要免疫抑制劑糖皮質(zhì)激素的作用部分來自對(duì)NF-κB激活的抑制(Scheinman，1995；Auphan，1995)。
人NF-κB正常的活性形式是兩個(gè)DNA結(jié)合亞基的異源二聚體，所述亞基是50KDa亞基(p50)和65KDa亞基(relA或p65)(Lenardo，1989；Libermann，1990；Satriano J，1994；Brennan，1990；Neish，1992)。在未受刺激的細(xì)胞內(nèi)，NF-κB與一種抑制分子IκB結(jié)合并隱藏在細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞受到刺激后，IκB發(fā)生磷酸化，然后被迅速降解。之后，NF-κB從IκB釋放，因此可使得轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與多種DNA識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合以調(diào)控基因表達(dá)(Baeurerle，1994，見上)。已經(jīng)提出轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從復(fù)合體的解離誘導(dǎo)了基因的受調(diào)控的反式激活作用，并在炎癥改變的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些基因包括白細(xì)胞介素(IL)-1，白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8；細(xì)胞間粘附因子；血管細(xì)胞粘附因子；內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子(Lenardo，1989；Libermann，1990；SatrianoJ，1994；Brennan，1990；Neish，1992Yamazaki，1993)。因此，阻斷NF-κB可減弱基因介導(dǎo)的心臟缺血再灌注。
一種合成的寡核苷酸作為順式元件“誘餌化合物”(以下稱作ODN)，阻斷一種核因子與相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，因此抑制體內(nèi)和體外分析系統(tǒng)的基因反式激活作用(Sullenger，1990；Bienlinska，1990；Yamada，1995；Morishita，1996)。已提出用這樣一種誘餌策略治療某種人類疾病。本發(fā)明人先前報(bào)道了E2F誘餌ODN作為再狹窄的基因治療模型進(jìn)行轉(zhuǎn)染，抑制了氣囊損傷后的過度增生(Morishita，1995)。最近，本發(fā)明人在大鼠中使用一種NF-κB誘餌成功保護(hù)了心肌免受缺氧損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是預(yù)防器官移植的急性排異反應(yīng)，由此改善預(yù)后。
本發(fā)明人假定合成的雙鏈DNA對(duì)NF-κB有高效的親和力，將其作為一種順式元件誘餌化合物導(dǎo)入體內(nèi)，可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子并阻斷基因介導(dǎo)的急性同種異體移植反應(yīng)的激活，因此為腎臟急性排異反應(yīng)提供一種有效的治療方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包含NF-κB順式元件的足夠量的誘餌ODN，其被轉(zhuǎn)染進(jìn)入供體腎臟的內(nèi)皮細(xì)胞，可與NF-κB有效結(jié)合，因此防止了必需的細(xì)胞因子和粘附分子的基因表達(dá)的反式激活，所以防止了急性排異現(xiàn)象的出現(xiàn)或發(fā)展。由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在灌注溶液中使用超聲心動(dòng)圖對(duì)比劑Optison(商標(biāo)Molecular Biosystems公司，美國(guó))以施加超聲暴露，足夠量的包含NF-κB順式元件的誘餌ODN被成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入大鼠腎臟同種異體移植體中。由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及一種治療劑，其抑制器官移植的排異反應(yīng)。該治療劑包含NF-κB誘餌化合物。靶器官的實(shí)例包括，但不局限于，腎臟，心臟，肺，肝臟，脾，胰腺，膽囊，胃，小腸，大腸，膀胱和類似器官。
優(yōu)選地，上述排異反應(yīng)是同種異體反應(yīng)。
優(yōu)選地，上述同種異體反應(yīng)是急性的。
優(yōu)選地，上述器官移植是腎臟移植。
優(yōu)選地，上述治療劑還包含超聲檢查的對(duì)比劑。
優(yōu)選地，上述超聲檢查對(duì)比劑包含一種選自半乳糖，白蛋白，半乳糖和棕櫚酸，脂質(zhì)體，高分子膜(Polymer film)，脂肪酸或乳酸聚合物中的底物。這樣的超聲檢查對(duì)比劑的實(shí)例包括Echovist(注冊(cè)商標(biāo))(Schering)，Alubunex(注冊(cè)商標(biāo))(Molecular Biology公司)，Levovist(注冊(cè)商標(biāo))(Schering)，DMP 115(Imagent)(Dupon Merk)，EchoGen(注冊(cè)商標(biāo))(Sonus)，Sonovist(注冊(cè)商標(biāo))(Schering)，Sono Vue(注冊(cè)商標(biāo))(Bracco)，BY963(注冊(cè)商標(biāo))(Byk-Gulden)，NC100100(Nycomed)，PESDA，Quantison(注冊(cè)商標(biāo))(Andaris)，Quantison Depo(注冊(cè)商標(biāo))(Andaris)，QUC82755和類似產(chǎn)品。
優(yōu)選地，上述超聲檢查對(duì)比劑是Optison(注冊(cè)商標(biāo))。Optison是來自白蛋白的含有微泡的小球體(microbubble-containing small sphere)，Optison包含全氟碳化合物(perfluorocarbon)，所述全氟碳是一種惰性氣體。
本發(fā)明還涉及改善器官移植的預(yù)后的治療劑。所述治療劑包含NF-κB誘餌化合物。
將所述治療劑施用于供體器官，并通過超聲處理增強(qiáng)NF-κB誘餌化合物高效轉(zhuǎn)染進(jìn)入該器官。
本發(fā)明還涉及一種抑制器官移植排異反應(yīng)的方法，包含將包含一種誘餌化合物的治療劑施用至供體器官，并對(duì)含有所述誘餌化合物的供體器官進(jìn)行超聲處理的步驟。
本發(fā)明也涉及改善器官移植的預(yù)后的一種方法，包含將包含誘餌化合物的治療劑施用至供體器官，并對(duì)含有所述誘餌化合物的供體器官進(jìn)行超聲處理的步驟。
本發(fā)明還涉及一種增強(qiáng)寡核苷酸轉(zhuǎn)染進(jìn)入生物組織的方法，包含將所述寡核苷酸導(dǎo)入所述生物組織，并對(duì)含有所述寡核苷酸的所述生物組織進(jìn)行超聲處理的步驟。
優(yōu)選地，以上描述的超聲處理是在超聲檢查對(duì)比劑存在的條件下進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式
以下，描述本發(fā)明的實(shí)施方案。如下描述的實(shí)施方案僅用于說明目的而不是限制本發(fā)明的范圍。
術(shù)語“誘餌”或“誘餌化合物”是指與染色體上的一個(gè)位點(diǎn)(該位點(diǎn)是一種轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)、或是由轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB控制的基因的另一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)(以下稱為靶結(jié)合位點(diǎn)))相結(jié)合的化合物，以拮抗NF-κB或其他轉(zhuǎn)錄因子與這些靶位點(diǎn)的結(jié)合。典型地，誘餌或誘餌化合物是一種核酸或其類似物。
當(dāng)一種誘餌存在于核內(nèi)時(shí)，誘餌與一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生沖突，競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的靶結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與靶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致的生物學(xué)功能被抑制。誘餌包含至少一種能與靶結(jié)合序列結(jié)合的核酸序列。依據(jù)本發(fā)明，只要一種誘餌具有與靶結(jié)合序列結(jié)合的活性，它就可用于制備本發(fā)明的藥物組合物。
優(yōu)選的誘餌的實(shí)例包括5’-CCT TGA AGG GAT TTC CCT CC-3，(SEQ ID NO1)(NF-κB誘餌)，或包含其互補(bǔ)序列、其突變體的寡核苷酸，或包含這些分子的化合物。寡核苷酸可以是DNA或RNA。寡核苷酸也可包括修飾的核酸和/或假核酸。此外，這些寡核苷酸也可能是其突變體，或包含它們的化合物。寡核苷酸具有單鏈或雙鏈，或呈線性或環(huán)形。突變體指具有上述序列的核酸，其中所述序列中的一部分序列具有突變、取代、插入、或缺失，并且根據(jù)不同因子結(jié)合的核酸結(jié)合位點(diǎn)的不同，所述核酸特異性拮抗轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB，或拮抗由轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB控制的基因的另一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
更優(yōu)選的誘餌實(shí)例包括含有一或多種上述核酸序列的雙鏈寡核苷酸，或其突變體。當(dāng)所含有的核酸序列數(shù)是2個(gè)時(shí)或所含有的核酸序列數(shù)是3個(gè)時(shí)，含有一或多種上述核酸序列的核酸稱為嵌合(雙)誘餌或三誘餌，以指示核酸序列的數(shù)目。
本發(fā)明使用的寡核苷酸包括修飾的寡核苷酸，以對(duì)抗體內(nèi)降解和類似情況，例如具有一個(gè)硫代磷酸二酯鍵的寡核苷酸(S-oligo)，所述硫代磷酸二酯鍵是磷酸二酯鍵的氧原子被一個(gè)硫原子代替，磷酸二酯鍵被一個(gè)無電荷的甲基磷酸酯基團(tuán)取代的寡核苷酸，或類似的情況。
本發(fā)明的誘餌可用本領(lǐng)域已知的化學(xué)或生化合成方法制備。例如，當(dāng)一種核酸被用作一種誘餌化合物時(shí)，可以采用基因工程的常規(guī)核酸合成方法。例如，一種DNA合成儀可被用于直接合成所需的誘餌核酸。此外，可以合成這些核酸、含有所述核酸或其部分的核酸，隨后采用PCR方法、克隆載體及類似方法擴(kuò)增。而且，使用限制性酶或類似物切割這些方法獲得的核酸，并使用DNA連接酶或類似的方法連接或用類似的方法來制備所需的核酸。為了獲得在細(xì)胞中更穩(wěn)定的誘餌核酸，所述核酸的堿基、糖和磷酸部分可進(jìn)行化學(xué)修飾，如烷基化、丙烯酸酯化或類似修飾。
本發(fā)明的治療劑可包含藥物學(xué)可接受的載體。這樣的藥物學(xué)可接受的載體的實(shí)例包括生理鹽水、生理鹽水緩沖液、葡萄糖、水等等。通常，藥物學(xué)可接受的載體具有藥物學(xué)惰性。
本發(fā)明的治療劑可包含一種誘餌化合物、一種賦形劑、一種佐劑、和一種藥物學(xué)可接受的載體。此外，除了誘餌化合物以外，治療劑可與其它藥物一起施用于病人。
本發(fā)明的治療劑可通過口服或胃腸外施用。胃腸外施用包括局部，表面，動(dòng)脈內(nèi)，肌肉，皮下，髓鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，腦室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹腔內(nèi)，或鼻腔內(nèi)施用。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物通過靜脈內(nèi)注射或動(dòng)脈內(nèi)注射施用。處方和施用技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)熟知，如“REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES”(Maack出版社，Easton，PA)所述。
本發(fā)明的治療劑包括含有可達(dá)到所述誘餌化合物的目的的有效量的誘餌化合物的藥物。典型的，本發(fā)明的治療劑包含的誘餌化合物具有的濃度大約為5-15μM?！爸委熡行Я俊被颉八幚韺W(xué)有效量”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的術(shù)語，并且其指有效產(chǎn)生所需藥理學(xué)結(jié)果的藥物量。因此，所述治療有效量是足夠的可減輕治療的疾病癥狀的量。通過測(cè)量從靶疾病恢復(fù)的程度可以分析治療有效量。治療有效量也可能依賴于治療的個(gè)體情況。所述量也可被優(yōu)化以便達(dá)到一種所需效果而無明顯副作用。治療有效量也可使用本領(lǐng)域常規(guī)方法確定。例如，使用細(xì)胞培養(yǎng)分析，適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型或類似分析估計(jì)治療有效量。其后，使用這些信息確定給予人的有效的量和途徑。
本發(fā)明使用的誘餌化合物的治療有效量指改善疾病癥狀或情況的誘餌化合物的量。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中通過標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)步驟可以決定一種誘餌化合物的治療效果和毒性(如，ED50，半數(shù)有效量和LD50，半數(shù)致死量)。這個(gè)劑量依據(jù)用藥形式，病人的易感性和給予途徑而改變。通常，誘餌化合物的使用濃度是5到15μM。


圖1A顯示一種表明USE和Optison的基因轉(zhuǎn)染功效的圖示。通過螢光素酶分析評(píng)估了USE的基因轉(zhuǎn)染的功效。直到2分鐘，超聲處理的功效(以下稱為USE)與它的持續(xù)時(shí)間成比例(圖1A中的左圖)。Optison以劑量依賴的關(guān)系顯著地增強(qiáng)了基因轉(zhuǎn)染(圖1A中的右圖)。
圖1B顯示的是移植腎切片的照片，顯示了通過熒光顯微鏡評(píng)估的FITC標(biāo)記的NF-κB誘餌ODN的轉(zhuǎn)染結(jié)果。應(yīng)用USE 30秒而無Optison時(shí)，可以觀察到FITC染色的表達(dá)量在腎小球(a)上很少，在腎小管(b)上有少量。在同種異體移植中，應(yīng)用USE 1分鐘，該表達(dá)量在腎小球(c)和腎小管(d)都增強(qiáng)了，通過使用Optison，則其更進(jìn)一步增強(qiáng)，腎小球(e)和腎小管(f)顯示明顯的FITC染色。
圖2顯示了一個(gè)測(cè)試中動(dòng)物的存活情況。使用USE通過NF-κB誘餌ODN基因轉(zhuǎn)染處理供體腎臟，動(dòng)物存活期顯著延長(zhǎng)(組1和組2)。另外，和其它所有組比較，組1中顯著延長(zhǎng)的動(dòng)物存活證實(shí)了使用Optison增強(qiáng)了基因轉(zhuǎn)染的功效在這個(gè)組內(nèi)，3/10的動(dòng)物存活20天或更長(zhǎng)。組1的受體動(dòng)物與所有其它組比較顯示了明顯延長(zhǎng)的存活；3/10的動(dòng)物存活20天或更長(zhǎng)。這些結(jié)果顯示了USE在基因轉(zhuǎn)染上的功效，且Optison的使用增強(qiáng)了USE在基因轉(zhuǎn)染上的功效。組4和組5的受體動(dòng)物在存活時(shí)間上沒有顯著差異，其表明灌注液中加入Optison或使用USE都不會(huì)影響動(dòng)物的存活。
圖3顯示了一個(gè)測(cè)試中的移植腎的功能的圖示。通過尿量(a)和血清肌酐(S-Cr)水平(b)評(píng)估移植體的功能。與組1的受體比較，組4的受體在移植2天后尿量明顯減少。移植6天后大多數(shù)動(dòng)物無尿，而組1的受體動(dòng)物保持正常尿量水平(a)。血清肌酐水平也確證了這些結(jié)果，與組1的受體動(dòng)物比較，組4的受體動(dòng)物的血清肌酐水平有顯著提高。
圖4顯示腎切片的照片，指示試驗(yàn)中腎移植體的組織學(xué)。從對(duì)照動(dòng)物同種異體移植器官移植后2天，顯示大量的廣泛的單核細(xì)胞浸潤(rùn)(a)。一些腎小球顯示明顯的單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴有大量的系膜基質(zhì)(b)。大多數(shù)腎小管的結(jié)構(gòu)變形，有明顯的蛋白質(zhì)沉積和管型(c)。在第4天，所有區(qū)域的細(xì)胞浸潤(rùn)變得更加突出，正常腎結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞并出血(d)。伴隨大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，一些腎小球(e)和腎小管(f)發(fā)生嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)殘缺和壞死。第6天，這些改變迅速和惡化，顯示嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)變形，伴有廣泛的壞死組織(g)。大多數(shù)腎小球(h)和腎小管(i)被嚴(yán)重的壞死所取代。相反，第2天時(shí)，NF-κB誘餌處理的同種異體移植器官保持完好，只有少量的單核細(xì)胞浸潤(rùn)(i)。大多數(shù)腎小球顯示沒有明顯改變(k)。在移植組織中，腎小管結(jié)構(gòu)大多保持正常沒有明顯蛋白質(zhì)沉積(l)。第4天，僅在間質(zhì)中觀察到細(xì)胞浸潤(rùn)(m)，大多數(shù)腎小球(n)和腎小管(o)保持完整。雖然在第6天組織中出現(xiàn)相當(dāng)多的細(xì)胞浸潤(rùn)(p)，大多數(shù)腎小球(q)和腎小管(r)顯示較小的改變。
圖5顯示的電泳照片示出了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析結(jié)果。
以下，本發(fā)明將舉例描述。本發(fā)明不僅局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例中使用的材料，試劑和類似物，除了特殊聲明的，都可以從商業(yè)來源獲得。
實(shí)施例本發(fā)明將通過以下實(shí)施例詳細(xì)描述。注意，以下實(shí)施例用于舉例目的，而沒有限制本發(fā)明的范圍。
1.材料和方法1.1.合成ODN和選擇靶序列使用的硫代磷酸酯ODN序列如下；NF-κB誘餌ODN5’-CCT TGAAGG GAT TTC CCT CC-3’(SEQ ID NO1)，3’-GGA ACT TCC CTA AAGGGA GG-5’；競(jìng)爭(zhēng)誘餌(scrambled decoy)ODN5’-TTG CCG TAC CTGACT TAG CC-3’(SEQ ID NO2)，3’-AAC GGC ATG GAC TGA ATCGG-5’，和PRE(黃體酮結(jié)合序列)5’-GAT CCT GTA CAG GAT GTT CTAGCT ACA-3’(SEQ ID NO3)，3’-CTA GGA CAT GTC CTA CAA GAT CGATGT-5’。
依據(jù)常規(guī)使用的方法合成這些ODN。合成的ODN用70％乙醇洗滌，晾干，溶于無菌Tris-EDTA緩沖液(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA)。上清經(jīng)過NAP10柱純化(Parmacia，瑞典)，采用分光光度計(jì)定量。使用一種內(nèi)標(biāo)記試劑盒(Clonetech，Inc.，Palo Alto Calif)，用FITC標(biāo)記NF-κB和競(jìng)爭(zhēng)誘餌的3’和5’端。
1.2.腎移植的急性排異模型以200到250克雄性Lewis大鼠(LEW，RTl1)作為腎移植受體，雄性WF(RTlu)大鼠作為供體。通過腎臟動(dòng)脈灌注冰冷肝素鹽水(hepalinizedsaline)(50U/ml)后，將WF大鼠左腎切除。采用顯微外科技術(shù)通過將左腎導(dǎo)管和左輸尿管首位相接，腎臟被同側(cè)移植到雙測(cè)腎切除的Lewis受體。所述技術(shù)已經(jīng)很好的建立，缺血時(shí)間已穩(wěn)定。手術(shù)期間，供體腎臟進(jìn)行30分鐘冷缺血性損傷。所有試驗(yàn)方案均符合發(fā)明人學(xué)院的動(dòng)物倫理委員會(huì)的方針。在這個(gè)模型中，動(dòng)物典型地發(fā)生急性排異反應(yīng)，變得無尿，10天內(nèi)死于尿毒癥(CTLA-9)。腎同種異體移植后的存活時(shí)間定義為從移植開始的時(shí)間到死亡的時(shí)間。在移植后24小時(shí)內(nèi)死于外科技術(shù)失敗的動(dòng)物在分析時(shí)被排除。
1.3.通過在灌注溶液中應(yīng)用超聲心動(dòng)圖對(duì)比劑(以下稱為USE)Optison施加超聲處理將NF-κB誘餌轉(zhuǎn)染進(jìn)入供體腎臟。
本發(fā)明完成如下研究以確定大多數(shù)在供體腎臟發(fā)生轉(zhuǎn)染的條件。灌注后，使用動(dòng)脈夾固定腎血管和輸尿管。50μg螢光素酶報(bào)道基因或FITC標(biāo)記的100μg NF-κB誘餌ODN溶解在0.5ml鹽水中，并分別含三種不同濃度的Optison(0，10，或25％)，經(jīng)腎動(dòng)脈灌注腎臟。切除腎臟并在水浴中暴露在2MHz頻率的超聲中，其信號(hào)強(qiáng)度是4bars，暴露持續(xù)的時(shí)間從30秒到8分鐘。然后，將腎臟移植進(jìn)入Lewis受體。同種異體移植器官分別在第1，2和4天切除，并分別通過螢光素酶分析和熒光顯微術(shù)評(píng)估螢光素酶報(bào)道基因和NF-κB誘餌ODN的表達(dá)。
(試驗(yàn)設(shè)計(jì))本發(fā)明設(shè)有6個(gè)組，列在表1中，以檢驗(yàn)使用USE的超聲處理的功效，并為使用NF-κB誘餌ODN處理腎同種異體移植器官建立新的步驟。
表1

組l，100μg NF-κB誘餌ODN(NF)溶于0.5ml含10％Optison(Opt)的鹽溶液，灌注每個(gè)供體腎臟。通過應(yīng)用超聲處理(USE)1分鐘，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染；組2，供體腎臟被同樣量的含USE的但是不含Optison的NF-κB誘餌處理；組3，腎臟被同樣量的Optison和NF-κB誘餌處理，但沒有USE；組4，腎臟僅被同樣量的無Optison和USE的NF-κB誘餌處理；組5，腎臟被同樣量的含如NF-κB那樣的Optison，USE的競(jìng)爭(zhēng)誘餌處理；組6，供體腎臟不進(jìn)行任何處理。
NF-κB誘餌(100μg)溶于0.5ml含10％Optison的鹽溶液(組1；Gp1)或100μg NF-κB誘餌溶于0.5ml不含Optison的鹽溶液(組2；Gp2)灌注每個(gè)供體腎臟。腎臟以2MHz載波頻率，USE水浴處理1分鐘，同側(cè)移植到Lewis大鼠受體。供體腎臟以同樣量含10％Optison(組3；Gp3)或無Optison(組4；Gp4)的NF-κB誘餌處理，不使用USE，將供體腎臟移植到受體。作為對(duì)照組，將以同樣量含有Optison和應(yīng)用USE的競(jìng)爭(zhēng)誘餌處理的供體腎臟移植到受體，為組5(Gp5)。未經(jīng)這些處理的腎臟同種異體移植受體作為另一個(gè)對(duì)照組(組6；Gp6)。從每組隨機(jī)選擇動(dòng)物并評(píng)估器官移植的存活。腎移植的存活時(shí)間被定義為從移植到死亡的時(shí)間。移植后24小時(shí)內(nèi)死于外科技術(shù)失敗的動(dòng)物已排除在分析之外。從每組隨機(jī)選出的5只動(dòng)物的供體腎臟在第4天被切除，并且用于評(píng)估ODN轉(zhuǎn)染，組織學(xué)分析，和免疫組織學(xué)。
(移植器官功能)移植后，在隔天的24小時(shí)，收集尿，連續(xù)測(cè)量尿量，通過測(cè)試尿沉積物來檢驗(yàn)?zāi)虻奶匦?。然后，本發(fā)明人通過測(cè)試組1到組5受體的一系列血清肌酐水平定量評(píng)估移植器官的功能。隔天從鼠尾靜脈獲得血清，采用Jaffe反應(yīng)方法檢測(cè)血清肌酐(S-Cr)。
(移植器官形態(tài)學(xué))腎的組織經(jīng)4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定。石蠟切片被蘇木精和伊紅(HE)以及高碘酸希夫(PAS)染色，之后采用光學(xué)顯微術(shù)觀察。以Banfu’s標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)觀察。
使用DAKO APAAP試劑盒(DAKO日本，京都，日本)，依照廠商說明書，通過采用堿性磷酸酶和抗堿性磷酸鹽(APAAP)方法，對(duì)ED1、CD4和CD8陽性細(xì)胞染色?？笶D1、CD4或CD8的單克隆抗體購(gòu)自QuantumAppligene(Parcd’innovation，illkirch，法國(guó))。通過采用免疫過氧化物酶方法，對(duì)細(xì)胞因子和粘附分子包括IL1，IL2，IL6，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，TNF-α，細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和VCAM-1進(jìn)行染色?？笽L1，IL2，TNF-α，ICAM-1，VCAM-1(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，加拿大)和MCP-1(Pepro Tech，倫敦，英國(guó))的兔抗大鼠多克隆抗體被作為一抗使用。二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔Ig(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)。反應(yīng)使用3，3’二氨基聯(lián)苯胺顯色觀察。
陽性標(biāo)記細(xì)胞量表示為每個(gè)視野(c/FV)細(xì)胞的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)。每個(gè)切片/樣品以放大率400X觀察20個(gè)或更多的視野。粘附因子，細(xì)胞因子和胞外基質(zhì)的表達(dá)被量化為0到4+等級(jí)(4+＝密集)。
逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析依據(jù)廠商說明書，使用RNeasy Total RNA試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國(guó))從組織提取RNA。通過甲醛-瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA量，按上述描述制備cDNA(Azuma，2001)。通過GeneAmp 9600 PCR系統(tǒng)(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)，使用對(duì)MCP-1，TNF-α，IL-6，誘導(dǎo)的氧化氮合酶(iNOS)和β-肌動(dòng)蛋白的引物完成PCR。引物序列，退火溫度和循環(huán)次數(shù)如下MCP-1，5’ATG CAG GTC TCT GTC ACG(SEQ ID NO4)和3’CTA GTT CTC TGT CAT ACT(55℃，33個(gè)循環(huán))；TGF-β1，5’CTG CAGCTC CAC AGA GAA GAA CTG C和3’CAC GAT CAT GTG GGA CAACTG CTC C(SEQ ID NO5)(64℃，28個(gè)循環(huán))；TNF-α，5’TAC TGA ACTTCG GGG TGA TTG GTC C(SEQ ID NO6)和3’CAG CCT TGT CCCTTG AAG AGA ACC(60℃，34個(gè)循環(huán))；IL-1，5’TGA TGT CCC ATT AGACAG C(SEQ ID NO7)和3’GAG GTG CTG ATG TAC CAG TT(55℃，35個(gè)循環(huán))；IL-6，5’CAA GAG ACT TCC AGC CAG TTG C(SEQ ID NO8)和3’TTG CCG AGT AGA CCT CAT AGT GAC C(30個(gè)循環(huán))；iNOS，5’TGC CAG GGT CAC AAC TTT ACA GG(SEQ ID NO9)和3’(35個(gè)循環(huán))；ICAM-1，5’AGA AGG ACT GCT GGG GAA(SEQ ID NO10)和3’CCT CTG GCG GTA ATA GGT G(60℃，28個(gè)循環(huán))；VCAM-1，5’CTGACC TGC TGC TCA AGT GAT CG(SEQ ID NO11)和3’GTG TCT CCCTCT TTG ACG CT(60℃，26個(gè)循環(huán))；β-肌動(dòng)蛋白，5’TTG TAA CCA ACTGGG ACG ATA TGG(SEQ ID NO12)和3’GAT CTT GAT CTT CAT GGTGCT AGG(60℃，23個(gè)循環(huán))。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，使用溴化乙啶染色(0.05mg/mi，染色10分鐘)，紫外燈下觀察條帶。通過掃描光密度計(jì)量學(xué)，使用SCANJET 4c(Hewlett Packerad，Corvallis，OR)Adobe PHOTOSHOP軟件(Adobe Systems，Mountainview，加拿大)檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)模擬和靶cDNA的密度。描繪條帶密度的比例并經(jīng)一系列模板稀釋度以建立一種線性關(guān)系。以樣品和模擬擴(kuò)增子的密度為基礎(chǔ)計(jì)算mRNA表達(dá)每個(gè)結(jié)果表示為樣品與β-肌動(dòng)蛋白的比例。RNA也直接進(jìn)行擴(kuò)增以排除DNA基因組污染。每個(gè)樣品完成2次以上描述的操作。結(jié)果的數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
(統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)對(duì)獲得的尿量和血清肌酐數(shù)值采用單變量方差分析(ANOVA)。通過Kaplan-Meier實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)移植器官存活。使用非配對(duì)學(xué)生t-檢驗(yàn)分析免疫組織化學(xué)的細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)組織學(xué)分析和免疫組織化學(xué)的粘附分子，細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann Whitney-U test分析。RT-PCR結(jié)果采用非重復(fù)的ANOVA分析。如果ANOVA結(jié)果顯著，則使用學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行個(gè)體比較。P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
2.結(jié)果2.1.發(fā)生沒有導(dǎo)致明顯不良反應(yīng)的最大基因轉(zhuǎn)染的條件。
首先，本發(fā)明人檢查了使用螢光素酶報(bào)道基因和FITC標(biāo)記的NF-κB誘餌ODN時(shí)USE對(duì)基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入供體腎臟的功效。結(jié)果顯示在圖1A和1B。USE持續(xù)時(shí)間達(dá)到1分鐘時(shí)，USE成比例地顯著增強(qiáng)螢光素酶報(bào)道基因的轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示在圖1A左邊。NF-κB誘餌ODN的表達(dá)結(jié)果證明它的功效(圖1B)。
圖1B顯示腎臟轉(zhuǎn)染了FITC標(biāo)記的NF-κB誘餌ODN切片的圖片，使用熒光顯微術(shù)觀察。如圖1B顯示，NF-κB誘餌ODN表達(dá)結(jié)果證明它的功效，在同種異體移植物的腎小管細(xì)胞內(nèi)顯示明顯的FITC染色。顯著地，如圖1B顯示，F(xiàn)ITC染色的表達(dá)在腎小球(a)內(nèi)很少，經(jīng)不含Optison的USE處理30秒的腎小管(b)內(nèi)，僅觀察到少量。經(jīng)USE處理1分鐘，在腎小球(c)和腎小管(d)的表達(dá)都增加，在使用Optison時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)，在同種異體移植器官的腎小球(e)和腎小管(f)顯示一種明顯的FITC染色。
再次提及圖1A，當(dāng)使用USE達(dá)到2分鐘或更長(zhǎng)時(shí)，提示有明顯的組織損傷，使用USE達(dá)到1分鐘，沒有觀察到顯著的損傷。因此，本發(fā)明人設(shè)置USE持續(xù)時(shí)間為1分鐘。使用USE時(shí)，本發(fā)明人檢測(cè)超聲波心動(dòng)圖對(duì)比劑，Optison的功效。如圖1A右邊所示，使用Optison可顯著增強(qiáng)螢光素酶報(bào)道基因的基因轉(zhuǎn)染并有劑量依賴效應(yīng)。但是，當(dāng)Optison的濃度是25％時(shí)，發(fā)生明顯的組織損傷，濃度是10％時(shí)，沒有明顯的組織損傷。因此，本發(fā)明人確定灌注液中Optison的濃度為10％，USE的持續(xù)應(yīng)用時(shí)間為1分鐘。
2.2.轉(zhuǎn)染NF-κB誘餌進(jìn)入供體腎臟以延長(zhǎng)動(dòng)物的存活圖2顯示每組動(dòng)物存活的結(jié)果。未經(jīng)任何處理模型的存活時(shí)間穩(wěn)定(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差＝7.5±1.2，n＝10)；所有動(dòng)物第9天死亡。相反，應(yīng)用USE的NF-κB誘餌ODN處理供體腎臟的受體動(dòng)物與所有其它組比較，顯示延長(zhǎng)的動(dòng)物存活。此外，使用對(duì)比劑Optison，增強(qiáng)了USE應(yīng)用在基因轉(zhuǎn)染上的功效，顯著的延長(zhǎng)組1的動(dòng)物存活；該組中，3/10動(dòng)物存活20天或更長(zhǎng)。這些結(jié)果指示使用USE轉(zhuǎn)染NF-κB誘餌ODN進(jìn)入供體腎臟對(duì)于延長(zhǎng)移植存活有益并且使用Optison增強(qiáng)了USE的功效。
2.3.移植功能圖3顯示，在測(cè)試組中移植器官功能檢測(cè)的結(jié)果。競(jìng)爭(zhēng)誘餌(組5)處理的同種異體移植受體顯示移植后第2天，有明顯的血尿。與組1受體比較，此時(shí)尿量顯著減少，如圖3上面圖片顯示(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差＝9.77±3.68和21.81±6.85ml/天，n＝10)。移植器官后第6天，大多數(shù)動(dòng)物變得無尿(1.29±1.12ml/天，n＝9)，而大多數(shù)受體經(jīng)NF-κB誘餌處理的同種異體移植器官后，保持正常的尿量，在第6天，沒有出現(xiàn)明顯的血尿(13.93±6.42ml/天，n＝10)。
如圖3下面圖片所示，血清肌酐水平證實(shí)這些結(jié)果，移植后第2天，與組1受體比較，組5受體的血清肌酐量顯著提高(1.84±0.23mg/天與0.97±0.16mg/天 n＝10)。移植功能的這些數(shù)據(jù)清楚證實(shí)動(dòng)物死于腎移植失敗和延長(zhǎng)生命決定于移植器官的存活。
2.4.NF-κB處理很好地保持了移植器官組織圖4顯示每組移植器官組織。在移植后第2天，從對(duì)照動(dòng)物收獲的同種異體移植器官顯示有大量廣泛的單核細(xì)胞浸潤(rùn)(a)。許多的腎小球顯示明顯單核細(xì)胞浸潤(rùn)和大量系膜基質(zhì)(b)。大多數(shù)腎小管結(jié)構(gòu)畸形并伴有明顯的蛋白質(zhì)沉積和管型(c)。在第4天，細(xì)胞浸潤(rùn)在所有區(qū)域變得更加突出，并有明顯的正常腎臟結(jié)構(gòu)破壞和產(chǎn)生血尿(d)。一些腎小球(e)和腎小管(f)顯示嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)畸形和伴大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)的壞死。在第6天，改變快速出現(xiàn)和惡化，顯示嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)畸形并伴隨廣泛的組織壞死(g)。大多數(shù)腎小球(h)和腎小管(i)被嚴(yán)重的壞死取代。相反，NF-κB誘餌處理的移植器官，在第2天，保持完好，只有少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)(j)。大多數(shù)腎小球沒有明顯改變(k)。腎小管結(jié)構(gòu)大部分保持正常，沒有明顯的蛋白質(zhì)沉淀在移植組織(l)。第4天(m)僅在間質(zhì)中觀察到很少細(xì)胞浸潤(rùn)，大多數(shù)腎小球(n)和腎小管(o)保持完整。在第6天，雖然，盡管在組織中出現(xiàn)可觀數(shù)量的細(xì)胞炎癥(p)，大多數(shù)腎小球(q)和腎小管(r)顯示很小改變。
2.4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析圖5顯示一種RT-PCR分析結(jié)果。圖5顯示的電泳照片顯示組2(給予NF-κB，應(yīng)用USE)和組5(給予競(jìng)爭(zhēng)誘餌，應(yīng)用USE)的RT-PCR分析結(jié)果。如圖5顯示，當(dāng)組5大鼠TGF-β的表達(dá)被抑制時(shí)，觀察組2大鼠IL-1，MCP-1，TNF-α和TGF-β的表達(dá)。因此，證明細(xì)胞因子的產(chǎn)生和粘附分子的表達(dá)在NF-κB處理的供體腎臟被抑制。
以上描述的結(jié)果總結(jié)如下。
本發(fā)明人合成了一種抗NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的異硫氰酸螢光素(FITC)標(biāo)記的順式元件誘餌化合物(NF-κB誘餌)并應(yīng)用超聲處理(USE)用所述的誘餌轉(zhuǎn)染了Wister Firth(WF)腎臟。另外，超聲對(duì)比劑，Optison，進(jìn)一步加強(qiáng)了使用USE的轉(zhuǎn)染，在腎小管和腎小球細(xì)胞顯示顯著的FITC染色。轉(zhuǎn)染了NF-κB誘餌的供體腎臟陽性移植進(jìn)入雙測(cè)腎切除的Lewis受體動(dòng)物。接受了代替NF-κB誘餌的競(jìng)爭(zhēng)誘餌(SD)處理的供體腎臟的受體動(dòng)物作為對(duì)照。
在對(duì)照組，具有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)的明顯腎組織破壞出現(xiàn)在第4天。免疫組織學(xué)和RT-PCR證實(shí)，在移植腎臟中細(xì)胞因子產(chǎn)生和粘附分子表達(dá)的增加。第10天，所有動(dòng)物死于腎臟移植失敗。相反，NF-κB誘餌轉(zhuǎn)染的同種異體移植受體動(dòng)物顯示了延長(zhǎng)的存活，特別是應(yīng)用了USE和Optison后(17.9±8.3(存活的平均天數(shù))和7.7±1.6(對(duì)照組存活的平均天數(shù))，n＝10)。3/10動(dòng)物存活達(dá)20天或更長(zhǎng)。腎臟移植功能和組織學(xué)保持良好(在第4天，血清肌酐＝0.69±0.12和2.45±0.12mg/dl(對(duì)照))，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和粘附分子的表達(dá)明顯減少。
因此，此新的步驟，使用Optison的USE應(yīng)用增強(qiáng)了轉(zhuǎn)染NF-κB誘餌化合物ODN進(jìn)入腎臟移植體并提高動(dòng)物存活，同時(shí)抑制了細(xì)胞因子的產(chǎn)生和粘附分子的表達(dá)。新的方法對(duì)于腎臟同種異體移植是一種新的和有效的策略。
提供以上描述的實(shí)施例闡明本發(fā)明的多個(gè)方面而且并不限制本發(fā)明的范圍。
工業(yè)實(shí)用性對(duì)于器官移植，本發(fā)明提供了一種新的和有效的策略。本發(fā)明提供了一種防止對(duì)移植器官急性排異反應(yīng)和改善其預(yù)后的治療劑和方法。
序列表<110>安琪士多摩奇株式會(huì)社<120>抑制器官移植排異反應(yīng)的組合物及其使用方法<130>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述NF-κB誘餌<300>
<400>1ccttgaaggg atttccctcc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Scramble誘餌<400>2ttgccgtacc tgacttagcc 20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PRE<400>3gatcctgtac aggatgttct agctaca 27<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Mcp-1引物<400>4atgcaggtct ctgtcacg 18<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述TGF-β1引物<400>5ctgcagctcc acagagaaga actgc 25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述TNF-α引物<400>6tactgaactt cggggtgatt ggtcc 25<210>7<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述IL-1引物<400>7tgatgtccca ttagacagc 19<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述IL-6引物<400>8caagagactt ccagccagtt gc 22<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述iNOS引物<400>9tgccagggtc acaactttac agg 23<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述ICAM-l引物<400>10agaaggactg ctggggaa 18<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述VCAM-1引物<400>11ctgacctgct gctcaagtga tcg 23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述β-肌動(dòng)蛋白引物<400>12ttgtaaccaa ctgggacgat atgg 2權(quán)利要求
1.一種用于抑制器官移植排異反應(yīng)的治療劑，其包含一種NF-κB誘餌化合物。
2.權(quán)利要求1的治療劑，其中所述排異反應(yīng)是同種異體移植反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1的治療劑，其中同種異體移植反應(yīng)是急性的。
4.權(quán)利要求1的治療劑，其中所述器官移植是腎臟移植。
5.權(quán)利要求1的治療劑，其進(jìn)一步包含一種超聲檢查對(duì)比劑。
6.權(quán)利要求5的治療劑，其中所述超聲檢查對(duì)比劑包含一種底物，所述的底物選自半乳糖、白蛋白、半乳糖和棕櫚酸、脂質(zhì)體、高分子膜、脂肪酸或乳酸聚合物。
7.權(quán)利要求5的治療劑，其中所述超聲檢查對(duì)比劑是Optison(注冊(cè)商標(biāo))。
8.一種改善器官移植的預(yù)后的治療劑，其包含一種NF-κB誘餌化合物。
9.權(quán)利要求8的治療劑，其中所述治療劑被施用于供體器官，并且所述NF-κB誘餌化合物轉(zhuǎn)染入所述器官的功效通過超聲處理而增強(qiáng)。
10.一種抑制器官移植排異反應(yīng)的方法，包含如下步驟將包含誘餌化合物的治療劑施用于供體器官；和對(duì)含有所述誘餌化合物的所述供體器官進(jìn)行超聲處理。
11.用于改善器官移植的預(yù)后的方法，包含如下步驟將包含誘餌化合物的治療劑施用于供體器官；和對(duì)含有所述誘餌化合物的所述供體器官進(jìn)行超聲處理。
12.一種用于增強(qiáng)寡核苷酸轉(zhuǎn)染入生物組織的方法，包含如下步驟將所述寡核苷酸導(dǎo)入所述生物組織；和對(duì)含有所述寡核苷酸的所述生物組織進(jìn)行超聲處理。
13.權(quán)利要求10到12的方法，其中在存在超聲對(duì)比劑的情況下進(jìn)行所述超聲處理。
全文摘要
本發(fā)明為器官移植提供了一種新的和有效的策略。本發(fā)明提供了一種防止移植的器官發(fā)生急性排異反應(yīng)并改善預(yù)后的治療劑和方法。本發(fā)明提供了一種用于抑制器官移植的排異反應(yīng)的治療劑，其包含一種NF－κB誘餌化合物。典型地，所述器官移植是腎臟移植。所述治療劑進(jìn)一步包含一種超聲檢查對(duì)比劑。本發(fā)明還提供了一種用于改善器官移植的預(yù)后的治療劑。將所述治療劑施用于一種供體器官。通過超聲處理可以提高所述NF－κB誘餌化合物轉(zhuǎn)染所述器官的功效。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1615157SQ0282742
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者森下竜一, 富田奈留也, 荻原俊男, 東治人 申請(qǐng)人:安琪士多摩奇株式會(huì)社