專利名稱：視黃醇衍生物、它們?cè)谥委煱┌Y和增強(qiáng)其它細(xì)胞毒性劑功效中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本身具有治療特性并能增強(qiáng)例如用于治療癌癥的細(xì)胞毒性化合物等其它治療活性化合物功效的新型化合物。所述新型化合物本身已顯示出具有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制特性。除此之外，令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)這些化合物能夠制備溶解性差的化合物的新型制劑，所述溶解性差的化合物在本文中以多西他賽和紫杉醇等溶解性差的細(xì)胞毒性化合物為例，所述制劑表現(xiàn)出改進(jìn)的溶解性和治療功效。也發(fā)現(xiàn)所述化合物能夠制備多柔比星和米托蒽醌等其它細(xì)胞毒性化合物的新型制劑，所述制劑表現(xiàn)出改進(jìn)的治療功效。此外，已發(fā)現(xiàn)在鹽水中在鈣存在下，本發(fā)明的化合物、特別是本發(fā)明化合物相應(yīng)的順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體表現(xiàn)出治療特性。
背景技術(shù)：
多西他賽是紫杉類(taxoid)家族的代表之一。[(2R，3S)-N-羧基-3-苯基異絲氨酸N-叔丁酯與5β-20-環(huán)氧基-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸酯2-苯甲酸酯形成的13-酯三水合物，是Taxotere_(Rhone-Poulenc Rorer，Collegeville，PA，USA)的活性成分]。所述化合物可從紫杉植物可再生松針中天然存在的它的化學(xué)前體經(jīng)合成而制備。
多西他賽是治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的最有效藥物。目前，實(shí)際使用已證實(shí)多西他賽對(duì)以下癌癥也具有高活性非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、頭頸部癌和胃癌；以及黑素瘤和軟組織肉瘤。它促進(jìn)微管的組裝并穩(wěn)定微管，因此抑制其解聚。多西他賽與蛋白高度結(jié)合，所述蛋白即α1-酸性糖蛋白、白蛋白和脂蛋白。其藥代動(dòng)力學(xué)特征是起先多西他賽迅速分布到周邊區(qū)室，而在后一階段多西他賽從所述周邊區(qū)室中緩慢排出。
多西他賽高度親脂，水溶性差。Taxotere_是含有20mg(0.5mL)或80mg(2.0mL)多西他賽(無(wú)水)的單劑量小瓶的制劑。該產(chǎn)品每毫升含有40mg多西他賽(無(wú)水)和1040mg聚山梨酯80。Taxotere_的稀釋劑含有溶于注射用水的13％乙醇。
Taxotere_的安全模式包括治療前用藥方案。所有患者應(yīng)在治療前給予口服皮質(zhì)類固醇，以降低液體潴留和超敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度。其它次要副作用包括神經(jīng)毒性、皮膚反應(yīng)、脫發(fā)和衰弱。
目前，多西他賽挑戰(zhàn)了老藥物在治療癌癥中的作用，目前在其它化學(xué)治療失敗后被批準(zhǔn)。例如，已證明多西他賽是針對(duì)肝轉(zhuǎn)移癌的最有效藥物。在臨床試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者表現(xiàn)出對(duì)劑量為100mg/m2的一線多西他賽治療的響應(yīng)率超過(guò)劑量＜250mg/m2的紫杉醇的響應(yīng)率。
多柔比星和紫杉醇聯(lián)用已進(jìn)入治療乳腺癌患者的臨床試驗(yàn)。有理由假定紫杉醇和多柔比星之間的藥代動(dòng)力學(xué)相互作用能加強(qiáng)蒽環(huán)類心臟毒性。相比之下，多西他賽不影響多柔比星的藥代動(dòng)力學(xué)。因此，多西他賽是臨床試驗(yàn)中與多柔比星聯(lián)用的首選候選藥(C.L.Vogel，J-M.Nabholtz，The Oncologist，1999，第4卷，第17-33頁(yè)；J.E.Cortes，R.Pazdur，J.Clin.Oncology，1995，第13卷，第2643-2655頁(yè))。
多柔比星是蒽環(huán)類水溶性抗生素，一直都是治療各種實(shí)體瘤和造血細(xì)胞腫瘤的一線化療的重要藥物。多柔比星是從波賽鏈霉菌青灰亞種(Streptomyces peucetius var.caesius)中分離的。多柔比星的化學(xué)名稱為{(8S，10S)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來(lái)蘇-吡喃己糖基)氧基]-8-乙醇酰基-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-萘二酮鹽酸鹽，是Adriamycin_(Pharmacia，Sweden)的活性成分}。Adriamycin_干品含有50mg鹽酸多柔比星、250mg乳糖一水合物、5mg對(duì)羥基苯甲酸甲酯。
多柔比星的功效因其劑量限制性毒性、慢性或急性心臟毒性以及自發(fā)性或獲得性抗性而復(fù)雜化。需要強(qiáng)調(diào)的是，多柔比星對(duì)磷脂有一定親和力，并且抗性的發(fā)展看來(lái)與某些膜改變相關(guān)。目前，認(rèn)為多柔比星的抗增殖效應(yīng)和細(xì)胞毒性效應(yīng)與DNA合成抑制、自由基形成和脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA結(jié)合和DNA交聯(lián)、直接膜效應(yīng)相關(guān)。
將多柔比星用于乳腺癌治療聯(lián)合方案中的試驗(yàn)已表現(xiàn)出對(duì)患有轉(zhuǎn)移癌疾病的婦女的適度存活率。
不管是內(nèi)在還是獲得性抗藥性都是該化合物在乳腺癌治療中臨床失敗的基本原因。然而，匯集了迄今為止的大量臨床經(jīng)驗(yàn)表明，對(duì)大多數(shù)蒽環(huán)類抗生素敏感性腫瘤來(lái)說(shuō)，多柔比星仍為耐受良好的和有效的藥物(D.A.Gewirtz，Biochem.Pharmacol.，1999，第57卷，第7期，第727-741頁(yè)；Vogel和Nabholtz，參見(jiàn)上文)。
米托蒽醌是衍生自具有多柔比星結(jié)構(gòu)相似性的蒽醌染料阿美蒽醌的合成蒽二酮類細(xì)胞毒性劑。其作用機(jī)制類似于蒽環(huán)類抗生素。米托蒽醌嵌入DNA中并抑制DNA合成。所述藥物的抗腫瘤活性也是因?yàn)槠渑cDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的相互作用。
米托蒽醌是Novantrone_(Wyeth Lederle)中的活性成分。Novantrone_用于輸注的濃度為2mg/ml。每ml濃度含有2mg鹽酸米托蒽醌、8mg氯化鈉、0.05mg乙酸鈉、0.46mg乙酸和0.15mg硫酸鈉。米托蒽醌在治療白血病、淋巴瘤和乳腺癌中表現(xiàn)出臨床功效。它也對(duì)肝癌、晚期卵巢癌和激素抗性前列腺癌的姑息治療有效。
米托蒽醌累積劑量可引起心臟毒性和免疫抑制。有過(guò)蒽環(huán)類治療史的患者可罹患充血性心力衰竭(D.Faulds等，Drugs，1991，第41卷，第3期，第400-449頁(yè))。
抗擊癌癥的現(xiàn)代趨勢(shì)正在挑戰(zhàn)患者治療中單一療法的主要作用。臨床經(jīng)驗(yàn)提示聯(lián)合療法在輔助治療中的巨大潛力。然而，對(duì)于輔助治療，有效治療選擇的產(chǎn)生需要開(kāi)發(fā)出水不溶性化合物的新制劑策略，以便最大發(fā)揮藥物的潛力。
在過(guò)去幾年中，已使用基于營(yíng)養(yǎng)乳劑產(chǎn)品的藥物制劑。所述制劑需要要用大量的載藥量來(lái)調(diào)節(jié)并補(bǔ)充乳化劑。所述制劑必須嚴(yán)格限定液滴大小分布。這使制備復(fù)雜化，并且需要對(duì)液體乳劑進(jìn)行高壓勻漿。此外，需要解決若干技術(shù)難題，諸如長(zhǎng)期穩(wěn)定性和消除藥物在稀釋中沉淀的可能性(L.Collins-Gold等，Modern Drug Discovery，2000，第3頁(yè)，第3期，第44-46，48頁(yè))。
在同時(shí)待審的申請(qǐng)(US 10/098,873和PCT/SE02/00380)中，本發(fā)明人已經(jīng)公開(kāi)了N-視黃?；?L-半胱磺酸、N-視黃酰基-L-高半胱磺酸、N-視黃?；?L-半胱亞磺酸以及這些化合物的鈉鹽。
在本專利申請(qǐng)中，本發(fā)明人公開(kāi)了N-視黃?；?L-半胱磺酸、N-視黃酰基-L-高半胱磺酸、N-視黃酰基-L-半胱亞磺酸的新型異構(gòu)體、它們的酯和酰胺及其鹽。這些新型化合物都表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制特性，除此之外，也使得制備紫杉醇和多西他賽等水溶性差的細(xì)胞毒性化合物的新型膠束制劑(所述制劑表現(xiàn)出改進(jìn)的溶解性和治療功效)和多柔比星和米托蒽醌的新型膠束制劑(所述制劑證明改進(jìn)的治療功效)成為可能。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一組如本文所附權(quán)利要求書中定義的以下新型化合物N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸(I-1)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸(II-1)、N-(全反式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(I-2)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(II-2)、N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(I-3)、N-(13-順式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(II-3)和這些化合物的鈉鹽以及它們的酯和酰胺的鈉鹽，所述化合物本身具有治療作用，而且所述化合物與多西他賽、紫杉醇、多柔比星和米托蒽醌等細(xì)胞毒性化合物聯(lián)用，具有協(xié)同作用。此外，本發(fā)明公開(kāi)了溶解性差的藥物(諸如多西他賽和紫杉醇)的水溶性制劑的制備方法，所述制劑表現(xiàn)出增強(qiáng)的藥理學(xué)活性；并且公開(kāi)了水溶性藥物(諸如多柔比星和米托蒽醌)制劑的制備方法，所述制劑表現(xiàn)出改進(jìn)的治療功效。本發(fā)明也提供了用于治療癌癥的方法，其中將溶于含有鈣離子并富含鈉離子的水性介質(zhì)中的本發(fā)明化合物和制劑給予患者。本發(fā)明也提供包含在鈣存在下溶于鹽溶液的至少一種本發(fā)明化合物、最好一種所述化合物的兩種相應(yīng)的順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體的新型藥用組合物，所述異構(gòu)體能與鈣形成絡(luò)合物。
發(fā)明描述在同時(shí)待審的申請(qǐng)(US 10/098,873和PCT/SE02/00380)中，本發(fā)明人已經(jīng)證明N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸(I-1)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸(II-1)、N-(全反式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(I-2)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(II-2)、N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(I-3)和N-(13-順式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸(II-3)能增加紫杉醇的溶解度，以及提高其治療功效。
現(xiàn)在，本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)一組新型酯(I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b)的鈉鹽和這些化合物的酰胺(I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)的鈉鹽具有相同特性。
這些化合物的通用結(jié)構(gòu)式和各自合成的化合物的結(jié)構(gòu)式如下所示
其中 R2＝OH、ONa、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OX，其中X為C1-C4烷基。
以上通式范圍內(nèi)的單個(gè)化合物已經(jīng)由本發(fā)明人合成，并制備其衍生物。這些化合物的實(shí)例如下給出。
首先，一組N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸衍生物示例如下 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸
N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸甲酯 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸乙酯 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸異丙酯 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸丙酯 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸丁酯
N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸酰胺 (N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸甲基酰胺 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸二甲基酰胺。
本發(fā)明也包括以上示例的這些化合物(I-1，I-1a-I-1h)的鈉鹽，以及該通式所包括的所有化合物的鈉鹽。本發(fā)明也包括以下化合物(I-2)及其衍生物 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱亞磺酸。
本發(fā)明也包括以上化合物(I-2)的鈉鹽。
本發(fā)明也包括以下化合物(I-3，I-3a，I-3f)及其衍生物
N-(全反式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸 N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸甲酯 N-(全反式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸酰胺。
本發(fā)明也包括以上示例的這些化合物(I-3，I-3a，I-3f)的鈉鹽，以及該通式所包括的所有化合物的鈉鹽。
此外，本發(fā)明包括一組N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱磺酸衍生物(II-1，II-1a-II-1f)
N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸甲酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸乙酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸異丙酯
N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱磺酸丙酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸丁酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸酰胺。
本發(fā)明也包括以上示例的這些化合物(II-1，II-1a-II-1f)的鈉鹽，以及該通式所包括的所有化合物的鈉鹽。
此外，本發(fā)明包括以下化合物(II-2)及其衍生物。
N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱亞磺酸。
本發(fā)明也包括以上化合物(II-2)的鈉鹽。
本發(fā)明也包括以下化合物(II-3，II-3b)及其衍生物 N-(13-順式-視黃?；?-L-高半胱磺酸 N-(13-順式-視黃?；?-L-高半胱磺酸乙酯。
本發(fā)明也包括以上示例的以上化合物(II-3，II-3b)的鈉鹽，以及該通式所包括的所有化合物的鈉鹽。
本發(fā)明提供所述通式定義的化合物、特別是以上示例的化合物、它們的鈉鹽或其衍生物在制備藥物中的用途。本發(fā)明也提供所述通式定義的化合物、特別是以上示例的化合物、它們的鈉鹽或其衍生物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
此外，本發(fā)明提供一種藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的活性物質(zhì)和一種如所述通式定義的化合物、特別是以上示例的化合物、它們的鈉鹽或其衍生物。具體地講，本發(fā)明提供一種藥用組合物，其中所述活性物質(zhì)是細(xì)胞毒性化合物，而所述增效化合物是一種上述化合物、它們的鈉鹽或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述活性物質(zhì)是多西他賽、紫杉醇、多柔比星和米托蒽醌。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于提高藥用活性物質(zhì)功效的方法，其中所述物質(zhì)是以含有至少一種上述化合物、它們的鈉鹽或其衍生物的膠束形式制備的。
另一個(gè)實(shí)施方案是用于增加藥用活性物質(zhì)溶解度的方法，其中所述物質(zhì)是以含有至少一種上述化合物、它們的鈉鹽或其衍生物的膠束形式制備的。
又一個(gè)實(shí)施方案是用于改進(jìn)藥用活性物質(zhì)生物利用度的方法，其中所述物質(zhì)是以含有至少一種上述化合物、它們的鈉鹽或其衍生物的膠束形式制備的。
本發(fā)明也提供一種新型藥用組合物，其中至少一種上述化合物、最好是一種上述化合物相應(yīng)的順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體、它們的鈉鹽或其衍生物是在鹽水中在鈣離子存在下存在。所述制劑在本說(shuō)明書和實(shí)施例中進(jìn)一步公開(kāi)，已證明它們表現(xiàn)出驚人的特性。因此，本發(fā)明也提供用于治療癌癥的方法，其中將溶于含有鈣離子并富含鈉離子的水性介質(zhì)中的至少一種上述化合物或上述化合物的兩種順?lè)串悩?gòu)體、它們的鈉鹽或其衍生物給予患者。鈣的用量?jī)?yōu)選相當(dāng)于約2.2-2.6mmol/L(8.8-10.4mg/dL)之間的CaCl2濃度或者最優(yōu)選2.3mmol/L的CaCl2濃度。
本發(fā)明也提供用于治療癌癥的方法，其中至少一種細(xì)胞毒性物質(zhì)與至少一種上述化合物或上述化合物的兩種順?lè)串悩?gòu)體、它們的鈉鹽或其衍生物混合并以溶于含有鈣離子并富含鈉離子的水性介質(zhì)形式給予患者。具體地講，本發(fā)明涉及所述方法，其中至少一種細(xì)胞毒性物質(zhì)選自多西他賽、紫杉醇、多柔比星和米托蒽醌。
本發(fā)明人已證明溶解性差的化合物多西他賽和紫杉醇可溶于以下的膠束中N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸(I-1)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸(II-1)、N-(全反式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(I-2)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(II-2)、N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(I-3)、N-(13-順式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(II-3)、它們的酯(I-1a-I-1e，I-3a；II-1a II-1e，H-3b)的鈉鹽和它們的酰胺(I-If-I-1h，I-3f，II-1f)的鈉鹽，產(chǎn)生混合膠束。這樣，以混合膠束形式存在的多西他賽和紫杉醇在鹽水中可達(dá)到良好的溶解度。
在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231培養(yǎng)物中，對(duì)呈鈉鹽形式的濃度范圍在10-9-10-7M的化合物(I-1a-I-1h，I-3a，I-3f；II-1a-II-1f，II-3b)進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，揭示出以下依從關(guān)系本發(fā)明化合物濃度增加導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的加強(qiáng)，對(duì)于化合物I-1a和II-1a達(dá)到接近47％的值；對(duì)于化合物I-1b和II-1b達(dá)到接近48％的值；對(duì)于化合物I-1c和II-1c達(dá)到接近50％的值；對(duì)于化合物I-1d和II-1d達(dá)到接近54％的值；對(duì)于化合物I-1e和II-1e達(dá)到接近54％的值；對(duì)于化合物I-1f和II-1f達(dá)到接近53％的值；對(duì)于化合物I-1g達(dá)到接近43％的值；對(duì)于化合物I-1h達(dá)到接近46％的值；對(duì)于化合物I-3a達(dá)到接近49％的值；對(duì)于化合物I-3f達(dá)到接近55％的值；對(duì)于化合物II-3b達(dá)到接近62％的值。
化合物I-1和II-1的鈉鹽可轉(zhuǎn)變成所述化合物相應(yīng)的酸形式并溶于甲醇中，以便制備多西他賽/化合物I-1制劑、多西他賽/化合物II-1制劑和紫杉醇/化合物II-1制劑。
多西他賽/化合物(I-1和II-1)制劑對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近86％(相比之下，作為陽(yáng)性對(duì)照的多西他賽單用接近48％)。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在多西他賽/化合物I-1制劑和多西他賽/化合物II-1制劑中，多西他賽所需濃度比多西他賽單用要低5倍以上。
紫杉醇/化合物II-1制劑對(duì)人卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近84％(相比之下，作為陽(yáng)性對(duì)照的紫杉醇單用接近44％)。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在紫杉醇/化合物II-1制劑中，紫杉醇所需濃度比紫杉醇單用要低3倍以上。
在多西他賽和化合物(I-1a-I-1c，II-1a-II-1c)鈉鹽制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，紫杉醇和化合物II-1a鈉鹽制劑表現(xiàn)出以下效果多西他賽/化合物(I-1a和II-1a)制劑對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系DU 145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近88％(相比之下，作為陽(yáng)性對(duì)照的多西他賽單用接近53％)；多西他賽/化合物(I-1b和II-1b)制劑對(duì)人卵巢腺癌細(xì)胞系SCOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近84％(相比之下，多西他賽接近51％)；而多西他賽/化合物(I-1c和II-1c)制劑對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近88％(相比之下，多西他賽接近40％)。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在多西他賽/化合物(I-1a-I-1c和II-1a-II-1c)制劑中，多西他賽所需濃度比多西他賽單用約低2-5倍。
紫杉醇/化合物II-1a制劑對(duì)人卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近82％(相比之下，作為陽(yáng)性對(duì)照的紫杉醇單用接近39％)。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在紫杉醇/化合物II-1a制劑中，紫杉醇所需濃度比紫杉醇單用低2.8倍。
在多柔比星和化合物(I-1d和II-1d)鈉鹽制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，表現(xiàn)出以下效果多柔比星/化合物(I-1d和II-1d)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近76％(相比之下，多柔比星接近48％)。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在多柔比星/化合物I-1d制劑和多柔比星/化合物II-1d制劑中，多柔比星所需濃度比多柔比星單用約低5-6倍。
在米托蒽醌和化合物(I-1e，I-1f，II-1e和II-1f)鈉鹽制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，表現(xiàn)出以下效果米托蒽醌/化合物(I-1e和II-1e)制劑對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近78％(相比之下，米托蒽醌接近47％)；米托蒽醌/化合物(I-1f和H-1f)制劑對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系DU 145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制接近80％(相比之下，米托蒽醌接近52％)。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在米托蒽醌/化合物(I-1e和II-1e)制劑中米托蒽醌所需濃度比米托蒽醌單用低12-20倍。要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在米托蒽醌/化合物(I-1f和II-1f)制劑中米托蒽醌所需濃度比米托蒽醌單用低4-6倍。
如下制備以下本發(fā)明化合物和多西他賽或紫杉醇制劑N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸(I-1)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸(11-1)、N-(全反式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(I-2)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸(II-2)、N-(全反式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸(1-3)、N-(13-順式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(II-3)、這些化合物的鈉鹽、它們的酯(I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b)的鈉鹽、它們的酰胺(I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)的鈉鹽。
首先，制備溶于乙醇(或其它脂族醇)的合適濃度的多西他賽或紫杉醇和任一本發(fā)明的化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)溶液。然后，將這些溶液部分混合，以形成具有所需摩爾比的多西他賽/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)或紫杉醇/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)的混合膠束溶液。攪拌后，將有機(jī)溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。所得溶液經(jīng)22μm除菌濾器過(guò)濾并凍干，得到干形式的制劑。
在混合膠束系統(tǒng)中以干形式存在的多西他賽/化合物制劑和紫杉醇/化合物制劑在足夠的待用周期內(nèi)顯示出穩(wěn)定性。在4℃下貯存6個(gè)月期間活性成分濃度沒(méi)有變化。在4℃下貯存6個(gè)月后用水或鹽水重建多西他賽/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)制劑和紫杉醇/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)制劑，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞系表現(xiàn)出不變的細(xì)胞毒性作用。
如下制備多柔比星/化合物制劑或米托蒽醌/化合物制劑將以下化合物的水-醇儲(chǔ)液部分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸(I-1)、N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸(II-1)、N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱亞磺酸(I-2)、N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱亞磺酸(II-2)、N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸(I-3)、N-(13-順式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸(II-3)、這些化合物的鈉鹽、它們的酯(I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b)的鈉鹽，它們的酰胺(I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)的鈉鹽。將所得干燥膜狀物溶于水中。將所得溶液與等分的多柔比星水溶液混合或者與等分的米托蒽醌水溶液混合，以形成具有所需摩爾比的多柔比星/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)或米托蒽醌/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)的混合膠束溶液。每種溶液經(jīng)22μm除菌濾器過(guò)濾并凍干，得到干形式的制劑。在混合膠束系統(tǒng)中以干形式存在的多柔比星/化合物制劑和米托蒽醌/化合物制劑在足夠的待用周期內(nèi)顯示出穩(wěn)定性。在4℃下在6個(gè)月貯存期間活性成分濃度沒(méi)有變化。在4℃下6個(gè)月貯存期后用水重建多柔比星/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)制劑和米托蒽醌/化合物(I-1-I-3，II-1-II-3或這些化合物的鈉鹽；I-1a-I-1e，I-3a；II-1a-II-1e，II-3b；I-1f-I-1h，I-3f，II-1f)制劑，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞系表現(xiàn)出不變的細(xì)胞毒性作用。
用本發(fā)明化合物原液連續(xù)稀釋后加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，進(jìn)行本發(fā)明化合物的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)。通過(guò)用含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)連續(xù)稀釋它們的原液，示例了鈣離子對(duì)所述化合物本身細(xì)胞毒性和對(duì)所述制劑細(xì)胞毒性的影響。
選用2.3mM的CaCl2濃度，是因?yàn)楸娝苤搜逯锌傗}維持在2.2-2.6mmol/L(8.8-10.4mg/dL)之間。
將呈鈉鹽形式的化合物(I-1，I-1f-I-1h，I-3f；II-1，II-1a，II-1f，II-3b)的原液在(A)和(B)中稀釋至濃度范圍在10-9-10-7M，在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231培養(yǎng)物中對(duì)它們進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)比較性試驗(yàn)，得出以下結(jié)果本發(fā)明化合物濃度增加導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的增加，對(duì)于(B)中的化合物I-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)到接近31％的值，而對(duì)于(A)中的化合物I-1接近41.5％的值(相比之下，B中的化合物I-1接近15％)；對(duì)于(B)中的化合物I-1f接近45％的值，而對(duì)于(A)中的化合物I-1f接近53％的值(相比之下，B中的化合物I-1f接近15％)；對(duì)于(B)中的化合物I-1g接近23％的值，而對(duì)于(A)中的化合物I-1g接近43％的值(相比之下，B中的化合物I-1g接近26.5％)；對(duì)于(B)中的化合物I-1h接近26％的值，而對(duì)于(A)中的化合物I-1h接近42％的值(相比之下，B中的化合物I-1h接近21％)；對(duì)于(B)中的化合物I-3f接近41％的值，而對(duì)于(A)中的化合物I-3f接近54％的值(相比之下，B中的化合物I-3f接近22％)；對(duì)于(B)中的化合物II-1接近32％的值，而對(duì)于(A)中的化合物II-1接近43％的值(相比之下，B中化合物II-1接近15.5％)；對(duì)于(B)中的化合物II-1a接近40.5％的值，而對(duì)于(A)中的化合物II-1a接近49％的值(相比之下，B中化合物II-1a接近14％)；對(duì)于(B)中的化合物II-1f接近46％的值，而對(duì)于(A)中的化合物II-1f接近54％(相比之下，B中化合物II-1f接近15％)；對(duì)于(B)中的化合物II-3b接近44％的值，而對(duì)于(A)中的化合物II-3b接近60.5％的值(相比之下，B中的化合物II-3b接近29％)。
將呈鈉鹽形式的化合物II-1a的原液在(A)和(B)中稀釋至濃度范圍在10-9-10-7M，在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549培養(yǎng)物中對(duì)它們進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)比較性試驗(yàn)，得出以下結(jié)果本發(fā)明化合物濃度增加導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的增加，對(duì)于(B)中的化合物II-1a細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)到接近26％的值，而對(duì)于(A)中的化合物II-1a接近34％的值(相比之下，B中的化合物II-1接近12％)。
將多西他賽/化合物(I-1a+II-1a)制劑、紫杉醇/化合物I-1制劑、紫杉醇/化合物(I-1a+II-1a)制劑、多柔比星/化合物(I-1a+II-1a)制劑、多柔比星/化合物I-1f制劑的原液在(A)和(B)和(C)中稀釋至濃度范圍在10-9-10-7M，在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231培養(yǎng)物中對(duì)它們進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)比較性試驗(yàn)，得出以下結(jié)果多西他賽濃度為10-7M的多西他賽/化合物(I-1a+II-1a)制劑細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在(A)中接近86％(相比之下，多西他賽單用接近41％)，在(B)中接近81％(相比之下，多西他賽單用接近18％)，在(C)中接近86.5％(相比之下，多西他賽單用接近43％)；紫杉醇濃度為10-7M的紫杉醇/化合物I-1制劑在(A)中接近83％(相比之下，紫杉醇單用接近39％)，在(B)中接近79％(相比之下，紫杉醇單用接近26％)，在(C)中接近84％(相比之下，紫杉醇單用接近42％)；紫杉醇濃度為10-7M的紫杉醇/化合物(I-1a+II-1a)制劑在(A)中接近84％(相比之下，紫杉醇單用接近45％)，在(B)中接近79％(相比之下，紫杉醇單用接近25％)，在(C)中接近85％(相比之下，紫杉醇單用接近48％)；多柔比星濃度為10-7M的多柔比星/化合物(I-1a+II-1a)制劑在(A)中接近77％(相比之下，多柔比星單用接近48％)，在(B)中接近66％(相比之下，多柔比星單用接近25％)，在(C)中接近78％(相比之下，多柔比星單用接近51％)；多柔比星濃度為10-7M的多柔比星/化合物I-1f制劑在(A)中接近81％(相比之下，多柔比星單用接近58％)，在(B)中接近70％(相比之下，多柔比星單用接近33％)，在(C)中接近82％(相比之下，多柔比星單用接近60％)。
要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在(A)中、(B)中、(C)中的多西他賽/化合物(I-1a+II-1a)制劑中，多西他賽所需濃度分別比多西他賽單用要低約5.7倍、低約3.3倍、低約7.7倍。
要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在(A)中、(B)中、(C)中的紫杉醇/化合物I-1制劑中，紫杉醇所需濃度分別比紫杉醇單用要低約11.3倍、低約2.8倍、低約14.1倍。
要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在(A)中、(B)中、(C)中的紫杉醇/化合物(I-1a+II-1a)制劑中，紫杉醇所需濃度分別比紫杉醇單用要低約7.7倍、低約2.1倍、低約10.0倍。
要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在(A)中、(B)中、(C)中的多柔比星/化合物(I-1a+II-1a)制劑中，多柔比星所需濃度分別比多柔比星單用要低約18.2倍、低約2.8倍、低約34.4倍。
要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在(A)中、(B)中、(C)中的多柔比星/化合物I-1f制劑中，多柔比星所需濃度分別比多柔比星單用要低約17.3倍、低約3.0倍、低約30.5倍。
將多西他賽/化合物(I-1a+II-1a)制劑的原液在(A)和(B)和(C)中稀釋至濃度范圍在10-9-10-7M，在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549培養(yǎng)物中對(duì)它們進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)比較性試驗(yàn)，得出以下結(jié)果多西他賽濃度為10-7M的多西他賽制劑細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在(A)中接近88％(相比之下，多西他賽單用接近44％)，在(B)中接近85％(相比之下，多西他賽單用接近23％)，在(C)中接近88％(相比之下，多西他賽單用接近41％)。
要想表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制達(dá)50％的相同效果，在(A)中、(B)中、(C)中的多西他賽/化合物(I-1a+II-1a)制劑中，多西他賽所需濃度分別比多西他賽單用要低約2.2倍、低約1.5倍、低約2.2倍。
將本發(fā)明化合物本身和所述制劑原液在生理鹽水和含2.3mMCaCl2的鹽水中稀釋，對(duì)它們進(jìn)行細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)，表現(xiàn)出與最后的溶媒相關(guān)的驚人效果。在最后這種情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的平均值接近用培養(yǎng)基稀釋后的所述化合物和所述制劑活性的結(jié)果。在這種關(guān)系中，有必要強(qiáng)調(diào)的是，本文公開(kāi)的實(shí)施例中所用的所有培養(yǎng)基都含有Ca2+離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了Ca2+離子對(duì)本發(fā)明化合物的治療活性、特別是抗腫瘤活性的重要作用。富含鈉離子也含少量鈣離子的水性介質(zhì)對(duì)本發(fā)明化合物細(xì)胞毒性創(chuàng)造了最佳條件。
本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)易于Ca2+的結(jié)合?；衔颕-1、I-2、I-3和II-1、II-2、II-3的鈉鹽含有磺酸基團(tuán)或亞磺酸基團(tuán)和羧酸基團(tuán)，在約生理pH的水性介質(zhì)中主要以中和Na+離子的共軛堿形式存在?；衔颕-1f-I-1h、II-1f、I-3f的鈉鹽含有中和Na+離子的磺酸基團(tuán)和甲酰胺基團(tuán)?；衔颕-1a-I-1e、II-1a-II-1e、I-3a和II-3b的鈉鹽含有中和Na+離子的磺酸基團(tuán)和酯基。在富含鈉離子的介質(zhì)中，少量鈣離子可形成鈣-螯形(helate)絡(luò)合物，其包含至少一個(gè)和/或兩個(gè)本發(fā)明化合物的分子和結(jié)合的金屬原子。螯合作用是指配體的兩個(gè)或多個(gè)供體原子與中心金屬原子的配位作用。所得絡(luò)合物具有穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性部分來(lái)自有利的熵因子伴隨水分子從配位層中釋放。
為了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有活性，以不穩(wěn)定的鈣-螯形絡(luò)合物形式存在的本發(fā)明化合物需要在與一個(gè)金屬原子的配位中包括每個(gè)配體的順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體，也就是說(shuō)，全反式-視黃?；?L-半胱磺酸和13-順式-視黃?；?L-半胱磺酸；全反式-視黃?；?L-半胱磺酸甲酯和13-順式-視黃?；?L-半胱磺酸甲酯；全反式-視黃酰基-L-半胱磺酸酰胺和13-順式-視黃?；?L-半胱磺酸酰胺等等。眾所周知，Ca2+離子易于形成高配位數(shù)和不規(guī)則配位幾何學(xué)。
本發(fā)明的化合物本身具有低毒性。在大鼠中進(jìn)行了腹膜內(nèi)單劑量毒性研究。劑量水平為100mg/kg體重的化合物(I-1、I-2、II-3、I-1a、II-1a、I-1f、I-1h、II-1f、I-3a、I-3f、II-3b)都不導(dǎo)致死亡。因此，對(duì)于這些化合物來(lái)說(shuō)，最小致死劑量大于100mg/kg體重。
本發(fā)明的化合物可以照原樣使用或作為藥用組合物的組分使用。所述化合物可系統(tǒng)給予或局部給予。所述化合物本身和在藥用組合物中所述化合物的合適給藥模式包括靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥。所述化合物的口服、直腸和經(jīng)皮給藥是合適而有效的。所述化合物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可表現(xiàn)出高活力，而且口服、直腸和經(jīng)皮給藥僅需要低劑量的化合物就能得到高響應(yīng)率。在患者治療中為了獲得最佳結(jié)果，所述化合物本身和以藥用制劑形式存在的所述化合物都必須溶于富含鈉離子并含有少量鈣離子的水性介質(zhì)中。
實(shí)施例材料與方法全反式-視黃酸、13-順式-視黃酸和L-半胱磺酸、L-半胱亞磺酸、L-高半胱磺酸購(gòu)自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA。所有其它化學(xué)試劑和溶劑購(gòu)自Aldrich Chemical Co.。
1H-NMR譜用Varian Unity-400分光計(jì)、在400MHz進(jìn)行記錄。DMSO-d6用作溶劑。
Merck硅膠60預(yù)包埋板用于薄層色譜(TLC)并在含有氯仿-甲醇(4∶1，v/v)的溶劑系統(tǒng)中展層。通過(guò)噴灑溶于甲醇的10％H2SO4后加熱至150℃，用碘染色并在紫外光(λ366nm)下檢測(cè)，可檢測(cè)TLC板上的化合物。
合成的化合物的濃度檢驗(yàn)可通過(guò)紫外光譜(Shimadzu UV-mini-1240分光光度計(jì)，λ÷250-500nm，EtOH)進(jìn)行，對(duì)于全反式-視黃酸衍生物λ最大348-350nm，ε45000；對(duì)于13-順式-視黃酸衍生物λ最大348-350nm，ε37000。用紫外光譜檢測(cè)的濃度等于樣品重量。
將合成的化合物溶于氯仿、乙醇、甲醇和70％乙醇水溶液中。所有合成步驟都在干燥氮?dú)夥障逻M(jìn)行。
4種人腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞都購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville，MD，USA)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(ATCC-HTB-26，批號(hào)1227150)、人前列腺癌細(xì)胞系DU 145(ATCC-HTB-81，批號(hào)1391494)、人卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV-3(ATCC-HTB-77，批號(hào)1658010)和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC-CCL-185，批號(hào)1388888)。
MDA-MB-231細(xì)胞在含有2mM L-谷氨酰胺、10％熱滅活胎牛血清(FBS)和抗生素的MEM培養(yǎng)基中增殖。DU 145細(xì)胞在含有2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、10％FBS和抗生素的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。SKOV-3細(xì)胞在補(bǔ)充了1,5mM L-谷氨酰胺、10％FBS和抗生素的McCoy 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)。A549細(xì)胞在含有1mM L-谷氨酰胺、10％FBS和抗生素的Ham F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基和補(bǔ)充成分都購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。所有細(xì)胞系的細(xì)胞增殖都在FalconTM25cm2培養(yǎng)瓶(Becton Dickinson Labware)中進(jìn)行。
采用供貼壁細(xì)胞用的Falcon 96孔培養(yǎng)板(Becton DickinsonLabware)，進(jìn)行藥物細(xì)胞毒性試驗(yàn)。細(xì)胞以12×103MDA-MB-231細(xì)胞/孔、或12×103DU 145細(xì)胞/孔、或14×103SKOV-3細(xì)胞/孔、或10×103A549細(xì)胞/孔的量、以200μL/孔的體積接種這些培養(yǎng)板。
培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板都在37℃、在95％空氣和5％CO2的增濕氣氛中保溫。
培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)物在24小時(shí)培養(yǎng)中允許貼壁。在細(xì)胞接種后第1天，向培養(yǎng)物中加入溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的2μL待測(cè)藥物溶液。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2天。在培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化分散，用錐蟲(chóng)藍(lán)排除試驗(yàn)和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)。所有數(shù)據(jù)來(lái)自3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。結(jié)果表示為平均細(xì)胞數(shù)±SE，并通過(guò)學(xué)生t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)系列與對(duì)照間的差異。根據(jù)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度來(lái)評(píng)價(jià)藥物細(xì)胞毒性。試驗(yàn)藥物的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制計(jì)算如下 在將本發(fā)明化合物本身和所述制劑的原液連續(xù)稀釋后加入到培養(yǎng)物中，對(duì)它們進(jìn)行細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)的情況下，將2μL溶于含5％FBS的培養(yǎng)基、生理鹽水和含2.3mM CaCl2的鹽水的待測(cè)藥物加入到培養(yǎng)物中。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基、生理鹽水和含2.3mM CaCl2的鹽水作為溶劑對(duì)照(陰性對(duì)照)。這些對(duì)照系列間的差異并不顯著。因此，計(jì)算陰性對(duì)照的平均值。在其它對(duì)照培養(yǎng)物中，將2μL溶于含5％FBS的培養(yǎng)基、生理鹽水和含2.3mM CaCl2的鹽水的多西他賽、紫杉醇、多柔比星溶液加入到培養(yǎng)物(陽(yáng)性對(duì)照)中。各種抗生素的對(duì)照序列間的差異并不顯著。因此，計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照的平均值(對(duì)每種抗生素)。
實(shí)施例1.N-視黃?；?L-半胱磺酸酯和酰胺以及N-視黃?；?L-高半胱磺酸酯和酰胺的合成L-半胱磺酸酯和L-高半胱磺酸酯的合成。在攪拌中將亞硫酰氯(3mmol，0.219ml)加入到50ml合適的醇中，15分鐘后再加入L-半胱磺酸一水合物(1mmol，187mg)或L-高半胱磺酸(1mmol，183mg)，將混合物回流48小時(shí)。減壓蒸發(fā)醇，殘余物從乙醇重結(jié)晶。對(duì)于所有酯，得到的收率在85-95％之間。
L-半胱磺酸酰胺和L-高半胱磺酸酰胺的合成。將10ml合適胺的水溶液(28％的NH3水溶液或40％甲胺或二甲胺水溶液)加入到5ml合適酸的甲酯水溶液(1mmol)中，將所得溶液放置2-7天。減壓除去溶劑和多余的胺并將殘余物從甲醇重結(jié)晶。對(duì)于所有酰胺，得到的收率在30-85％之間。
L-半胱磺酸酯和酰胺以及L-高半胱磺酸酯和酰胺的?；?。將全反式-視黃酸或13-順式-視黃酸(150mg，0.5mmol)和三乙胺(0.083ml，0.6mmol)溶于1ml無(wú)水四氫呋喃中，再加入無(wú)水乙腈(2ml)，將混合物冷卻至-20℃，再加入0.07ml(0.55mmol)氯甲酸丁酯。30分鐘后，將沒(méi)有沉淀三乙胺鹽酸鹽的混合物用吸管移至L-半胱磺酸或L-高半胱磺酸(0.75mmol)的合適衍生物在3ml飽和NaHCO3溶液(約1.1M)、10ml H2O、8ml甲醇和15ml THF的混合物的溶液中。在室溫下攪拌10小時(shí)后，將混合物部分減壓蒸餾，直至未反應(yīng)的視黃酸開(kāi)始沉淀(至殘余物體積約為10ml)。然后，將15ml H2O加入到殘余物中，并將未反應(yīng)的視黃酸用乙醚(5×30ml)萃取。將20ml飽和NaCl溶液加入到該水溶液中，產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯(3×30ml)萃取。減壓蒸發(fā)溶劑。將所得殘余物溶于20ml乙醇中并濾出所有不溶性雜質(zhì)。產(chǎn)物以所得純品的澄清溶液形式貯存。
為了得到所述化合物的酸形式，將其鈉鹽溶液減壓蒸發(fā)，溶于水中，用0.1M HCl小心酸化至pH 3.5并用氯仿-乙醇(1∶1，v/v)萃取。減壓蒸發(fā)氯仿，得到濃縮的乙醇-水溶液，必要時(shí)，用乙醇稀釋并過(guò)濾。然后立即使用所得化合物溶液。
化合物(I-1a)收率65％.Rf0.30-0.35.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.43和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.68[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.24(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.81(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，3.57(3H，s，OCH3)，4.47(1H，m，NCH)，5.83(1H，s，＝CHCO)，6.12-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.34[1H，d，J 15.0Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.92[1H，dd，J 15.0，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，8.16(1H，d，J 6.4Hz，NH).
化合物(I-1b)收率55％.Rf0.35-0.40.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.16(3H，t，J 7.1Hz，CH3CH2)，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CHH3C＝CC(CH3)2]，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.24(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.81(2H，d，J 6.1Hz，SCH2)，4.04(2H，q，J 7.1Hz，OCH2)，4.44(1H，m，NCH)，5.84(1H，s，＝CHCO)，6.11-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.34[1H，d，J 15.0Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.91[1H，dd，J 15.0，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，8.14(1H，d，J 6.4Hz，NH).
化合物(I-1c)收率57％.Rf0.35-0.40.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.14和1.17[3H+3H，2d，J 6.2Hz，(CH3)2CHO]，1.43和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.68[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.24(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.79(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，4.38(1H，m，NCH)，4.84(1H，m，OCH)，5.84(1H，s，＝CHCO)，6.11-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.34[1H，d，J15.0Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.91[1H，dd，J 15.0，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，8.12(1H，d，J 6.2Hz，NH).
化合物(I-1d)收率58％.Rf040-0.45.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ0.86(3H，t，J 7.3Hz，CH3CH2)，1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.43和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.55(2H，m，CH2CH3)，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.24(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.81(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，3.95(2H，m，OCH2)，4.44(1H，m，NCH)，5.84(1H，s，＝CHCO)，6.12-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.34[1H，d，J 15.2Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.91[1H，dd，J 15.2，11.3Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，8.15(1H，d，J6.4Hz，NH).
化合物(I-1e)收率60％.Rf0.40-0.45.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ0.86(3H，t，J 7.3Hz，CH3CH2)，1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.31(2H，m，CH2CH3)，1.43和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.52(2H，m，CH2CH2O)，1.68[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.24(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.81(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，3.99(2H，m，OCH2)，4.43(1H，m，NCH)，5.84(1H，s，＝CHCO)，6.11-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.34[1H，d，J 15.0Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.91[1H，dd，J 15.0，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝HCO]，8.15(1H，d，J 6.4Hz，NH).
化合物(I-1f)收率32％.Rf0.10-0.15.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.25(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.73(1H，dd，J 13.9，7.7Hz，SCHaHb)，2.83(1H，dd，J 13.9，4.8Hz，SCHaHb)，4.36(1H，m，NCH)，5.83(1H，s，＝CHCO)，6.11-6.27[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.33[1H，d，J 15.2Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.90[1H，dd，J 15.2，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，6.93(1H，br s，NHaHb)，7.34(1H，br s，NHaHb)，8.02(1H，d，J 6.4Hz，NHCH).
化合物(I-1g)收率30％.Rf0.20-0.25.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ0.99[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.94[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.27(3H，s，CH3C＝HCO)，2.53(3H，d，J 4.6Hz，CH3NH)，2.73(1H，dd，J 13.7，7.9Hz，SCHaHb)，2.83(1H，dd，J 13.7，4.8Hz，SCHaHb)，4.40(1H，m，NCH)，5.84(1H，s，＝CHCO)，6.10-6.27[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.32[1H，d，J 15.0Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.90[1H，dd，J15.0，11.4Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.77(1H，m， NHCH3)，8.04(1H，d，J 6.4Hz，NHCH).
化合物(I-1h)收率21％.Rf0.20-0.25.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝C(CH3)2]，1.94[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.25(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.59(1H，dd，J 13.5，6.4Hz，SCHaHb)，2.77[3H，s，(CH3)aN(CH3)b]，2.82(1H，dd，J 13.5，6.2Hz，SCHaHb)，3.11[3H，s，(CH3)aN(CH3)b]，5.00(1H，m，NCH)，5.84(1H，s，＝CHCO)，6.10-6.32[4H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.89[1H，dd，J 15.2，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，8.13(1H，d，J 7.1Hz，NH).
化合物(I-3a)收率58％.Rf0.30-0.35.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.86-2.07(2H，br m，CH2CH2S)，1.95[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.25(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.47(2H，m，SCH2)，3.61(3H，s，OCH3)，4.31(1H，m，NCH)，5.90(1H，s，＝CHCO)，6.11-6.29[3H，m，CH=CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.29[1H，d，J 15.0Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，6.91[1H，dd，J 15.0，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，8.46(1H，d，J6.9Hz，NH).
化合物(I-3f)收率35％.Rf0.10-0.15.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.80-2.00(2H，br m，CH2CH2S)，1.94[3H，s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.98(2H，m，CH2C＝)，2.26(3H，s，CH3C＝CHCO)，2.45(2H，m，SCH2)，4.26(1H，m，NCH)，5.96(1H，s，＝CHCO)，6.10-6.31[4H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.89[1H，dd，J 15.0，11.3Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.00(1H，br s，NHaHb)，7.41(1H，br s，NHaHb)，8.12(1H，d，J 8.1Hz，NHCH).
化合物(II-1a)收率63％.Rf0.25-0.30.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95和1.98(3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.82(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，3.57(3H，s，OCH3)，4.46(1H，m，NCH)，5.70(1H，s，＝CHCO)，6.13-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.88[1H，dd，J 15.4，11.4Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.84[1H，d，J 15.4Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，8.16(1H，d，J 6.4Hz，NH).
化合物(II-1b)收率60％.Rf0.30-0.35.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.16t，J 7.1Hz，CH3CH2)，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95和1.98(3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，2.00(2H，m，CH2C＝)，2.80(2H，d，J 6.2Hz，SCH2)，4.04(2H，q，J 7.1Hz，OCH2)，4.41(1H，m，NCH)，5.68(1H，s，＝CHCO)，6.13-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.88[1H，dd，J 15.4，11.5Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.83[1H，d，J 15.4Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，8.12(1H，d，J6.2Hz，NH).
化合物(II-1c)收率55％.Rf0.35-0.40.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.14和1.17[3H+3H，2d，J 6.2Hz，(CH3)2CHO]，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95和1.98(3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)=CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.78(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，4.36(1H，m，NCH)，4.84(1H，m，OCH)，5.68(1H，s，＝CHCO)，6.13-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.87[1H，dd，J 15.2，11.4Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.82[1H，d，J 15.2Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，8.08(1H，d，J 6.0Hz，NH).
化合物(II-1d)收率58％.Rf0.35-0.40.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ0.85(3H，t，J 7.3Hz，CH3CH2)，1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.55(2H，m，CH2CH3)，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95和1.98(3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.81(2H，d，J 6.0Hz，SCH2)，3.95(2H，m，OCH2)，4.42(1H，m，NCH)，5.69(1H，s，＝CHCO)，6.13-6.27[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.87[1H，dd，J 15.4，11.4Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.83[1H，d，J 15.4Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，8.13(1H，d，J6.2Hz，NH).
化合物(II-1e)收率59％.Rf0.35-0.40.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ0.85(3H，t，J 7.4Hz，CH3CH2)，1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.30(2H，m，CH2CH3)，1.43和1.55[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.52(2H，m，CH2CH2O)，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95和1.98(3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.80(2H，d，J 6.1Hz，SCH2)，3.98(2H，m，OCH2)，4.41(1H，m，NCH)，5.68(1H，s，＝CHCO)，6.13-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.87[1H，dd，J 15.4，11.4Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.82[1H，d，J 15.4Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，8.13(1H，d，J 6.2Hz，NH).
化合物(II-1f)收率34％.Rf0.10-0.15.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.43和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.95和1.97[3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.71(1H，dd，J 13.9，7.9Hz，SCHaHb)，2.82(1H，dd，J 13.9，4.9Hz，SCHaHb)，4.33(1H，m，NCH)，5.68(1H，s，＝CHCO)，6.12-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.87[1H，dd，J 15.6，11.3Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，6.90(1H，br s，NHaHb)，7.33(1H，br s，NHaHb)，7.88[1H，d，J 15.6Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，7.96(1H，d，J 6.2Hz，NHCH).
化合物(II-3b)收率54％.Rf0.30-0.35.1H-NMR(CD3SOCD3，400MHz)δ1.00[6H，s，C(CH3)2]，1.17(3H，t，J 7.1Hz，CH3CH2)，1.42和1.56[2H+2H，2m，CH2CH2C(CH3)2]，1.67[3H，s，CH3C＝CC(CH3)2]，1.84-2.11(2H，br m，CH2CH2S)，1.95和1.97(3H+3H，2s，CH3C＝(CH)3C(CH3)＝CHCO]，1.99(2H，m，CH2C＝)，2.46(2H，m，SCH2)，4.07(2H，m，OCH2)，4.24(1H，m，NCH)，5.75(1H，s，＝CHCO)，6.12-6.26[3H，m，CH＝CHC(CH3)＝CHCH＝CH]，6.87[1H，dd，J 15.4，11.4Hz，CH＝CHC(CH3)＝CHCO]，7.86[1H，d，J 15.4Hz，CHC(CH3)＝CHCO]，8.41(1H，d，J 7.0Hz，NH).
實(shí)施例2.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1a的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1a的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1a的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1a的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1a的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1a終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1a試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.2±3.00)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1a溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(34.3±2.27)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為40.0％(p＜0.001)；10-8mol/L(31.1±1.90)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為45.6％(p＜0.001)；10-7mol/L(29.8±2.44)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為47.9％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1a被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1a的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加47.9％(p＜0.001)。
實(shí)施例3.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1b的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1b的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1b的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1b的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1b的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1b終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1b試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.2±3.00)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1b溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(34.8±2.41)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為39.2％(p＜0.001)；10-8mol/L(31.9±2.16)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.2％(p＜0.001)；10-7mol/L(30.5±1.82)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.7％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1b被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1b的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加46.7％(p＜0.001)。
實(shí)施例4.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1c的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1c的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1c的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1c的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1c的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1c終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1c試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.2±3.00)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1c溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(34.0±2.13)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為40.6％(p＜0.001)；10-8mol/L(30.4±1.79)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.9％(p＜0.001)；10-7mol/L(28.9±1.52)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為49.5％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1c被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1c的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加49.5％(p＜0.001)。
實(shí)施例5.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1d的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1d的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1d的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1d的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1d的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1d終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1d試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(53.3±2.66)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1d溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(29.2±1.89)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為45.2％(p＜0.001)；10-8mol/L(26.3±1.67)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為50.7％(p＜0.001)；10-7mol/L(24.1±1.46)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為54.8％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1d被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1d的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加54.8％(p＜0.001)。
實(shí)施例6.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1e的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1e的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1e的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1e的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1e的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1e終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1e試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(53.3±2.66)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1e溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(29.5±2.18)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.7％(p＜0.001)；10-8mol/L(27.1±1.75)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為49.2％(p＜0.001)；10-7mol/L(24.8±1.34)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.5％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1e被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1e的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加53.5％(p＜0.001)。
實(shí)施例7.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1f的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1f的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1f的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1f的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1f的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1f終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1f試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(53.3±2.66)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1f溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(29.4±2.15)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.8％(p＜0.001)；10-8mol/L(27.4±1.42)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為48.6％(p＜0.001)；10-7mol/L(25.3±1.11)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為52.5％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1f被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1f的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加52.5％(p＜0.001)。
實(shí)施例8.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1a的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-1a的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-1a的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-1a的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-1a的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1a終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1a試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(58.5±3.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-1a溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(35.8±2.50)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為38.8％(p＜0.001)；10-8mol/L(32.7±2.06)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.1％(p＜0.001)；10-7mol/L(31.3±2.15)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.5％(p＜0.001)。
因此，化合物II-1a被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-1a的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加46.5％(p＜0.001)。
實(shí)施例9.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中的化合物II-1b細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-1b的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-1b的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-1b的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-1b的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1b終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1b試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(58.5±3.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-1b溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(34.3±1.88)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為41.4％(p＜0.001)；10-8mol/L(31.4±1.94)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.3％(p＜0.001)；10-7mol/L(29.8±1.70)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為49.1％(p＜0.001)。
因此，化合物II-1b被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-1b的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加49.1％(p＜0.001)。
實(shí)施例10.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1c的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-1c的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-1c的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-1c的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-1c的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1c終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1c試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(58.5±3.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-1c溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(33.6±2.75)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為42.6％(p＜0.001)；10-8mol/L(31.0±2.05)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為47.0％(p＜0.001)；10-7mol/L(29.0±1.26)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為50.4％(p＜0.001)。
因此，化合物II-1c被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-1c的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加50.4％(p＜0.001)。
實(shí)施例11.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1d的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-1d的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-1d的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-1d的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-1d的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1d終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1d試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.8±3.16)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-1d溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(31.3±2.68)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.9％(p＜0.001)；10-8mol/L(28.2±1.29)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為50.4％(p＜0.001)；10-7mol/L(26.3±1.86)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.7％(p＜0.001)。
因此，化合物II-1d被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-1d的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加53.7％(p＜0.001)。
實(shí)施例12.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1e的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-1e的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-1e的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-1e的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-1e的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1e終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1e試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.8±3.16)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-1e溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(30.9±1.82)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為45.6％(p＜0.001)；10-8mol/L(28.0±1.34)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為50.7％(p＜0.001)；10-7mol/L(26.0±1.27)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為54.2％(p＜0.001)。
因此，化合物II-1e被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-1e的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加54.2％(p＜0.001)。
實(shí)施例13.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1f的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-1f的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-1f的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-1f的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-1f的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1f終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1f試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.8±3.16)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-1f溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(31.2±2.42)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為45.1％(p＜0.001)；10-8mol/L(28.5±2.13)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為49.8％(p＜0.001)；10-7mol/L(26.6±1.83)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.2％(p＜0.001)。
因此，化合物II-1f被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-1f的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加53.2％(p＜0.001)。
實(shí)施例14.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物I-1的摩爾比將化合物I-1的鈉鹽轉(zhuǎn)變成化合物I-1的酸形式并溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物I-1的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液(1mg/ml)。從這些溶液，制備溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.6±3.04)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(15.4±1.02)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為73.3％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物I-1摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的MDA-MB-231培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(9.3±0.75)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為83.9％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加39.6％(p＜0.001)；1∶6(8.4±0.53)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為85.4％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加45.5％(p＜0.001)；1∶10(7.8±0.61)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為86.5％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加49.4％(p＜0.001)。
實(shí)施例15.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1制劑(多西他賽∶化合物I-1摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1制劑的終濃度將化合物I-1的鈉鹽轉(zhuǎn)變成化合物I-1的酸形式并溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表1)。
表1.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1制劑(多西他賽∶化合物I-1摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1制劑的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(b)外推值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01實(shí)施例16.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物I-1a的摩爾比將化合物I-1a的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物I-1a的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.7±2.69)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(14.2±0.85)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為74.5％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物I-1a摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(8.0±0.69)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為85.6％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加43.7％(p＜0.001)；1∶6(7.2±0.66)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為87.1％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加49.3％(p＜0.001)；
1∶10(6.4±0.52)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為88.5％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加54.9％(p＜0.001)。
實(shí)施例17.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a制劑(多西他賽∶化合物I-1a摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a的終濃度將化合物I-1a的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表2)。
表2.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a制劑(多西他賽∶化合物I-1a摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01實(shí)施例18.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1b制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物I-1b的摩爾比將化合物I-1b的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物I-1b的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(51.5±2.84)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(16.1±0.94)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為68.7％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物I-1b摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(9.2±0.82)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為82.1％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加42.9％(p＜0.001)；1∶6(8.4±0.75)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為83.7％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加47.8％(p＜0.001)；1∶10(7.6±0.69)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為85.2％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加52.8％(p＜0.001)。
實(shí)施例19.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1b制劑(多西他賽∶化合物I-1b摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1b的終濃度將化合物I-1b的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1b的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表3)。
表3.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1b制劑(多西他賽∶化合物I-1b摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1b的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01實(shí)施例20.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1c制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物I-1c的摩爾比將化合物I-1c的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1c的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物I-1c的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(53.7±2.59)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(10.6±0.72)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為80.3％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物I-1c摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的A549細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(7.0±0.53)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為87.0％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加34.0％(p＜0.002)；1∶6(6.6±0.58)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為87.7％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加37.7％(p＜0.002)；1∶10(6.3±0.42)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為88.3％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加40.6％(p＜0.001)。
實(shí)施例21.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1c制劑(多西他賽∶化合物I-1c摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1c的終濃度將化合物I-1c的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物I-1c的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表4)。
表4.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1c制劑(多西他賽∶化合物I-1c摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1c的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.05
實(shí)施例22.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物II-1的摩爾比將化合物II-1的鈉鹽轉(zhuǎn)變成化合物II-1的酸形式并溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物II-1的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.6±3.04)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(15.4±1.02)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為73.3％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物II-1摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(9.5±0.62)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為83.5％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加38.3％(p＜0.001)；1∶6(8.6±0.57)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為85.1％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加44.2％(p＜0.001)；1∶10(8.1±0.59)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為85.9％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加47.4％(p＜0.001)。
實(shí)施例23.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1制劑(多西他賽∶化合物II-1摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1的終濃度將化合物II-1的鈉鹽轉(zhuǎn)變成化合物II-1的酸形式并溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表5)。
表5.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1制劑(多西他賽∶化合物II-1摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(b)外推值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.02實(shí)施例24.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1a制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物II-1a的摩爾比將化合物II-1a的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物II-1a的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.7±2.69)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(14.2±0.85)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為74.5％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物II-1a摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(7.9±0.73)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為85.8％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加44.4％(p＜0.001)；1∶6(7.5±0.59)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為86.5％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加47.2％(p＜0.001)；1∶10(6.8±0.58)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為87.8％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加52.1％(p＜0.001)。
實(shí)施例25.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1a制劑(多西他賽∶化合物II-1a摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1a的終濃度將化合物II-1a的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表6)。
表6.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1a制劑(多西他賽∶化合物II-1a摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1a的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.002(·)p＜0.05(··)p＞0.05實(shí)施例26.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1b制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物II-1b的摩爾比將化合物II-1b的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1b的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物II-1b的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(51.5±2.84)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(16.1±0.94)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為68.7％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物II-1b摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(9.6±0.86)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為81.4％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加40.4％(p＜0.001)；1∶6(8.8±0.72)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為82.9％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加45.3％(p＜0.001)；1∶10(8.1±0.70)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為84.3％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加49.7％(p＜0.001)。
實(shí)施例27.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1b制劑(多西他賽/化合物II-1b摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1b的終濃度將化合物II-1b的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1b的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表7)。
表7.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1b制劑(多西他賽∶化合物II-1b摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1b的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.02實(shí)施例28.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1c制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多西他賽∶化合物II-1c的摩爾比將化合物II-1c的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1c的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按多西他賽∶化合物II-1c的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多西他賽的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(53.7±2.59)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多西他賽處理的培養(yǎng)物含有(10.6±0.72)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為80.3％(p＜0.001)。
經(jīng)多西他賽/化合物II-1c摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的制劑溶液處理的A549細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(7.2±0.61)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為86.6％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加32.1％(p＜0.01)；1∶6(6.8±0.52)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為87.3％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加35.8％(p＜0.002)；1∶10(6.5±0.50)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為87.9％(p＜0.001)，與多西他賽細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加38.7％(p＜0.001)。
實(shí)施例29.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1c制劑(多西他賽/化合物II-1c摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1c的終濃度將化合物II-1c的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將多西他賽的甲醇溶液與化合物II-1c的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表8)。
表8.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1c制劑(多西他賽/化合物II-1c摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多西他賽/化合物II-1c的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.05
實(shí)施例30.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及紫杉醇∶化合物II-1的摩爾比將化合物II-1的鈉鹽轉(zhuǎn)變成化合物II-1的酸形式并溶于甲醇中。將紫杉醇的甲醇溶液與化合物II-1的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按紫杉醇∶化合物II-1的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。紫杉醇的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中紫杉醇終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(50.5±2.58)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM紫杉醇處理的培養(yǎng)物含有(14.6±0.82)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為71.1％(p＜0.001)。
經(jīng)紫杉醇/化合物II-1摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(9.6±0.68)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為81.0％(p＜0.001)，與紫杉醇細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加34.2％(p＜0.001)；1∶6(8.7±0.63)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為82.8％(p＜0.001)，與紫杉醇細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加40.4％(p＜0.001)；1∶10(8.2±0.70)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為83.8％(p＜0.001)，與紫杉醇細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加43.8％(p＜0.001)。
實(shí)施例31.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1制劑(紫杉醇∶化合物II-1的摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1的終濃度將化合物II-1的鈉鹽轉(zhuǎn)變成化合物II-1的酸形式并溶于甲醇中。將紫杉醇的甲醇溶液與化合物II-1的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中紫杉醇終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表9)。
表9.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1制劑(紫杉醇∶化合物II-1的摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.002實(shí)施例32.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1a制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及紫杉醇∶化合物II-1a的摩爾比將化合物II-1a的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將紫杉醇的甲醇溶液與化合物II-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
按紫杉醇∶化合物II-1a的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于鹽水中的原液(1mg/ml)。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。紫杉醇的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中紫杉醇終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(50.5±2.58)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM紫杉醇處理的培養(yǎng)物含有(14.6±0.82)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為71.1％(p＜0.001)。
經(jīng)紫杉醇/化合物II-1的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(10.1±0.73)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為80.0％(p＜0.001)，與紫杉醇細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加30.8％(p＜0.002)；1∶6(9.4±0.80)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為81.4％(p＜0.001)，與紫杉醇細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加35.6％(p＜0.001)；
1∶10(8.9±0.64)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為82.4％(p＜0.001)，與紫杉醇細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加39.0％(p＜0.001)。
實(shí)施例33.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1a制劑(紫杉醇∶化合物II-1a的摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1a的終濃度將化合物II-1a的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將紫杉醇的甲醇溶液與化合物II-1a的甲醇溶液混合。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將所得干燥膜狀物溶于鹽水中。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中紫杉醇終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表10)。
表10.在人卵巢腺癌SKOV-3細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1a制劑(紫杉醇∶化合物II-1a的摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物II-1a的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.002實(shí)施例34.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1d制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多柔比星∶化合物I-1d的摩爾比將化合物I-1d的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的多柔比星水溶液混合。
按多柔比星∶化合物I-1d的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。多柔比星的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多柔比星終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(50.9±2.07)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多柔比星處理的培養(yǎng)物含有(23.6±1.02)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.6％(p＜0.001)。
經(jīng)多柔比星/化合物I-1d摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(12.2±0.62)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為76.0％(p＜0.001)，與多柔比星細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加48.3％(p＜0.001)；1∶6(12.1±0.69)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為76.2％(p＜0.001)，與多柔比星細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加48.7％(p＜0.001)；1∶10(11.9±0.74)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為76.6％(p＜0.001)，與多柔比星細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加49.6％(p＜0.001)。
實(shí)施例35.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1d制劑(多柔比星/化合物I-1d摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1d的終濃度將化合物I-1d的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的多柔比星水溶液混合。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多柔比星終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表11)。
表11.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1d制劑(多柔比星/化合物I-1d摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1d的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.05(·)p＜0.002實(shí)施例36.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物II-1d制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及多柔比星∶化合物II-1d的摩爾比將化合物II-1d的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的多柔比星水溶液混合。
按多柔比星∶化合物II-1d的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于5％FBS介質(zhì)的工作液。多柔比星的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多柔比星終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(50.9±2.07)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的多柔比星處理的培養(yǎng)物含有(23.6±1.02)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.6％(p＜0.001)。
經(jīng)多柔比星/化合物II-1d摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(13.0±0.76)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為74.5％(p＜0.001)，與多柔比星細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加44.9％(p＜0.001)；1∶6(12.8±0.60)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為74.9％(p＜0.001)，與多柔比星細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加45.8％(p＜0.001)；1∶10(12.6±0.68)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為75.2％(p＜0.001)，與多柔比星細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加46.6％(p＜0.001)。
實(shí)施例37.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物II-1d制劑(多柔比星∶化合物II-1d摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多柔比星/化合物II-1d的終濃度將化合物II-1d的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將所得溶液和多柔比星水溶液混合。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多柔比星終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表12)。
表12.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物II-1d制劑(多柔比星∶化合物II-1d摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中多柔比星/化合物II-1d的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.05(·)p＜0.01實(shí)施例38.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1e制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及米托蒽醌∶化合物I-1e的摩爾比將化合物I-1e的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
按米托蒽醌∶化合物I-1e的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。米托蒽醌的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.6±2.88)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的米托蒽醌處理的培養(yǎng)物含有(22.9±1.49)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為58.8％(p＜0.001)。
經(jīng)米托蒽醌/化合物I-1e摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(13.7±1.05)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為75.4％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加40.2％(p＜0.001)；1∶6(12.5±0.98)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為77.5％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加45.4％(p＜0.001)；1∶10(11.9±0.82)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為78.6％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加48.0％(p＜0.001)。
實(shí)施例39.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1e制劑(米托蒽醌/化合物I-1e摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1e的終濃度將化合物I-1e的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表13)。
表13.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1e制劑(米托蒽醌/化合物I-1e摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1e的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(b)外推值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.02實(shí)施例40.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1e制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及米托蒽醌∶化合物II-1e的摩爾比將化合物II-1e的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
按米托蒽醌∶化合物II-1e的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。米托蒽醌的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.6±2.88)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的米托蒽醌處理的培養(yǎng)物含有(22.9±1.49)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為58.8％(p＜0.001)。
經(jīng)米托蒽醌/化合物II-1e摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(14.0±1.23)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為74.8％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加38.9％(p＜0.001)；1∶6(12.9±0.62)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為76.8％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加43.7％(p＜0.001)；1∶10(12.3±1.01)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為77.9％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加46.3％(p＜0.001)。
實(shí)施例41.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1e制劑(米托蒽醌∶化合物II-1e摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1e的終濃度將化合物II-1e的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表14)。
表14.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1e制劑(米托蒽醌∶化合物II-1e摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1e的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(b)外推值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.05
實(shí)施例42.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1f制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及米托蒽醌∶化合物I-1f的摩爾比將化合物I-1f的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
按米托蒽醌∶化合物I-1f的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。米托蒽醌的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(48.2±3.14)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的米托蒽醌處理的培養(yǎng)物含有(19.2±1.16)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為60.2％(p＜0.001)。
經(jīng)米托蒽醌/化合物I-1f摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(9.9±0.48)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為79.5％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加48.4％(p＜0.001)；1∶6(9.3±0.54)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為80.7％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加51.6％(p＜0.001)；1∶10(8.8±0.65)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為81.7％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加54.2％(p＜0.001)。
實(shí)施例43.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1f制劑(米托蒽醌∶化合物I-1f摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1f的終濃度將化合物I-1f的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表15)。
表15.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1f制劑(米托蒽醌∶化合物I-1f摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物I-1f的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.02(··)p＜0.05實(shí)施例44.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1f制劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及米托蒽醌∶化合物II-1f的摩爾比將化合物II-1f的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
按米托蒽醌∶化合物II-1f的摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10，制備所述制劑溶于水中的原液。從這些溶液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。米托蒽醌的濃度等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度等于10-7M。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(48.2±3.14)×103細(xì)胞。
經(jīng)濃度為100nM的米托蒽醌處理的培養(yǎng)物含有(19.2±1.16)×103細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為60.2％(p＜0.001)。
經(jīng)米托蒽醌/化合物II-1f摩爾比等于1∶3、1∶6和1∶10的制劑溶液處理的DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)1∶3(10.9±0.83)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為77.4％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加43.2％(p＜0.001)；1∶6(10.4±0.70)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為78.4％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加45.8％(p＜0.001)；1∶10(9.7±0.53)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為79.9％(p＜0.001)，與米托蒽醌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制增加49.5％(p＜0.001)。
實(shí)施例45.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1f制劑(米托蒽醌∶化合物II-1f摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1f的終濃度將化合物II-1f的鈉鹽(2mg)的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將等分的所得溶液與等分的米托蒽醌水溶液混合。
從該原液，制備用于加入到培養(yǎng)物中的溶于含5％FBS的培養(yǎng)基的工作液。接種后第1天，用藥物溶液處理DU 145細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中米托蒽醌終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表16)。
表16.在人前列腺癌DU 145細(xì)胞系培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1f制劑(米托蒽醌∶化合物II-1f摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中米托蒽醌/化合物II-1f的終濃度
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.02(··)p＜0.05實(shí)施例46.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1g的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1g的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1g的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1f的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1g的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1g終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1g試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.5±2.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1g溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(40.8±2.14)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為27.8％(p＜0.001)；10-8mol/L(36.2±1.95)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為35.9％(p＜0.001)；10-7mol/L(32.1±1.72)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為43.2％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1g被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1g的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加43.2％(p＜0.001)。
實(shí)施例47.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1h的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-1h的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-1h的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-1h的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-1h的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1h終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1h試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.5±2.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-1h溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(38.4±2.11)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為32.0％(p＜0.001)；10-8mol/L(34.1±1.89)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為39.6％(p＜0.001)；10-7mol/L(30.3±1.55)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.4％(p＜0.001)。
因此，化合物I-1h被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-1h的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加46.4％(p＜0.001)。
實(shí)施例48.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-3a的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-3a的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-3a的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-3a的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-3a的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-3a終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-3a試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.5±2.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-3a溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(40.0±2.06)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為29.2％(p＜0.001)；10-8mol/L(34.9±1.64)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為38.2％(p＜0.001)；10-7mol/L(28.8±1.15)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為49.0％(p＜0.001)。
因此，化合物I-3a被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-3a的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加49.0％(p＜0.001)。
實(shí)施例49.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-3f的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物I-3f的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物I-3f的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物I-3f的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物I-3f的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-3f終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-3f試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.5±2.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物I-3f溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(33.1±1.90)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為41.4％(p＜0.001)；10-8mol/L(29.0±1.32)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為48.7％(p＜0.001)；10-7mol/L(25.3±0.76)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為55.2％(p＜0.001)。
因此，化合物I-3f被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物I-3f的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加55.2％(p＜0.001)。
實(shí)施例50.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-3b的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)涉及培養(yǎng)物中化合物II-3b的終濃度通過(guò)將干物質(zhì)溶于鹽水中，制備化合物II-3b的原液(1mg/ml)。從該溶液，通過(guò)連續(xù)稀釋制備溶于含5％FBS的MEM的不同濃度的化合物II-3b的工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同濃度的化合物II-3b的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-3b終濃度在10-9-10-7mol/L之間。在對(duì)照培養(yǎng)物中，加入2μL含5％FBS的培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-3b試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.5±2.35)×103細(xì)胞。
經(jīng)化合物II-3b溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/L(29.5±1.21)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為47.8％(p＜0.001)；10-8mol/L(25.2±1.27)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為55.4％(p＜0.001)；10-7mol/L(21.4±0.88)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為62.1％(p＜0.001)。
因此，化合物II-3b被證明對(duì)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮顯著細(xì)胞毒性作用。當(dāng)增加化合物II-3b的濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度增加62.1％(p＜0.001)。
實(shí)施例51.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物I-1的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物I-1的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物I-1濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物I-1的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.9±3.30)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物I-1溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(35.9±1.38)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為36.9％(p＜0.001)B(42.8±1.56)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為24.8％(p＜0.01)I-1的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加16.1％(p＜0.01)；10-8mol/LA(34.0±1.32)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為40.2％(p＜0.001)B(40.0±1.35)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為29.7％(p＜0.001)I-1的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加15.0％(p＜0.01)；10-7mol/LA(33.3±1.17)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為41.5％(p＜0.001)B(39.1±1.41)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為31.3％(p＜0.001)I-1的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加14.8％(p＜0.01)。
實(shí)施例52.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物II-1的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物II-1的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物II-1濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物II-1的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(56.9±3.30)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物II-1溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(35.6±1.29)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為37.4％(p＜0.001)B(42.4±1.63)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為25.5％(p＜0.01)II-1的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加16.0％(p＜0.01)；10-8mol/LA(33.4±1.20)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為41.3％(p＜0.001)B(39.5±1.46)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為30.6％(p＜0.001)II-1的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加15.4％(p＜0.01)；10-7mol/LA(32.6±1.09)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為42.7％(p＜0.001)B(38.6±1.25)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為32.2％(p＜0.001)II-1的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加15.5％(p＜0.01)。
實(shí)施例53.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1a細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物II-1a的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物II-1a的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物II-1a濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物II-1a的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1a試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.3±1.70)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物II-1a溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(36.8±1.74)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為35.8％(p＜0.001)B(44.1±2.24)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為23.0％(p＜0.001)II-1a的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加16.6％(p＜0.05)；10-8mol/LA(33.4±1.25)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為41.7％(p＜0.001)B(39.4±2.28)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為31.2％(p＜0.001)II-1a的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加15.2％(p＜0.05)；10-7mol/LA(29.3±0.76)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為48.9％(p＜0.001)B(34.1±1.97)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為40.5％(p＜0.001)II-1a的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加14.1％(p＜0.05)。
實(shí)施例54.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1f細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物I-1f的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物I-1f的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物I-1f濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物I-1f的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1f終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1f試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.4±3.10)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物I-1f溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(35.3±1.34)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為38.6％(p＜0.001)B(42.6±0.80)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為25.8％(p＜0.001)I-1f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加17.1％(p＜0.001)；10-8mol/LA(30.8±1.23)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.3％(p＜0.001)B(36.7±0.75)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為36.1％(p＜0.001)I-1f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加16.1％(p＜0.01)；10-7mol/LA(26.8±0.63)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.3％(p＜0.001)B(31.6±0.89)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.9％(p＜0.001)I-1f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加15.2％(p＜0.002)。
實(shí)施例55.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1f細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物II-1f的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物II-1f的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物II-1f濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物II-1f的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1f終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1f試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(57.4±3.10)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物II-1f溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(34.4±1.20)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為40.1％(p＜0.001)B(41.8±1.46)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為27.2％(p＜0.001)II-1f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加17.7％(p＜0.01)；10-8mol/LA(30.2±0.75)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為47.4％(p＜0.001)B(36.0±1.28)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為37.3％(p＜0.001)II-1f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加16.1％(p＜0.01)；10-7mol/LA(26.3±0.68)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為54.2％(p＜0.001)B(31.1±0.96)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為45.8％(p＜0.001)II-1f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加15.4％(p＜0.002)。
實(shí)施例56.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1g細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物I-1g的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物I-1g的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物I-1g濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物I-1g的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1g終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1g試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.8±1.37)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物I-1g溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(39.9±1.76)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為28.5％(p＜0.001)B(53.5±3.21)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為4.2％(p＞0.05)I-1g的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加25.4％(p＜0.01)；10-8mol/LA(35.3±1.94)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為36.7％(p＜0.001)B(47.9±2.86)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為14.2％(p＜0.05)I-1g的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加26.3％(p＜0.01)；10-7mol/LA(31.7±2.13)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為43.2％(p＜0.001)B(43.1±2.03)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為22.8％(p＜0.001)I-1g的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加26.5％(p＜0.01)。
實(shí)施例57.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-1h細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物I-1h的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物I-1h的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物I-1h濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物I-1h的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-1h終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-1h試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.8±1.37)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物I-1h溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(40.9±2.47)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為26.7％(p＜0.001)B(51.9±3.46)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為7.0％(p＞0.05)I-1h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加21.1％(p＜0.05)；10-8mol/LA(36.7±2.04)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為34.2％(p＜0.001)B(46.1±2.65)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為17.4％(p＜0.02)I-1h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加20.4％(p＜0.02)；10-7mol/LA(32.5±1.26)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為41.8％(p＜0.001)B(41.3±0.99)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為26.0％(p＜0.001)I-1h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加21.3％(p＜0.001)。
實(shí)施例58.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物I-3f細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物I-3f的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物I-3f的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物I-3f濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物I-3f的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物I-3f終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物I-3f試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.4±1.76)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物I-3f溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(33.8±2.36)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為39.0％(p＜0.001)B(43.3±2.88)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為21.8％(p＞0.01)I-3f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加21.9％(p＜0.05)；10-8mol/LA(29.5±1.14)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.8％(p＜0.001)B(37.6±1.52)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為32.1％(p＜0.001)I-3f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加21.5％(p＜0.002)；10-7mol/LA(25.7±0.90)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.6％(p＜0.001)B(32.8±0.99)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為40.8％(p＜0.001)I-3f的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加21.6％(p＜0.001)。
實(shí)施例59.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-3b細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物II-3b的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物II-3b的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物II-3b濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物II-3b的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-3b終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-3b試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.4±1.76)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物II-3b溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)10-9mol/LA(29.9±1.23)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為46.0％(p＜0.001)B(41.4±2.15)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為25.3％(p＞0.001)II-3b的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加27.8％(p＜0.001)；10-8mol/LA(25.7±1.13)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為53.6％(p＜0.001)B(35.6±1.97)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為35.7％(p＜0.001)II-3b的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加27.8％(p＜0.002)；10-7mol/LA(21.9±0.98)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為60.5％(p＜0.001)B(30.8±1.60)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為44.4％(p＜0.001)II-3b的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加28.9％(p＜0.001)。
實(shí)施例60.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中化合物II-1a細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)和生理鹽水(B)中的稀釋度將化合物II-1a的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中，形成濃度為10-3M的化合物II-1a的原液。從這些原液制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的化合物II-1a濃度為10-5M的兩種工作液。
接種后第1天，用藥物溶液處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)和溶于生理鹽水(B)的不同濃度的化合物II-1a的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中化合物II-1a終濃度為1×10-9mol/L至1×10-7mol/L。連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度，以便評(píng)價(jià)化合物II-1a試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性。
培養(yǎng)3天后，對(duì)照培養(yǎng)物含有(55.8±1.90)×103細(xì)胞。
經(jīng)溶于A和B的化合物II-1a溶液處理的培養(yǎng)物具有以下活細(xì)胞數(shù)
10-9mol/LA(44.4±2.03)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為20.4％(p＜0.002)B(51.8±2.48)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為7.2％(p＞0.05)II-1a的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加14.3％(p＜0.05)；10-8mol/LA(40.8±1.14)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為26.9％(p＜0.001)B(47.1±1.43)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為15.6％(p＜0.01)II-1a的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加13.4％(p＜0.01)；10-7mol/LA(36.6±1.13)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為34.4％(p＜0.001)B(41.5±1.80)×103，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為25.6％(p＜0.001)II-1a的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在A中比在B中增加11.8％(p＜0.05)。
實(shí)施例61.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a+化合物II-1a制劑(多西他賽∶(化合物I-1a+化合物II-1a)摩爾比為1∶(2.5+2.5))的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)中的稀釋度將化合物I-1a的鈉鹽和化合物II-1a的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液混合并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將一等份多西他賽甲醇溶液加入到含有化合物I-1a和化合物II-1a甲醇溶液的3種相同溶液中，形成具有多西他賽∶(化合物I-1a+化合物II-1a)為1∶(2.5+2.5)的所需摩爾比的溶液。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中。在制劑的這三種原液中多西他賽的濃度都等于10-3M。從這些原液，制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)的制劑的三種工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。在這三種工作液中多西他賽的濃度都等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基的不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表17)。
表17.
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(b)外推(*)p＜0.001(**)p＜0.05(·)p＜0.002
實(shí)施例62.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1a+化合物II-1a制劑(多柔比星∶(化合物I-1a+化合物II-1a)摩爾比為1∶(1.5+1.5))的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)中的稀釋度將化合物I-1a的鈉鹽和化合物II-1a的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液混合并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將一等份多柔比星水溶液加入到含有化合物I-1a和化合物II-1a水溶液的3種相同溶液中，形成具有多柔比星∶(化合物I-1a+化合物II-1a)的所需摩爾比為1∶(1.5+1.5)的溶液。在制劑的這三種原液中多柔比星的濃度都等于10-3M。
從這些原液，制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)的制劑的三種工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。在這三種工作液中多柔比星的濃度都等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基的不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多柔比星終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表18)。
表18
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(·)p＜0.002實(shí)施例63.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中多柔比星/化合物I-1f制劑(多柔比星∶化合物I-1f摩爾比為1∶3)的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)中的稀釋度將化合物I-1f的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于水中。將一等份多柔比星水溶液加入到含有化合物I-1f水溶液的3種相同溶液中，形成具有多柔比星∶化合物I-1f的所需摩爾比為1∶3的溶液。在制劑的這三種原液中多柔比星的濃度都等于10-3M。
從這些原液，制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)的制劑的三種工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。在這三種工作液中多柔比星的濃度都等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基的不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多柔比星終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表19)。
表19
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001實(shí)施例64.在人肺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)物中多西他賽/化合物I-1a+化合物II-1a制劑(多西他賽∶(化合物I-1a+化合物II-1a)摩爾比為1∶(2.5+2.5))的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)中的稀釋度將化合物I-1a的鈉鹽和化合物II-1a的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液混合并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將一等份多西他賽甲醇溶液加入到含有化合物I-1a和化合物II-1a甲醇溶液的3種相同溶液中，形成具有多西他賽∶(化合物I-1a+化合物II-1a)的所需摩爾比為1∶(2.5+2.5)的溶液。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中。在制劑的這三種原液中多西他賽的濃度都等于10-3M。從這些原液，制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)的制劑的三種工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。在這三種工作液中多西他賽的濃度都等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基的不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中多西他賽終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表20)。
表20
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(***)p＜0.05(·)p＜0.002(°)p＞0.05實(shí)施例65.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物I-1制劑(紫杉醇∶化合物I-1摩爾比為1∶6)的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)中的稀釋度將化合物I-1的鈉鹽轉(zhuǎn)化成化合物I-1的酸形式并溶于甲醇中。將一等份紫杉醇甲醇溶液加入到化合物I-1甲醇溶液的3種相同溶液中，形成具有紫杉醇∶化合物I-1的所需摩爾比為1∶3的溶液。
攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mMCaCl2并含有化合物I-1的鈉鹽的鹽水中，另一份溶于含有化合物I-1的鈉鹽的生理鹽水中，形成具有紫杉醇∶化合物I-1的所需摩爾比為1∶6的制劑的原液。在制劑的所有這三種原液中紫杉醇的濃度都等于10-3M。
從這些原液，制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)的制劑的三種工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。在這三種工作液中紫杉醇的濃度都等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基的不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中紫杉醇終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表21)。
表21
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(***)p＜0.02(·)p＜0.002實(shí)施例66.在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)物中紫杉醇/化合物I-1a+化合物II-1a制劑(紫杉醇∶(化合物I-1a+化合物II-1a)摩爾比為1∶(2.5+2.5))的細(xì)胞毒性比較性評(píng)價(jià)涉及其原液在含2.3mMCaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)中的稀釋度將化合物I-1a的鈉鹽和化合物II-1a的鈉鹽的乙醇-水(2∶1，v/v)等分儲(chǔ)液混合并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)。將所得干燥膜狀物溶于甲醇中。將一等份紫杉醇甲醇溶液加入到含有化合物I-1a和化合物II-1a甲醇溶液的3種相同溶液中，形成具有紫杉醇∶(化合物I-1a+化合物II-1a)為1∶(2.5+2.5)的所需摩爾比的溶液。攪拌后，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。將一份所得干燥膜狀物溶于含2.3mM CaCl2的鹽水中，另一份溶于生理鹽水中。在制劑的所有這三種原液中多柔比星的濃度都等于10-3M。從這些原液，制備溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基(C)的制劑的三種工作液，用于加入到培養(yǎng)物中。在這三種工作液中紫杉醇的濃度都等于10-5M。
接種后第1天，用藥物溶液處理MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物。將溶于含2.3mM CaCl2的鹽水(A)、生理鹽水(B)和含5％FBS的培養(yǎng)基的不同濃度的制劑的等分工作液(2μL)加入到200μL培養(yǎng)物中，使培養(yǎng)物中紫杉醇終濃度為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L。
連續(xù)培養(yǎng)2天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，以便評(píng)價(jià)所述制劑試驗(yàn)溶液的細(xì)胞毒性(表22)。
表22
(a)使用以3種不同濃度測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算與未處理對(duì)照培養(yǎng)物相比抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。所有數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定、每次6個(gè)重復(fù)的平均值。
(*)p＜0.001(**)p＜0.01(***)p＜0.02(·)p＜0.05盡管已經(jīng)用構(gòu)成本發(fā)明人目前已知的最佳方式的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是人們應(yīng)該知道，在不偏本文所附權(quán)利要求書所提出的本發(fā)明范圍的情況下，可以進(jìn)行對(duì)本發(fā)明普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的各種變化和修改。
參考文獻(xiàn)L.Collins-Gold等，Modern Drug Discovery，2000，第3卷，第3期，第44-46，48頁(yè)J.E.Cortes，R.Pazdur，H.Clin.Oncology，1995，第13卷，第2643-2655頁(yè)D.Faulds等，Drugs，1991，第41卷，第3期，第400-449頁(yè)D.A.Gewirtz，Biochem.Pharmacol.，1999，第57卷，第7期，第727-741頁(yè)C.L.Vogel，J-M.Nabholtz，The Oncologist，1999，第4卷，第17-33頁(yè)
權(quán)利要求
1.一種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物， 或 其中R1選自 并且R2選自O(shè)H、ONa、NH2、NHCH3、N(CH3)2或OX，其中X為C1-C4烷基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物選自下列化合物 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸甲酯 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸乙酯 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸異丙酯 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸丙酯 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸丁酯 N-(全反式-視黃酰基)-L-半胱磺酸酰胺 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸甲基酰胺 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱磺酸二甲基酰胺 N-(全反式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸 N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸 N-(全反式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸甲酯 N-(全反式-視黃?；?-L-高半胱磺酸酰胺 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸 N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱磺酸甲酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸乙酯 N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱磺酸異丙酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸丙酯 N-(13-順式-視黃酰基)-L-半胱磺酸丁酯 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱磺酸酰胺 N-(13-順式-視黃?；?-L-半胱亞磺酸 N-(13-順式-視黃?；?-L-高半胱磺酸 N-(13-順式-視黃酰基)-L-高半胱磺酸乙酯。
3.權(quán)利要求1或2的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。
4.權(quán)利要求1或2的化合物的藥學(xué)上可接受的鈉鹽。
5.權(quán)利要求1或2的化合物或其衍生物在制備藥物中的用途。
6.權(quán)利要求1或2的化合物或其衍生物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
7.一種藥用組合物，所述組合物包含溶于含有鈣離子的鹽水溶液中的權(quán)利要求1或2的至少一種化合物。
8.權(quán)利要求7的藥用組合物，其特征在于鈣離子濃度相當(dāng)于約2.2-2.6mmol/L之間的CaCl2濃度。
9.權(quán)利要求8的藥用組合物，其特征在于鈣離子濃度相當(dāng)于2.3mmol/L的CaCl2濃度。
10.權(quán)利要求7的藥用組合物，其特征在于權(quán)利要求1或2的所述至少一種化合物是以順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體存在。
11.一種藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的活性物質(zhì)，其特征在于所述組合物還包含權(quán)利要求1的化合物或其衍生物。
12.權(quán)利要求11的藥用組合物，其特征在于所述活性物質(zhì)是細(xì)胞毒性化合物。
13.權(quán)利要求11的藥用組合物，其特征在于所述活性物質(zhì)選自多西他賽、紫杉醇、多柔比星和米托蒽醌。
14.權(quán)利要求11的藥用組合物，其特征在于所述活性物質(zhì)是以Taxol_形式存在的紫杉醇。
15.權(quán)利要求11的藥用組合物，其特征在于權(quán)利要求1的化合物是以其鈉鹽形式存在。
16.權(quán)利要求11的藥用組合物，其特征在于權(quán)利要求1的化合物是以酸形式存在。
17.一種用于增強(qiáng)藥用活性物質(zhì)功效的方法，其特征在于所述物質(zhì)是以含有權(quán)利要求1的化合物的膠束形式而制備的。
18.一種用于增加藥用活性物質(zhì)溶解度的方法，其特征在于所述物質(zhì)是以含有權(quán)利要求1的化合物的膠束形式而制備的。
19.一種改進(jìn)藥用活性物質(zhì)生物利用度的方法，其特征在于所述物質(zhì)是以含有權(quán)利要求1的化合物的膠束形式而制備的。
20.一種改進(jìn)藥用活性物質(zhì)貯存特性的方法，其特征在于所述物質(zhì)是以含有權(quán)利要求1的化合物的膠束形式而制備的。
21.一種用于治療癌癥的方法，其特征在于將細(xì)胞毒性物質(zhì)與權(quán)利要求1的化合物混合并給予患者。
22.權(quán)利要求21的方法，其特征在于所述細(xì)胞毒性物質(zhì)選自多西他賽、紫杉醇、多柔比星和米托蒽醌。
23.權(quán)利要求21的方法，其特征在于所述細(xì)胞毒性物質(zhì)是以Taxol_形式存在的紫杉醇。
24.權(quán)利要求21的方法，其特征在于權(quán)利要求1的化合物是以其鈉鹽形式存在。
25.權(quán)利要求21的方法，其特征在于權(quán)利要求1的化合物是以酸形式存在。
26.一種用于治療癌癥的方法，其特征在于將權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的藥用組合物給予患者。
27.一種制備溶解性差的藥用化合物的水溶性制劑的方法，所述方法包括下述步驟將所述第一化合物溶于第一溶劑中，將權(quán)利要求1的第二化合物溶于第二溶劑中，將所需摩爾比的所述第一化合物和所述第二化合物的所得溶液的等分溶液進(jìn)行混合，并且將所得混合物蒸發(fā)至干。
28.一種用于制備溶解性差的藥用化合物的穩(wěn)定保存制劑的方法，所述方法包括下述步驟將所述第一化合物溶于第一溶劑中，將權(quán)利要求1的第二化合物溶于第二溶劑中，將所需摩爾比的所述第一化合物和所述第二化合物的所得溶液的等分溶液進(jìn)行混合。
29.一種制備溶解性差的藥用化合物的制劑供給予患者用的方法，所述方法包括下述步驟將所述第一化合物溶于第一溶劑中，將權(quán)利要求1的第二化合物溶于第二溶劑中，將所需摩爾比的所述第一化合物和所述第二化合物的所得溶液的等分溶液進(jìn)行混合，將所得混合物蒸發(fā)至干，形成所述第一化合物和所述第二化合物的殘余物，將所述殘余物溶于水中，將所得溶液凍干，并且用適于給予患者的第三溶劑重建所述殘余物。
30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一溶劑和所述第二溶劑是至少一種脂族醇。
31.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一溶劑和所述第二溶劑是乙醇。
32.權(quán)利要求29的方法，其特征在于所述第一溶劑和所述第二溶劑是至少一種脂族醇，而所述第三溶劑是含有鈣離子的鹽水溶液。
全文摘要
一組新型化合物即N－(全反式－視黃?；?－L－半胱磺酸、N－(13－順式－視黃?；?－L－半胱磺酸、N－(全反式－視黃?；?－L－半胱亞磺酸、N－(13－順式－視黃?；?－L－半胱亞磺酸、N－(全反式－視黃?；?－L－高半胱磺酸、N－(13－順式－視黃?；?－L－高半胱磺酸和這些化合物的鈉鹽、包括它們的酯和酰胺的鈉鹽，被證明本身具有治療作用，并且當(dāng)所述化合物與多西他賽、紫杉醇、多柔比星和米托蒽醌等細(xì)胞毒性化合物聯(lián)用時(shí)，具有協(xié)同作用。這些化合物能夠制備溶解性差的藥用化合物的新型制劑，本發(fā)明以多西他賽和紫杉醇為例，公開(kāi)了所述化合物的水溶性制劑的制備方法，所述制劑表現(xiàn)出增加的藥理學(xué)活性；并且以多柔比星和米托蒽醌為例，公開(kāi)了水溶性藥物制劑的制備方法，所述制劑表現(xiàn)出改進(jìn)的治療功效。
文檔編號(hào)A61K31/198GK1668583SQ02829608
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日
發(fā)明者O·斯特勒臣諾克, J·阿勒克索夫 申請(qǐng)人:阿登尼亞投資有限公司