用于結(jié)合黃病毒蛋白的適體的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及核酸。具體地，涉及能夠結(jié)合黃病毒結(jié)構(gòu)性蛋白或黃病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白的適體，用作用于預(yù)防、治療和/或診斷患者的黃病毒感染的治療?！緦＠f明】用于結(jié)合黃病毒蛋白的適體
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及核酸。具體地，涉及能夠結(jié)合黃病毒結(jié)構(gòu)性蛋白或黃病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白的適體，用作用于預(yù)防、治療和/或診斷患者的黃病毒感染的治療(therapeutics)?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]黃病毒屬（Flaviviridae)家族是由七十種包膜正單鏈RNA病毒（envelopedpositivesingle-strandedRNAvirus)組成。在這七十種中，多種是臨床相關(guān)的人類病原體，其包括登革熱病毒(DENV)，黃熱病毒(YFV)、日本腦炎病毒(JEV)、西尼羅河病毒(WNV)和蜱傳腦炎病毒(TBEV)(Chavezetal.，2010，Nodaetal.，2012)。除黃病毒外，黃病毒屬家族還由兩種其他物種，痕病毒（Pestivirus)和肝炎病毒(Hepacivirus)組成（Chavezetal.，2010)。黃病毒主要是蟲媒病毒并且通過感染的蚊子傳播給宿主。黃病毒的病毒粒子(virion)通常較小，是具有40-60nm直徑的包膜顆粒（envelopedparticle)的形式。黃病毒，特別是登革熱和西尼羅熱(WestNile)產(chǎn)生目前沒有用于人類治療的有效疫苗或抗病毒特效藥物的廣泛疾病蔓延(Chavezetal.，2010)。[0003]通過蚊子傳播的西尼羅病毒(WNV)，一種黃病毒（Saxenaetal?，2013，Bighametal.，2011)是黃病屬家族中日本腦炎病毒(JEV)血清組(sero-group)的成員。其他成員包括卡西帕克利病毒（Cacipacorevirus)、墨累山谷腦炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus)和圣路易斯腦炎病毒（St.Louisencephalitisvirus)。在澳大利亞和亞洲發(fā)現(xiàn)的庫(kù)京病毒(Kunjinvirus)也是WNV的亞型（subtype)。1937年WNV首次從烏干達(dá)的西尼羅區(qū)域中的女性分離出（Silvaetal.，2013，Duanetal.，2009)，并且在1999年首次在紐約城(NewYorkCity)中報(bào)道（Silvaet&1.，2013)。胃附是嗜神經(jīng)組織黃病毒（neurotropicflavivirus)并且能夠?qū)е氯祟?、馬和一些鳥類的神經(jīng)疾病(Silvaetal.，2013)。其基因組是11，〇29個(gè)核苷酸長(zhǎng)的正單鏈RNA并且病毒粒子較小、球形、包膜且具有約50nm的直徑(Bighametal.JOllhWNV最常見的癥狀是發(fā)燒、頭痛和/或肝炎。2012年美國(guó)最近的WNV爆發(fā)報(bào)道了5387例并且243例死亡(⑶C報(bào)告）（Saxenaetal.，2013)。到目前為止沒有批準(zhǔn)的可用的人類的疫苗或治療(⑶C報(bào)告）（Duanetal.，2009)。1爾的基因組和蛋白質(zhì)組組織非常類似于登革熱病毒的組織。登革熱病毒(DENV)(-種蚊子傳播的病毒病原體)是黃病屬家族的成員。DENV由四種血清型（DENV1、DENV2、DENV3、和DENV4)組成。DENV具有反義11-kbRNA基因組，其在單個(gè)多聚蛋白中包含結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的兩者(Gromowskietal.，2007，Crilletal.，2001，Lisovaetal.，2007，Rajamanonmanietal.，2009)?；蛐蛄袨镃-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。病毒包膜由脂質(zhì)雙層組成，其中包膜(envelope)(E)和膜(membrane)(M)蛋白是嵌入的。E蛋白是495個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，并且在DENV中以及WNV中是糖基化的。具體地，其Asn-67處的N連接糖基化主要用于病毒的繁殖，并且對(duì)DENV是唯一的(unique)(ReyJOOShE蛋白的功能作用是其涉及病毒附接至細(xì)胞，并且也涉及膜融合(Clydeetal.，2006，Modisetal.，2004)。也已經(jīng)證實(shí)了其是高免疫原性的并且能夠產(chǎn)生對(duì)抗野生型病毒的中和抗體。登革熱E蛋白包括3個(gè)區(qū)域:結(jié)構(gòu)域-I(DI)、結(jié)構(gòu)域-II(DII)和結(jié)構(gòu)域III(Dili)。01是中心結(jié)構(gòu)域;DII是二聚且熔合的結(jié)構(gòu)域，而Dili是免疫球蛋白狀受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Mukhopadhyayetal.，2005，Reyetal.，1995)。已經(jīng)證明了Dill結(jié)構(gòu)域是受體識(shí)別和結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Bhardwajetal.，2001，Chinetal.，2007，Chuetal.，2005，Zhangetal.，2007)。因此Dill是用于對(duì)抗DENV的治療發(fā)展的重要的靶標(biāo)。感染的人類可以表現(xiàn)出從無癥狀，至熱?。╢ebriledisease)，至可能致命的內(nèi)出血的癥狀(Teohetal.，2012，Nodaetal.，2012)。對(duì)抗不同登革熱血清型的免疫性是通過血清型特異性抗體介導(dǎo)的。因此，從感染血清型恢復(fù)的患者被認(rèn)為具有對(duì)感染的血清型長(zhǎng)久免疫，但對(duì)于其他血清型具有短期的免疫（Teohetal.，2012)。如疾病控制和預(yù)防中心（theCentreforDiseaseControlandPrevention)的報(bào)告，每年多達(dá)一億人感染（CDC報(bào)告）。最近的報(bào)告警告登革熱感染的全球分布可能甚至超過了每年3.9億人（Bhattetal.，2013)。至今為止，在臨床市場(chǎng)中沒有用于人類的批準(zhǔn)的疫苗或可用的抗病毒治療(Teohetal.，2012)。[0004]檢測(cè)WNV和DENV的一種方法為通過使用抗體。然而抗體檢測(cè)的使用已經(jīng)表現(xiàn)出非特異性且難以設(shè)計(jì)(engineering)和插入新的檢測(cè)部分。[0005]因此，本領(lǐng)域需要用于檢測(cè)、治療和預(yù)防患者的黃病感染的替換方法。【
發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明涉及能夠結(jié)合黃病結(jié)構(gòu)蛋白或黃病非結(jié)構(gòu)蛋白的適體。這種適體作為治療劑用于預(yù)防、治療和/或診斷患者的黃病感染。類似于抗體，適體能夠結(jié)合至病毒的表面。然而，與抗體相比適體的優(yōu)勢(shì)在于可以將化學(xué)設(shè)計(jì)的檢測(cè)部分引入到適體中。同時(shí)，由于適體是化學(xué)合成的，因此用于適體的制造成本低于抗體。適體也易于定制、穩(wěn)定、不需要冷運(yùn)輸鏈，并具與抗體相比其對(duì)抗原有較高的結(jié)合親和力。[0007]在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了核酸適體，包括特異性結(jié)合至黃病結(jié)構(gòu)蛋白或黃病非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA分子。[0008]優(yōu)選地，黃病選自由西尼羅病毒、登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦炎和蜱傳腦炎病毒組成的組。[0009]在優(yōu)選實(shí)施方式中，適體特異性結(jié)合至西尼羅病毒包膜蛋白，并且優(yōu)選地，適體特異性結(jié)合至西尼羅病毒包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域III區(qū)域。在這個(gè)實(shí)施方式中，DNA分子優(yōu)選基于以下三種天然適體序列的一種的修飾的DNA分子：（a)西尼羅病毒包膜蛋白Dili的序列5'_ACGCTGCCACAAGTCCTGGTTCCCTG-3'（SEQIDN0:1);(b)西尼羅病毒包膜蛋白DIII的序列5'-CCTCCCAAACATGTAGAGTCTCACAT-3'（SEQIDNo:2);(c)西尼羅病毒包膜蛋白DIII的序列5'-CCAAAITGCCGCAGACTCGITGTGAA-3'（SEQIDN0:3)并且包括氨基酸側(cè)鏈。優(yōu)選地，修飾的DNA分子包括選自由以下項(xiàng)組成的組中的序列：[0010](a)[0011]5'-A_CfGkC_T_GwChC_A_CfAlA_GbT_ChC_T_GwGbT_T_CyChC_T_Gw-3'（基于SEQIDNo.1的修飾)或其互補(bǔ)物；[0012](b)[0013]5'-ChC_T_CyChC_AlA_A_CfAeT_GbT_AsG_AsG_T_CyT_CyA_CfAeT_-3'（基于SEQIDNo.2的修飾)或其互補(bǔ)物;和[0014](c)[0015]5'-ChC_AlA_AeT_T_GwChC_GkC_AsG_A_CfT_CyGbT_T_GwT_GwAlA_-3'（基于SEQIDNo.3的修飾)或其互補(bǔ)物，[0016]其中側(cè)鏈的官能基團(tuán)以小寫字母表示(b:噻吩、e:谷氨酸、f:苯丙氨酸、h:組氨酸、k:賴氨酸、1:亮氨酸、s:絲氨酸、y:酪氨酸、w:色氨酸)且使用下劃線(_)表示天然核苷酸。[0017]在可替換的優(yōu)選實(shí)施方式中，適體特異性結(jié)合至登革熱病毒包膜蛋白，并且優(yōu)選地適體特異性結(jié)合至登革熱病毒包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域III區(qū)域。在這個(gè)實(shí)施方式中，DNA分子優(yōu)選基于以下三種天然適體序列的一種的修飾的DNA分子：（a)DENV2包膜蛋白DIII的序列5'-TCACATTCAGATATGTTGGTTCCCAC-3'（SEQIDN0:4);(B)DENV2包膜蛋白Dili的序列5'-AAATGTGACGTTCACAGACAAGTCC-3''（SEQIDNo:5);或（c)DENV2包膜蛋白Dili的序列5'-6八丁六04〇'6446了61'1'(^64打6-3'（3￡010勵(lì):6)并且包括氨基酸側(cè)鏈。優(yōu)選地，修飾的0嫩分子包括選自由以下項(xiàng)組成的組成的組中的序列：[0018](a)[0019]5，T-CyA_CfAeT_T_CyAsG_AeT_AeT_GbT_T_GwGbT_T_CyChC_A_Cf-3,（基于SEQIDNo.4的修飾)或其互補(bǔ)物；[0020](b)[0021]5，-T_AkAlA_T_GwT_GwA_CfGbT_T_CyA_CfAsG_A_CfAlA_GbT_ChC_-3，（基于SEQIDNo.5的修飾)或其互補(bǔ)物;和[0022](c)[0023]5，-GkC_T_GwAeT_A_CfA_CfT_GwAlA_GbT_GbT_T_CyT_GwAeT_T_Gw-3,（基于SEQIDNo.6的修飾)或其互補(bǔ)物，[0024]其中側(cè)鏈的官能基團(tuán)以小寫字母表示(b:噻吩、e:谷氨酸、f:苯丙氨酸、h:組氨酸、k:賴氨酸、1:亮氨酸、s:絲氨酸、y:酪氨酸、w:色氨酸)且使用下劃線(_)表示天然核苷酸。[0025]在兩個(gè)實(shí)施方式中，DNA分子可以進(jìn)一步包括可檢測(cè)的部分。可檢測(cè)的部分可以選自由生物素、酶、發(fā)色團(tuán)、焚光分子、化學(xué)發(fā)光分子、磷光分子、著色顆粒和發(fā)光分子組成的組。優(yōu)選地，可檢測(cè)部分是生物素。[0026]優(yōu)選地，適體進(jìn)一步包括感興趣的藥物，其中DNA分子與黃病毒結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合將感興趣的藥物靶向其期望的作用位點(diǎn)和/或由適體釋放感興趣的藥物。優(yōu)選地，藥物選自由藥物化合物、核苷酸、抗原、類固醇、維生素、半抗原、代謝物、肽、蛋白質(zhì)、擬肽化合物、顯影劑、抗炎劑、細(xì)胞因子和免疫球蛋白分子或它們的片段組成的組。[0027]將各種試劑或藥物附接至抗體或適體和其他靶標(biāo)位遞送試劑的方法是本領(lǐng)域公知的，并且因此制備本發(fā)明的包括感興趣的藥物的適體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。[0028]藥物和試劑可以化學(xué)或生物結(jié)合至本發(fā)明的適體。具體地，也可以使用用于將藥物或試劑結(jié)合至DNA分子的任何方法。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到無論選擇何種本發(fā)明的制造結(jié)合物的方法，均必須確定DNA分子保持其靶向能力并且藥物保持其相關(guān)功能。[0029]在將適體結(jié)合至其特異性靶標(biāo)之后藥物或試劑可以從適體釋放。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行藥物或制劑的釋放。例如，可以通過觸發(fā)分子或機(jī)制的方式由宿主裂解藥物或試劑?？商鎿Q地，可以通過光活化釋放藥物或試劑。根據(jù)選擇的光不穩(wěn)定鍵、DNA分子和藥物的光敏性，可以通過多種方式中的一種提供用于以其活化形式釋放藥物的福射。這可以包括電磁福射的使用，例如供給自白熾光源（incandescentsource)、自然光源，激光包括固體激光器或甚至陽光的紅外線、可見光或紫外線輻射。[0030]在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供了一種根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的適體用于診斷。優(yōu)選地，本發(fā)明的適體用于診斷患者的黃病毒感染。患者優(yōu)選人類但可以是任何動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。[0031]在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，提供了一種根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的適體用于治療。優(yōu)選地，本發(fā)明的適體用于治療或預(yù)防患者的黃病毒感染。[0032]根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種免疫原性組合物或疫苗，包括根據(jù)本發(fā)明的第一方面的適體。通常，疫苗表示治療物質(zhì)，處理以失去其病毒性且包含衍生自一種或多種病原生物體的抗原，將給藥至患者時(shí)其將刺激活性免疫并保護(hù)這些或相關(guān)生物體免于感染，同時(shí)免疫原性組合物表示包含抗原例如微生物或其組分的任何藥物組合物，所述組合物可以用于引起患者免疫響應(yīng)。[0033]在本發(fā)明的第五個(gè)方面中，提供了一種包括根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的適體和賦形劑或載體的組合物。藥物可接受的賦形劑可以是例如抗粘附劑、粘合劑、包衣(coating)、崩解劑、香料、色素、潤(rùn)滑劑、助流劑(gildant)、吸收劑、防腐劑和甜味劑。藥物可接受載體的實(shí)例是載體蛋白，其促進(jìn)不同分子擴(kuò)散穿過生物膜。[0034]在本發(fā)明的第六個(gè)方面中，提供了一種包括根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的適體和載體的試劑盒。優(yōu)選地，載體可以是含有化學(xué)醫(yī)療試劑、光試劑或量子點(diǎn)（quantumdot)的可生物降解的納米顆粒。載體可以與適體結(jié)合用于診斷/治療應(yīng)用或治療劑開發(fā)。也優(yōu)選地，試劑盒用于檢測(cè)患者的黃病毒感染。[0035]在本發(fā)明的第七個(gè)方面中，提供了一種用于診斷或檢測(cè)患者黃病毒感染的體外方法，該方法包括：（a)獲得來自患者的生物樣本；（b)使生物樣本與根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的適體接觸；（c)檢測(cè)適體和黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白和/或黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白之間的結(jié)合復(fù)合物的形成，其中結(jié)合的復(fù)合物的存在表示患者具有黃病毒感染。檢測(cè)結(jié)合復(fù)合物的形成的步驟可以通過試劑或藥物與本發(fā)明的適體的化學(xué)或生物結(jié)合來實(shí)施。SELEX(指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)過程可以用于獲得針對(duì)靶蛋白的高親和力和高特異性的適體。適體的主要優(yōu)勢(shì)是針對(duì)靶蛋白的解離常數(shù)(Kd)的值位于納摩爾范圍中。獲得具有高親和力的序列并且與生物素分子結(jié)合，這可以通過鏈親和素HRP(辣根過氧化酶)檢測(cè)。[0036]優(yōu)選地，黃病毒選自由西尼羅河病毒、登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒組成的組。[0037]優(yōu)選地，生物樣本是血液樣本、唾液或尿液。如在本文中使用的術(shù)語"血液樣本"包括血細(xì)胞、血清和血漿。更優(yōu)選地，生物樣本是血液樣本。[0038]在本發(fā)明的第八個(gè)方面中，提供了一種用于治療或引起對(duì)患者黃病毒感染免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予患者治療有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的第五和六個(gè)方面的組合物或疫苗。給藥的方式可以是通過靜脈內(nèi)、口服、肺部、眼眶、腸胃外(parental)、儲(chǔ)庫(kù)(depot)或局部的方式。優(yōu)選地，給藥的方式是靜脈內(nèi)。【附圖說明】[0039]圖1:克隆策略。A.示意圖示出了重疊延伸PCR(OE-PCR)技術(shù)以獲得用于適體的篩選和評(píng)價(jià)的生物素化的西尼羅包膜蛋白結(jié)構(gòu)域IlKWNE-BNrDIII)。設(shè)計(jì)片段A使得其3'懸垂部(overhang)與片段B的5'懸垂部互補(bǔ)。同樣地，引物B和引物C彼此互補(bǔ)。兩個(gè)片段均通過互補(bǔ)序列和引物A和D連接在一起。B.使用0E-PCR生成重組WNE-BNrDIII蛋白的構(gòu)建體。生物素受體多肽(BAP)在6xHis標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)的下游，但是在腸激酶切割位點(diǎn)的上游，然而其他片段編碼WNE-rDIII蛋白。位于N-端的6xHis標(biāo)簽用于親和純化，而BAP是用于生物素化的信號(hào)肽。包括凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn)以在沒有標(biāo)簽的情況下獲得感興趣的蛋白。C.構(gòu)建體的不意圖不出了未和標(biāo)簽和感興趣的蛋白。[0040]圖2:純化的生物素化的WNE-BNrD111蛋白的制備。（A)(i)用于在大腸桿菌(E.coli)BL21DE3中的重組蛋白的表達(dá)的SDS-PAGE分析。泳道2示出了來自未誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物，且泳道3和4示出了來自使用ImMIPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物。通過星號(hào)指示表達(dá)的重組蛋白。（A)(ii)使用抗-His抗體用于表達(dá)的重組蛋白的Western印跡。蛋白質(zhì)構(gòu)建體由6xHis純化標(biāo)簽組成，并且因此當(dāng)使用抗-His抗體探測(cè)時(shí)，其在誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物中出現(xiàn)較厚的帶(通過星號(hào)指示hUKiii)用于鎳-氮川三乙酸(Ni-NTA)金屬親和色譜純化的BN-WNDIII的SDS-PAGE的曲線圖（FT:流過(Flow-through)、W1-W3:清洗(Wash)、E1-E5:洗脫(Elute))。在8M脲存在下在變性條件下，溶解細(xì)菌細(xì)胞并且分離并純化內(nèi)含體。通過星號(hào)指示期望的分子量~15kDa。對(duì)非生物素化的WNE-rDIII蛋白實(shí)施相似的表達(dá)和純化條件。（B)用于WNE-BNrDIII的FPLC-SEC色譜曲線。注射的樣本獲得自使用降低脲濃度的逐步（step-by-step)透析，并且也存在清潔劑Tween-20。兩個(gè)跡線均對(duì)應(yīng)于在280nm處的蛋白質(zhì)的UV吸收(虛線-未生物素化的WNrDIII，實(shí)線-WNE-BnrDIII)。樣品峰的差異指示了生物素化和未生物素化的WNDIII蛋白之間的分子量差異。[0041]圖3:示意圖示出了涉及用于篩選和評(píng)估適體的WNE-rDIII抗原的制備的逐步方法。[0042]圖4:生物素化的和未生物素化的WNDIII蛋白的檢測(cè)。[A(i)]使用單克隆鼠抗-His抗體檢測(cè)WNVDili蛋白的存在?？梢栽谖瓷锼鼗?UB)和生物素化(B)的WNVDili兩者中觀察到帶（泳道3和4)。麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)不包含His標(biāo)簽，所以在泳道1和2中不能觀察到帶。[A(ii)]當(dāng)使用鏈親和素-HRP第二抗體直接檢測(cè)生物素化時(shí)，在MBP和WNVDIII蛋白的生物素化的泳道(B)(泳道2和4)中可以觀察到明顯的帶。[B]使用鏈親和素-HRP抗體通過ELISA檢測(cè)WNVDili蛋白中生物素的存在。在450nm下生物素化的蛋白（MBP-BN、WDIII-BN)表現(xiàn)出高吸收值，而未生物素化的蛋白（MBP-UBN和WNDIII-UBN)則不能檢測(cè)。[0043]圖5:用于使用表面等離子體共振(SPR)測(cè)試不同適體的Biacore傳感圖的峰頂高度。選擇標(biāo)記為標(biāo)號(hào)1-10的菱形點(diǎn)和描繪的適體數(shù)用于進(jìn)一步的評(píng)估。[0044]圖6:用于表面篩選的酶連接的修飾適體吸收試驗(yàn)(ELMAS)。測(cè)試生物素化的適體和生物化的蛋白在不同表面例如111￡1：?[;[801^、皿1]^;[801^、？015^01^和1116(1180印中的結(jié)合效率。PolySorp板具有對(duì)疏水性分子的高親和力。MediSorp具有在PolySorp和MaxiSorp之間的板表面，其允許在樣本包含血清時(shí)的低背景讀數(shù)。MaxiSorp板具有對(duì)親水和疏水分子的混合物中的分子的高親和力。MultiSorp板具有對(duì)親水性分子的高親和力。在涂覆適體且使用鏈親和素HRP探測(cè)蛋白之后，隨后使用酶底物培育以用于顏色顯現(xiàn)。吸收對(duì)應(yīng)于結(jié)合至表面的起始生物素化的適體或蛋白的量。在生物化的適體的這種情況下，發(fā)現(xiàn)Multisorp板在450nm下的吸收率非常低（最大吸收0?15)，polysorp和medisorp為中等（最大吸收在從2-2.5改變)且Maxisorp較高(最大吸收在從2.5至3改變），并且其選擇用于進(jìn)一步的評(píng)估。[0045]圖7:用于親和力篩選的蛋白涂覆的酶連接的修飾適體吸收試驗(yàn)。將西尼羅病毒包膜Dili蛋白涂覆在表面上，然后使用不同濃度的生物素化的適體進(jìn)行孵育，并且隨后使用鏈親和素-HRP結(jié)合物進(jìn)行探測(cè)。強(qiáng)力結(jié)合至蛋白的適體表現(xiàn)出高吸收率。B03、B79和B99結(jié)合至WNDIII蛋白，因?yàn)楫?dāng)比較參照和其他適體(通過星號(hào)指示)時(shí)，吸收率明顯較高。[0046]圖8:用于親和力篩選的西尼羅病毒涂覆的酶連接的修飾適體吸收試驗(yàn)。將西尼羅病毒W(wǎng)engler菌株涂覆在表面上，并且然后使用不同濃度的生物素化的適體進(jìn)行孵育，然后使用鏈親和素-HRP結(jié)合物進(jìn)行探測(cè)。結(jié)合至蛋白質(zhì)的適體表現(xiàn)出高吸收率。當(dāng)比較各種濃度的適體時(shí)，適體B03、B79和B99在測(cè)試的全部濃度中均顯著結(jié)合（當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)）。相反，其他適體僅在高于3.3nM的濃度下顯著結(jié)合至病毒。[0047]圖9:用于親和力篩選的西尼羅病毒菌株Sarafend和Kunjin涂覆的酶連接的修飾適體吸收試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)對(duì)于Sarafend菌株，在濃度高于3.3nM下，適體B03、B67、B73和B99顯著結(jié)合，而對(duì)于1^1111」;[11菌株，在濃度高于3.311]\1下，適體1303、1366、1367、1373和1379顯著結(jié)合。[0048]圖10:使用5ym和1Oym的修飾適體對(duì)西尼羅病毒W(wǎng)eng1er菌株的中和的百分比。[0049]圖11:用于適體的Apotox和Alamar藍(lán)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。使BHK細(xì)胞生長(zhǎng)并使用不同濃度的適體，陽性對(duì)照（毛地黃皂苷洗滌劑和MPER-膜蛋白提取劑）和BSA(作為陰性對(duì)照）處理。在在處理后24、36、48和60小時(shí)時(shí)測(cè)試活性。如圖所示，當(dāng)與未處理的樣本(OnM)比較時(shí)，不同濃度(從3.3nM至26nM)下的適體處理不能改變細(xì)胞活性。陽性對(duì)照MPER中證明了失去了活性，然而在毛地黃皂苷洗滌劑處理的細(xì)胞中，在處理后24和36小時(shí)時(shí)失去了活性。有趣的是，細(xì)胞在處理后48和60小時(shí)時(shí)開始恢復(fù)。使用Alamar藍(lán)活性實(shí)驗(yàn)獲得了相似的結(jié)果。[0050]圖12:用于適體的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。上圖（24小時(shí)），下圖（100小時(shí))孵育。在37°C下孵育5天之后，在凝膠紅中檢測(cè)適體帶，指示適體非常穩(wěn)定。[0051]圖13:用于血清中適體的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)。上圖（48小時(shí)），下圖（120小時(shí)）孵育。當(dāng)在450nm的ELISA吸收中檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)BN-適體非常穩(wěn)定。[0052]圖14:示意圖示出了涉及針對(duì)WNE-rDIII抗原的修飾的適體評(píng)估的逐步方法。[0053]圖15:在大腸桿菌BL21(DE3)和大腸桿菌K12菌株AVB100中的BAP-WNDIII蛋白的表達(dá)。左圖。用于大腸桿菌BL21DE3(泳道2示出了來自未誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物且泳道3和4示出了來自使用ImM的IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物)和大腸桿菌K12菌株AVB100(泳道5示出了來自未誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物且泳道6和7示出了來自使用ImM的阿拉伯糖誘導(dǎo)的細(xì)胞的裂解物）中重組蛋白的表達(dá)的SDS-PAGE分析。在大腸桿菌BL21(DE3)中觀察到了蛋白的表達(dá)且在大腸桿菌K12菌株AVB100中未觀察到蛋白的表達(dá)。右圖。使用抗-His抗體用于在大腸桿菌BL21(DE3)和大腸桿菌K12菌株AVB100中表達(dá)的蛋白質(zhì)的Western印跡。蛋白質(zhì)構(gòu)建體由6xHis純化標(biāo)簽組成，并且因此當(dāng)使用抗His抗體探測(cè)時(shí)可以通過較厚的帶識(shí)別，如在大腸桿菌BL21(DE3)的情況中誘導(dǎo)的蛋白（泳道3和4)，然而帶不存在于誘導(dǎo)的大腸桿菌K12菌株AVB100(泳道6和7)中。[0054]圖16:使用生物素連接酶用于體外生物素化的確定的ELISA。使用鏈親和素-HRP結(jié)合物通過ELISA檢測(cè)WNVDIII蛋白中的生物素的存在。生物素化的蛋白表現(xiàn)出在450nm下的高吸收值，而未生物化的蛋白則未檢測(cè)到。使用BirA在WNDIII-未生物素化的蛋白以及WNDIII體外生物素化的蛋白兩者(樣本1和樣本2)中均觀察到了高吸收。這些結(jié)果給予我們一個(gè)暗示，表達(dá)的BAP-WNDIII蛋白可能是內(nèi)源生物素化的。[0055]圖17:使用Bc-Mac鏈親和素磁珠用于生物素化確認(rèn)的ELISAJNDIII蛋白允許與鏈親和素磁珠結(jié)合。如果蛋白包含生物素，則其將與鏈親和素強(qiáng)力結(jié)合。使用0.1M的甘氨酸完成結(jié)合蛋白的洗脫，然后通過ELISA評(píng)估蛋白。使用的陽性對(duì)照是生物素化和未生物素化的MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白）。獲得自Bc-Mag珠和獲得自FPLC部分的BAP-WNDIII蛋白表現(xiàn)出高吸收，指示出WNDIII蛋白在表達(dá)過程中確實(shí)是體內(nèi)內(nèi)源性生物素化的。[0056]圖18:人類血清中的WNVDIII修飾適體的穩(wěn)定性評(píng)估。陰性對(duì)照(在95°C下加熱48小時(shí)的B03)示出了減少的吸收，指示出修飾的適體在高溫下是不穩(wěn)定的。柱狀圖a、b和c表示在緩沖劑中孵育的修飾的適體，然而d、e和f表示在不同持續(xù)時(shí)間內(nèi)（2、5和14天)在人類血清中孵育的修飾的適體。當(dāng)與它們相應(yīng)的緩沖劑處理的對(duì)照相比時(shí)，B74(2-5天）、B76、866、871、873、803(5-14天）和879(超過14天）是穩(wěn)定的。[0057]圖19:胎牛血清(FBS)中WNVDili修飾的適體B03的穩(wěn)定性的評(píng)估。修飾的適體B03的穩(wěn)定性在4天的時(shí)間里逐漸降低，超過該時(shí)間沒有觀察到進(jìn)一步的降低。相同的修飾適體在孵育的全部5天內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。[0058]圖20:在人類血清存在下修飾的適體B03與WNVDili蛋白的結(jié)合。在孵育24小時(shí)后，適體仍與靶蛋白結(jié)合。[0059]圖21:在人類血清或FBS存在下修飾的適體B03與WNV的結(jié)合。結(jié)果顯示出在使用人類血清以及FBS孵育最高達(dá)48小時(shí)后，修飾的適體仍是功能性的。[0060]圖22:WNVDIII側(cè)鏈修飾的和未修飾的適體B03在人類血清(血清)和FBS中穩(wěn)定性的比較。側(cè)鏈修飾的適體B03是高穩(wěn)定性的，然而其未修飾的DNA適體對(duì)應(yīng)物在人類血清和FBS中孵育24小時(shí)后失去了穩(wěn)定性。[0061]圖23:WNVDIII側(cè)鏈修飾的和未修飾的適體B99在人類血清和FBS中穩(wěn)定性的比較。側(cè)鏈修飾的適體B99是高穩(wěn)定性的，然而其未修飾的DNA適體對(duì)應(yīng)物在人類血清和FBS中孵育24小時(shí)后失去了穩(wěn)定性。[0062]圖24:WNVDIII側(cè)鏈修飾和未修飾的適體的功能性的比較。側(cè)鏈修飾的適體B03和B99結(jié)合至WNVDili蛋白，然而未修飾的DNA適體B03和B99則不能。[0063]圖25:不同未生物素化的修飾的適體和抗體，和WNVDIII蛋白之間結(jié)合的比較。涂覆修飾的適體并且使用生物素化的WNVDili蛋白（BNWNDIII)評(píng)估它們的結(jié)合效率。[0064]圖26:用于登革熱病毒血清2型包膜蛋白結(jié)構(gòu)域III(DENV2-rEDIII)的克隆策略。A.示意圖示出了重疊延伸PCR(OE-PCR)技術(shù)用于獲得用于適體的下游篩選和評(píng)價(jià)的生物素化的DENV2-rEDIII(DENV2BN-rEDIII)。設(shè)計(jì)片段1從而使得3'懸垂部與片段2的5'懸垂部互補(bǔ)。同樣地，引物B和引物C彼此互補(bǔ)。兩個(gè)片段均通過互補(bǔ)序列連接在一起且通過引物A和D擴(kuò)增。B.使用0E-PCR生成重組DENV2-rEDIII蛋白的構(gòu)建體。生物素受體多肽(BAP)在6xHis標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)的下游，但是在腸激酶切割位點(diǎn)的上游，然而片段2編碼DENV2-rEDIII蛋白。位于N-端的6xHis標(biāo)簽用于親和純化，而BAP是用于生物素化的信號(hào)肽。包括凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn)以在沒有標(biāo)簽的情況下獲得感興趣的蛋白。C.構(gòu)建體的示意圖示出了親和標(biāo)簽、蛋白酶切割位點(diǎn)、生物素化位點(diǎn)和感興趣的蛋白。使用相似的克隆策略以獲得DENV1、3和4BN-rEDIII蛋白。[0065]圖27:示意圖示出了涉及用于下游篩選和評(píng)估適體的DENVl-4BN-rEDIII蛋白的制備的逐步方法。[0066]圖28:純化的生物素化的DENV2BN-rEDIII蛋白的制備。用于DENV2BN-rEDIII蛋白的純化的FPLC-SEC色譜曲線圖。兩個(gè)跡線對(duì)應(yīng)于在280nm處的蛋白質(zhì)的UV吸收（虛線：DENV2rEDIII，實(shí)線:DENV2BN-rEDIII)。由于生物素化的和未生物素化的DENV2Dili蛋白之間的分子量的差異，跡線沒有完全重疊。（B)在SEC純化之前（泳道2)和之后（泳道3:FPLC純化的部分1;泳道4:FPLC純化的部分2)DENV2BN-rEDIII蛋白的Western印跡分析。星號(hào)(*)表示純化的DENV2BN-rEDIII單體蛋白質(zhì)）。[0067]圖29:用于使用表面等離子體共振（SPR)針對(duì)DENV2rEDIII蛋白測(cè)試不同修飾的適體的Biacore傳感圖的峰頂高度。選擇通過標(biāo)號(hào)為1-10的菱形表示的修飾的適體用于進(jìn)一步評(píng)估。[0068]圖30:用于修飾的適體親和力篩選的蛋白質(zhì)涂覆的ELMASA。將DENV2rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。與對(duì)照相比，修飾的適體B006、B012和B027與DENV2rEDIII蛋白具有顯著的結(jié)合。[0069]圖31:用于修飾的適體親和力篩選的蛋白質(zhì)涂覆的ELMASA。將DENV1rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。與對(duì)照相比，測(cè)試的全部10種修飾的適體與DENV1rEDIII蛋白均不具有顯著的結(jié)合。[0070]圖32:用于修飾的適體親和力篩選的蛋白質(zhì)涂覆的ELMASA。將DENV3rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。與對(duì)照相比，測(cè)試的全部10種修飾的適體與DENV1rEDIII蛋白均不具有顯著的結(jié)合。[0071]圖33:用于修飾的適體親和力篩選的蛋白質(zhì)涂覆的ELMASA。將DENV4rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板上。與對(duì)照相比，測(cè)試的全部10種修飾的適體與DENV1rEDIII蛋白均不具有顯著的結(jié)合。[0072]圖34:用于修飾的適體親和力篩選的DENV2涂覆的ELMASA。將野生型DENV2涂覆在maxisorp板上。與對(duì)照相比，在全部測(cè)試濃度下，修飾的適體B118、B121和B128均顯著地結(jié)合。相反，其他修飾的適體僅在高于4nM的濃度下顯著地結(jié)合至病毒。[0073]圖35:通過lyM的修飾的適體中和DENV2的百分比。通過結(jié)合至DENV2的包膜蛋白，修飾的適體B60、B121和B128顯著地阻止了病毒的進(jìn)入。[0074]圖36:用于針對(duì)其他黃病毒的潛在交叉反應(yīng)的確定的蛋白涂覆的ELMASA。將(A)WNVDIII、（B)TBEV-281或（C)JEV-290包膜蛋白涂覆在maxisorp板上。修飾的適體不與WNVDIII、TBEV和JEV包膜蛋白交叉反應(yīng)。[0075]圖37:用于適體親和力篩選的蛋白涂覆的ELMASA。將DENV1-4和WNV的rEDIII蛋白、以及TBEV(TBEV-281)和JEV(JEV-290)的包膜蛋白涂覆在maxisorp板上以測(cè)試商購(gòu)適體(D2A)的結(jié)合。適體D2A沒有表現(xiàn)出與全部測(cè)試的黃病毒包膜或DIII蛋白的任何結(jié)合活性。[0076]圖38:用于修飾的適體B128與其他黃病毒包膜或EDIII蛋白的交叉反應(yīng)的評(píng)估的蛋白涂覆的ELMASA。將DENV1-D4rEDIII、WNDIII，或TBEV和JEV的包膜蛋白涂覆在maxisorp板上。修飾的適體B128僅與DENV2rEDIII蛋白顯著結(jié)合，但是不與測(cè)試的其他靶蛋白顯著結(jié)合。[0077]圖39:示意圖示出了涉及針對(duì)DENV2rEDIII蛋白的修飾的適體的評(píng)估的逐步方法。[0078]本發(fā)明的目標(biāo)在于開發(fā)使用修飾的適體的新的平臺(tái)，以用于黃病毒，特別是西尼羅病毒和登革熱病毒的診斷和治療應(yīng)用。[0079]有利地，本發(fā)明利用修飾的適體而不是傳統(tǒng)DNA或RNA適體，由此DNA鏈包含修飾的氨基酸側(cè)鏈。這些氨基酸側(cè)鏈形成適體與靶蛋白之間的額外的分子間相互作用，因此產(chǎn)生更高的親和力相互作用。修飾的適體技術(shù)可以用于開發(fā)新的治療劑，以及用于黃病毒感染的診斷的新平臺(tái)。[0080]作為概念的證明，對(duì)于修飾的適體的設(shè)計(jì)，將西尼羅病毒和登革熱病毒血清2型包膜結(jié)構(gòu)域m(Diii)蛋白用作抗原/靶蛋白。對(duì)于每種蛋白，針對(duì)io13個(gè)適體的隨機(jī)庫(kù)篩選蛋白的結(jié)合，然后識(shí)別針對(duì)每種蛋白的特異性且強(qiáng)力結(jié)合的適體。通過評(píng)估選擇的適體與每種純化的Dili蛋白和病毒中全長(zhǎng)E蛋白的結(jié)合特性，識(shí)別可以用于診斷和治療應(yīng)用的適體。評(píng)估用于每種蛋白的十種潛在適體候選物并且結(jié)論將在下文中討論?！揪唧w實(shí)施方式】[0081]將參考下文的非限定性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。[0082]實(shí)施例1:西尼羅病毒(WNV)包膜DIII蛋白修飾的適體的評(píng)估[0083]材料和方法[0084]pET28aWNE-BNDIII質(zhì)粒的構(gòu)建。WNE-DIII基因（Wengler菌株）亞克隆自包含WN-DIII基因的實(shí)驗(yàn)室原始質(zhì)粒。Dili基因預(yù)先擴(kuò)增自由西尼羅病毒W(wǎng)engler菌株合成的cDNA。如圖1所示，通過重疊延伸PCR(OE-PCR)，引物生物素_F、生物素_WNDIII_F、生物素_WNDII1_R和WNDIII_R(表1)用于連接包含腸激酶切割位點(diǎn)的生物素化信號(hào)肽基因和WNEDIII基因。通過Nhel和Xhol剪切位點(diǎn)，將含有連接的片段的凝膠-純化的PCR產(chǎn)物隨后克隆到pET28a表達(dá)載體(Novagen，德國(guó)hexHis標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)位于生物素化的信號(hào)肽的N-端處，然后是位于C-端的腸激酶切割位點(diǎn)和WNDIII蛋白。進(jìn)行DNA測(cè)序以驗(yàn)證構(gòu)建體。[0085]表1.用于克隆的生物素化的WNVDili蛋白的引物的列表。粗體的字母是限制酶識(shí)別位點(diǎn)，而下劃線的字母是重疊PCR位點(diǎn)。[0088]蛋白的表達(dá)和提取。將pET28aBNWNDIII質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為BL-21-DE3表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞(AgilentTechnologies，USA)且在包含30iig/ml的卡那霉素（kanamycin)的Luria-Bertani(LB)瓊脂上生長(zhǎng)。在1L的LB肉湯（30μg/ml的卡那霉素）中在30°C下培養(yǎng)選擇的克隆，直到吸收率〇D6Q()為0.6。使用ImM的異丙基0-D-硫代半乳糖苷（IPTG)在16°C過夜誘導(dǎo)BN-WNDIII蛋白的表達(dá)。在4°C下使用離心在8000rpm下進(jìn)行15分鐘沉淀(pelleteddown)細(xì)菌細(xì)胞。表達(dá)的蛋白靶向內(nèi)含體。為了分離內(nèi)含體，在溶解緩沖劑(20mM的Tris(三羥甲基氨基甲烷），pH8.0,500!^的似(：1，10111]\1的咪唑）中再懸浮小球化6116〇，然后在冰浴中超聲處理（15分鐘，1OAmp)。在4°C下以12，OOOrpm離心裂解物15分鐘。獲得內(nèi)含體的小白透明小球。之后使用相同的溶解緩沖劑清洗內(nèi)含體小球，然后在室溫下使用提取緩沖劑(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaC1，1OmM的咪唑，pH8.0)進(jìn)行孵育30分鐘。隨后通過13，500rmp的離心澄清裂解物20min〇[0089]純化。使用銀-氮川三乙酸(]1；[01^1-11；[1：1'；[101：1'1&061:;[。&(^(1)(附-1^\)樹脂(13;[0-Rad，USA)孵育包含BN-WNDIII蛋白的提取的內(nèi)含物體，以用于在4°C下在色譜柱中的過夜結(jié)合。使用十個(gè)柱體積的清洗緩沖劑(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，10mM的咪唑，pH8.0)以洗掉非特異性結(jié)合的蛋白。最終在六個(gè)部分(fraction)中使用洗脫緩沖劑(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，500mM的咪唑，pH8.0)洗脫出BN-WNDIII蛋白。接下來，將全部的洗脫物合并用于再折疊。簡(jiǎn)言之，將洗脫物集中至SnakeSkin透析膜管(ThermoScientific，USA)并且將0.5%的Tween-20加入到樣本中。在4°C下在1L的6M脲中孵育透析管6-12小時(shí)，并且每6-12小時(shí)將250ml的25mM的Tris(pH8.0)加入至溶液。當(dāng)最終的體積達(dá)到3L時(shí)，將透析管轉(zhuǎn)移至2L的25mM的Tris和150mM的NaCl(pH8.0)持續(xù)6小時(shí)。從透析管中收集再折疊的WNDIII蛋白。將包含感興趣的蛋白的部分(fraction)注射到FPLC機(jī)器并且進(jìn)一步通過在PBS中的排阻色譜進(jìn)行純化。[0090]蛋白身份分析。通過SDS-PAGE和Western印跡（蛋白質(zhì)印記）分析從流過（flowthrough)、清洗和洗脫收集的樣本。12%Tris-tricine聚丙稀酰胺變性膠用于分離樣本中的蛋白，并且隨后使用用于蛋白檢測(cè)的考馬斯藍(lán)(Coomassieblue)染色。通過兩種不同方法通過Western印跡證實(shí)生物素化的WNDIII蛋白的存在。首先使用抗His抗體確認(rèn)WNDIII蛋白的身份（identity)。簡(jiǎn)言之，使用?干印記系統(tǒng)(LifeTechnologies，USA)將分離的蛋白從聚丙烯酰胺膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在室溫下使用5%的BSA持續(xù)1小時(shí)完成封閉。接下來，在4°C下使用0?lμg/ml鼠抗-His抗體(Qiagen，Germany)過夜孵育膜。然后使用lxTBST清洗膜并且使用〇.lμg/ml的結(jié)合有HRP的山羊抗-小鼠第二抗體(ThermoScientific，USA)在室溫下孵育1小時(shí)。在使用lxTBST清洗之后，使用SuperSigiial?WestPico化學(xué)發(fā)光底物(Thermo3(^6的1行(3，1^4)將膜顯影。對(duì)于第二種方法，使用結(jié)合有冊(cè)?的鏈親和素直接檢測(cè)WNDIII蛋白。在將樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜之后，使用4%的BSA在室溫下封閉1小時(shí)。然后，在室溫下使用HRP結(jié)合的鏈親和素(Millip〇re，USA)孵育膜另一個(gè)小時(shí)。隨后，在室溫下使用lxPBST完全清洗膜1小時(shí)，并且使用化學(xué)發(fā)光底物顯影。相似的純化程序用于未生物素化的WNDIII的制備。[0091]用于質(zhì)譜的樣本制備。使用12%的Tris-tricine聚丙稀酰胺變性膠通過SDS-PAGE將純化的蛋白（BN-WNDIII和WNDIII)電泳，并且使用考馬斯藍(lán)染色。使用脫色溶液(40%的甲醇，10%的冰醋酸，50%的蒸餾H20)去除考馬斯-染色凝膠的背景。從凝膠中切除BN-WNDIII蛋白-相關(guān)的帶并且保留在含有蒸餾水的微量離心管(eppendorf管）中。樣本提交至用于質(zhì)譜分析的蛋白和蛋白質(zhì)組中心，生物科學(xué)學(xué)院，NUS(ProteinandProteomicsCentre，DepartmentofBiologicalSciences，NUS)〇[0092]用于生物素化的酶連免疫吸收實(shí)驗(yàn)（ELISA)。將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品一式三份添加至MaxiSorp板(eBi〇SCienCe，USA)的孔(well)中。使用鋁箱覆蓋板并孵育2小時(shí)。在室溫下進(jìn)行全部的孵育和清洗步驟。在使用lxPBST清洗之后，將封閉緩沖劑添加至每個(gè)孔中并孵育另外一小時(shí)。接下來，添加鏈親和素-HRP酶結(jié)合物并孵育1小時(shí)。使用lxPBST清洗板以去除未結(jié)合的結(jié)合物，并且然后添加底物溶液、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)以用于顯影。通過添加0.5M的H2S〇4溶液停止反應(yīng)。立即在450nm下測(cè)量吸收率。通過ELISA測(cè)試每批FPLC純化的BN-WNDIII蛋白以確保蛋白是生物素化的。[0093]生物素化的蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)。根據(jù)制造商的方案，使用鏈親和素磁珠（GEHealthcare，UK)測(cè)試純化的生物素化的WNDIII蛋白的連接親和力。簡(jiǎn)言之，將樣本與鏈親和素磁珠混合并在溫和混合下孵育30分鐘。使用清洗緩沖劑去除未結(jié)合的蛋白，同時(shí)使用試劑盒中提供的洗脫緩沖劑洗脫出生物素化的蛋白。通過Western印跡和ELISA分析洗脫的蛋白。[0094]用于適體設(shè)計(jì)的Se1ex程序：AptaBi〇sciencesPteLtd，（AdaptamerBiosolutions)www.aptabiosciences.com,31BiopolisWay，#02_25Nanos，Singapore138669,電話：+65-3109-0178,傳真：+65-6779-6584,手機(jī)+65-9184-7323)，曾用名FujitsuBiolaboratories〇Bi〇-laboratories，R&DDivision,(FujitsuAsiaPteLtd,FujitsuLaboratoriesLtd.,NanotechnologyBusinessCreationInitiative,3IBiopolisWay，#02_25Nanos，Singapore)〇[0095]適體的設(shè)計(jì)和合成：Fujitsu，Biolaboratories，Singapore。[0096]使用BN-WNDIII蛋白的表面等離子體共振(SPR)分析:Fujitsu(圖5)[0097]用于親和力計(jì)算的使用WNDIII的SPR分析:Fujitsu(表2)[0098]用于評(píng)估的由Fujitsu接收的十種適體是下列項(xiàng)：[0099]未生物素化的適體:N03、N66、N67、N71、N73、N74、N76、N79、N97、N99[0100]生物素化的適體:B03、B66、B67、B71、B73、B74、B76、B79、B97、B99[0101]表2:選擇的適體的列表用于在使用SPR測(cè)量它們的親和力之后進(jìn)一步評(píng)估。[0103]用于表面篩選的酶連接的修飾的適體的吸收實(shí)驗(yàn)(ELMASA)。為了增強(qiáng)適體分子與靶蛋白的結(jié)合，將由氨基酸側(cè)鏈組成的修飾的適體結(jié)合到DNA主鏈中。為了選擇用于修飾的適體的分析的適合的表面，測(cè)試四種不同的ELISA表面。（Nunc-Multisorp、Polysorp、Medisorp和Maxisorp)。簡(jiǎn)言之，將50ng的生物素化的適體和不同濃度的BN-WNDIII蛋白添加至每個(gè)孔并且在4°C下過夜孵育。在過夜孵育之后使用4%的BSA進(jìn)行封閉，然后使用PBS清洗。之后，添加1:2000稀釋的鏈親和素-HRP酶結(jié)合物并孵育1小時(shí)。使用lxPBST清洗板6次以去除未結(jié)合的結(jié)合物。然后，添加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液以用于顯影，并且在室溫下孵育15分鐘。添加0.5i^H2S〇4溶液以停止反應(yīng)。立即在450nm下測(cè)量吸收率。[0104]用于親和力篩選的蛋白涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)。將100ng的純化的未生物素化的WNDIII蛋白涂覆在maxisorp板上，在4°C下過夜。在涂覆之后，使用PBS清洗ELISA板三次，并使用溶解于不含RNase的TE緩沖劑（Invitrogen)中的不同濃度（1.65nM至26nM/孔)的生物素化的適體孵育1小時(shí)。然后，添加1:2000稀釋的鏈親和素-HRP酶結(jié)合物并孵育1小時(shí)，然后進(jìn)行前文提及的標(biāo)準(zhǔn)程序。[0105]病毒涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)。代替使用Dili蛋白，將西尼羅病毒W(wǎng)engler菌株涂覆在ELISA板上。簡(jiǎn)言之，將1000PFU的病毒涂覆在每個(gè)孔中，然后在4°C下過夜孵育。使用1xF>BST清洗孔，然后使用4%的BSA封閉。在這個(gè)步驟之后，使用不同濃度的(0.3nM至26nM/孔)生物素化的適體（1-10)孵育孔1小時(shí)。然后，添加1:2000稀釋的鏈親和素-HRP酶結(jié)合物并孵育1小時(shí)，然后進(jìn)行前文提及的標(biāo)準(zhǔn)程序。在二級(jí)生物安全柜（BSCclass2)中進(jìn)行涂覆、清洗、適體添加和顯影。[0106]斑(plaque)減少中和測(cè)試(PRNT)。在使用之前，將幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞接種在24孔板中過夜。小心地解凍冷凍的病毒原液（virusstock)并稀釋為1000PFU/ml。為了達(dá)到50PFU/50yl西尼羅病毒W(wǎng)engler菌株，將各種濃度（1.25nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80礎(chǔ)、16511]\1、33〇11]\1、66〇11]\1、13.33虛、5處和10處/孔）的未生物素化的適體一式兩份地添加，并且允許孵育1.5小時(shí)以用于結(jié)合。從24孔板中去除細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)，使用2%的RPMI簡(jiǎn)短地清洗細(xì)胞單層并且然后用l〇〇yl的適體+病毒孵育混合物感染。在37°C和5%的C02下孵育板1小時(shí)，同時(shí)每15分鐘間隔恒定搖動(dòng)板。抽出（aspirate)接種體，簡(jiǎn)言之，使用2%的RPMI清洗，并且使用lml覆蓋介質(zhì)覆蓋每個(gè)孔。在37°C和5%的⑶2下孵育板4.5天，直到形成斑。使用在PBS中0.1%的結(jié)晶紫溶液染色細(xì)胞單層持續(xù)24小時(shí)。去除結(jié)晶紫溶液，在蒸餾水中清洗板并對(duì)斑計(jì)數(shù)。[0107]適體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):通過在三種不同的溫度下(_20°C、室溫和37°C)孵育固定濃度的適體1至5天測(cè)試適體的穩(wěn)定性。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后，通過運(yùn)行與GEL-RED預(yù)混合的1.5%的瓊脂糖凝膠來分析適體的完整性。樣本在40V運(yùn)行4小時(shí)且在紫外(UV)光下在Gel-doc上觀察。[0108]ApoTox-Glo三重實(shí)驗(yàn)。使用ApoTox-Glo三重實(shí)驗(yàn)試劑盒(Promega)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且使用Glomax儀器進(jìn)行讀取。簡(jiǎn)言之，以5000細(xì)胞/孔(5000細(xì)胞/0.11111)的細(xì)胞濃度將冊(cè)1(細(xì)胞接種到96孔實(shí)驗(yàn)板中，并且過夜孵育。在24小時(shí)之后，使用適體(3.3至26nM濃度/孔)和對(duì)于細(xì)胞毒性(毛地黃皂苷洗滌劑、MPER、膜蛋白提取劑）陽性對(duì)照處理細(xì)胞。在第1天和第4天時(shí)，使用20yl的活性/細(xì)胞毒性試劑孵育細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，通過軌道振動(dòng)以300rpm混合板30秒，并在37°C下孵育30分鐘。在兩個(gè)波長(zhǎng)集合中測(cè)量熒光，400Ex/505Em(活性)和485Ex/520Em(細(xì)胞毒性）。對(duì)于發(fā)光讀數(shù)，在每個(gè)孔中使用l〇〇yl的Capase-Glo3/7試劑接種板。簡(jiǎn)言之，通過軌道振動(dòng)以300rpm混合板30秒，并在室溫下孵育30分鐘。[0109]Alamar藍(lán)活性實(shí)驗(yàn)。使用alamarBlue細(xì)胞活力測(cè)試(Invitrogen)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并且使用Glomax儀器進(jìn)行讀數(shù)。以5000細(xì)胞/孔(5000細(xì)胞/0.11111)的細(xì)胞密度將冊(cè)1(細(xì)胞接種到96孔實(shí)驗(yàn)板中，并且過夜培養(yǎng)。在24小時(shí)之后，使用適體(3.3至26nM濃度)和對(duì)于細(xì)胞毒性(毛地黃皂苷洗滌劑、MPER、膜蛋白提取劑）陽性對(duì)照處理細(xì)胞。在第1、2、3和4天時(shí)，使用10yl的alamar藍(lán)試劑孵育細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，通過軌道振動(dòng)以300rpm混合板30秒，并在37°C下孵育1-4小時(shí)，避免直接光照。在570Ex/585Em下測(cè)量板的熒光。[0110]通過ELISA方法對(duì)血清中修飾的適體的穩(wěn)定性的確定:將已知量(40ng/孔）的生物素化的適體涂覆在Maxisorp板上并在RT下孵育2小時(shí)。然后在不同時(shí)間點(diǎn)（1、20、48和120小時(shí)）內(nèi)，在使用和不使用100%和20%的血清的情況下孵育板。使用4%的牛血清白蛋白(BSA)孵育陽性對(duì)照(僅適體(Justaptamer))。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)，去除血清和BSA。添加鏈親和素-HRP酶結(jié)合物（1:5000稀釋)并孵育1小時(shí)。使用1xPBST清洗板6次以去除未結(jié)合的結(jié)合物。然后，添加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液以用于顯影并在室溫下孵育15分鐘。添加0.511的秘〇4溶液以停止反應(yīng)。立即在450nm下測(cè)量吸收率。對(duì)于陰性對(duì)照，在95°C下煮沸適體(B03)48小時(shí)。如果適體被血清或加熱降解，則適體將不能被鏈親和素-HRP檢測(cè)。[0111]結(jié)果[0112]WNE-BNrDIII質(zhì)粒的構(gòu)建[0113]為了獲得用于適體篩選的西尼羅病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域III(WNE-BNrDIII)的生物素化蛋白，通過在N-端以及在BAP和WNDIII基因之間的腸激酶切割位點(diǎn)上對(duì)生物素化受體肽(BAP)進(jìn)行工程化，來設(shè)計(jì)新型質(zhì)粒構(gòu)建體。對(duì)應(yīng)于BAP的DNA序列是化學(xué)合成的(Cul1etal.，2000)，然而WNDIII序列獲得自先前的構(gòu)建體，其衍生自WNVWengler菌株的cDNA。如圖1A中的描述，隨后，具有腸激酶切割位點(diǎn)的BAP序列通過重疊延伸PCR(OE-PCR)在5'端處連接至WNDIII。使用Nhel和Xhol限制酶雙重消化最終的PCR產(chǎn)物和pET28a載體，并且重組的基因連接至消化的質(zhì)粒，其由多克隆位點(diǎn)的上游的6xHis標(biāo)簽組成。因此，包含WNDIII包膜蛋白的重組BAP已經(jīng)在N-端用2個(gè)標(biāo)簽克隆，即6xHis標(biāo)簽（用于親和純化)和生物素（用于結(jié)合至鏈親和素），并且包含兩鐘酶(凝血酶和腸激酶)切割位點(diǎn)（圖1B和1C)。然后將這種工程化的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，并且通過菌落PCR、限制性消化和DNA測(cè)序證實(shí)陽性克隆。質(zhì)粒的新穎性是已經(jīng)使用用于生物素化的WNDIII基因工程化了生物素受體肽(BAP)。這種構(gòu)建體可以用于體內(nèi)或體外生物素化。此外，凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn)能夠在純化后去除任一個(gè)或全部的標(biāo)簽。這允許用于下游蛋白選擇的純化的重組Dili蛋白與來自蛋白和/或適體庫(kù)的集合(P〇〇1)的配對(duì)物(partner)和/或適體相互作用。[0114]WNE-BNrDIII質(zhì)粒的表達(dá)[0115]為了表達(dá)重組蛋白，將工程化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到商購(gòu)大腸桿菌AVB-100中（獲得自GenecopoeiahAVB100大腸桿菌菌株在基因組DNA內(nèi)與過量表達(dá)的BiRA(生物素連接酶）基因結(jié)合。這種酶特異性地將生物素分子添加至BAP的賴氨酸殘基。最初，感興趣的蛋白(BAP-WNDIII)并未在大腸桿菌K12AVB-100中表達(dá)(圖15)。原因可能是由于在其他細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)蛋白的固有特性。以前，表達(dá)BL-21(DE3)中的WNEDIII蛋白。為了克服這個(gè)問題，改變策略以在大腸桿菌BL21DE3中表達(dá)BAP-WNDIII構(gòu)建體，然后使用BirA酶體外生物素化。當(dāng)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)構(gòu)建體時(shí)，在IPTG誘導(dǎo)的BL-21(DE)菌株的裂解物中檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于重組全長(zhǎng)BAP-WNrDIII蛋白的明顯的帶[圖2(A)(i)]。使用抗His抗體探測(cè)的Western印跡顯示出感興趣的重組蛋白在大腸桿菌BL-21(DE)中表達(dá)[圖2(A)(ii)]。在證實(shí)表達(dá)之后，擴(kuò)大培養(yǎng)體積以用于重組蛋白的大量生產(chǎn)。在培養(yǎng)之后，使用IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞。收獲細(xì)胞并分離內(nèi)含體（IB)。然后從IB提取粗蛋白并且使其經(jīng)歷在材料和方法中說明的His-標(biāo)簽親和純化、再折疊和排阻色譜。圖2(A)(iii)和（B)中示出了對(duì)應(yīng)于BAP-WNDIII蛋白的SDS-PAGE和FPLC曲線圖。為了比較，示出了對(duì)應(yīng)于未生物素化的WNDIII的跡線。使用這種純化程序，從1L的培養(yǎng)物中獲得了lmg的純化蛋白。通過進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化然后進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜（fingerprinting)通過質(zhì)譜進(jìn)一步證實(shí)了純化蛋白的身份（identity)。圖3中示出了表示重組蛋白的表達(dá)、純化和評(píng)估的示意流程圖。[0116]生物素化的蛋白的篩選：[0117]由于在K12菌株AVB100中表達(dá)構(gòu)建體的嘗試不成功，因此進(jìn)行使用Bir-A酶的體外生物素化。使用ELISA測(cè)試體外生物素化的WNDIII，并且結(jié)果示出在450nm的吸收率，其指示出重組的蛋白是生物素化的，并且在兩種實(shí)驗(yàn)條件（1小時(shí)和過夜反應(yīng)設(shè)置）下均結(jié)合至鏈親和素-HRP結(jié)合物。有趣的是，對(duì)照試驗(yàn)，即不使用BirA酶的樣本也在450nm下表現(xiàn)出高吸收率，這指示出其也結(jié)合至鏈親和素-HRP結(jié)合物（圖16)。為了證實(shí)內(nèi)源的體內(nèi)生物素化的WNDIII可以是人工的，在ELISA中重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。使用陽性和陰性對(duì)照，即生物素化的和未生物素化的麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)，以及無BAP的WN-DIII和登革熱1-4DIII蛋白[圖4(A)]。在全部的測(cè)試條件下，獲得了相同的結(jié)果，這指示出了BAP-WNDIII蛋白可以是內(nèi)源生物素化的。為了進(jìn)一步證實(shí)這點(diǎn)，進(jìn)行通過使用鏈親和素-HRP結(jié)合物的Western印跡[圖4(B)]和BeMag-鏈親和素珠的測(cè)試，并且發(fā)現(xiàn)了在表達(dá)過程中蛋白在特定BAP位點(diǎn)確實(shí)是內(nèi)源生物素化的（圖17)。[0118]內(nèi)源生物素化：[0119]在證明了在蛋白自身的表達(dá)過程中包含WNDIII蛋白的BAP是內(nèi)源體內(nèi)生物素化的之后，感興趣的將是理解生物素化可以如何內(nèi)源的發(fā)生，以及細(xì)胞中用于生物素化的生物素來源在哪。進(jìn)行對(duì)于大腸桿菌BL21(DE3)的基因組DNA序列中的BirA酶的生物信息學(xué)檢索，并且發(fā)現(xiàn)了在大腸桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)了編碼BirA的基因，其已經(jīng)用于表達(dá)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物素將存在于介質(zhì)中，其已經(jīng)用于培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞(Tolaymatetal.，1989)。因此，利用培養(yǎng)基中的生物素，通過在細(xì)胞中已經(jīng)存在的生物素連接酶內(nèi)源生物素化蛋白。從而，將BAP附接至感興趣的基因并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)它將產(chǎn)生內(nèi)源生物化的蛋白，因此排除了對(duì)于商購(gòu)表達(dá)菌株或體外生物素化的需要。因此，已經(jīng)建立了用于獲得用于生物應(yīng)用例如適體篩選的內(nèi)源生物化的、純化蛋白的平臺(tái)。檢查用于生物素化的每批純化蛋白并發(fā)現(xiàn)它們是一致的。也對(duì)其進(jìn)行測(cè)試以確定內(nèi)源生物素化對(duì)于通過克隆用于登革熱病毒衣殼蛋白的BAP的其他蛋白是否是通用的，并且證實(shí)了發(fā)現(xiàn)的衣殼(capsid)蛋白是內(nèi)源生物素化的。這表現(xiàn)出這種平臺(tái)可以潛在延伸至其他生物素化的蛋白，其在診斷和藥物開發(fā)中具有商業(yè)應(yīng)用。這已經(jīng)通過科技拓展公司(ExploitTchnologies)提交了臨時(shí)專利(新加坡專利申請(qǐng)第201208602-1，題目為:生物素化蛋白，提交日期：2012年11月22日，其內(nèi)容以參考的形式結(jié)合于本文中）。[0120]修飾的適體的評(píng)估[0121]表面選擇。[0122]為了測(cè)試適體的結(jié)合效率，通過涂覆50ng的生物素化的修飾的適體（1至10)，然后使用鏈親和素-HRP結(jié)合物檢測(cè)，來測(cè)試四種不同表面的適合性。相似地，也涂覆改變濃度的生物素化的WNDIII(10、25、50和100ng/孔)蛋白。結(jié)果在圖6中示出，盡管對(duì)于四個(gè)不同表面的全部實(shí)驗(yàn)環(huán)境均是相同的，但觀察到了結(jié)合的差異。在Multisorp板上，在450nm的吸收率指示適體和WNDIII蛋白的非常低的結(jié)合(對(duì)于適體在0.15下最大吸收率，且對(duì)于蛋白為0.1至0?5)。發(fā)現(xiàn)了對(duì)于適體，Polysorp和Medisorp板的結(jié)合效率相似(最大吸收率從2至2?5改變），相反對(duì)于WNDIII蛋白，其在從(0.1至1)的范圍內(nèi)。對(duì)于Maxisorp板，對(duì)于適體的吸收率從2.5至3變化，且對(duì)于蛋白為從0.2至1.3。因此，選擇Maxisorp板作為用于涂覆適體以及蛋白的良好表面，用于進(jìn)一步的評(píng)估。[0123]用于親和力篩選的蛋白涂覆的酶連接修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)。[0124]為了評(píng)估適體與WNDIII蛋白的特異性結(jié)合，進(jìn)行用于十種適體的蛋白涂覆的ELISA。涂覆WNDIII蛋白（100ng/孔)過夜，并且使用不同濃度(0至26nM)的生物素化的適體孵育，然后使用鏈親和素-HRP結(jié)合物探測(cè)。如果適體結(jié)合至WNDIII蛋白，則可以通過酶底物反應(yīng)檢測(cè)。在這種情況下，觀察到當(dāng)與對(duì)照和其他適體比較時(shí)，適體B03、B79和B99結(jié)合到WNDIII蛋白，因?yàn)樗鼈兊奈章曙@著較高（圖7,通過星號(hào)表示）。當(dāng)比較各個(gè)濃度的適體時(shí)，除在1.65nM濃度下，適體B03、B79和B99在全部濃度（3.3、6.6、13和26nM)下均顯著結(jié)合(P〈0.05)。這指示結(jié)合在1.65nM下可能是非顯著的。當(dāng)與圖7中示出的B03、B79和B99比較時(shí)，在測(cè)試的各個(gè)濃度下，其他適體較不顯著地結(jié)合至WNDIII蛋白，其中吸收率相對(duì)較低(0.05〈p-值〈0.1)〇[0125]病毒涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)。[0126]在證實(shí)修飾的適體能夠結(jié)合至純化的WNDIII蛋白之后，評(píng)估適體是否能夠結(jié)合至西尼羅包膜蛋白（如果涂覆整個(gè)病毒）。在ELISA板中涂覆西尼羅病毒W(wǎng)engler菌株(1000PFU/孔)過夜，然后使用不同濃度的適體孵育。仍觀察到適體B03、B79和B99特異性結(jié)合至病毒上存在的天然包膜蛋白中的結(jié)構(gòu)域IIK圖8)。當(dāng)比較各個(gè)濃度的適體時(shí)，與對(duì)照相比，對(duì)于全部濃度(0.3nM至26nM)適體B03、B79和B99均顯著結(jié)合(P〈0.05)。在其他適體的情況下，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诟哂?.3nM的濃度下顯著結(jié)合至病毒。這證明了在與其他適體相比時(shí)，B03、B79和B99具有較高的結(jié)合效果(甚至在較低的濃度下）。在病毒涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)的情況下，當(dāng)與其蛋白涂覆的對(duì)應(yīng)物相比時(shí)，吸收率的強(qiáng)度通常較高。這可以是由于在用于適體結(jié)合的病毒中的更多包膜蛋白的可用性，最終導(dǎo)致較高吸收率。使用陰性對(duì)照BSA和緩沖劑對(duì)照，并且發(fā)現(xiàn)它們的吸收率是可以忽略的。這個(gè)結(jié)果示出了修飾的適體可以特異性結(jié)合到野生型西尼羅病毒的天然結(jié)構(gòu)域III。這種修飾的適體也可以結(jié)合至其他西尼羅病毒菌株，即Sarafend和Kunjin病毒菌株（圖9)適體B03、B67、B73和B99在高于3.3nM的濃度下顯著結(jié)合至Sarafend菌株，而適體803、866、867、873和879在高于3.3礎(chǔ)的濃度下顯著結(jié)合至Kunjin菌株。這些結(jié)果指示出開發(fā)的修飾的適體可以用于西尼羅病毒的不同菌株的檢測(cè)?？梢允褂脙煞N不同的適體建立基于原型適體的診斷。一種未標(biāo)記的適體附接至測(cè)試樣本可以添加至其上的表面。因此，第一適體將結(jié)合至抗原，然后其可以使用第二生物素化的適體（用于ELISA或用于檢測(cè)的基因盒)或附接至適體的熒光體(通過成像、微流體或微毛細(xì)管檢測(cè))來檢測(cè)。這樣，可以將適體的應(yīng)用擴(kuò)展用于黃病毒屬的診斷目的以及也擴(kuò)展以識(shí)別它們的不同菌株。[0127]通過修飾的適體中和西尼羅病毒。[0128]因?yàn)橐呀?jīng)確定修飾的適體能夠結(jié)合至純化的WNDIII和野生型西尼羅病毒的包膜蛋白中的天然DIII，然后測(cè)試適體中和WNV的能力。使用不同濃度的適體孵育病毒，然后使用適體處理的或未處理的病毒感染BHK細(xì)胞。在一小時(shí)后去除處理或未處理的病毒。在感染之后的第4天將板染色并且觀察斑的形成。在較低濃度的適體處理中，沒有中和活性。在5yM和10yM的適體處理中，斑的數(shù)量明顯減少。圖10示出了對(duì)于不同測(cè)試濃度獲得的中和百分比。觀察到5yM的N03、N71、N79和N99的處理示出了約30-35%中和，相反其他適體示出小于30%的中和。當(dāng)適體處理濃度為10yM時(shí)，N03和N99示出了高于50%的中和。這些結(jié)果示出了N03和N99具有開發(fā)針對(duì)西尼羅病毒的治療劑的潛力。[0129]用于修飾的適體的活性實(shí)驗(yàn)[0130]由于將開發(fā)用于治療劑的適體的可能性非常高，因此測(cè)試使用修飾的適體處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞是否導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。為了檢查在適體處理過程中細(xì)胞活性的結(jié)果，進(jìn)行兩個(gè)不同組的活性實(shí)驗(yàn)。第一個(gè)涉及使用apotox-glo三重實(shí)驗(yàn)，而第二個(gè)涉及使用alamar藍(lán)活性實(shí)驗(yàn)。使用不同濃度的適體處理細(xì)胞，然后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（處理后24、36、48和60小時(shí)）測(cè)試活性。圖11中示出了通過兩種方法獲得的結(jié)果。結(jié)果表明在測(cè)試濃度下，與正常未處理的細(xì)胞相比，適體沒有表現(xiàn)出任何細(xì)胞毒性且細(xì)胞仍存活。陽性對(duì)照如MPER和毛地黃皂苷處理表現(xiàn)出失去細(xì)胞活性。結(jié)果可以與使用alamar藍(lán)進(jìn)行的活性實(shí)驗(yàn)相比較。因此，結(jié)合的結(jié)果指示在3.3至26nM的處理?xiàng)l件下，在多至處理后60小時(shí)時(shí)，細(xì)胞與未處理的細(xì)胞一樣存活。[0131]適體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):[0132]通過在三個(gè)不同的溫度(_20°C、室溫和37°C)孵育適體不同的時(shí)間段（1至5天），然后檢查凝膠-紅染色的瓊脂糖膠中修飾的適體的完整性，來測(cè)試適體的穩(wěn)定性。圖12示出了在室溫和37°C下孵育5天的適體仍是穩(wěn)定且完整的，并且通過凝膠紅可以檢測(cè)它們相應(yīng)的帶。[0133]人類血清中適體的穩(wěn)定性:[0134]將測(cè)試修飾的適體的穩(wěn)定性擴(kuò)展至在血清存在下，作為開發(fā)這些用于治療應(yīng)用的適體的可能性的第一步。涂覆生物素化的適體，然后孵育人類血清持續(xù)不同的時(shí)間點(diǎn)（1、20、48和120小時(shí)）。圖13示出了獲得的在100%和20%的血清中測(cè)試的不同適體的穩(wěn)定性的ELISA結(jié)果?？梢杂^察到發(fā)現(xiàn)適體在血清中約120小時(shí)內(nèi)是高穩(wěn)定性的。當(dāng)僅適體(條a)的吸收率與使用100%的血清(條b)和20%的血清(條c)處理48和120小時(shí)的適體比較時(shí)，它們是可比較的，不具有任何主要的改變(吸收率(abs)>1.6)。相反，在陰性樣本(B03在95°C下加熱48小時(shí)）中，在450nm下的吸收率非常低(吸收率〈0.5)指示出在95°C下連續(xù)加熱使適體失去穩(wěn)定性。[0135]結(jié)論：[0136]1.第一次設(shè)計(jì)了用于生物素化的WNDIII的制備的新型質(zhì)粒構(gòu)建體。使用用于生物素化的WNDIII基因工程化了生物素受體肽(BAP)。這種構(gòu)建體可以用于體內(nèi)或體外生物素化。此外，凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn)能夠去除純化標(biāo)簽以在純化之后產(chǎn)生天然蛋白。[0137]2.發(fā)現(xiàn)了在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的BAP-WNDIII質(zhì)粒構(gòu)建體產(chǎn)生了內(nèi)源生物素化的蛋白。通過ELISA和Western印跡證實(shí)了這種內(nèi)源生物素化。[0138]3.內(nèi)源生物素化對(duì)WNDIII蛋白是非特異性的且可應(yīng)用于任何感興趣的蛋白。也通過使用登革熱病毒衣殼蛋白克隆BAP來測(cè)試，并且通過ELISA和Western印跡發(fā)現(xiàn)了衣殼和登革熱2包膜Dili蛋白均是內(nèi)源生物素化的。[0139]4.建立了一種平臺(tái)以獲得用于生物應(yīng)用如適體篩選以及研究蛋白-蛋白相互作用的內(nèi)源生物素化的、純化的蛋白。[0140]5.生物素化的蛋白可以用于黃病毒屬的診斷和治療的開發(fā)，并且可以擴(kuò)展至其他醫(yī)學(xué)重要病原體。[0141]6.作為概念驗(yàn)證，生物素化的WNDIII蛋白用于通過FujitsuLaboratories對(duì)修飾的適體進(jìn)行篩選和選擇。[0142]7.初始篩選從庫(kù)中產(chǎn)生了十種適體的選擇，其均通過表面等離子體共振結(jié)合至WNDIII蛋白。在序列鑒別之后，F(xiàn)ujitsu的科學(xué)家合成十種適體(生物素化和非生物素化的適體)用于評(píng)估。[0143]8.對(duì)于結(jié)合和中和，針對(duì)WNDIII蛋白和西尼羅病毒評(píng)估十種適體。也對(duì)于任何細(xì)胞毒性效果和它們的穩(wěn)定性評(píng)估適體。[0144]9.對(duì)ELISA板的表面完成初始評(píng)估。選擇Maxisorp板作為用于涂覆適體以及WNDIII蛋白的良好的表面以用于進(jìn)一步的評(píng)估。[0145]10.用于親和力篩選的蛋白涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)顯示出，當(dāng)與其他適體比較時(shí)，適體B03、B79和B99顯著地結(jié)合至WNDIII蛋白。[0146]11.病毒涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)示出了，適體B03、B79和B99特異性結(jié)合至存在于野生型病毒上的天然包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域IIK甚至在較低濃度的適體下）。[0147]12.對(duì)于WNV的Sarafend菌株，在高于3.3nM的濃度下適體B03、B67、B73和B99顯著地結(jié)合，而對(duì)于Kunjin菌株，在高于3.3nM的濃度下適體仙3、866、867、873和879顯著的結(jié)合。這指示了開發(fā)的修飾的適體可以用于不同菌株的西尼羅病毒的檢測(cè)。[0148]13.基于前文的評(píng)估，這些適體可以開發(fā)為用于西尼羅病毒檢測(cè)的診斷工具，并且也可以擴(kuò)展至包括登革熱和日本腦炎和其他病原體的其他黃病毒屬。此外，適體也可以用于開發(fā)用于在學(xué)術(shù)研究中的病毒探測(cè)的分子探針。[0149]14.病毒中和實(shí)驗(yàn)示出了5福處理的適體_3471、階9和湘9產(chǎn)生了約30-35%中和，相反其他適體示出小于30%的中和。當(dāng)適體處理的濃度在10yM時(shí)，N03和N99示出了高于50%的中和。這些結(jié)果示出了N03和N99具有開發(fā)針對(duì)西尼羅病毒的治療劑的潛能。[0150]15.活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指示了在3.3至26nM的適體處理的測(cè)試條件下，在至少60小時(shí)內(nèi)細(xì)胞是存活的，類似于未處理的細(xì)胞。[0151]16.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)示出當(dāng)在室溫和37°C下孵育適體5天時(shí)，適體是穩(wěn)定且完整的，并且通過凝膠紅可以檢測(cè)到帶。[0152]17.血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)示出了通過ELISA檢測(cè)在RT下在100%的血清中直到120小時(shí)(5天)適體是穩(wěn)定的。[0153]18.在圖3和14中示出了用于BN-WNDIII蛋白的制造和針對(duì)WNDIII蛋白的適體的評(píng)估的完整的平臺(tái)。[0154]19.用于治療應(yīng)用的基于評(píng)估的針對(duì)WNV選擇的三種最好的候選適體是N03、N67和N99(未標(biāo)記的適體），和用于診斷應(yīng)用的B03、B67和B99(生物素化的適體）。表3中列出了序列。這些序列將進(jìn)一步修飾和評(píng)估以用于更高的親和力。[0155]表3:最好的三種抗-WNDIIIA-D適體的適體序列[0157]1.主鏈核苷酸表示為大寫字母；[0158]A:腺嘌呤，G:鳥嘌呤，C:胞嘧啶，T:胸腺嘧啶[0159]2.側(cè)鏈的官能基團(tuán)表示為小寫字母；[0160]b:噻吩，e:谷氨酸、f:苯丙氨酸、h:組氨酸、k:賴氨酸、1:亮氨酸、s:絲氨酸、y:酪氨酸、w:色氨酸[0161]3.天然核苷酸表示為下劃線(_)。[0162]下列實(shí)施例評(píng)估用于人類和胎牛血清中WNVDIII的修飾的適體的穩(wěn)定性和功能性。也進(jìn)行與其他修飾和未修飾的適體和商購(gòu)的適體和抗體的比較研究。[0163]實(shí)施例2:血清中WNDIII適體的穩(wěn)定性和功能性的評(píng)估[0164]人血清中的適體的穩(wěn)定性。[0165]為了通過ELISA測(cè)試修飾的適體的穩(wěn)定性，將生物素化的WNDIII適體(獲得自AptaBiosciencesPteLtdwww.aptabiosciences.com,31BiopolisWay,#02-25Nanos，Singapore138669，Phone:+65-3109-0178，F(xiàn)ax:+65-6779-6584，Mobile:+65-9184-7323)，曾用名為FujitsuBiolaboratories的803、866、871、873、874、876和879)涂覆在1^1丨8〇鄺板(40ng/孔)上，然后在不同的持續(xù)時(shí)間內(nèi)使用人類血清孵育。如果適體是不穩(wěn)定的，則其可以在沖洗過程中降解或被去除。此外，穩(wěn)定的修飾的適體可以保持結(jié)合至maxisorp板。然后可以通過鏈親和素-HRP結(jié)合物檢測(cè)生物素化適體的存在，從而產(chǎn)生TMB底物轉(zhuǎn)化。如圖18所示，監(jiān)控修飾的適體的血清穩(wěn)定性最多至14天，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)與其他相應(yīng)的不含血清的對(duì)照相比時(shí)，修飾的適體的血清穩(wěn)定性在50%和90%之間改變。陰性對(duì)照涉及在95°C下加熱修飾的適體B0348小時(shí)，這示出了修飾的適體在延長(zhǎng)加熱的情況下是不穩(wěn)定的。[0166]根據(jù)在人類血清中適體穩(wěn)定性研究的結(jié)果，修飾的適體可以分類為類型1:適度的穩(wěn)定(B74)，類型2:高的穩(wěn)定(803、866、871、873、876)和類型3:非常高的穩(wěn)定(879)。這暗示了修飾的適體B79的主鏈可以用作起始模板以在將來產(chǎn)生高穩(wěn)定的適體。盡管修飾的適體B79表現(xiàn)出具有最高的穩(wěn)定性(可以從圖18中看出），但是選擇修飾的適體B03和B99用于進(jìn)一步的研究，這是由于它們?cè)诰哂凶詈媒Y(jié)合和病毒中和的最好的三種修飾的適體中，并且具有開發(fā)診斷劑或治療候選物的潛力。盡管如此，這個(gè)實(shí)驗(yàn)示出了與其他適體(Kauretal.，2013，Pengetal.，2007)相比修飾的適體在血清中是更穩(wěn)定的，并且可以是具有長(zhǎng)的生理半衰期的潛在治療劑。[0167]也進(jìn)行在胎牛血清(FBS)中的修飾的適體B03的持續(xù)5天的穩(wěn)定性的比較。圖19示出了修飾的適體B03在FBS中穩(wěn)定性隨時(shí)間降低。一種可能的原因是由于在FBS中存在去穩(wěn)定劑諸如牛核酸酶。先前的研究已經(jīng)示出了B細(xì)胞受體的未修飾的適體在血清中具有1小時(shí)的半衰期，相反使用鎖核酸（1ockednucleicacid)(LNA)的修飾將半衰期增加至~9小時(shí)(Mallikaratchyetal.，2010)。修飾的適體示出了在100%人血清中最多至14天和在100%的FBS中最多至4天的核酸酶抗性。[0168]人血清中修飾的適體的功能測(cè)試[0169]在人血清和胎牛血清中適體與WNVDili和WNV的結(jié)合[0170]使用ELISA作為平臺(tái)，使用WNVDili蛋白或WNV涂覆maxisorp板。然后添加不同濃度的生物素化的WNVDili修飾的適體B03,并且孵育2小時(shí)，以允許修飾的適體結(jié)合至靶標(biāo)。接下來，隨后添加凈人類血清或FBS，并孵育不同的時(shí)間段。是在孵育之后，使用鏈親和素_HRP結(jié)合物探測(cè)修飾的適體的存在，然后通過TMB底物顯影。圖20示出了當(dāng)使用WNVDili蛋白涂覆maxisorp板時(shí)，發(fā)現(xiàn)了對(duì)于測(cè)試的兩種適體濃度，修飾的適體B03均能夠在最多至24小時(shí)內(nèi)結(jié)合至人類血清中的靶蛋白。從圖21可以看出，相似地，修飾的適體B03能夠在最多至48小時(shí)內(nèi)結(jié)合至人類血清中的野生型WNV。相反，這種結(jié)合至病毒的能力在FBS中逐漸降低。這可能還是由于FBS中的適體的不穩(wěn)定性。[0171]通過ELISA對(duì)未修飾的適體的穩(wěn)定性和功能性的評(píng)估[0172]合成對(duì)應(yīng)于WNVDili修飾的適體B03和B99(即，未修飾的適體）的DNA主鏈的多核苷酸(SigmaAldrich，USA)，用于與修飾的適體(其具有肽側(cè)鏈)比較穩(wěn)定性和功能性。對(duì)應(yīng)于WNVDili修飾的適體B03和B99的DNA主鏈的核苷酸序列在下文中列出。[0174]對(duì)于穩(wěn)定性比較研究，在人類血清或FBS中，在改變的持續(xù)時(shí)間下在室溫下(RT)孵育已知量的未修飾的DNA適體。然后通過在ELISA中使用鏈親和素-HRP結(jié)合物的檢測(cè)來確定它們的穩(wěn)定性。[0175]基于圖22和23中示出的穩(wěn)定性研究，可以推斷WNDIII修飾的適體B03(參見圖22)和B99(參見圖23)在人類血清中非常穩(wěn)定且在FBS中適度的穩(wěn)定。相應(yīng)的未修飾的DNA適體(對(duì)應(yīng)于適體B03和B99的核苷酸序列）的穩(wěn)定性應(yīng)在人類血清和FBS中低得多。這指示了在修飾的適體中通過側(cè)鏈修飾提供了額外的穩(wěn)定性。相似地，當(dāng)測(cè)試WNVDili側(cè)鏈修飾的適體B03和B99以及它們的未修飾的DNA對(duì)應(yīng)物的功能性時(shí)，觀察到未修飾的DNA適體不能結(jié)合至靶蛋白，這可以從圖24中看出。[0176]與WNVDili商購(gòu)抗體結(jié)合的適體的比較[0177]使用ELISA平臺(tái)，將相同濃度（33nM)的適體(B03、B79、B99、B66、B67、B7lWPWmM#異性抗體(MilliporeMAB8151)涂覆在maxisorp板上，從而捕獲生物素化的WNVDili蛋白。圖25示出了適體和抗體均能夠捕獲WNVDili蛋白。修飾的適體B99具有最強(qiáng)的結(jié)合并且可以與抗體相比。接下來依次是修飾的適體卻3、879、866、867和871。[0178]結(jié)論：[0179]1.在最多至14天內(nèi)，在人類血清中修飾的適體的穩(wěn)定性在50%和90%之間改變，并且單獨(dú)的適體有所不同?？梢愿鶕?jù)在人類血清中的它們的穩(wěn)定性將修飾的適體分類為類型1:適度的穩(wěn)定(B74)，類型2:高的穩(wěn)定0〇3、866、871、873和876)和類型3:非常高的穩(wěn)定(B79)〇[0180]2.在最多至24和48小時(shí)內(nèi)在人類血清中，修飾的適體(B03)能夠分別結(jié)合至WNVDili蛋白和野生型WNV。[0181]3.穩(wěn)定性和功能性的結(jié)果指示出修飾的適體在人類血清中是功能性的，對(duì)于修飾的適體的主要性能是開發(fā)作為診斷工具或治療候選物。[0182]4.在側(cè)鏈修飾的WNVDili適體B03和B99與它們未修飾的DNA對(duì)應(yīng)物之間的穩(wěn)定性的比較研究指示出了，修飾的適體B03和B99是高穩(wěn)定的，相反它們的未修飾的DNA對(duì)應(yīng)物在人類血清和FBS中的24小時(shí)孵育之后變得不穩(wěn)定。[0183]5.在側(cè)鏈修飾的WNVDIII適體B03和B99與它們未修飾的DNA對(duì)應(yīng)物之間的功能性的比較研究指示出了，修飾的適體B03和B99可以結(jié)合至WNVDili蛋白，相反它們的未修飾的DNA對(duì)應(yīng)物則不能。[0184]6.修飾的適體和抗體均能夠在相同的濃度下結(jié)合WNVDili蛋白。修飾的適體B99與WNVDili蛋白的結(jié)合是最強(qiáng)的且可以與抗體的結(jié)合相比較，接下來依次是修飾的適體803、879、866、867和871。[0185]實(shí)施例3:登革熱病毒血清2型(DENV2)修飾的適體的評(píng)估[0186]下列實(shí)施例評(píng)估了單獨(dú)組的選擇的修飾的適體(產(chǎn)生自AdaptamerSolutions，www.aptabiosciences.com,AptaBiosciencesPteLtd，31BiopolisWay，#02_25Nanos，Singapore138669，Phone:+65-3109-0178，F(xiàn)ax:+65-6779-6584，Mobile:+65-9184-7323)對(duì)純化的DENV2DIII蛋白和野生型DENV上的天然包膜蛋白的結(jié)合特性。然后識(shí)別可以用于診斷和治療應(yīng)用的最好的適體。評(píng)估針對(duì)DENV2DIII蛋白的十種潛在適體候選物，并且也討論了這些結(jié)果。[0187]材料和方法[0188]DENV1-4生物素化的重組包膜結(jié)構(gòu)域III(DENVl-4BN-rEDIII)蛋白的克隆和表達(dá)[0189]重疊延伸-聚合酶鏈反應(yīng)(0E-PCR)。在DENVl-4BN-rEDIII蛋白的克隆中使用兩種片段?；瘜W(xué)合成生物素受體肽(BAP)(片段1)。每種DENV血清型的包膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)域III(片段2)分別衍生自DENV1-4的cDNA。圖26示出了涉及DENV2BN-rEDIII質(zhì)粒的構(gòu)建的步驟。按照相似的策略獲得用于下游適體篩選的DENV1、3和4BN-rEDIII蛋白。表4中示出了在0E-PCR中使用的引物的列表。[0190]表4:用于全部四種DENV血清型的在0E-PCR中使用的連接片段l(BAP)和片段2(Dili基因）的正向和反向引物的列表。[0193]蛋白的表達(dá)和提取。將pET28a-DENV2BN-rEDIII質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至BL-21-DE3表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞(AgilentTechnologies，USA)并且在含有30iig/ml的卡那霉素的Luria-Bertani(LB)瓊脂中生長(zhǎng)。在1L的LB肉湯（30μg/ml的卡那霉素）中在30°C下培養(yǎng)選擇的克隆，直到0D6Q()為0.6。使用ImM的異丙基f3-D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)DENV2BN-rEDIII蛋白的表達(dá)6小時(shí)。在4°C下使用離心在8000rpm下進(jìn)行15分鐘沉淀(pelleteddown)細(xì)菌細(xì)胞。表達(dá)的蛋白靶向內(nèi)含體（IB)。在隨后的步驟中分離IB。首先在溶解緩沖劑（20mM的Tris，pH8.0，500mM的NaCl，10mM的咪唑）中再懸浮細(xì)菌細(xì)胞小球，然后在冰浴中超聲處理（10分鐘，1OAmp)。然后在4°C下以12，OOOrpm離心裂解物15分鐘以獲得內(nèi)含體的白色半透明小球。之后使用相同的溶解緩沖劑清洗內(nèi)含體小球，在室溫下在提取緩沖劑（8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，10mM的咪唑，pH8.0)中孵育30分鐘，并且通過13,500rmp的離心澄清提取物20分鐘。[0194]BN-rEDIII蛋白的固定金屬離子親和色譜（IMAC)純化。使用鎳-氮川三乙酸(Ni-NTA)樹脂(Bio-Rad，USA)孵育含有DENV2BN-rEDIII蛋白的內(nèi)含體提取物，用于在4°C下在色譜柱中過夜結(jié)合。使用五個(gè)柱體積的清洗緩沖劑(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，20mM的咪唑，pH8.0)去除非特異性結(jié)合的蛋白。然后在八個(gè)1.5-ml的部分(fraction)中使用洗脫緩沖劑(8M脲，20mM的Tris，300mM的NaCl，500mM的咪唑，pH8.0)洗脫出BN-D2DIII蛋白。將全部的洗脫物集中至SnakeSkin透析膜管（ThermoScientific，USA)并且將0?05%的Tween-20加入到樣本中。在4°C下在4M脲中孵育透析管6-12小時(shí)，并且將脲逐漸稀釋至0.5M。最終從透析管中收集再折疊的DENV2BN-rEDIII蛋白，并注射到FPLC機(jī)器以通過在PBS中的排阻色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化。也以類似的方式純化DENV1、3和4BN-rEDIII蛋白。[0195]蛋白身份分析。通過SDS-PAGE和Western印跡分析來自頂AC純化的流過物、清洗物和洗脫液。12%的Tris-tricine聚丙烯酰胺變性膠用于分離蛋白，并且隨后使用用于蛋白檢測(cè)的考馬斯藍(lán)(Coomassieblue)染色。對(duì)于Western印跡，使用iB丨Ot忠干印記系統(tǒng)(LifeTechnologies，USA)將蛋白從聚丙烯酰胺膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在4°C下使用5%的BSA過夜完成封閉。然后在室溫下使用鏈親和素結(jié)合-HRP孵育膜以檢測(cè)DENVBN-rEDIII2小時(shí)。在室溫下使用lxPBST完全清洗膜1小時(shí)，并且使用SuperSignal?westPico化學(xué)發(fā)光底物(ThermoScientific，USA)顯影。圖27示出了表示重組的純化的DENVl-4BN-rEDIII蛋白的表達(dá)、純化和評(píng)估的示意流程圖。[0196]用于親和力篩選的蛋白涂覆的酶連接的修飾的適體吸收實(shí)驗(yàn)(ELMASA)。將100ng的純化的未生物素化的DENV2rEDIII蛋白涂覆在maxisorp板的每個(gè)孔上，在4°C下過夜。在接下來的一天，使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗ELISA板三次，并一式三份使用溶解于不含RNase的TE緩沖劑（Invitrogen)中的不同濃度（1至32nM/孔)的生物素化的(DENV)適體孵育1小時(shí)。然后使用PBS中4%的BSA進(jìn)行過夜封閉，隨后用PBS清洗。隨后添加l:2000(v/v)稀釋的鏈親和素-HRP酶結(jié)合物(Millipore)，并孵育板1小時(shí)。使用lxPBST清洗板6次，然后添加50yl的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液并在室溫下孵育15分鐘。最終，添加50yl的0.511的賊〇4溶液以停止反應(yīng)并立即在450nm下測(cè)量吸收率。[0197]病毒涂覆的ELMASA。代替使用DENV2rEDIII蛋白，將1000PFU的DENV2野生型病毒涂覆在ELISA板上，并且在4°C下過夜孵育。使用1xPBST清洗孔，然后使用4%的BSA封閉。在這個(gè)步驟之后，使用不同濃度的（InM至32nM)生物素化的適體（1-10)孵育孔1小時(shí)。然后，添加l:2000(v/v)稀釋的鏈親和素-HRP酶結(jié)合物，然后根據(jù)前文蛋白涂覆的ELMASA中的描述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的剩余部分。在二級(jí)生物安全柜(BSC)中進(jìn)行全部的程序。[0198]病毒封閉實(shí)驗(yàn)。將BHK細(xì)胞以50000細(xì)胞/孔接種在24孔板上過夜。將溶解于不含RNase的TE緩沖劑（Invitrogen)中的50yl的2處的適體一式三份添加至50PFU/50ylDENV2。將混合物孵育1.5小時(shí)以用于結(jié)合(最終適體的工作濃度為liiM/孔）。陰性對(duì)照相似地建立但是無任何病毒。然后從24孔板中去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且使用包含2%FCS的RPMI清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞單層，并且使用l〇〇yl的適體_病毒混合物進(jìn)行感染。在37°C和5%的⑶2下孵育板1小時(shí)，以15分鐘間隔恒定搖動(dòng)板。去除接種液，使用包含2%FCS的RPMI清洗細(xì)胞單層，并且將lml的CMC覆蓋介質(zhì)添加至每個(gè)孔。在37°C和5%的⑶2下孵育板4.5天，直到形成斑。最后使用結(jié)晶紫染色剩余的細(xì)胞，并計(jì)數(shù)未染色的斑。[0199]結(jié)果[0200]DENVl-4BN-rEDIII質(zhì)粒的構(gòu)建[0201]為了獲得用于適體篩選的DENVl-4BN-rEDIII蛋白，通過生物素化的受體肽(BAP)中，然后腸激酶切割位點(diǎn)(在DENV1-4包膜DIII基因的N-端)的工程化來設(shè)計(jì)新型表達(dá)質(zhì)粒?；瘜W(xué)合成對(duì)應(yīng)于BAP的DNA序列（Kauretal.，2013)，相反DENV1-4包膜DillDNA序列各自衍生自DENV1-4的cDNA。如圖26A所示，具有腸激酶切割位點(diǎn)的BAP序列通過重疊延伸PCR(0E-PCR)連接Dili的上游。使用Nhel和Xhol限制酶雙重消化最終的PCR產(chǎn)物和pET28a載體，并且重組的基因連接至消化的質(zhì)粒，其包含多克隆位的上游的6xHis標(biāo)簽。因此，包含重組BAP的DENVl-4rEDIII蛋白各自在N-端具有2個(gè)標(biāo)簽，即6xHis標(biāo)簽(用于親和純化)和生物素(用于結(jié)合至鏈親和素）。它們中的每個(gè)也包含兩種酶(凝血酶和腸激酶)切割位點(diǎn)（圖26B和26C)。然后將工程化的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細(xì)胞中，并且通過菌落PCR、限制性消化和DNA測(cè)序證實(shí)陽性克隆。因此可以在體內(nèi)和體外進(jìn)行含重組BAP的DENVl-4rEDIII蛋白的生物素化。此外，凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn)能夠在純化后去除具有或不具有生物素化的BAP的6xHis標(biāo)簽。這允許在其他下游應(yīng)用諸如從蛋白和/或適體庫(kù)中選擇蛋白相互作用的配對(duì)物(partner)和/或適體中使用純化的rEDIII蛋白。[0202]DENVl-4BN-rEDIII蛋白的表達(dá)和純化[0203]DENV1-4BN-rEDIII蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。在通過使用抗-His抗體的Western印跡確認(rèn)DENVl-4BN-rEDIII蛋白表達(dá)之后，擴(kuò)大表達(dá)以產(chǎn)生大量DENV1-4BN-rEDIII蛋白。從內(nèi)含體提取粗蛋白并且使其經(jīng)歷在材料與方法中說明的頂AC親和純化、再折疊和排阻色譜。圖28中示出了DENV2BN-rEDIII蛋白的典型FPLC-SEC曲線圖。用于比較，重疊了對(duì)應(yīng)于未生物素化的DENV2rEDIII蛋白的跡線。圖28(B)示出了使用鏈親和素-HRP的Western印跡確認(rèn)DENV1-4BN-rEDIII以及它們的純化物上生物素的存在。在FPLC之后在純化的部分中僅檢測(cè)到單一的帶(泳道3和4)，相反在SEC純化之前在IMAC洗脫液中檢測(cè)到了多條帶（泳道2)。從1L的細(xì)菌培養(yǎng)物中純化lmg的純化的rEDIII蛋白。進(jìn)一步通過凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化以及肽質(zhì)量指紋圖譜確認(rèn)了純化的DENV1-4BN-rED111蛋白的身份(identity)〇[0204]適體篩選：[0205]適體設(shè)計(jì)和合成：[0206]DENV2BN-rEDIII蛋白-結(jié)合修飾的適體候選物的識(shí)別[0207]使用修飾的適體的庫(kù)溶液孵育固定在單體抗生物素蛋白-瓊脂糖樹脂上的DENV2BN-rEDIII蛋白。然后在使用親和素溶液從樹脂洗脫修飾的適體:DENV2BN-rEDIII復(fù)合物之前，重復(fù)清洗樹脂以去除弱結(jié)合的修飾的適體。使用堿處理洗脫的復(fù)合物以去除側(cè)鏈并釋放DNA適體主鏈，從而用于RPC、測(cè)序和隨后克隆，以實(shí)現(xiàn)結(jié)合的適體的DNA序列的確定。獲得了136種DENV2BN-rEDIII修飾的適體候選物的DNA序列，并且通過DNA合成器合成這些修飾的適體。通過將它們應(yīng)用至固定在CM5Biacore傳感器芯片(通過胺連接)上的DENV2BN-rEDIII蛋白，重復(fù)DENV2BN-rEDIII修飾的適體候選物的篩選。選擇前10種DENV2BN-rEDIII修飾的適體候選物以用于進(jìn)一步的分析。[0208]使用DENV2rEDIII蛋白的SPR分析:[0209]對(duì)于Kd測(cè)量，10種DENV2BN-rEDIII修飾的適體候選物的每種均是生物素化的且單獨(dú)地固定在BiacoreSA芯片上。在MES緩沖劑中在pH5.5下，對(duì)于各個(gè)濃度的DENV2rEDIII蛋白確定它們的單獨(dú)的Kd(參見圖29和表5)。用于針對(duì)DENV2EDIII確認(rèn)的從適AdaptamerSolutions接收的十種適體是生物素化修飾的適體B002、B006、B012、B016、B027、B060、B113、B118、B12GPB128。[0210]表5:選擇用于在使用SPR測(cè)量它們的親和力之后進(jìn)一步評(píng)估的適體的列表。[0213]用于修飾的適體親和力篩選的DENV2BN-rEDIII涂覆的ELMASA[0214]為了評(píng)估10種選擇的修飾的適體與DENV2rEDIII蛋白的結(jié)合，使用各種濃度(0至32nM)的生物素化的修飾的適體進(jìn)行DENV2rEDIII蛋白涂覆的ELMASA。盡管在全部測(cè)試濃度下修飾的適體8012、8060、8113、8118和8121也顯著的結(jié)合至0￡附2也0111蛋白，但是觀察到修飾的適體B002、B006、B027和B12最有效地結(jié)合至DENV2rEDIII蛋白。評(píng)估了針對(duì)DENV1、3和4的rEDIII蛋白，修飾的適體的結(jié)合，并且結(jié)果分別在圖31、32和33中示出。對(duì)于全部10種修飾的適體，對(duì)DENV1、3和4的rEDIII蛋白具有最小結(jié)合。這個(gè)結(jié)果暗示了修飾的適體特異性結(jié)合至DENV2rEDIII蛋白。[0215]病毒涂覆的ELMASA。[0216]進(jìn)一步使用野生型病毒確認(rèn)修飾的適體與純化的DENV2rEDIII蛋白的結(jié)合。將DENV2(1000PFU/孔)涂覆在ELISA板上過夜，然后使用不同濃度的適體進(jìn)行孵育。與對(duì)照相比仍觀察到修飾的適體8060、8118、8121和8128特異性結(jié)合至0￡附2(圖34)。這暗示了這些修飾的適體可以特異性結(jié)合至野生型DENV2上的天然包膜結(jié)構(gòu)域III，并且修飾的適體可以用于不同DENV血清型的檢測(cè)和鑒別，目前僅可以通過PCR來實(shí)現(xiàn)。[0217]通過修飾的適體中和DENV2[0218]在確定修飾的適體能夠結(jié)合至純化的DENV2rEDIII蛋白以及野生型DENV2上的天然包膜Dili蛋白之后，評(píng)估它們中和DENV2的能力。首先在使用不同濃度的修飾的適體孵育病毒，然后進(jìn)行BHK細(xì)胞的感染。當(dāng)使用1yM的修飾的適體預(yù)處理DENV2時(shí)，病毒誘導(dǎo)的斑的數(shù)量減少。結(jié)果示出了使用lyM的修飾的適體B060和B118的預(yù)處理導(dǎo)致了超過60%的中和，相反通過其他修飾的適體的中和在40%至58%之間改變。因此，修飾的適體B060和B118具有將開發(fā)為針對(duì)DENV2的治療劑的潛能。[0219]DENV2Dili修飾的適體與其他黃病毒包膜蛋白的交叉反應(yīng)：[0220]為了評(píng)估修飾的適體與其他黃病毒包膜蛋白的潛在非特異性和交叉反應(yīng)結(jié)合，使用西尼羅病毒(WNV)的包膜或Dili蛋白、蜱傳腦炎病毒(TBEV)(ProSpecbio，USA)和日本腦炎病毒(JEV)(ProSpecbio，USA)進(jìn)行蛋白涂覆的ELMASA。在測(cè)試的全部修飾的適體濃度下檢測(cè)出沒有顯著地結(jié)合至全部三種前述病毒的包膜或Dili蛋白（參見圖36;小圖（panel)A:WNV包膜DIII，小圖B:TBEV-281包膜蛋白，小圖C:JEV-290包膜蛋白）。[0221]TBE-281:蜱傳腦炎由蜱傳腦炎病毒(TBEV)(黃病毒屬家族的一員）引起。TBE-281是包含蜱傳腦炎病毒包膜糖蛋白的殘基95至229的大腸桿菌衍生的重組蛋白。[0222]JEV-290：日本腦炎(原先稱為日本B腦炎)是來自黃病毒屬家族的病毒。它與WNV和圣路易斯腦炎病毒緊密相關(guān)。JEV-290蛋白是在大腸桿菌中表達(dá)的50-kDa全長(zhǎng)日本腦炎病毒包膜蛋白，且與6x組氨酸標(biāo)簽融合。[0223]用于本發(fā)明的DENV2Dili修飾的適體和其他商購(gòu)適體與DENV2rEDIII蛋白的結(jié)合的比較。[0224]針對(duì)0￡?duì)?0111(02厶）（01^81(^6吐，1^厶），將本發(fā)明的0￡附20111修飾的適體的功能性與可商購(gòu)適體比較。以與DENV2Dili修飾的適體相似的方式評(píng)估商購(gòu)適體。如圖37中所示，商購(gòu)的適體不能在測(cè)試濃度下與全部靶蛋白結(jié)合。在比較中，在ELISA中修飾的適體B128表現(xiàn)出非常高的吸收率，這指示出與DENV2rEDIII蛋白顯著的結(jié)合。[0225]結(jié)論：[0226]1.設(shè)計(jì)用于生物化的DENV1-4rEDIII蛋白的制備的質(zhì)粒構(gòu)建體，以用于篩選修飾的適體。將生物素受體肽(BAP)設(shè)計(jì)為用于生物素化的DENV1-4rEDIII的基因。這種構(gòu)建體可以用于體內(nèi)和體外生物素化。凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn)的插入進(jìn)一步使標(biāo)簽?zāi)苋コ栽诩兓螽a(chǎn)生天然蛋白。[0227]2.已經(jīng)建立了平臺(tái)以獲得用于應(yīng)用諸如適體篩選和蛋白-蛋白相互作用的研究的生物素化的純化的DENV1-4Dili。[0228]3?生物素化的DENV2rEDIII蛋白用于通過AdaptamerSolutions篩選和選擇修飾的適體。[0229]4.初始篩選通過表面等離子體共振從庫(kù)中選擇結(jié)合至DENV2rEDIII蛋白的十種修飾的適體。在識(shí)別序列之后，AdaptamerSolutions的科學(xué)家合成了用于評(píng)估的十種修飾的適體(生物素化的適體）。[0230]5.對(duì)于結(jié)合和中和，分別針對(duì)DENV2rEDIII蛋白和DENV2評(píng)估十種生物素化的修飾的適體。[0231]6.用于修飾的適體親和篩選的蛋白涂覆的ELMASA顯示了修飾的適體B002、B118和B128特異性結(jié)合至DENV2rEDIII蛋白。[0232]7.病毒涂覆的ELMASA示出了修飾的適體B118、B121和B128特異性結(jié)合至野生型DENV2上存在的天然包膜蛋白（甚至在低濃度下）。基于上述評(píng)估，這些適體可以開發(fā)為用于DENV檢測(cè)的診斷工具。這些適體也可以被開發(fā)為用于學(xué)術(shù)研究的病毒檢測(cè)的分子探針。[0233]8.病毒中和實(shí)驗(yàn)示出了使用lyM的修飾適體B060和B118的處理導(dǎo)致了超過60%的DENV2病毒的中和。其他修飾的適體導(dǎo)致了病毒中和在40%和58%之間改變。這暗示了修飾的適體B060和B118具有開發(fā)為用于治療DENV2感染的治療劑的潛能。[0234]9.用于修飾的適體(DENV2rEDIII適體)與其他黃病毒包膜蛋白（WNVEDIII、TBEV和JEV)的結(jié)合的對(duì)比研究示出了非顯著的結(jié)合且對(duì)于DENV2rEDIII非常特異性。[0235]10.與從商業(yè)來源獲得的適體相比，修飾的適體與DENV2rEDIII的結(jié)合是非常高的且是顯著的。[0236]11.圖39示出了用于針對(duì)DENV2rEDIII蛋白的適體評(píng)估的完整平臺(tái)。[0237]12.基于評(píng)估，用于DENV2rEDIII蛋白的最好的三種修飾的適體候選物是B002、B118和B128,它們可以進(jìn)一步開發(fā)用于診斷和治療應(yīng)用(5表6中列出了它們的序列^這些序列可以進(jìn)一步修飾以用于更高的親和力。[0238]表6:針對(duì)DENV2Dili的修飾的適體的序列。[0240]1.主鏈核苷酸表示為大寫字母；[0241]A:腺嘌呤，G:鳥嘌呤，C:胞嘧啶，T:胸腺嘧啶[0242]2.側(cè)鏈的官能基團(tuán)表示為小寫字母；[0243]b:噻吩，e:谷氨酸、f:苯丙氨酸、h:組氨酸、k:賴氨酸、1:亮氨酸、s:絲氨酸、y:酪氨酸、w:色氨酸[0244]3.不具有側(cè)鏈的天然核苷酸表示為下劃線(_)。[0245]參考文獻(xiàn)[0246]Bhardwaj，S?，Holbrook，M?，Shope，R?E?，Barrett，A?D?andWatowich，S?J?(2001).Biophysicalcharacterizationandvector-specificantagonistactivityofdomainIIIofthetick-borneflavivirusenvelopeprotein.JViral75,4002_4007.[0247]Bhatt，S.，Gething，P.W.，Brady，0.J.，Messina，J.P.，F(xiàn)arlow，A.W.，Moyes，C.L.，etal.(2013).Theglobaldistributionandburdenofdengue.Nature.[0248]Bigham，A.W.，Buckingham，K.J.，Husain，S.，Emond，M.J.，Bofferding，K.M.，Gildersleeve?H.?etal.(2011).HostgeneticriskfactorsforWestNilevirusinfectionanddiseaseprogression.PloSone6，e24745.[0249]Chavez，J.H.，Silva，J.R.，Amarilla，A.A.andMoraesFigueiredo，L.T.(2010).DomainIIIpeptidesfromflavivirusenvelopeproteinareusefulantigensforserologicdiagnosisandtargetsforimmunization.Biologicals:journaloftheInternationalAssociationofBiologicalStandardization38,613_618.[0250]Chin，J.F.，Chu，J.J.andNg，M.L.(2007).TheenvelopeglycoproteindomainIIIofdenguevirusse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疫原性組合物或疫苗或根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，用于治療或預(yù)防患者的黃病毒感染?！疚臋n編號(hào)】C12Q1/68GK106029888SQ201480073002【公開日】2016年10月12日【申請(qǐng)日】2014年11月13日【發(fā)明人】黃瑪莉,克魯帕卡爾·帕塔薩拉蒂,蔡錦順,楊惠羽【申請(qǐng)人】新加坡國(guó)立大學(xué)