專利名稱：疫苗組合物及制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，其包含非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料(Nanopowders)和抗原。
背景技術(shù)：
疫苗的應(yīng)用已有200多年歷史，第二次世界大戰(zhàn)后，人用疫苗得到了迅速發(fā)展。到目前為止，人用疫苗有近百種。人類已利用疫苗控制了天花、百日咳、白喉、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹等多種疾病。家禽及獸用的疫苗也有幾十種。在本發(fā)明中，所有通過注射、粘膜或皮膚途徑接種的、可以誘導(dǎo)針對致病原的特異性抗體和細(xì)胞免疫或其它免疫狀態(tài)，從而獲得保護(hù)或消滅這種致病原或消除這種病態(tài)因子的蛋白、多糖、核酸、活載體或感染因子，統(tǒng)稱為疫苗。
疫苗可以分為幾類，一類是病毒的滅活疫苗，就是獲得病毒以后經(jīng)過一些方法的處理，讓它完全喪失活性。第二類是減毒疫苗，也就是去除微生物對宿主的毒力，把它做成疫苗。第三類是基因工程和化學(xué)合成疫苗，即使用基因工程和化學(xué)合成的方法生產(chǎn)出與免疫源相同的特異抗原片斷蛋白質(zhì)、多糖或表達(dá)特異抗原片斷蛋白質(zhì)的DNA，再將其導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞，使產(chǎn)生針對這一段免疫源的蛋白的抗體，來達(dá)到獲得保護(hù)或消滅這種致病原或消除這種病態(tài)因子的目的。
在以往的疫苗中，以預(yù)防單一疾病的“單苗”為主，隨著疫苗種類的增多，注射一針預(yù)防多種疾病的聯(lián)合疫苗也開始出現(xiàn)。如“麻風(fēng)腮”疫苗，就是將預(yù)防麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎三大危害健康的疾病的疫苗做在一起的聯(lián)合疫苗。23價肺炎疫苗就是將23種不同亞型的肺炎球菌夾膜多糖做在一起的多價疫苗。
過去的來源于微生物的疫苗多未經(jīng)純化，使用時副作用大，效果也受到影響。為了降低副作用，現(xiàn)在的來源于微生物的疫苗一部分已經(jīng)是純化疫苗。新開發(fā)的合成細(xì)菌、病毒外殼的特異蛋白、多糖結(jié)構(gòu)，只包含了有用的抗原或抗原決定簇，由此制成的疫苗稱為亞單位疫苗。純化疫苗、亞單位疫苗僅有幾種主要抗原決定簇蛋白和/或多糖，因而能減少不需要的副作用。但是它們(特別是多糖亞單位疫苗)又有免疫原性較低的弱點(diǎn)，需與佐劑合用才能得到好的效果。佐劑是一類與免疫原結(jié)合使用而能增強(qiáng)免疫效果的物質(zhì)。在本發(fā)明中，疫苗組合物是指包含有佐劑與抗原的物質(zhì)。當(dāng)前，為了獲得疫苗更好的免疫效果，疫苗幾乎都使用了佐劑?；蛘哒f，當(dāng)前幾乎所有的疫苗均為疫苗組合物。
最廣泛使用的疫苗組合物，是以氫氧化鋁、磷酸鈣等金屬鹽類為佐劑的疫苗組合物，例如基因工程乙肝疫苗，等等。這些金屬鹽類佐劑對大分子蛋白質(zhì)、多糖有很強(qiáng)的吸附能力，使用后大大增強(qiáng)了疫苗的免疫原性和免疫持久性。但是這些經(jīng)典佐劑在弱抗原時佐劑作用不強(qiáng)。因此，后來發(fā)展出了油性佐劑、脂肪族佐劑、聚合物表面活性劑、聚微粒載體佐劑、植物佐劑、細(xì)菌佐劑、人工合成佐劑、細(xì)胞因子佐劑、核酸佐劑，等等。一個有效的佐劑必須滿足下列條件1).可以強(qiáng)化宿主的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，2).不可以使宿主的系統(tǒng)惡化，3).易于制備且穩(wěn)定。到目前為止，美國FDA批準(zhǔn)用于人體的疫苗佐劑還只有鋁鹽一種。盡管如此，由于其巨大的潛力，各種不同的佐劑、或者疫苗組合物仍然在不斷地被發(fā)明出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種疫苗組合物、特別是疫苗組合物的佐劑。本發(fā)明的佐劑(或免疫效應(yīng)物)要滿足的目標(biāo)，是在使用劑量范圍基本無毒，可以加強(qiáng)各種疫苗特別是小分子蛋白質(zhì)和多糖疫苗的免疫源性，增強(qiáng)免疫動物體內(nèi)的體液和細(xì)胞免疫，提高接種和治療效果，并且易于生產(chǎn)和具有較高的穩(wěn)定性。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的疫苗組合物的應(yīng)用及制備方法。
本發(fā)明提供的疫苗組合物是一種疫苗組合物，包含非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料(Nanopowders)和抗原，所述納米粉體材料的平均粒徑小于300nm，優(yōu)選方案小于100nm，更優(yōu)選方案小于50nm。
本發(fā)明所述的無機(jī)物基納米粉體材料是指無機(jī)粉體材料及基于無機(jī)粉體材料的改性粉體材料。例如，基于無機(jī)納米粉體材料的表面改性納米粉體材料。
本行業(yè)的專業(yè)人士都應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明疫苗組合物中的納米粉體材料是一種佐劑。目前報道的用作佐劑的納米材料，均為有機(jī)材料，包括納米高分子微球和納米脂質(zhì)體，等等。用作佐劑的鋁等的金屬鹽沉淀，也不會被本專業(yè)的技術(shù)人員視作本發(fā)明所述的納米粉體材料。載藥磁性納米載體，例如三氧化二鐵、四氧化三鐵、鐵鈷合金等及其衍生物，也不在本發(fā)明所述的納米粉體材料內(nèi)。此外，粉體材料專業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的粉體材料更易以可控尺寸(平均粒徑小于300nm，優(yōu)選方案小于100nm，更優(yōu)選方案小于50nm)及較高的尺寸一致性的方式生產(chǎn)，也容易進(jìn)行各種表面改性。
又一方面，本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中納米粉體材料包括無機(jī)納米粉體材料和基于無機(jī)納米粉體材料的表面改性納米粉體材料。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中無機(jī)納米粉體材料包括納米非金屬氧化物粉體、納米金屬粉體和納米金屬氧化物粉體。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中納米非金屬氧化物粉體包括硅的納米氧化物粉體，等等；所述納米金屬粉體包括納米金，等等；所述納米金屬氧化物粉體包括鈦的納米氧化物粉體，等等。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中硅的納米氧化物粉體為多微孔顆?；?和實(shí)心顆粒。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中納米粉體材料為在上述無機(jī)納米粉體材料的表面上固定分布有有機(jī)物的表面改性納米粉體材料。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中納米粉體材料的表面上固定分布的有機(jī)物為胺基或/和環(huán)氧烷基或/和醚基胺基。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中納米粉體材料的表面上固定分布的有機(jī)物為高分子表面活性劑。高分子表面活性劑是指相對分子量數(shù)千以上，含有親水基和疏水基，具有表面活性功能的高分子化合物。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中納米粉體材料的表面上固定分布的高分子表面活性劑包括聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯。
另一方面，本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中抗原來自下述微生物或組織病毒、細(xì)菌、衣原體、螺旋體、瘧原蟲、弓形蟲、細(xì)胞、過敏原，和根據(jù)上述微生物或組織的氨基酸序列或/和核酸序列采用基因工程、核酸合成、蛋白質(zhì)或多肽合成所得到的產(chǎn)物。
本發(fā)明提供的疫苗組合物，其中佐劑結(jié)構(gòu)和組成簡單，專業(yè)人士應(yīng)當(dāng)知道其可與范圍廣泛的抗原混合而不喪失其在本發(fā)明中的佐劑性質(zhì)。上述微生物或組織的更細(xì)的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)、水痘帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人巨細(xì)胞病毒、登革熱病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳頭狀瘤病毒、流感病毒、流行性腦膜炎病毒、人類白血病病毒(HTLV)、冠狀病毒、流行性出血熱病毒(EHFV)、沙門氏菌屬、弧菌屬、奈瑟氏菌屬、包特(Bordetella)氏菌屬、布氏菌屬(Brucella)、耶爾森菌屬(Yersinia)、需氧芽胞桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、鏈球菌屬、支原體屬、分枝桿菌屬、嗜血桿菌屬、疏螺旋體菌屬、衣原體屬、瘧原蟲屬、弓形蟲屬、腫瘤相關(guān)蛋白抗原和核酸抗原、口蹄疫病毒、鼠瘟病毒、口蹄疫病毒、鼠假性狂犬病毒、登革熱病毒、黃熱病減毒活病毒，導(dǎo)致動脈粥樣硬化肺炎衣原體、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒、獨(dú)特型抗體抗原、綠膿桿菌、動物寄生蟲抗原，等等。
本發(fā)明疫苗組合物的應(yīng)用是本發(fā)明疫苗組合物在作為制備預(yù)防和/或治療病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染，過敏或癌癥的疫苗和避孕疫苗方面的應(yīng)用。
發(fā)明所述的疫苗包括用于人和動物的DNA疫苗、蛋白質(zhì)/多肽疫苗、多糖疫苗，重組疫苗、亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒活疫苗、粘膜疫苗，單價或多價、單聯(lián)或多聯(lián)疫苗。
本發(fā)明所述的疫苗包括預(yù)防疫苗和治療性疫苗(Therapeuticalvaccines)。
又一方面，本發(fā)明疫苗組合物是以片劑、口含劑、栓劑、水針劑、透皮劑、滴鼻劑、氣溶膠或噴霧的形式應(yīng)用。
本發(fā)明疫苗組合物的制備方法是本發(fā)明一種制備疫苗組合物的方法，將非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料、抗原或抗原組合物進(jìn)行混合。
本發(fā)明所述的制備疫苗組合物的方法還包括將非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料、抗原或抗原組合物、與藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或藥學(xué)上要求的保護(hù)劑、穩(wěn)定劑進(jìn)行混合。
本發(fā)明疫苗組合物的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明疫苗組合物所包含的佐劑，更易以可控尺寸及較高的尺寸一致性的方式生產(chǎn)，也容易進(jìn)行各種表面改性，其可以強(qiáng)化宿主的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)而無明顯毒性。由于本發(fā)明佐劑的組成和結(jié)構(gòu)的簡單性，本發(fā)明疫苗組合物的應(yīng)用可以有很廣的范圍。本發(fā)明疫苗組合物的制備程序簡單、易于操作。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1，不同佐劑疫苗小鼠免疫效果試驗(yàn)本實(shí)施例所用納米粉體材料見表1表1，用作佐劑的納米粉體材料

本實(shí)施例所用抗原為經(jīng)純化的乙肝核心抗原(HBcAg)(北京人民醫(yī)院肝病研究所)。本實(shí)施例所用疫苗組合物由表1中列出的納米粉體材料與HBcAg在巳優(yōu)化的條件下混合而成。本實(shí)施例所用哺乳動物模型為8周齡，重18-20g的Balb/c小鼠(清潔級)。實(shí)驗(yàn)動物共分9組，1、2、3、4組分別為以納米氧化硅、納米金、納米氧化鈦、聚乙烯吡喀烷酮改性納米氧化硅為佐劑、以HBcAg為抗原的不同疫苗組合物免疫；第5、6、7、8組分別為不加抗原的納米氧化硅、納米金、納米氧化鈦、聚乙烯吡喀烷酮改性納米氧化硅佐劑對照；第9組為不加佐劑的HBcAg抗原對照。
在本實(shí)施例中，純化的HBcAg用PBS稀釋至20μg/ml，與等體積的免疫佐劑完全混合后，在小鼠腹腔內(nèi)按2ug HBcAg/只的劑量注射。初次免疫后間隔3周再以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。采用耳洞法進(jìn)行組內(nèi)小鼠編號標(biāo)記，采用毛細(xì)吸管眼靜脈采血法采集小鼠免疫前及免疫后第3、6、9周血，分離血清，-30℃保存待檢。
抗-HBc抗體的檢測采用ELISA法?？?HBc抗體酶標(biāo)檢測試劑盒為市售酶標(biāo)檢測試劑盒(廈門科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)。檢測時將小鼠血清和參考品倍比稀釋(1∶50，1∶100，1∶200，1∶400…)，每個稀釋度雙孔測定。陰性和陽性對照不需稀釋每個稀釋度雙份測定。對照為樣品稀釋液(雙份)、陰性和陽性對照(不需稀釋)。終點(diǎn)滴定各組小鼠血清抗-HBc抗體滴度。結(jié)果見表2。
表2各組小鼠抗乙肝表面抗原抗體終點(diǎn)滴度的檢測結(jié)果

9組小鼠在免疫前均未檢測到抗-HBc抗體。在本實(shí)施例的條件下，比較疫苗組合物免疫組(1、2、3、4組)和佐劑免疫組(5、6、7、8)，兩者之間抗體滴度有顯著性差別；比較疫苗組合物免疫組(1、2、3、4組)和HBcAg免疫組(第9組)，兩者之間抗體滴度有顯著性差別；比較分別混合有不同納米粉體材料佐劑的疫苗組合物免疫組(1、2、3、4組)之間，不同疫苗組合物之間抗體滴度無顯著性差別。免疫后3-9周，不同疫苗組合物免疫組(1、2、3、4組之間)的抗-HBc滴度隨觀察時間延長而增高。
到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，在實(shí)驗(yàn)組72只小鼠無一死亡，提示本發(fā)明的疫苗組合物具有安全性。實(shí)施例2，納米粉體材料佐劑的疫苗小鼠局部反應(yīng)試驗(yàn)本實(shí)施例所用抗原與實(shí)施例1相同，為經(jīng)純化的乙肝核心抗原(HBcAg)(北京人民醫(yī)院肝病研究所)。本實(shí)施例所用納米粉體材料佐劑與實(shí)施例1的納米粉體材料佐劑(表1)相同。
本實(shí)施例所用哺乳動物模型為8周齡，重18-20g的Balb/c小鼠(清潔級)。實(shí)驗(yàn)動物共分5組，1、2、3、4組分別以納米氧化硅、納米金、納米氧化鈦、聚乙烯吡喀烷酮改性納米氧化硅為佐劑、以HBcAg為抗原(注射濃度與實(shí)施例1中相同)的不同疫苗組合物免疫；第5組分別為不加佐劑的HBcAg抗原對照。每只小鼠在后腳掌中皮下注射25ul疫苗組合物或抗原，以后每天測量小鼠注射掌厚度，減去注射前掌厚度，結(jié)果見表3。
表3不同佐劑的局部反應(yīng)組別 腫脹值(mm)1天 2天 3天 6天 12天1 1.68 1.89 1.58 1.29 0.682 1.58 1.69 1.41 1.23 0.723 1.72 1.87 1.56 1.31 0.934 1.65 1.61 1.53 1.26 0.615 0.32 0.16 0.03 0.01 0.00所有的注射小鼠腳掌均有不同程度的腫脹，僅有蛋白質(zhì)的腫脹程度最輕，消退也最快。而疫苗組合物則腫脹的程度強(qiáng)，消退也慢。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，其特征在于該疫苗組合物包含非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料(Nanopowders)和抗原，所述納米粉體材料的平均粒徑小于300nm，優(yōu)選方案小于100nm，更優(yōu)選方案小于50nm。
2.根椐權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于所述納米粉體材料包括無機(jī)納米粉體材料和基于無機(jī)納米粉體材料的表面改性納米粉體材料。
3.根椐權(quán)利要2所述的疫苗組合物，其特征在于所述無機(jī)納米粉體材料包括納米非金屬氧化物粉體、納米金屬粉體和納米金屬氧化物粉體。
4.根椐權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于所述納米非金屬氧化物粉體包括硅的納米氧化物粉體；所述納米金屬粉體包括納米金；所述納米金屬氧化物粉體包括鈦的納米氧化物粉體。
5.根椐權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于所述硅的納米氧化物粉體為多微孔顆粒或/和實(shí)心顆粒。
6.根椐權(quán)利要求2-5之一所述的疫苗組合物，其特征在于所述納米粉體材料為在所述無機(jī)納米粉體材料表面上固定分布有有機(jī)物的表面改性納米粉體材料。
7.根椐權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于所述有機(jī)物為含胺基或/和環(huán)氧烷基或/和醚基的有機(jī)物。
8.根椐權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于所述有機(jī)物為高分子表面活性劑。
9.根椐權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其特征在于所述高分子表面活性劑包括聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯。
10.根椐權(quán)力要求1所述的疫苗組合物，其所包合的抗原來自下述微生物或組織病毒、細(xì)菌、衣原體、螺旋體、瘧原蟲、弓形蟲、細(xì)胞、過敏原，和根據(jù)所述微生物或組織的氨基酸序列或/和核酸序列采用基因工程、核酸合成、蛋白質(zhì)或多肽合成所得到的產(chǎn)物。
11.一種疫苗組合物的應(yīng)用，其特征在于所述的疫苗組合物在作為制備預(yù)防和/或治療病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染，過敏或癌癥的疫苗和避孕疫苗方面的應(yīng)用。
12.根椐權(quán)利要求11的疫苗組合物，其特征在于其中所述疫苗是片劑、口含劑、栓劑、水針劑、透皮劑、滴鼻劑、氣溶膠或噴霧形式。
13.一種疫苗組合物的制備方法，其特征在于將非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料、抗原或抗原組合物進(jìn)行混合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗組合物的制備方法，其特征在于將非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料、抗原或抗原組合物，與藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或藥學(xué)上要求的保護(hù)劑、穩(wěn)定劑進(jìn)行混合。
全文摘要
本發(fā)明提供一種疫苗組合物、特別是疫苗組合物的佐劑，以及該疫苗組合物制備方法及應(yīng)用，其為平均粒徑小于300nm、優(yōu)選方案小于100nm、更優(yōu)選方案小于50nm的非磁性的無機(jī)物基的納米粉體材料(Nanopowders)。本發(fā)明疫苗組合物中的佐劑更易以可控尺寸及較高的尺寸一致性的方式生產(chǎn)，也容易進(jìn)行各種表面改性，其可以強(qiáng)化宿主的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)而無明顯毒性。
文檔編號A61P35/00GK1483477SQ03135250
公開日2004年3月24日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者鄒方霖, 陳春生, 陳寧, 王建霞 申請人:成都夸?？萍加邢薰?br>