專利名稱：一種促進(jìn)組織血管化的基因－殼聚糖納米粒復(fù)合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)組織血管化的基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體，屬于組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米材料由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，表現(xiàn)出許多不同于傳統(tǒng)材料的物理、化學(xué)性能，它作為一個(gè)基本構(gòu)成單元，呈三維立體排列。目前，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，納米材料已經(jīng)得到成功的應(yīng)用。最引人注目的是作為藥物載體、基因載體或制作人體生物醫(yī)學(xué)材料，如人工腎臟、人工關(guān)節(jié)等。在納米材料研究中，目前的熱點(diǎn)是納米?；蜣D(zhuǎn)移載體和藥物納米載體技術(shù)。這種技術(shù)是以納米粒作為基因轉(zhuǎn)移的載體，將DNA和RNA等基因分子包裹在納米粒之中或吸附在其表面，同時(shí)顆粒表面藕聯(lián)特異性的靶向分子，如特異性配體、單克隆抗體等，通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因表達(dá)。納米粒作為基因載體具有一些顯著的特點(diǎn)；納米粒能包裹、濃縮、保護(hù)核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；比表面積大，具有生物親和性，易于在其表面藕聯(lián)特異性的靶向分子，在循環(huán)系統(tǒng)中的循環(huán)時(shí)間較普通顆粒明顯延長(zhǎng)，在一定時(shí)間內(nèi)不會(huì)象普通顆粒那樣迅速地被吞噬細(xì)胞清除；讓核苷酸緩慢釋放，有效地延長(zhǎng)作用時(shí)間；并維持有效的產(chǎn)物濃度，提高轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的利用度；代謝產(chǎn)物少，副作用小，無(wú)免疫排斥反應(yīng)等。但在納米粒作為載體的研究中，多數(shù)將納米粒作為藥物的載體。然而，將殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF重組基因再負(fù)荷上I型膠原構(gòu)成組織工程支架，接種上心肌細(xì)胞，體外培養(yǎng)后，移植到體內(nèi)，在體內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)促進(jìn)心肌血管化卻未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能促進(jìn)組織血管化的基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體，其中所提的組織可以是心肌組織，其特征是以殼聚糖納米粒為載體與重組質(zhì)粒基因(pcDNA3.1-hVEGF)構(gòu)建成復(fù)合體，后用I型膠原作為三維支架、接種心肌細(xì)胞、體外培養(yǎng)，體內(nèi)植入，異位誘導(dǎo)心肌組織血管生長(zhǎng)等過(guò)程，包括1)重組質(zhì)?；驑?gòu)建用限制性內(nèi)切酶可將BamHI和KpnI區(qū)域切開(kāi)，然后用T4DNA連接酶與同樣經(jīng)過(guò)BamHI和KpnI雙酶切處理的外源基因連接，使其置于人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子控制下，這樣就構(gòu)建成外源基因的真核表達(dá)載體。載體采用T7和SP6引物雙向測(cè)序，證實(shí)無(wú)誤后，在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。
2)制備基因-殼聚糖納米粒將質(zhì)粒載體溶于75mM的硫酸鈉溶液中，與一定濃度的pH5.5殼聚糖溶液分別置于55℃水浴恒溫20分鐘。分別取200ul在旋渦混合器上迅速混合30秒，即得基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體。
3)組織工程化心肌的構(gòu)建在新分離的新生大鼠(1-2天)心肌細(xì)胞懸液中加入一定濃度的pcDNA3.1-hVEGF-殼聚糖納米粒，再與I型膠原支架材料混合使其終濃度為2×106/ml左右?；旌弦杭尤氕h(huán)型槽中，60分鐘后加入培養(yǎng)液(DMEM，含10％馬血清)。心肌細(xì)胞與膠原的混合液即可在環(huán)型槽中形成環(huán)型的心肌細(xì)胞-膠原條帶。形成的環(huán)狀心肌細(xì)胞-膠原條帶在環(huán)形槽中培養(yǎng)7天。然后植入體內(nèi)。
4)結(jié)果檢測(cè)脫頸處死動(dòng)物，取植入組織作病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織血管生長(zhǎng)狀況，從中看出，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的心肌組織血管生長(zhǎng)旺盛，血運(yùn)豐富、心肌生長(zhǎng)活躍，心肌組織增厚等生長(zhǎng)趨勢(shì)，而只植入未載基因的殼聚糖納米粒的對(duì)照動(dòng)物其心肌血管生長(zhǎng)一般化，兩者呈明顯對(duì)比。
有益效果本發(fā)明的是殼聚糖納米粒粒徑在70-160nm之間，比表面積大，攜帶的重組質(zhì)?；驍?shù)量多，體內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因表達(dá)量高，能夠顯著提高構(gòu)建組織內(nèi)部的血管化水平，有助于再造心肌組織的成活和功能發(fā)揮。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1重組pcDNA3.1-hVEGF質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1是一種真核表達(dá)載體，該質(zhì)粒構(gòu)建有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，可以對(duì)插入的外源基因進(jìn)行表述調(diào)控。該質(zhì)粒自身載有hVEGF的基因編碼序列，在自身表達(dá)調(diào)控元件的作用下可以表達(dá)產(chǎn)生hVEGF。質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)上有17個(gè)酶切位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶可將BamHI和KpnI區(qū)域切開(kāi)，然后用T4DNA連接酶與同樣經(jīng)過(guò)BamHI和KpnI雙酶切處理的外源基因連接，使其置于人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子控制下，這樣就構(gòu)建成外源基因的真核表達(dá)載體(見(jiàn)附圖)。
實(shí)施例2基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體的構(gòu)建采用凝聚法制備，全部操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。先配制0.03％殼聚糖(Sigma)溶液，用1N HCl調(diào)成pH5.5，用0.22um濾膜過(guò)濾除菌，用75μM硫酸鈉(分析純，北京化工廠)溶液(用0.22um濾膜過(guò)濾除菌)溶解pcDNA3.1-hVEGF重組質(zhì)粒，使其終濃度為200ug/ml。從中取200ul0.03％殼聚糖溶液和200ul內(nèi)含重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hVEGF的75mM Na2SO4液分別置于55℃水恒溫20分鐘。準(zhǔn)確吸取200ul Na2SO4溶液加到殼聚糖溶液中，迅速在旋渦混合器上混合30秒，制成基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體混懸液。
實(shí)施例3組織工程化心肌的構(gòu)建制備I型膠原支架取體重250克左右大鼠一只，從尾根部切斷鼠尾，置75％酒精中浸泡30分鐘；無(wú)菌條件下將鼠尾切成1.5cm的小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿，浸入150ml醋酸溶液(0.01-0.25M)中，10磅10分鐘高壓滅菌后，置4℃冰箱，48小時(shí)后移入滅菌離心管中，以4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，吸取上清液分裝小瓶，-20℃冰箱保存?zhèn)溆脴?gòu)建組織工程化心肌以I型膠原作為支架，接種上大鼠乳鼠(1-2天)的心肌細(xì)胞。其心肌細(xì)胞的制備法是取乳鼠的心肌組織，切碎研磨均勻成細(xì)胞懸液，過(guò)濾除去未分散的組織凝塊，制成完全均勻的心肌細(xì)胞混懸液，其制備全過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。在心肌細(xì)胞懸液中加入一定濃度的pcDNA3.1-hVEGF-殼聚糖納米粒，再與I型膠原支架材料混合使其終濃度為2×106/ml左右。混合液加入環(huán)型槽中，60分鐘后加入培養(yǎng)液(DMEM，含10％馬血清)。心肌細(xì)胞與膠原的混合液即可在環(huán)型槽中形成環(huán)型的心肌細(xì)胞-膠原條帶。形成的環(huán)狀心肌細(xì)胞-膠原條帶在環(huán)形槽中培養(yǎng)7天。
實(shí)施例4體內(nèi)植入選用150-250g雄性、健康大鼠，1.5％戊巴比妥鈉腹腔注射0.4ml全身麻醉，開(kāi)腹部，暴露腹膜，將構(gòu)建的組織工程化心肌植入腹膜內(nèi)，并以未復(fù)合殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體的組織工程化心肌作為對(duì)照。
結(jié)果體內(nèi)培養(yǎng)14天后處死動(dòng)物，取心肌組織制成切片染色，觀察心肌組織的血管生長(zhǎng)趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物心肌組織內(nèi)可見(jiàn)，心肌組織內(nèi)血管生長(zhǎng)旺盛，在一視野內(nèi)大小血管生長(zhǎng)數(shù)十個(gè)、血運(yùn)豐富，心肌組織增生活躍，組織增厚，而對(duì)照組在一個(gè)視野內(nèi)心肌血管生長(zhǎng)和組織增生狀況一般，兩者呈明顯對(duì)比。


附圖重組pcDNA3.1-hVEGF質(zhì)粒
權(quán)利要求
1一種促進(jìn)組織血管化的基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體，其特征是將攜帶人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hVEGF)基因的真核表達(dá)載體與殼聚糖納米粒復(fù)合，采用凝聚法制造殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體，該復(fù)合體加入構(gòu)建的組織工程化組織中，可顯著提高組織的血管化水平。
2權(quán)利要求1所述的hVEGF基因，其特征是編碼區(qū)基因，含起始密碼子和終止密碼子。
3權(quán)利要求1所述的hVEGF基因，其功能是能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成新生血管。
4權(quán)利要求1中所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體，其特征是平均粒徑在70-160nm之間，粒徑較小，比表面積大，單位體積的粒數(shù)較多。因而在體內(nèi)基因表達(dá)量也會(huì)增多，為本發(fā)明的特點(diǎn)。
5權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體，其特征是在體內(nèi)質(zhì)粒從復(fù)合體中緩慢釋放，轉(zhuǎn)染周圍細(xì)胞，產(chǎn)生hVEGF，促進(jìn)血管增生，可以應(yīng)用于心肌等大塊軟組織的組織工程，也可以應(yīng)用于其他涉及需要改善局部血供的治療，以提高組織的血管化程度。
6權(quán)利要求1中所述的殼聚糖納米粒-pcDNA3.1-hVEGF基因復(fù)合體加入構(gòu)建的組織工程化組織，其方法是在支架上接種心肌細(xì)胞。在心肌細(xì)胞懸液中加入一定濃度的pcDNA3.1-hVEGF-殼聚糖納米粒，再與I型膠原支架材料混合使其終濃度為2×106/ml左右?；旌弦杭尤氕h(huán)型槽中，60分鐘后加入培養(yǎng)液(DMEM，含10％馬血清)。心肌細(xì)胞與膠原的混合液即可在環(huán)型槽中形成環(huán)型的心肌細(xì)胞-膠原條帶。形成的環(huán)狀心肌細(xì)胞-膠原條帶在環(huán)形槽中培養(yǎng)7天后植入體內(nèi)。
7要求1中所述的提高組織的血管化水平，其特征是通過(guò)組織工程化組織內(nèi)的基因-殼聚糖納米粒復(fù)合體緩慢釋放pcDNA3.1-hVEGF質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染周圍的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)hVEGF基因，后者作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使其長(zhǎng)入到組織工程化組織內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)組織血管化的基因－殼聚糖納米粒復(fù)合體，屬于組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明用pcDNA
文檔編號(hào)A61L31/14GK1565650SQ0314839
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月2日
發(fā)明者王常勇, 齊子榮, 郭希民, 段翠密, 趙云山 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所