專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸和血管活性劑相組合用于加強(qiáng)的基因投遞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因療法，更具體地涉及病毒介導(dǎo)的和其它形式的基 因療法，還涉及某些載體構(gòu)建體，包括腺病毒構(gòu)建體，以及用于傳遞 所需基因的技術(shù)。本發(fā)明更具體地涉及栽體介導(dǎo)的基因傳遞，所述基 因可用于促進(jìn)心臟血管生成，還涉及使用所述載體和基因傳遞技術(shù)治 療外周血管病和心臟病，包括心肌缺血和其它疾病的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)(1995年統(tǒng)計(jì)副刊)報(bào)道，美國(guó)約有6000萬(wàn)成 人患有心血管病，其中有1100萬(wàn)成人患有冠心病。心血管病每年造成 約100萬(wàn)美國(guó)人死亡，占總死亡率的40%。 1995年，美國(guó)有150萬(wàn)成 人被診斷為心絞痛，因心肌短暫缺血而感到胸痛。美國(guó)每年新出現(xiàn)約 350， 000例心絞痛。
當(dāng)心肌不能接受足夠的血液供給因此缺乏必需水平的氧和營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)時(shí)會(huì)出現(xiàn)心肌缺血。心肌缺血最常見(jiàn)的病因是動(dòng)脈硬化，動(dòng)脈硬化 使得為心肌提供血流的血管(冠狀動(dòng)脈)堵塞。目前的治療包括藥理學(xué) 療法，冠狀動(dòng)脈分流術(shù)和使用如氣嚢血管成形術(shù)的技術(shù)進(jìn)行的經(jīng)皮換 血管術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)療法依據(jù)的策略是增加心肌的血液供給或降低心 肌對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。增加心肌的血液供給可通過(guò)如鈣通道阻滯 劑或硝酸甘油的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。據(jù)認(rèn)為這些藥劑可通過(guò)使動(dòng)脈壁的平滑 肌;f^弛來(lái)增加患病動(dòng)脈的直徑。降低心肌對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求可通 過(guò)降低心臟血液動(dòng)力學(xué)負(fù)荷的藥劑，如動(dòng)脈血管舒張藥或降低心臟對(duì) 給定血液動(dòng)力學(xué)負(fù)荷的收縮反應(yīng)的藥劑，如p-腎上腺素能受體拮抗劑 來(lái)實(shí)現(xiàn)。缺血性心臟病的外科療法基于用精心放置的分流移植物(通常
是隱靜脈或乳房?jī)?nèi)部的動(dòng)脈移植物)來(lái)分流患病的動(dòng)脈區(qū)段。經(jīng)皮換血 管術(shù)基于使用導(dǎo)管來(lái)降低患病冠狀動(dòng)脈的狹窄程度。所有這些策略都 被用來(lái)降低心肌缺血發(fā)作的次數(shù)或根除此病，但它們都有這樣那樣的
局限性。
初步報(bào)告描述了通過(guò)直接注射血管生成蛋白質(zhì)或肽在心臟中生成 了新血管，從而可治療心肌缺血。生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中血管生成的調(diào)節(jié)
涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的幾個(gè)成員(即酸性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子，aFGF;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，bFGF;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子-5， FGF-5等)。aFGF蛋白促進(jìn)成年動(dòng)物血管生成的作用是一個(gè)最新 報(bào)道的主題。該報(bào)道中提到將被膠原包被的基質(zhì)中的aFGF蛋白置于成 年大鼠的腹腔中可導(dǎo)致血管分布良好并能正常灌注的結(jié)構(gòu)(Thompson 等，PNAS 86:7982-7932， 1989)。據(jù)報(bào)道，將bFGF蛋白注入成年犬 冠狀血管閉塞的冠狀動(dòng)脈中會(huì)導(dǎo)致心肌功能障礙降低，心肌梗塞面積 變小，危險(xiǎn)區(qū)域的血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，科學(xué) 257:1401-1403, 1992)。使用bFGF蛋白在心肌缺血的動(dòng)物模型中也可 得到類(lèi)似結(jié)果(Harada等，J Clin Invest 94:623-630， 1994， Unger 等，美國(guó)生理學(xué)雜志，266:H1588-H1595， 1994)。
然而，用這些蛋白質(zhì)達(dá)到血管生成效果的前提條件是需要重復(fù) 地或長(zhǎng)期地傳遞該蛋白質(zhì)，這就限制了在臨床環(huán)境使用這些蛋白質(zhì)刺 激血管生成的實(shí)用性。換句話說(shuō)，對(duì)人的成功療法需要持續(xù)地和長(zhǎng)期 地灌注一種或多種這些血管生成肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)本身的 價(jià)格高得讓人不敢問(wèn)津，而且需要通過(guò)置于冠狀動(dòng)脈中的導(dǎo)管來(lái)傳遞， 這進(jìn)一步抬高了價(jià)格并增加了治療難度。
最近，多篇文獻(xiàn)都致力于使用基因轉(zhuǎn)移來(lái)治療或預(yù)防疾病，包括 心臟病，例見(jiàn)Mazur等，寬狀動(dòng)脈再狹窄和基因治療分子和細(xì)胞 藥理學(xué)，21:104-111， 1994; French,"基因轉(zhuǎn)移和心血管疾病"， Herz 18:222-229, 1993; Williams,鈹血性心臟病基因療法展望", 美國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，306:129-136， 1993; Schneider和French, 腺 病毒的出現(xiàn)心血管病的基因療法"，循環(huán)88:1937-1942， 1993。另
一篇文獻(xiàn)，即Leiden等，題為，十對(duì)心臟和血管平滑肌的腺病毒介導(dǎo) 的基因轉(zhuǎn)移"的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US93/11133中報(bào)道了使用腺病毒介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)心血管平滑肌細(xì)胞的功能。Leiden等提到可將 含有編碼基因產(chǎn)物之DNA序列的重組腺病毒傳遞至心臟或血管平滑肌 細(xì)胞并維持細(xì)胞直至基因產(chǎn)物得以表達(dá)。根據(jù)Leiden等的報(bào)道，通過(guò) 改變基因轉(zhuǎn)錄和改變基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，如多核普酸或多肽的產(chǎn)生可調(diào)節(jié) 肌細(xì)胞的功能。
使用腺病毒和其它載體成功地將基因轉(zhuǎn)移至如心臟的器官仍有一 定的困難。例如，將轉(zhuǎn)基因插入快速分裂的細(xì)胞群體會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表 達(dá)的時(shí)間大大縮短。這種細(xì)胞的例子包括構(gòu)成所有血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì) 胞和分散在整個(gè)心臟中的成纖維細(xì)胞。還需著重考慮的是耙向轉(zhuǎn)基 因以使僅有所需細(xì)胞能接受并表達(dá)轉(zhuǎn)基因，而轉(zhuǎn)基因不會(huì)全身性地分 布。如果不能做到這一點(diǎn)，就會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的全身性表達(dá)并引發(fā)一系 列問(wèn)題。例如，經(jīng)記載，肝臟中由腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致炎性 滲入(Yang，等，Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 91: 4407, 1994)。
或那樣的問(wèn)題。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了編碼轉(zhuǎn)基因之腺病毒的獲救重組構(gòu)建。 圖2顯示了用lacZ (對(duì)照基因)和FGF-5進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移之前和14±1 天之后，在右心房起博(HR=200bpm)過(guò)程中缺血血管床壁增厚的百分比 (%WTh),該百分比是通過(guò)測(cè)定舒張結(jié)束時(shí)血管壁的厚度(EDWTh)和收縮 結(jié)束時(shí)血管壁的厚度(ESWTh)計(jì)算出的，用FGF-5轉(zhuǎn)移之后，缺血血管 床的功能增加了 2. 6倍(p^0. 0001),而對(duì)照基因卻不起作用。
圖3顯示了用lacZ(對(duì)照基因)和FGF-5進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移之前和14±1 天之后，心房起博(200bpm)過(guò)程中的峰對(duì)比率(與血流相關(guān))，該對(duì)比 率以缺血區(qū)域(LCx床)的峰視頻強(qiáng)度除以室間隔(IVS)的峰視頻強(qiáng)度 的比率表示，是使用基于計(jì)算機(jī)的視頻分析程序由視頻影像測(cè)得的。
用FGF-5轉(zhuǎn)移之后，流向缺血床的血流比正常情況下增加2倍
(p-0.0018)，但用對(duì)照基因轉(zhuǎn)移之后，血流只為正常情況下的50%。
圖4顯示了心Jl^ttb^聲心動(dòng)4^i己圖(M示)的對(duì)應(yīng)圖，白色區(qū)J^^示對(duì)比 增強(qiáng)(更多i^JD，黑色區(qū)^^示血;械少。圖4A表示正常豬的急性LCx閉塞， 圖4B表示LacZ基因^f多后14±1天，圖4C表示FGF-5基因#^后14±1天。
圖5顯示了用FGF-5和lacZ基因轉(zhuǎn)移之后，通過(guò)對(duì)缺血和非缺 血區(qū)域進(jìn)行顯微分析而定量測(cè)定的毛細(xì)血管數(shù)目與纖維數(shù)目的比率。 FGF-5基因轉(zhuǎn)移之后，血管生成增加(p〈0. 038)。
圖6圖示了處理的動(dòng)物的區(qū)域性收縮功能。圖6A顯示了在用lacZ (對(duì)照基因)和用FGF-5進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移之前或者之后兩周動(dòng)物的結(jié)果， 圖6B顯示了在用FGF-5進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移之前或者之后12周動(dòng)物的結(jié)果。
圖7圖示了在用lacZ(對(duì)照基因)和用FGF-5進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移之前、 之后兩周和之后12周，處理動(dòng)物的區(qū)域性心肌血流。
圖8圖示了在用FGF-5和用lacZ進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移之后，處理動(dòng)物缺 血和非缺血區(qū)域中毛細(xì)血管(圖8A)和血管(圖8B)數(shù)目的評(píng)估。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明涉及用于治療心臟病，如心Jin^jfei和外周血管病以及其它疾病的 基因療法，其中通過(guò)血管內(nèi)傳遞導(dǎo)入基因治療栽體。本發(fā)明的一個(gè)目的是提 供治療心臟病的方法,其中通過(guò)用含有血管生成蛋白或肽(如FGF-5或FGF-4)
基因的載^I建體，優(yōu)選為病毒栽體，如復(fù)制缺損的腺病毒構(gòu)建體乾向心臟 而持續(xù)^4心肌中產(chǎn)生治療有效量的所i^jk管生成蛋白或肽，所,建體是 通itm內(nèi)注射傳遞的，優(yōu)選通過(guò)導(dǎo)管傳遞，所述導(dǎo)管位于一個(gè)或兩個(gè)冠狀動(dòng) iM^者一個(gè)或多個(gè)隱"^J3^乳房?jī)?nèi)部動(dòng)il^植物(internal mammary artery graft)開(kāi)口下較遠(yuǎn)的位置("-^至少約1cm)。因此，希望注射到一個(gè)冠狀 動(dòng)脈或移植物動(dòng)脈，優(yōu)選注射到右和左冠狀循環(huán)中。特別優(yōu)選通過(guò)三次注射 進(jìn)行傳遞， 一次注射至左前降(left anterior descending, LAD)動(dòng)脈，一 次注射至左旋(left circumflex, LCx)冠狀動(dòng)脈， 一次注射至右冠狀動(dòng)脈。
如4^^斤述，為了進(jìn)一步增強(qiáng)基因艦，>^ ^1^^1基因傳遞栽體的同時(shí)在 血管內(nèi)^it/斤乾向的位點(diǎn)處灌:aiL管活性劑(例Ma^，纟J^:動(dòng)劑iUL管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白)；IL^^導(dǎo)A^^^前的;L^內(nèi)灌;aik管洽性劑。
本發(fā)明的另 一方面是治療患有心肌缺血之患者的心臟病的方法，
所述方法包括通過(guò)冠內(nèi)注射，優(yōu)選通過(guò)將栽體直接注射至一個(gè)或兩個(gè)
冠狀動(dòng)脈(或移植物)中而將含有轉(zhuǎn)基因的載體傳遞至患者的心肌中， 以轉(zhuǎn)染患病心肌的心肌細(xì)胞，所述栽體含有編碼血管生成蛋白或肽(例
如FGF-5， FGF-4， aFGF， bFGF或VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子))的轉(zhuǎn)基因， 并在心臟中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，籍此促進(jìn)患病心肌區(qū)域的血管生成。如下文 所述，也可使用其它轉(zhuǎn)基因，例如編碼p-腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的 基因。本發(fā)明所用載體可以是質(zhì)粒，或優(yōu)選為病毒載體，例如復(fù)制缺 損的腺病毒或腺伴隨病毒(AAV)。通過(guò)以107-1013個(gè)病毒顆粒的優(yōu)選 量(經(jīng)光密度測(cè)定法測(cè)定，更優(yōu)選為109-IO"個(gè)病毒顆粒)，將病毒栽 體原種，例如不含有野生型病毒的上述原種深深注射至一個(gè)或兩個(gè)冠 狀動(dòng)脈(或移植物)的腔中，優(yōu)選注射至右和左冠狀動(dòng)脈(或移植物)中， 可以用編碼血管生成蛋白或肽的基因局部轉(zhuǎn)染患病心肌內(nèi)所需數(shù)目的 細(xì)胞，尤其是心肌細(xì)胞，從而使基因轉(zhuǎn)移的治療效力最大化，并使心 臟外位點(diǎn)不必要的血管生成和對(duì)病毒蛋白質(zhì)之炎癥反應(yīng)的可能性最小 化。如果使用的是心室肌細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子能更可靠地確 保只在心肌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)從而避免非心組織，如視網(wǎng)膜中血管生成
的潛在有害的影響。為了進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明基因傳遞載體的局部傳遞， 可以按本文所述的方式利用導(dǎo)管在心肌中灌注血管活性劑，優(yōu)選灌注 組胺或組胺激動(dòng)劑或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白。
另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)過(guò)濾可以注射的腺病毒載體制品，其 含有重組腺病毒載體和藥學(xué)可接受的載體，優(yōu)選最終的病毒滴度為107 -1013個(gè)病毒顆粒，所述載體不含野生型病毒，但含有部分腺病毒序 列，其中一個(gè)或多個(gè)賦予復(fù)制能力所需的腺病毒基因，例如EIA/EIB 基因已缺失，還含有側(cè)翼為部分腺病毒序列的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼血管 生成蛋白或肽(如aFGF， bFGF , FGF-4， FGF-5或VEGF)的轉(zhuǎn)基因。通 過(guò)使用這一可注射的腺病毒載體制品，任選同時(shí)使用血管活性劑如組 胺或組胺激動(dòng)劑或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白增強(qiáng)本文所述的基因 傳遞，可以進(jìn)行有效的腺病毒介導(dǎo)的FGF基因傳遞以治療心臟病，如 臨床心肌缺血或外周血管病，而沒(méi)有任何有害的副作用。
另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)含有重組載體的病毒原種的方法，
其中所述載體能在心肌中體內(nèi)表達(dá)血管生成蛋白或肽，所述生產(chǎn)方法
包括將轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選編碼血管生成蛋白或肽，如FGF-4, FGF-5， aFGF， bFGF或VEGF)克隆至含有啟動(dòng)子、多接頭以及位于側(cè)翼的人腺病毒5 基因組左末端的部分腺病毒序列的質(zhì)粒中，其中賦予復(fù)制能力的一個(gè) 或多個(gè)所需的腺病毒基因，例如EIA/EIB基因已缺失；用所述質(zhì)粒與 含有整個(gè)人腺病毒5基因組和另外的插入物使得質(zhì)粒太大以致于不能 被包裹的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用缺失的復(fù)制所需基因轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，籍 此在含有轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒和具有整個(gè)腺病毒基因組的質(zhì)粒之間發(fā)生獲救 重組，從而產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因而不含復(fù)制所需基因的重組基因組，所述 重組基因組小得足以被包裹；鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物中成功的重組子；在被 缺失的復(fù)制所需基因轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增殖所得重組子；純化增 殖的重組子使其中含有重組栽體，而不含野生型病毒，任選將純化的
載體穿過(guò)濾器，優(yōu)選為10-50微米的濾器，更優(yōu)選為30微米的濾器。 另一方面，可通過(guò)插入股動(dòng)脈近側(cè)部分的導(dǎo)管來(lái)傳遞表達(dá)血管生 成肽或蛋白質(zhì)的重組腺病毒，優(yōu)選同時(shí)使用血管活性劑，如組胺或組 胺激動(dòng)劑，從而將基因轉(zhuǎn)移至接受來(lái)自股動(dòng)脈之血流的骨骼肌細(xì)胞中。 籍此提供血管生成刺激物，導(dǎo)致腿骨骼肌中的血管生成，從而治療特 征在于腿肌肉供血不足的外周血管病。
在本發(fā)明的另一方面，通過(guò)將載體傳遞至用血管活性劑，如組胺 或組胺激動(dòng)劑或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白共灌注或預(yù)灌注的血管 (如動(dòng)脈)中，可增強(qiáng)使用載體，如病毒載體(如腺病毒或腺伴隨病毒) 進(jìn)行基因傳遞的效力。最優(yōu)選在導(dǎo)入栽體之前的幾分鐘內(nèi)將血管活性 劑灌注至血管中。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因
在本發(fā)明中，可使用多種能促使心肌血流向心臟(對(duì)外周血管病 而言為骨骼肌)缺血區(qū)域的蛋白質(zhì)或肽生長(zhǎng)因子以及其它轉(zhuǎn)基因。至 于待表達(dá)的血管生成蛋白或肽，可例舉如aFGF, bFGF, FGF-4和FGF-5
的血管生成蛋白或肽。在蛋白質(zhì)灌注的過(guò)程中合理地確定了 FGF家族 的血管生成活性(YanagisawaMiwa等，科學(xué)，257:1401-1403， 1992， Harada等，J Clin Invest 94:623-630， 1994， Unger等，美國(guó)生理 學(xué)雜志，266:H1588-H1595， 1994)。也可使用VEGF (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子，它是新血管生成的有效刺激物)基因?；蜣D(zhuǎn)移方法的成功需要合 成基因產(chǎn)物并由轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌該產(chǎn)物。由此看來(lái)，編碼FGF-5或FGF-4 的基因是優(yōu)選的，優(yōu)選選擇的基因中包括信號(hào)肽編碼序列，該序列使 得基因產(chǎn)物(一旦被表達(dá))可進(jìn)入心臟(或骨骼肌)間質(zhì)組織并誘導(dǎo)血管 生成。可以使用的血管生成蛋白包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),血小板-衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，胰烏素樣生長(zhǎng) 因子(IGF)等家族的成員。FGF家族成員包括但不限于aFGF(FGF-l)， bFGF(FGF-2)， FGF-4(也稱(chēng)為"hst/KS3")， FGF-5, FGF-6。體外和 體內(nèi)的心肌細(xì)胞對(duì)缺血所作的反應(yīng)是表達(dá)VEGF; VEGF是生理狀況下以 及對(duì)病理狀況的適應(yīng)反應(yīng)過(guò)程中血管生成的調(diào)節(jié)劑(Banai等，循環(huán) 89:2183-2189, 1994)。 VEGF家族包括但不限于VEGF-A亞族的成員(如 VEGF-121，腦F-145， VEGF-165， VEGF-189和VEGF-206)以及VEGF-B 亞族的成員(如VEGF-167和VEGF-186)和VEGF-C亞族.PDGF家族包 括PDGF A和PDGF B。編碼這些蛋白質(zhì)之基因的核苷酸序列和相應(yīng)的 氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的(例見(jiàn)這些和其它序列的GENBANK序列數(shù) 據(jù)庫(kù))。有關(guān)FGF家族，例見(jiàn)Burgess, Aim, N. Y. Acad. Sci. 638:89-97， 1991; Burgess等，生物化學(xué)年評(píng)，58: 575-606， 1989; Muhlhauser 等，人類(lèi)基因治療6:1457-1465, 1995; Zhan等，分子細(xì)胞生物學(xué)， 8:3487， 1988; Seddon等，Ann， N. Y. Acad. Sci. 638:98-108, 1991。 有關(guān)人hst/KS3(即FGF-4),例見(jiàn)Taira等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2980-2984, 1987。有關(guān)人VEGF,例見(jiàn)Tischer等，生物化學(xué) 雜志，206:11947-11954, 1991和其中的參考文獻(xiàn)；Muhlhauser等， Cir. Res. 77:1077- 1086， 1995。從諸如GenBank或EMBL的序列數(shù) 據(jù)庫(kù)中易于得到所述基因和所編碼多肽的序列資料。也可使用例如PCR 或本領(lǐng)域的常規(guī)雜交技術(shù)從基因文庫(kù)中得到編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷
酸。編碼FGF-4, FGF-5或FGF-6的基因是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)含 有功能性的分泌信號(hào)序列，易于從細(xì)胞中分泌出來(lái)。很多(如果不是大 多數(shù))人VEGF蛋白(包括但不限于VEGF-121和VEGF-165)也是易于分 泌的，并且在分泌之后可以擴(kuò)散。因此，這些血管生成蛋白一旦表達(dá)， 即易于進(jìn)入心臟間質(zhì)組織并誘導(dǎo)血管生成。至于缺乏天然分泌信號(hào)序 列的其它血管生成蛋白，如aFGF(FGF-l)和bFGF(FGF-2)，使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法學(xué)可重組產(chǎn)生具有分泌信號(hào)序列 的融合蛋白。據(jù)信aFGF和bFGF天生具有一定的分泌水平；然而，可 再包含另外的分泌信號(hào)序列以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的分泌。分泌信號(hào)序列 一般 位于所需蛋白質(zhì)的N末端，但也可位于適于分泌血管生成因子的任何 位置。例如，含有適當(dāng)信號(hào)序列的多核苷酸可與選定血管生成蛋白基 因的第一個(gè)密碼子5，端融合。適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)序列包括FGF-4， FGF-5， FGF-6基因的信號(hào)序列或不同分泌蛋白，如IL-lp的信號(hào)序列。血管生 成蛋白經(jīng)修飾可含有另一種蛋白質(zhì)的信號(hào)序列，所述修飾如用介導(dǎo)分 泌第二種分泌型蛋白質(zhì)的殘基取代血管生成蛋白中的殘基，例見(jiàn)1997 年5月6日提交的共同懸而未決的美國(guó)流水號(hào)08/852, 779 (列入本文 作為參考)?？墒褂眯募〖?xì)胞正常分泌之蛋白質(zhì)的信號(hào)序列。為了治療 人，優(yōu)選使用來(lái)源于人的編碼血管生成蛋白的基因，但也可使用來(lái)源 于其它哺乳動(dòng)物，并表現(xiàn)出種間交叉反應(yīng)性，即在人中具有血管生成
活性的血管生成蛋白。
除了血管生成因子以外，也可使用能增強(qiáng)心臟功能的p-腎上腺素 能信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(p-ASP)。這種p-ASP的例子包括P-腎上腺素能受體 (P-AR)， G-蛋白受體激酶抑制劑(GRK抑制劑)和腺苷酸環(huán)化酶(AC)， 其詳細(xì)描述于1997年9月5日提交的共同懸而未決的美國(guó)流水號(hào) 08/924， 757(基于1997年6月16日提交的美國(guó)申請(qǐng)60/048,933和 1996年9月5日提交的美國(guó)申請(qǐng)08/708， 661)以及1997年9月5曰 提交的PCT/US97/15610和1998年1月16日提交的美國(guó)繼續(xù)申請(qǐng)流水 號(hào)08/...。這些和所有其它專(zhuān)利申請(qǐng)以及專(zhuān)利申請(qǐng)中提及的參考文獻(xiàn) 都列入本文作為參考。
基因傳遞所用的載體
在本發(fā)明的方法中，載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，例如復(fù)制
缺損的腺病毒載體或腺伴隨病毒載體。下文提供了描述多種載體(包括 病毒和非病毒載體)的構(gòu)建和使用的參考文獻(xiàn)。
作為實(shí)例，將所需基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移至心臟(或骨骼肌)，包括心肌細(xì) 胞(和骨骼肌細(xì)胞)并介導(dǎo)所編碼蛋白質(zhì)的組成型產(chǎn)生?？梢允褂脦追N 不同的基因轉(zhuǎn)移方法，優(yōu)選使用不依賴(lài)于輔助病毒的復(fù)制缺損的人腺 病毒系統(tǒng)。通過(guò)使用該系統(tǒng)，我們證明通過(guò)單次冠內(nèi)注射可體內(nèi)轉(zhuǎn)染
60%以上的心肌細(xì)胞(Giordano和Hammond, 臨床研究，42:123A， 1994)。非復(fù)制型重組腺病毒載體對(duì)轉(zhuǎn)染冠狀內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞并在 冠內(nèi)注射后獲得高度有效的轉(zhuǎn)染特別有用。對(duì)轉(zhuǎn)染外周血管系統(tǒng)的靶 細(xì)胞也特別有用。
基于人腺病毒5(病毒學(xué)，163:614-617， 1988)的重組腺病毒載體 缺乏腺病毒基因組中必需的早期基因(通常是E1A/E1B)，因此不能復(fù) 制，除非在可反式提供缺失基因產(chǎn)物的允許細(xì)胞系中生長(zhǎng)時(shí)才能復(fù)制。 替代缺失的腺病毒基因組序列，可克隆所需的轉(zhuǎn)基因并在被該復(fù)制缺 損的腺病毒感染的組織/細(xì)胞中表達(dá)。盡管基于腺病毒的基因轉(zhuǎn)移不會(huì) 使轉(zhuǎn)基因整合至宿主基因組(低于0. 1%的腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn) 基因摻入宿主DNA)，因此是不穩(wěn)定的，但腺病毒載體可以高滴度增殖 并轉(zhuǎn)染非復(fù)制細(xì)胞。盡管轉(zhuǎn)基因不能傳遞至子代細(xì)胞，但基因轉(zhuǎn)移至 不分裂的成年骨骼肌和心肌細(xì)胞是可以接受的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體提供 了穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移，目前經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒假型化可以得到高滴度的病 毒載體 (Burns 等 ， Proc. Natl. Acad. Sci(USA) 90:8033-8037， 1993)，但最新的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)非復(fù)制 細(xì)胞(成年骨骼肌和心肌細(xì)胞)。另外，如果只需進(jìn)行短期基因轉(zhuǎn)移即 已足夠的話，轉(zhuǎn)基因摻入宿主DNA的潛在危害就不復(fù)存在。實(shí)際上， 我們已發(fā)現(xiàn)在有限的時(shí)間內(nèi)表達(dá)血管生成蛋白就足以生成大量血管， 對(duì)心血管病和外周血管病進(jìn)程進(jìn)行瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)移即可進(jìn)行充分的治療。
被腺病毒E1A/E1B基因轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞，即人293細(xì)胞是有用 的允許細(xì)胞系的典型代表。然而，也可使用允許復(fù)制缺損的腺病毒載 體在其中增殖的其它細(xì)胞系，包括HeLa細(xì)胞。
構(gòu)建基因傳遞所用的重組腺病毒載體和其它載體
通過(guò)Graham，病毒學(xué)163:614-617， 1988所述的獲救重組技術(shù) 可構(gòu)建本發(fā)明中所用的所有腺病毒載體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將所需轉(zhuǎn)基因克 隆至含有啟動(dòng)子、多接頭和部分側(cè)翼腺病毒序列的穿梭栽體中，該部 分腺病毒序列中已缺失了 EIA/EIB基因。作為穿梭載體，可例舉質(zhì)粒 pACl(病毒學(xué)，163:614-617， 1988)(或類(lèi)似物)，其編碼人腺病毒5基 因組左末端部分(病毒學(xué)，163:614-617,1988),并缺失了對(duì)病毒復(fù)制 至關(guān)重要的編碼早期蛋白質(zhì)的E1A和E1B序列；和質(zhì)粒ACCMVPLPA(生 物化學(xué)雜志，267:25129-25134， 1992)，其含有多接頭，CMV啟動(dòng)子 和SV40聚腺苷酸化信號(hào)，以及位于側(cè)翼的EIA/EIB基因已缺失的部分 腺病毒序列。質(zhì)粒pACl或ACCMVPLA的使用便于克隆過(guò)程。然后用穿 梭載體與含有整個(gè)人腺病毒5基因組，因長(zhǎng)度太大以致于不能被包裹 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。通過(guò)磷酸鈣沉淀或脂轉(zhuǎn)染法(生物技術(shù)， 15:868-872， 1993)可進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒JM17編碼整個(gè)人腺病毒5基 因組及載體pBR322的一部分，其中包括氨千青霉素抗性基因(4. 3kb)。 盡管JM17編碼獲得成熟的病毒顆粒所必需的所有腺病毒蛋白質(zhì)，但它 太大以致于不能被包裹(40kb,而野生型為36kb)。在共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的一 小群中，含有轉(zhuǎn)基因的穿梭載體(如質(zhì)粒pACl)和具有整個(gè)腺病毒5基 因組的質(zhì)粒(如質(zhì)粒pJM17)之間的獲救重組提供了 E1A/E1B序列缺損 的重組基因組，其含有所需轉(zhuǎn)基因，但在重組過(guò)程中失去了額外的序 列，如pBR322序列，因而小得足以被包裹(見(jiàn)圖1)。關(guān)于上述方法， 我們已報(bào)道了成功的結(jié)果(Giordano等，循環(huán)88:1-139， 1993和 Giordano和Ham邁ond，臨床研究，42:123A, 1994)?？蒦f吏用CMV驅(qū)動(dòng) 的編碼P-半乳糖苷酶的腺病毒HCMVSPllacZ(CLIN RES 42:123A, 1994)，利用X-gal處理來(lái)評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)移的效力。
最初的基因轉(zhuǎn)移模式使用了上文所述的腺病毒載體。這些載體的
優(yōu)點(diǎn)包括能實(shí)現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)移(體內(nèi)轉(zhuǎn)染60%以上的耙器官細(xì)胞)，易 于得到高滴度的病毒原種，并且這些載體還能對(duì)如心肌細(xì)胞的不分裂 細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。
描述多種其它基因傳遞載體的文獻(xiàn)是本領(lǐng)域已知的，本文提到了 其中的一些文獻(xiàn)。所述其它載體包括例如其它病毒栽體(如腺伴隨病毒 (AAV))，脂質(zhì)體和其它含有脂質(zhì)的復(fù)合物，和其它能介導(dǎo)多核苷酸傳 遞至宿主細(xì)胞的大分子復(fù)合物。如上文和所述參考文獻(xiàn)中所述，載體 也可含有其它能進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因傳遞和/或基因表達(dá)，或要不然能為靶 細(xì)胞提供有利特性的組分或功能元件。所述其它組分包括例如可影響
結(jié)合或耙向細(xì)胞的組分(包括介導(dǎo)細(xì)胞型或組織特異性結(jié)合的組分)； 影響細(xì)胞攝取載體核酸的組分；影響攝取后多核苷酸在細(xì)胞中的定位 的組分(如介導(dǎo)核定位的試劑)；和影響多核苷酸表達(dá)的組分。所述組 分也可包括標(biāo)記物，如可用于檢測(cè)或選擇已吸收并表達(dá)由栽體傳遞之 核酸的細(xì)胞的可測(cè)的和/或可選擇的標(biāo)記物。所述組分可作為載體的天 然特征被提供(例如使用某些具有介導(dǎo)結(jié)合和攝取的組分或功能元件 的病毒載體)，或者對(duì)載體進(jìn)行修飾以提供所述功能元件。選擇標(biāo)記可 以是陽(yáng)性，陰性或雙功能的。陽(yáng)性選擇標(biāo)記可選擇攜有標(biāo)記物的細(xì)胞， 而陰性選擇標(biāo)記可選擇標(biāo)記物被選擇性消除的細(xì)胞。已描述了多種標(biāo)
記基因，其中包括雙功能(即陽(yáng)性/陰性)標(biāo)記(例見(jiàn)Lupton， S. ， W0 92/08796， 1992年5月29日公開(kāi)；和Lupton, S. ， W094/28143, 1994 年12月8日公開(kāi))。這種標(biāo)記基因另外還可作為對(duì)照，這對(duì)基因治療 過(guò)程而言是有利的。多種此類(lèi)栽體是本領(lǐng)域已知的，并且一般是可以 得到的(例見(jiàn)上述多篇文獻(xiàn))。
描述本發(fā)明方法中可用的腺病毒載體和其它病毒載體的其它文獻(xiàn) 包括下列Horwitz， M. S.，腺病毒科及其復(fù)制，F(xiàn)ields, B等(編)， 病毒學(xué)，Vol.2, Raven出版社，紐約，pl679-1721， 1990; Graham, F 等，pl09-128,分子生物學(xué)方法，Vol.7:基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方法, Murray, E(編)，H咖ana出版社，Clifton, N. J(1991); Miller, N
等，F(xiàn)ASEB Journal 9:190-199， 1995; Schreier， H. Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145—159， 1994; Schneider and French, 循環(huán)， 88:1937-1942， 1993; Curiel D. T等，人類(lèi)基因治療，3:147-154, 1992; Graham, F. L等，WO 95/00655(1995年1月 5 日)； Falck-Pedersen， E. S., WO 95/16772 (1995年6月22日)；Denefle, P等，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada， H等，WO 94/26914 (1994年11月24曰)；Perricaudet, M等，W0 95/02697 (1995 年l月26日)；Zhang, W等，WO 95/25071 (1995年10月12曰)。多 種腺病毒質(zhì)粒也可以商購(gòu)自，包括例如Microbix Biosystems of Toronto, Ontario(例見(jiàn)Microbix產(chǎn)品目錄腺病毒載體構(gòu)建所用質(zhì) 粒，1996)，也可參見(jiàn)Vile等的論文，天然生物技術(shù)，15:840-841， 1997， Feng等，天然生物技術(shù)，15:866-870， 1997，其中描述了可用 于基因傳遞的腺病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合載體的構(gòu)建和使用。
描述本發(fā)明方法中可用的AAV載體的其它文獻(xiàn)包括下列Carter, B, 細(xì)小病毒手冊(cè)，vol. 1, pl69-228， 1990; Berns, 病毒學(xué)， pl743-1764 (Raven出版社，1990) ; Carter, B.，生物技術(shù)最新觀點(diǎn)， 3:533-539， 1992; Muzyczka， N.，微生物學(xué)和免疫學(xué)最新論題， 158:92-129， 1992; Flotte， T. R等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356， 1992; Chatterjee等，Ann. NY Acad. Sci.， 770:79-90, 1995; Flotte, T. R等，WO 95/13365(1995-5-18); Trempe, J. P 等，W0 95/13392(1995-5—18) ; Kotin. R.,人類(lèi)基因治療，5:793—801， 1994; Flotte， T. R等，基因治療，2:357-362, 1995: Allen, J. M.， W0 96/17947(1996-6-13);和Du等，基因治療，3:254-261， 1996。
描述本發(fā)明方法中可用的非病毒載體的其它文獻(xiàn)包括下列 Ledley， FD，人類(lèi)基因治療，6:1129-1144, 1995; Miller, N等， FASEB Journal 9:190-199, 1995; Chonn. A等，生物技術(shù)最新觀點(diǎn)， 6:698-708， 1995; Schofield, J. P等，British Med. Bull. 51:56-71， 1995; Brigham， K. L等,脂質(zhì)體研究雜志，3:31-49， 1993; Brigham, K. L. ， W0 91/06309(1991-5-16); Feigner, P. L等，WO 91/
17424(1991-11-14) ; Solodin等，生物化學(xué)34:13537—13544， 1995; WO 93/19768(1993-10—14); Debs等，WO 93/25673; Feigner, P. L 等，美國(guó)專(zhuān)利5， 264， 618(1993-11-23); Epand, R. M等，美國(guó)專(zhuān) 利 5，283，185(1994-2-l); Gebeyehu 等， 美國(guó)專(zhuān)利 5， 334， 761 (1994-8-2) ; Feigner, P. L 等， 美國(guó)專(zhuān)利 5,459,127(1995—10-17); Overell， R. W 等 ， WO 95/28494(1995-10-26); Jessee， WO 95/02698 (1995-1-26); Haces 和Ciccarone， WO 95/17373(1995-6-29); Lin等，WO 96/01840 (1996+25)。
組織特異性啟動(dòng)子
本發(fā)明也希望不僅通過(guò)將轉(zhuǎn)基因傳遞至冠狀動(dòng)脈或股動(dòng)脈，還使 用組織特異性啟動(dòng)子進(jìn)行細(xì)胞耙向。通過(guò)將左心室肌球蛋白輕鏈 -2 (MLC2v)或肌球蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列與腺病毒 構(gòu)建體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因，如FGF-5融合，可將轉(zhuǎn)基因的表達(dá)局限于心室心 肌細(xì)胞。針對(duì)lacZ，使用本發(fā)明的重組腺病毒系統(tǒng)測(cè)定了由MLC^和 MHC啟動(dòng)子提供的基因表達(dá)的效力以及特異性程度。Lee等以前曾報(bào)道 過(guò)心臟特異性表達(dá)(生物化學(xué)雜志，267:15875-15885， 1992)。 MLC2v 啟動(dòng)子由250bp組成，容易符合腺病毒-5的包裝限制范圍。已知肌球 蛋白重鏈啟動(dòng)子是強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，它是另一個(gè)合理的心臟特異 性啟動(dòng)子，由低于300bp組成。盡管其它啟動(dòng)子(如肌鈣蛋白-C啟動(dòng) 子)是高效的并且足夠小，但卻缺乏足夠的組織特異性。通過(guò)使用MLC2v 或MHC啟動(dòng)子并在體內(nèi)傳遞轉(zhuǎn)基因，據(jù)信只有心肌細(xì)胞(即在心臟內(nèi)的 內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中不相伴表達(dá))中足量表達(dá)了血管 生成蛋白，如FGF-5以促進(jìn)血管生成。將表達(dá)局限于心肌細(xì)胞對(duì)利用 基因轉(zhuǎn)移治療臨床心肌缺血是有利的。通過(guò)將表達(dá)局限于心臟，避免 了非心臟組織(如視網(wǎng)膜)中血管生成的潛在有害的影響。另外，在心 臟細(xì)胞中，由于肌細(xì)胞不會(huì)快速轉(zhuǎn)換，因而可能提供最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)；因此表達(dá)不會(huì)因內(nèi)皮細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生的細(xì)胞分裂和死亡而降低。
已得到了內(nèi)皮細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子可用于此目的(Lee等，生物化學(xué) 雜志，265: 10446-10450， 1990)。
在本發(fā)明中，關(guān)于治療心臟病，目前優(yōu)選通過(guò)冠內(nèi)注射高滴度的 載體靶向心臟并轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞類(lèi)型。
增殖并純化腺病毒栽體
可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法噬斑純化成功的重組栽體。在反式提供E1A和E1B 功能的293細(xì)胞上增殖所得的病毒載體至滴度的優(yōu)選范圍為101Q- 1012 個(gè)病毒顆粒/ml。然后感染80%鋪滿(mǎn)的細(xì)胞，48小時(shí)后收獲病毒。3次 凍融循環(huán)之后，離心沉淀細(xì)胞碎片，通過(guò)CsCl梯度超離心(優(yōu)選雙CsCl 梯度超離心)純化病毒。體內(nèi)注射之前，通過(guò)S印harose柱(如G25 S印hadex)進(jìn)行凝膠過(guò)濾使病毒原種脫鹽。然后將產(chǎn)物流經(jīng)30微米的 濾器以過(guò)濾，籍此降低冠內(nèi)注射未經(jīng)過(guò)濾的病毒的有害影響(對(duì)生命有 威脅的心率失常)并促進(jìn)有效的基因傳遞。所得病毒原種最終的病毒滴 度范圍為10" - 1012個(gè)病毒顆粒/1111。重組的腺病毒必需是高度純化的， 不含野生型(可能會(huì)復(fù)制的)病毒。不純的構(gòu)建體可導(dǎo)致宿主動(dòng)物強(qiáng)烈 的免疫應(yīng)答。由此看來(lái)，可通過(guò)例如使用適當(dāng)引物經(jīng)PCR筌定成功的 重組子，進(jìn)行兩輪噬斑純化和雙CsCl梯度超離心進(jìn)行增殖和純化以排 除污染物和野生型病毒。另外，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)在冠內(nèi)注射之前將重組 腺病毒流經(jīng)適當(dāng)大小的濾器進(jìn)行過(guò)濾即可避免因?qū)⑾俨《据d體注射至 患者體內(nèi)而誘導(dǎo)的心率失常的相關(guān)問(wèn)題。此策略似乎可大大改善基因 轉(zhuǎn)移和表達(dá)。
重組載體的傳遞
本發(fā)明的載體，包括病毒栽體以及非病毒載體可以是(例如，必要 時(shí))含有藥物可接受的載體，如鹽水的可注射制劑形式。
優(yōu)選的載體是上文所述的復(fù)制缺損的腺病毒載體?？勺⑸渲苿┲?該載體最終滴度的優(yōu)選范圍為允許有效基因轉(zhuǎn)移的107- 1013個(gè)病毒顆 粒。下文描述了其它藥物學(xué)載體，制劑和劑量。通過(guò)在熒光鏡的指導(dǎo)
下，使用基于標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)皮導(dǎo)管的方法，灌注一個(gè)或兩個(gè)冠狀動(dòng)脈(或移植 血管)可將載體轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體傳遞至心肌，灌注的量足以使轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)水平可達(dá)到高效治療。
注射應(yīng)深入冠狀動(dòng)脈(或移植血管)的腔內(nèi)(動(dòng)脈腔內(nèi)約lcm),優(yōu) 選在兩個(gè)冠狀動(dòng)脈內(nèi)進(jìn)行，因?yàn)楦鱾€(gè)患者的側(cè)血管生長(zhǎng)是高度可變的。 因此，也包括注射至一個(gè)冠狀動(dòng)脈或移植動(dòng)脈；然而，優(yōu)選注射至右 和左冠狀動(dòng)脈循環(huán)。特別優(yōu)選通過(guò)三次注射進(jìn)行傳遞， 一次注射至左 前降動(dòng)脈(LAD)， 一次注射至左旋(LCx)冠狀動(dòng)脈， 一次注射至右冠狀 動(dòng)脈。通過(guò)用冠狀導(dǎo)管直接將治療物質(zhì)注射至冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)(當(dāng)需要增 強(qiáng)基因治療時(shí)，優(yōu)選與血管活性劑聯(lián)合，如組胺或組胺激動(dòng)劑或VEGF 蛋白)，可以更有效地靶向基因，并使注射過(guò)程中流向近側(cè)主動(dòng)脈的重 組載體損失最小化。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)以此方式傳遞時(shí)，基因表達(dá)不會(huì)在肝 細(xì)胞中發(fā)生，在冠內(nèi)注射后任何時(shí)間的尿液中也未曾發(fā)現(xiàn)病毒RNA。 本發(fā)明可使用任一種冠狀導(dǎo)管或使用例如Stack灌注導(dǎo)管。另外，也 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)將基因轉(zhuǎn)移至動(dòng)脈壁。
可以類(lèi)似的方法經(jīng)由動(dòng)脈內(nèi)灌注至供給靶組織的動(dòng)脈內(nèi)而將基因 傳遞至其它器官或組織，優(yōu)選按本文所述聯(lián)合灌注血管活性劑，如組 胺或組胺激動(dòng)劑或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白以增強(qiáng)基因傳遞。
作為實(shí)例，為了治療外周血管病(其特征在于腿部供血不足)，可 通過(guò)插入股動(dòng)脈近側(cè)部分的導(dǎo)管來(lái)傳遞表達(dá)血管生成肽或蛋白質(zhì)的重 組載體，優(yōu)選聯(lián)合使用血管活性劑，如組胺或組胺激動(dòng)劑，從而將基 因轉(zhuǎn)移至接受來(lái)自股動(dòng)脈之血流的骨骼肌細(xì)胞中。籍此提供血管生成 剌激物，導(dǎo)致欲治療的腿骨骼肌中的血管生成，同時(shí)使血流增加。
本文所用的血管活性劑指的是可誘導(dǎo)血管通透性增加并增強(qiáng)大分 子(如基西傳遞載體)轉(zhuǎn)移穿過(guò)毛細(xì)血管壁的天然或合成的物質(zhì)。通過(guò) 增加血管對(duì)大分子的通透性或要不然便于大分子轉(zhuǎn)移至被動(dòng)脈灌注的 毛細(xì)血管床中，血管活性劑可增強(qiáng)這些載體至靶位點(diǎn)的傳遞，因而有 效地增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因在靶組織中的全面表達(dá)。在下文說(shuō)明性的實(shí)施例中(例 見(jiàn)實(shí)施例5)，將組胺用作血管活性劑，發(fā)現(xiàn)它能大大增強(qiáng)栽體至灌注
位點(diǎn)如心肌的傳遞?？梢允褂玫慕M胺衍生物(和激動(dòng)劑，如與組胺^
受體相互作用的那些化合物)包括例如2-甲基組胺，2-吡啶基乙胺， 培他司汀(betahistine)和2-塞唑基乙胺。這些和其它組胺激動(dòng)劑 描述于例如Garrison JC. ， Goodman和Gilman，治療劑的藥物學(xué)基礎(chǔ) (第8版Gilman AG, Rail TW， Nies AS, Taylor P編)Pergamon 出版社，1990， p575-582。
除了組胺和組胺激動(dòng)劑可用作血管活性劑以外，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子(VEGF)和VEGF激動(dòng)劑(如上文和提到的參考文獻(xiàn)中所述)也可使血 管通透性增加，因此在本文所述的組合物和方法中也可用作血管活性 劑以增強(qiáng)基因傳遞。與組胺一樣，優(yōu)選在灌注載體之前的幾分鐘內(nèi)將 VEGF灌注至供給靶位點(diǎn)的血管中。關(guān)于人VEGF,可參見(jiàn)例如Tischer 等，生物化學(xué)雜志，206:11947-11954, 1991和其中的參考文獻(xiàn)；和 Muhlhauser等，循環(huán)研究，77:1077- 1086, 1995。
可在施用載體的同時(shí)導(dǎo)入血管活性劑，但優(yōu)選在導(dǎo)入栽體前的幾 分鐘內(nèi)將血管活性劑導(dǎo)入靶位點(diǎn)(例如通過(guò)預(yù)灌注)以使血管活性劑能 在細(xì)胞暴露于載體之前在灌注細(xì)胞中引發(fā)反應(yīng)。不希望受理論的束縛， 據(jù)信施用這種血管活性劑可增強(qiáng)穿過(guò)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞壁的跨毛細(xì)血 管?chē)稗D(zhuǎn)運(yùn)，從而便于轉(zhuǎn)移大分子復(fù)合物，如病毒載體。
心肌缺血的動(dòng)物模型成功地研究基因治療的重要前提條件是(a)組建適用于臨床心肌 缺血的動(dòng)物模型，該模型可提供有關(guān)心肌缺血情況下血管生成機(jī)理的 有用數(shù)據(jù)，和(b)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)移的效果。由此看來(lái)，現(xiàn)有技術(shù)無(wú)一 令人滿(mǎn)意。我們已使用了模擬臨床冠狀動(dòng)脈病的豬心肌缺血模型。將 ameroid縮窄器置于左旋(LCx)冠狀動(dòng)脈的周?chē)鷷?huì)導(dǎo)致逐步完全的閉 塞(在置入7天內(nèi))，而梗塞的程度最低(左心室1%, LCx床4±1%) (Roth 等，循環(huán)，82:1778,1990， Roth等，美國(guó)生理學(xué)雜志，235:H1279, 1987， White等，循環(huán)研究，71:1490, 1992, Hammond等，Cardiol 23:475， 1994和Hammond等，J Clin Invest 92:2644， 1993)。由于
生成了側(cè)血管，先前被閉塞動(dòng)脈灌注的區(qū)域(指的是缺血區(qū)域)的心肌 功能和血流在休息時(shí)是正常的，但是當(dāng)心肌對(duì)氧的需求增加時(shí)，血流
儲(chǔ)備不足以防止缺血。因此，LCx床遭遇類(lèi)似于臨床心絞痛的陣發(fā)性 缺血。在放置ameroid后21天內(nèi)，側(cè)血管生成和流動(dòng)-功能的關(guān)系是 穩(wěn)定的，在4個(gè)月內(nèi)保持不變(Roth等，循環(huán)，82:1778， 1990， Roth 等，美國(guó)生理學(xué)雜志，235:H1279， 1987， White等，循環(huán)研究， 71:1490， 1992)。經(jīng)遠(yuǎn)距測(cè)定法證實(shí)，動(dòng)物體內(nèi)處于危險(xiǎn)之中的血管 床在整個(gè)白天表現(xiàn)出周期性的缺血機(jī)能異常，這與銅喂過(guò)程被管理員 中斷時(shí)心率的突然增加有關(guān)(數(shù)據(jù)未公開(kāi))，因此，該模型所具有的血
管床具有穩(wěn)定但不充足的側(cè)血管，因而會(huì)發(fā)生周期性的心肌缺血。該 模型的另一個(gè)與眾不同的優(yōu)點(diǎn)是有一個(gè)正常灌注和起作用的區(qū)域(LAD 床)與異常灌注并起作用的區(qū)域(LCx床)相鄰，籍此在每個(gè)動(dòng)物體內(nèi)提 供一個(gè)對(duì)照床。
使用心肌對(duì)比超聲心動(dòng)描記法估計(jì)區(qū)域性心肌灌注。對(duì)比材料由 半乳糖的微聚集體組成，可增加影像的回波產(chǎn)生(白色)。微聚集體以 同血流成比例的方式分布于冠狀動(dòng)脈和心肌壁(Skyba等，循環(huán)， 90:1513-1521， 1994)。經(jīng)微球體測(cè)定，已證明對(duì)比峰的強(qiáng)度與心肌血 流密切相關(guān)(Skyba等，循環(huán)，90:1513-1521， 1994)。為了證明本發(fā) 明所用的超聲心動(dòng)描記法可準(zhǔn)確地鑒定LCx床，而且可使用心肌對(duì)比 超聲心動(dòng)描記法評(píng)價(jià)心肌血流，可將液壓套閉塞器置于LCx近側(cè)周?chē)?與ameroid相鄰。
在本研究中，當(dāng)處死動(dòng)物時(shí)，(在生理壓力下，用戊二醛原位)灌 注固定心臟以通過(guò)顯微鏡定量毛細(xì)血管的生長(zhǎng)。使用PCR檢測(cè)已接受 基因轉(zhuǎn)移的動(dòng)物心肌中的血管生成蛋白DNA和mRNA。另外，如下文所 迷，基因轉(zhuǎn)移2周后，取自所有5只lacZ感染動(dòng)物的心肌樣品都在組 織學(xué)檢查中顯示出顯著的p-半乳糖苷酶活性。最后，使用針對(duì)血管生 成蛋白的多克隆抗體闡明了取自已接受基因轉(zhuǎn)移的動(dòng)物的細(xì)胞和心肌 中血管生成蛋白的表達(dá)。
治療研究的策略包括轉(zhuǎn)基因傳遞的時(shí)機(jī)，轉(zhuǎn)基因施用的途徑和血
管生成基因的選擇。在心肌缺血的ameroid模型中，在生成了穩(wěn)定但 不充足的側(cè)血管之后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。使用ameroid模型的先前研究包 括在發(fā)生心肌缺血和產(chǎn)生側(cè)血管之前，在閉塞ameroid的過(guò)程中傳遞 血管生成肽。然而，因下列幾個(gè)原因不使用該策略。首先，以前的研 究不適于準(zhǔn)確地再現(xiàn)治療臨床心肌缺血時(shí)(其中在不斷發(fā)展的心肌缺 血狀態(tài)下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移)所處的狀態(tài)；以前的研究類(lèi)似于在心肌缺血之 前提供肽，因此相關(guān)性較差。第二，根據(jù)以前對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的研究， 推測(cè)缺血刺激與肽聯(lián)合可能是刺激血管生成的最佳環(huán)境。在心肌缺血 已經(jīng)發(fā)生時(shí)傳遞轉(zhuǎn)基因可以最好地達(dá)到上述目的。與這些決定相關(guān)的 是選擇獲得轉(zhuǎn)基因傳遞的方法。技術(shù)應(yīng)適用于隨后進(jìn)行的對(duì)冠狀動(dòng)脈 病患者的治療這一限制因素使得幾種方法站不住腳(不斷將肽灌注至 冠狀動(dòng)脈，直接將質(zhì)粒注射至心臟，用含有肽的樹(shù)脂包被心臟以提供 長(zhǎng)期緩慢的釋放)。最后，豬模型提供了極好的方法，可以在基因傳遞 之前和之后追蹤區(qū)域性血流和功能。接受相同重組腺病毒構(gòu)建體但具 有報(bào)道基因的對(duì)照動(dòng)物的使用為這些研究提供了對(duì)照。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)懂得下文中所描述的豬的結(jié)果可以預(yù)測(cè)人的結(jié)果。豬天生具有與 人非常類(lèi)似的冠狀動(dòng)脈循環(huán)，包括缺乏天生的冠狀側(cè)血管。
治療應(yīng)用
本發(fā)明的載體，如復(fù)制缺損的腺病毒可以在體內(nèi)進(jìn)行高效基因轉(zhuǎn) 移而不會(huì)在基因表達(dá)區(qū)域引起細(xì)胞病變或炎癥.根據(jù)下文實(shí)施例中將 進(jìn)一步描述的這些結(jié)果，可以看出水平足夠高的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移在體內(nèi) 進(jìn)行，獲得了功能上的改變。在治療心臟病時(shí)，通過(guò)冠內(nèi)注射對(duì)血管 生成蛋白進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移可促進(jìn)血管生成并增強(qiáng)心臟功能。因此，可在 觀察到最初的心肌缺血發(fā)作之后對(duì)心肌缺血進(jìn)行治療。另外，在基因 轉(zhuǎn)移之后，缺血區(qū)域的毛細(xì)血管數(shù)目、血流和功能會(huì)增加。將這些技 術(shù)應(yīng)用于臨床將十分有用，對(duì)不能手術(shù)的冠狀動(dòng)脈病和致人死地的心 絞痛尤其有用。本發(fā)明的數(shù)據(jù)證明表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(如FGF-5) 的重組腺病毒的基因轉(zhuǎn)移能有效地大大降低心肌缺血的發(fā)病率。血管生成蛋白和轉(zhuǎn)基因也可用于1997年5月6日提交的共同懸而未決的美 國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)08/852， 779 (列入本文作為參考)中所述的組合物和治 療方法。如本文所述，血管活性劑，如組胺或組胺激動(dòng)劑或VEGF蛋白 可與這些方法和組合物聯(lián)合使用以進(jìn)一步增強(qiáng)血管內(nèi)注射所靶向位點(diǎn) 的基因傳遞。
如上文所述，也可使用P-腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(P-ASP)，例 如p-腎上腺素能受體(P-AR), G-蛋白受體激酶抑制劑(GRK抑制劑)和 腺苷酸環(huán)化酶(AC)來(lái)增強(qiáng)心臟功能，其詳細(xì)描述于1997年9月5日提 交的共同懸而未決的美國(guó)流水號(hào)08/924, 757(基于1997年6月16日 提交的美國(guó)申請(qǐng)60/048,933和1996年9月5日提交的美國(guó)申請(qǐng) 08/708， 661)以及1997年9月5日提交的PCT/US97/15610和1998年 1月16日提交的美國(guó)繼續(xù)申請(qǐng)流水號(hào)08/...，這些參考文獻(xiàn)都列入本 文作為參考。如本文所述，血管活性劑，如組胺或組胺激動(dòng)劑或VEGF 蛋白可與這些方法和組合物聯(lián)合使用以進(jìn)一步增強(qiáng)血管內(nèi)注射所靶向 位點(diǎn)的基因傳遞。
本發(fā)明的組合物或產(chǎn)物可以適于冠內(nèi)給藥的制劑形式方便地提 供。適當(dāng)?shù)慕o藥方式最好由醫(yī)務(wù)人員根據(jù)各個(gè)患者的情況來(lái)確定。適當(dāng) 的藥物可接受的載體及其制劑描述于標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)制劑的論文中，例見(jiàn) E. W. Martin的Remington藥物科學(xué)，也可參見(jiàn)Wang, Y. J和Hanson, M. A. 貨白質(zhì)和肽的胃腸外制劑穩(wěn)定性和穩(wěn)定劑"，Journals of Parental Science and Technology, Technical Report No. 10， S叩p. 42:2S(1988)。應(yīng)優(yōu)選在中性pH，例如約pH6. 5至約pH8. 5，更優(yōu)選在 約pH7至8的溶液中配制本發(fā)明的載體，加入賦形劑，如4. 5%甘露糖 醇或0.9%氯化鈉使溶液大致等滲，用本領(lǐng)域已知的一般被認(rèn)為是安全 的緩沖溶液，如磷酸鈉來(lái)緩沖pH，另外還可加入可接受的防腐劑，如 0. 1%至0. 75%的間甲酚，更優(yōu)選為0. 15%至0. 4%的間甲酚。j「吏用氯化 鈉或其它藥物可接受的試劑，如葡萄糖，硼酸，酒石酸鈉，丙二醇， 多元醇(如甘露糖醇和山梨糖醇)或其它無(wú)機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)可獲得所需的 等滲性。對(duì)于含有鈉離子的緩沖液，特別優(yōu)選氯化鈉。必要時(shí)，也可制
備上述組合物溶液以增強(qiáng)貯存期限和穩(wěn)定性。根據(jù)通?？山邮艿姆椒?混合成分即可制備本發(fā)明的治療有用的組合物。例如，可混合選定的 成分以產(chǎn)生濃縮的混合物，再通過(guò)加入水調(diào)整至最終的濃度和粘度和/
或加入緩沖液以控制pH或加入其它溶質(zhì)控制張力。
為了便于醫(yī)師使用，所提供的組合物的劑量形式中所含本發(fā)明載 體的量應(yīng)能在一個(gè)或多個(gè)劑量中有效誘導(dǎo)一定水平的血管生成。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)理解，治療劑的有效量因多個(gè)因素的不同而不同，所述 因素包括患者的年齡和體重，患者的生理狀況和想達(dá)到的血管生成水 平和其它因素。
本發(fā)明優(yōu)選化合物，如復(fù)制缺損的腺病毒的有效劑量一般至少約 為107個(gè)病毒顆粒，優(yōu)選約為109個(gè)病毒顆粒，更優(yōu)選約為1()H個(gè)病毒 顆粒。病毒顆粒的數(shù)目可以達(dá)，但優(yōu)選不超過(guò)1013個(gè)。需說(shuō)明的是， 給藥的精確劑量由臨床護(hù)理醫(yī)生決定，但優(yōu)選于lml磷酸緩沖鹽水中。
為了治療心臟病，本發(fā)明優(yōu)選的給藥模式是使用適當(dāng)?shù)墓跔顚?dǎo)管 冠內(nèi)注射一個(gè)或兩個(gè)冠狀動(dòng)脈(或一個(gè)或多個(gè)隱靜脈或乳房?jī)?nèi)部動(dòng)脈 移植物)。如本文所述，優(yōu)選注射至右和左冠狀動(dòng)脈循環(huán)。特別優(yōu)選通 過(guò)三次注射進(jìn)行傳遞， 一次注射至左前降動(dòng)脈(LAD)， 一次注射至左旋 (LCx)冠狀動(dòng)脈， 一次注射至右冠狀動(dòng)脈。盡管兩次左冠狀動(dòng)脈進(jìn)行系 列注射比較方便，但這應(yīng)在注射右冠狀動(dòng)脈之前或之后進(jìn)行。在右冠 狀動(dòng)脈不易進(jìn)入的情況下(不具有搭橋并行血管因而閉塞的結(jié)果或因 為太小而不能進(jìn)行選擇性注射)，全部的載體劑量可都通過(guò)注射至左冠 狀動(dòng)脈循環(huán)(優(yōu)選為上述的LAD和LCx)來(lái)傳遞。每次注射一般都在1 至幾分鐘內(nèi)進(jìn)行， 一般約為1.5分鐘。為了治療外周血管病，本發(fā)明 優(yōu)選的給藥模式是使用適當(dāng)?shù)膭?dòng)脈導(dǎo)管注射股動(dòng)脈的近側(cè)部分。
如本文所述，可在傳遞載體的同時(shí)或之前通過(guò)導(dǎo)管將血管活性劑 灌注至耙位點(diǎn)以促進(jìn)基因傳遞。使用這種試劑可導(dǎo)致基西傳遞效力增 強(qiáng)，這一點(diǎn)可由耙位點(diǎn)處表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的百分比增加來(lái)證實(shí)。有 關(guān)組胺和其它血管活性劑的生理學(xué)和藥物學(xué)作用，例見(jiàn)Altura BM和 HalevyS.組胺對(duì)心血管的作用，《組胺II和抗-組胺劑化學(xué)，代謝
和生理學(xué)及藥物學(xué)作用》(Rocha e Silva M編)Handbuch der Ex'perimentellen Pharmakologie， Vol 18， Part 2， Springer Verlag， Berlin, 1978， pi-39?？梢允褂玫慕M胺衍生物(和激動(dòng)劑，如與組胺 Ht受體相互作用的那些化合物)包括例如2-甲基組胺，2-吡啶基乙胺， 培他司汀和2-€唑基乙胺。這些和其它組胺激動(dòng)劑描述于例如 Garrison JC. ， Goodman和Gilman,治療劑的藥物學(xué)基礎(chǔ)(第8版 Gil, AG, Rail TW， Nies AS, Taylor P編)Perg譜n出版社，1990， p575_582。
為了有助于理解本發(fā)明，提供了下列實(shí)施例來(lái)描述一 系列實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果。當(dāng)然，不應(yīng)認(rèn)為與本發(fā)明相關(guān)的實(shí)驗(yàn)特別地限制了本發(fā)明，目
的，落在本文所述和下文所要求的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1:腺病毒構(gòu)建體
使用了不依賴(lài)于輔助病毒的復(fù)制缺損的人腺病毒5系統(tǒng)。目的基 因是lacZ和FGF-5。以1. lkb EcoRI片斷的形式從質(zhì)粒pLTRI22E(Zhen 等，分子細(xì)胞生物學(xué)，8:3487， 1988)上釋放人FGF-5的全長(zhǎng)cDNA， 其包括981bp的基因開(kāi)放閱讀框，將該片斷克隆至質(zhì)粒ACCMVPLPA的 多接頭中，所述質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子和SV40聚腺苷酸化信號(hào)，以及位 于側(cè)翼的其中EIA和EIB基因(病毒復(fù)制所必需的)已缺失的部分腺病 毒序列。用該質(zhì)粒和質(zhì)粒JM17共轉(zhuǎn)染(脂轉(zhuǎn)染)293細(xì)胞，質(zhì)粒JM17 含有整個(gè)人腺病毒5基因組以及另外的4. 3kb插入物，從而使pJM17 太大以致于不能被包裹。同源獲救重組導(dǎo)致腺病毒栽體含有轉(zhuǎn)基因而 缺乏EIA/EIB序列。盡管這些重組子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能復(fù)制，但 它們?cè)诒籈IA/EIB轉(zhuǎn)化并反式提供這些必需基因產(chǎn)物的293細(xì)胞中可 以增殖。監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中通常在轉(zhuǎn)染后10至14天發(fā)生的細(xì)胞病變效 應(yīng)的表現(xiàn)。
為了鑒定成功的轉(zhuǎn)化子，于56t:用蛋白酶K(50mg/ml，含O. 5%十 二烷基硫酸鈉和20mM EDTA)將表現(xiàn)出細(xì)胞病變效應(yīng)的培養(yǎng)板中的細(xì)胞
上清液處理60分鐘，用苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀。通過(guò)PCR鑒定成 功的轉(zhuǎn)化子，PCR使用了與CMV啟動(dòng)子和SV40聚腺苷酸化序列互補(bǔ)以 擴(kuò)增插入物(預(yù)期為l.lkb片斷)的引物(生物技術(shù)15:868-872， 1993)，和經(jīng)設(shè)計(jì)可同時(shí)擴(kuò)增腺病毒序列的引物(生物技術(shù)15:868-872 1993)。然后對(duì)成功的重組子進(jìn)行兩輪噬斑純化。在293細(xì)胞中增殖病 毒原種直至滴度為101°-1012個(gè)病毒顆粒，使用前通過(guò)兩次CsCl梯度 離心進(jìn)行純化。使用全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建編碼p-半乳糖苷酶或FGF-5的重組 腺病毒。用于產(chǎn)生重組腺病毒的系統(tǒng)最多可包裝5kb轉(zhuǎn)基因插入物。 建議由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并含SV40聚腺苷酸化序列的基因小于4kb，剛 好處于包裝限制的范圍內(nèi)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法噬斑純化重組載體，在293 細(xì)胞中增殖所得病毒栽體直至滴度為101。-1012個(gè)病毒顆粒，感染80% 鋪滿(mǎn)的細(xì)胞，36至48小時(shí)之后收獲細(xì)胞，凍融循環(huán)之后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) 離心方法沉淀細(xì)胞碎片，通過(guò)兩次CsCl梯度超離心(不連續(xù)的 1.33/1.45 CsCl梯度在5mM Tris, lmM EDTA(pH7. 8)中制備的銫； 90,000 xg (2小時(shí))，105,000 xg(18小時(shí)))進(jìn)一步純化病毒。體內(nèi)注 射之前，通過(guò)S印harose柱(如G25 S印hadex)進(jìn)行凝膠過(guò)濾使病毒原 種脫鹽。所得病毒原種最終的病毒滴度范閨為1011-1012個(gè)病毒顆粒。 腺病毒構(gòu)建體被高度純化，不含野生型(可能會(huì)復(fù)制的)病毒。
實(shí)施例2:細(xì)胞培養(yǎng)中的成年大鼠心肌細(xì)胞
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)用含有膠原酶的灌注液進(jìn)行Langendorf灌注 制備成年大鼠心肌細(xì)胞。在覆蓋有層粘連蛋白的培養(yǎng)板上培養(yǎng)桿狀細(xì) 胞，24小時(shí)后用實(shí)施例1所得的編碼p-半乳糖苷酶的腺病毒感染細(xì)胞， 感染復(fù)數(shù)為l:l。再過(guò)36小時(shí)之后，用戊二醛固定細(xì)胞并與X-gal保 溫。用重組腺病毒感染之后， 一般有70-90%成年心肌細(xì)胞表達(dá)卩-半乳 糖苷酶轉(zhuǎn)基因。當(dāng)感染復(fù)數(shù)為1-2:1時(shí)，未觀察到細(xì)胞毒性。
實(shí)施例3:豬體內(nèi)心肌
根據(jù)實(shí)施例1的方法，在293允許細(xì)胞中增殖實(shí)施例1所得的編碼(3-半乳糖苷酶的腺病毒栽體，通過(guò)CsCl梯度超離心純化使最終的病 毒滴度為1. 5 xi(T個(gè)病毒顆粒。對(duì)經(jīng)麻醉，通風(fēng)的40kg豬進(jìn)行胸廓 切開(kāi)術(shù)，將26號(hào)蝴蝶形針頭插入左前降(LAD)冠狀動(dòng)脈中部，注射2ml 載體(1.5 xi(T個(gè)病毒顆粒)。縫合胸部，使動(dòng)物恢復(fù)。在注射后第4 天，殺死動(dòng)物。用戊二醛固定心臟，切片并與X-gal保溫16. 5小時(shí)。 包埋和切片之后，用伊紅復(fù)染組織。
對(duì)組織切片進(jìn)行顯微分析(冠內(nèi)注射含有l(wèi)acZ的腺病毒96小時(shí)之 后，LAD床的透壁切片)，結(jié)果表明在LAD冠狀動(dòng)脈床中觀察到大量基 因轉(zhuǎn)移，很多組織切片中50-6096以上細(xì)胞的p-半乳糖苷酶染色呈陽(yáng) 性。離LAD循環(huán)床很遠(yuǎn)的心肌區(qū)域未見(jiàn)X-gal染色，可用作陰性對(duì)照， 而在肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到基因的擴(kuò)散表達(dá)。大多數(shù)肌細(xì)胞顯示 出P-半乳糖苷酶活性(染成藍(lán)色)，在隨后使用閉胸冠內(nèi)注射的研究中， 基因轉(zhuǎn)移(n二8)14天后也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似活性。在基因表達(dá)的區(qū)域未見(jiàn)炎癥 或壞死。
實(shí)施例4:豬缺血模型
動(dòng)物包括18只家豬(30-40kg)。在無(wú)菌搡作條件下進(jìn)行左胸廓切 開(kāi)術(shù)(Ha,ond等，J Clin Invest 92:2644-2652和Roth等，J. Clin Invest 91:939-949， 1993)。將導(dǎo)管置入左心房和主動(dòng)脈，提供測(cè)定 區(qū)域性血流和監(jiān)測(cè)壓力的裝置。用線縫合左心房以進(jìn)行ECG記錄和心 房起博。最后，在近側(cè)LCx周?chē)胖胊meroid，當(dāng)穩(wěn)定水平的缺血狀 態(tài)建立之后，給治療組(n41)施用包括由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的FGF-5(血 管生成基因)的腺病毒構(gòu)建體。對(duì)照動(dòng)物(11=7)接受包括由CMV啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因lacZ的腺病毒構(gòu)建體的基因轉(zhuǎn)移。
放置ameroid后35±3天開(kāi)始研究，其時(shí)側(cè)血管生成和起博誘導(dǎo) 的功能異常是穩(wěn)定的(Roth等，美國(guó)生理學(xué)雜志，253:H1279-1288， 1987和Roth等，循環(huán)，82:1778-1789)。將清醒的動(dòng)物吊在懸?guī)希?以數(shù)字的形式在線記錄LV, LA和主動(dòng)脈的血壓以及心電倒(休息時(shí)和 心房以200bpm起博的過(guò)程中).使用.Hewlett Packard超聲顯像系統(tǒng)
得到二維和M-模式圖像。在中乳頭肌肉水平上由右胸骨旁方法得到圖 象并記錄在VHS磁帶上。記錄處于基礎(chǔ)狀態(tài)和右心房起博過(guò)程中 (服400bpni)的動(dòng)物的圖象。在基因轉(zhuǎn)移前1天進(jìn)行這些研究，14±1 天之后重復(fù)這一研究。基因轉(zhuǎn)移之前和之后，兩組的速率-壓力乘積和 左心房壓力類(lèi)似，這表明心肌氧需求和負(fù)荷狀況類(lèi)似。使用標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖的測(cè)定(Sahn等，循環(huán)58:1072， 1978)。由5次連 續(xù)的心跳測(cè)定舒張結(jié)束時(shí)血管壁的厚度(EDWTh)和收縮結(jié)束時(shí)血管壁 的厚度(ESWTh)并取平均值。計(jì)算壁增厚的百分比(％WTh) [ (EDWTh -ESWTh) / EDWTh] xioo。在不知道動(dòng)物接受了何種基因的情況下分析數(shù) 據(jù)。為了闡明超聲心動(dòng)測(cè)定結(jié)果的可重復(fù)性，連續(xù)2天對(duì)動(dòng)物(n二5) 進(jìn)行顯像研究，結(jié)果顯示出高度的相關(guān)性(1"2 = 0. 90; p=0. 005)。
放置ameroid后35±3天，在ameroid閉塞之后，但在基因轉(zhuǎn)移 之前，使用在心房起博(200bpm)過(guò)程中注射至左心房的對(duì)比材料 (Levovist)進(jìn)行對(duì)比超聲心動(dòng)研究。基因轉(zhuǎn)移后14±1天重復(fù)該研究。 使用基于計(jì)算機(jī)的視頻分析程序(Color Vue II， Nova Microsonics， Indianapolis, Indiana)由視頻影像測(cè)得峰對(duì)比強(qiáng)度，這樣可以客觀 地測(cè)定視頻強(qiáng)度。在不知道動(dòng)物接受了何種基因的情況下分析對(duì)比研 究的數(shù)據(jù)。
研究結(jié)束時(shí)，麻醉動(dòng)物，進(jìn)行中線胸廓切開(kāi)術(shù)。分離短頭動(dòng)脈， 插入插管，連接其它大血管。給動(dòng)物靜脈內(nèi)施用肝素(10，000IU)和罌 粟堿(60mg)。施用氯化鉀以誘導(dǎo)舒張心停滯，交叉夾住主動(dòng)脈。通過(guò) 短頭動(dòng)脈插管(120nnnHg壓力)傳遞鹽水，籍此灌注冠狀動(dòng)脈。灌注戊 二醛溶液(6.25%， 0. 1M 二甲胂酸鹽緩沖液)(120mmHg壓力)直至心臟 被很好地固定(10-15分鐘)。然后取出心臟，使用順行注射至左前降 動(dòng)脈(LAD)，左旋動(dòng)脈(LCx)和右冠狀動(dòng)脈的顏色編碼染料筌定血管床。 檢查ameroid以證實(shí)閉塞，將取自正常灌注和缺血區(qū)域的樣品分成三 份，用可塑性材料包埋取自心內(nèi)膜和心外膜的三份樣品。按上文所述 (Mathieu-Costello等，美國(guó)生理學(xué)雜志,369:H204， 1990)進(jìn)行顯微 分析以定量毛細(xì)血管的數(shù)目。4個(gè)1微米厚的橫切片取自各個(gè)次生樣
品(各個(gè)區(qū)域的心內(nèi)膜和心外膜)，以400倍的放大倍數(shù)，使用點(diǎn)計(jì)數(shù) 測(cè)定毛細(xì)血管數(shù)目/纖維數(shù)目的比率。每個(gè)次生樣品計(jì)數(shù)20至25個(gè)高 強(qiáng)視野。在各個(gè)區(qū)域中，心內(nèi)膜和心外膜的毛細(xì)血管與纖維數(shù)目的比 類(lèi)似，因此每個(gè)區(qū)域40至50個(gè)視野的平均值可提供跨壁毛細(xì)血管與 纖維數(shù)目的比率。
為了確定改善的區(qū)域性功能和血流是由轉(zhuǎn)基因表達(dá)引起的，使用 PCR和RT-PCR檢測(cè)接受FGF-5基因轉(zhuǎn)移的動(dòng)物心肌中的轉(zhuǎn)基因FGF-5 DNA 和 niRNA 。 使用針對(duì) CMV 啟動(dòng)子的有義引物 [GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC] (SEQ ID N0:1)和針對(duì)內(nèi)部FGF-5序列的反 義引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT] (SEQ ID NO :2)， PCR擴(kuò)增預(yù)期的 500bp片斷。使用針對(duì)FGF-5序列起始部分的有義引物 [ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC] (SEQ ID NO:3)和針對(duì)內(nèi)部FGF-5序列的反 義引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT] (SEQ ID NO: 2) ， RT-PCR擴(kuò)增預(yù)期的 400bp片斷。
最后，使用針對(duì)FGF-5的多克隆抗體(Kitaoka等，科學(xué)，35:3189， 1994),在FGF-5基因轉(zhuǎn)移48小時(shí)以及14±1天之后，闡明接受FGF-5 基因轉(zhuǎn)移的動(dòng)物的細(xì)胞和心肌中的FGF-5蛋白表達(dá)。
使用按實(shí)施例1構(gòu)建的不依賴(lài)于輔助病毒的復(fù)制缺損的人腺病毒 5系統(tǒng)制備含有轉(zhuǎn)基因的載體。所需基因是lacZ和FGF-5。體內(nèi)注射 的制劑是高度純化的，不含野生型(有復(fù)制能力的)腺病毒。因此，心 臟中的腺病毒感染和炎癥浸潤(rùn)被最小化了。通過(guò)用冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管將制 劑直接注射至冠狀動(dòng)脈腔中，可以有效地靶向基因。當(dāng)以此方式傳遞 時(shí)，在肝細(xì)胞中未見(jiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在冠內(nèi)注射之后任何時(shí)間的尿液中 都未發(fā)現(xiàn)病毒RNA。
在左和右冠狀動(dòng)脈(流向LCx床的側(cè)血流似乎來(lái)自這兩個(gè)血管)中 注射2.0ml以進(jìn)行構(gòu)建體注射(4.0ml含有約1011個(gè)腺病毒顆粒)。麻 醉動(dòng)物，通過(guò)切開(kāi)右頸動(dòng)脈獲得動(dòng)脈入口；放置5F Cordis鞘。使用 5F多用(A2)冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管插入冠狀動(dòng)脈.通過(guò)對(duì)比注射至左主冠狀動(dòng) 脈進(jìn)一步證實(shí)LCx ameroid的閉塞。然后將導(dǎo)管頭置入動(dòng)脈腔內(nèi)lcm
以使注射過(guò)程中最少的制劑流失至近側(cè)主動(dòng)脈。對(duì)每只豬實(shí)施這一方法。
一旦進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，可使用3個(gè)策略建立成功的基因摻入和表達(dá)， (l)一些構(gòu)建體包括報(bào)道基因(lacZ) ; (2)取相關(guān)血管床的心肌樣品， 并進(jìn)行免疫印跡以定量FGF-5的存在；和(3)使用PCR測(cè)定FGF-5 mRNA 和謹(jǐn)。
圖2中的區(qū)域性收縮功能數(shù)據(jù)表明基因轉(zhuǎn)移之前以及14±1天之 后，接受lacZ的豬的缺血區(qū)域顯示出類(lèi)似程度的起博誘導(dǎo)的功能異 常。相反，接受FGF-5基因轉(zhuǎn)移的豬的缺血區(qū)域在起博過(guò)程中血管壁 的厚度增加了 2. 6倍。=0. 0001)。這些數(shù)據(jù)表明根據(jù)本發(fā)明的FGF-5 基因轉(zhuǎn)移與起博過(guò)程中缺血區(qū)域改善的收縮有關(guān)。起博過(guò)程中正常灌
注區(qū)域(室間隔)的壁厚度是正常的，不受基因轉(zhuǎn)移的影響(％壁增厚 LacZ組基因轉(zhuǎn)移前，56±11%，基因轉(zhuǎn)移后，51±9%; FGF-5組基 因轉(zhuǎn)移前，63±7%，基因轉(zhuǎn)移后，58±5%;沒(méi)有差異，方差的雙向分析)。 獨(dú)立測(cè)定的數(shù)據(jù)重復(fù)性很高(側(cè)壁增厚r2=0. 90; p=0. 005)。相同模 型的心房起博過(guò)程中通過(guò)經(jīng)胸廓超聲心動(dòng)描記法測(cè)定的功能降低的百 分比與通過(guò)聲波測(cè)微法(sonomicrometry )測(cè)定的百分比降低非常類(lèi) 似(Hammond等，J Clin Invest 92:2644, 1993),顯示出超聲心動(dòng)描 記法評(píng)價(jià)缺血功能異常的準(zhǔn)確性。圖2中的柱表示平均值，誤差柱表 示1 SE。圖4A-4C是對(duì)應(yīng)于心肌對(duì)比超聲心動(dòng)描記法的圖。圖4A闡 明了正常豬的急性LCx閉塞，其中LCx床中未見(jiàn)血流(黑色)，而膈(IVS) 中血流增強(qiáng)(白色)，這表明影像準(zhǔn)確地鑒定了 LCx床，減少的血流與 降低的對(duì)比增強(qiáng)有關(guān)。圖4B闡明了用lacZ基因轉(zhuǎn)移后14天IVS和 LCx床之間對(duì)比增強(qiáng)的差異，顯示出心房起博過(guò)程中(200bpm)兩個(gè) 區(qū)域中不同的血流。圖4C闡明了用FGF-5基因轉(zhuǎn)移后14天IVS和LCx 床的對(duì)比增強(qiáng)近乎相同，顯示出心房起博過(guò)程中兩個(gè)區(qū)域中有類(lèi)似的 血流-
圖3概述了對(duì)所有動(dòng)物的兩個(gè)區(qū)域的視頻強(qiáng)度進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分 析。在圖3中，數(shù)據(jù)被表示為缺血區(qū)域(LCx床)峰視頻強(qiáng)度(心肌血流的相關(guān)值)/室間隔(IVS，通過(guò)未閉塞的左前降冠狀動(dòng)脈接受正常血流 的區(qū)域)峰視頻強(qiáng)度的比率。兩個(gè)區(qū)域血流相等時(shí)，該比率為l.O?；?因轉(zhuǎn)移-之前，該比率平均為0.5，表明LCx床的血流比室間隔中的血 流顯著較少。圖3表明接受lacZ基因轉(zhuǎn)移的動(dòng)物的缺血區(qū)域總是血流 缺乏，而接受FGF-5基因轉(zhuǎn)移的動(dòng)物的兩個(gè)區(qū)域顯示出均一的對(duì)比增 強(qiáng)，增加了 2倍的心肌血流改善了缺血區(qū)域的血流(p二O. 0018,方差雙 向分析)。柱表示平均值，誤差柱表示1 SE。
圖5中的柱形圖概述了顯微分析數(shù)據(jù)，顯示出與接受lacZ基因轉(zhuǎn) 移的動(dòng)物心臟的缺血區(qū)域和非缺血區(qū)域相比，接受FGF-5基因轉(zhuǎn)移的 動(dòng)物的相同區(qū)域中毛細(xì)血管數(shù)目/纖維數(shù)目的比率增加。柱表示每組5 至6只動(dòng)物的平均值，誤差柱表示1 SE， p值得自基因作用的方差雙 向分析。在對(duì)治療組一無(wú)所知的情況下進(jìn)行分析。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖證實(shí)了用FGF-5基因轉(zhuǎn)移后14天，3只豬 的LAD和LCx床中JM17- CMV-FGF-5 DNA(預(yù)期為500bp片斷)的存在。 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖證實(shí)了用FGF-5基因轉(zhuǎn)移后14天的LAD和 LCx床中有心臟FGF-5 mRNA(預(yù)期為400bp片斷)的存在，而用lacZ 基因轉(zhuǎn)移后沒(méi)有。另外，基因轉(zhuǎn)移2周后，經(jīng)組織學(xué)檢查，所有5只 lacZ感染動(dòng)物的心肌樣品顯示出顯著的p-半乳糖苷酶活性。
最后，使用抗FGF-5的多克隆抗體對(duì)經(jīng)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 基進(jìn)行免疫印跡，證實(shí)了用FGF-5 (n=4個(gè)培養(yǎng)板)基因轉(zhuǎn)移之后2天有 蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞外分泌，而用lacZ基因轉(zhuǎn)移之后沒(méi)有。還證實(shí)了在 用FGF-5基因轉(zhuǎn)移之后14±1天心肌樣品中有蛋白質(zhì)表達(dá)，而用 lacZ(n-4)基因轉(zhuǎn)移之后卻沒(méi)有。
如上所述，可以類(lèi)似的方法使用本領(lǐng)域已知的腺伴隨病毒載體和 其它基因傳遞載體。
實(shí)施例5:使用血管活性劑增強(qiáng)基因傳遞
如上所述，在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)在用血管活性劑，如組胺 共灌注或預(yù)灌注的情況下將載體傳遞至血管中，即可增強(qiáng)使用載體，
如病毒載體進(jìn)行基因傳遞的效力。
在例舉的實(shí)施例中，我們檢查了組胺(血管活性劑的 一 個(gè)例子)對(duì)
使用上述表達(dá)lacZ報(bào)道基因的腺病毒載體(實(shí)施例l)進(jìn)行的基因傳遞 的作用。我們發(fā)現(xiàn)用組胺灌注冠狀動(dòng)脈可顯著增加基因轉(zhuǎn)移的效力。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，麻醉豬，經(jīng)由右頸動(dòng)脈得到動(dòng)脈入口。將5個(gè)French 多用導(dǎo)管置入右冠狀動(dòng)脈(RCA)，并插入口內(nèi)2cm。 3分鐘內(nèi)傳遞約3ml 鹽水，然后快速地在約1. 5分鐘內(nèi)灌注2ml含有3 xio"個(gè)病毒顆粒(vp) 的表達(dá)lacZ的腺病毒。然后從RCA中取出導(dǎo)管，置入左前降冠狀動(dòng)脈 (LAD)中，再將導(dǎo)管頭插入LAD腔內(nèi)2cm。插入之后，在3分鐘內(nèi)傳遞 3ml濃度為25微克組胺/ml的組胺，然后快速地在約2. 25分鐘內(nèi)灌注 3ml含有4. 5 xio"個(gè)vp的表達(dá)lacZ的腺病毒溶液。 一般情況下，在 傳遞載體之前的幾分鐘內(nèi)進(jìn)行組胺灌注。組胺灌注過(guò)程中或之后，全 身血壓、心率或心律基本上不變。取出導(dǎo)管，縫合頸部，使動(dòng)物蘇醒。 應(yīng)指出的是，盡管灌注至LAD床的病毒顆粒的總數(shù)約為RCA床中的1.5 倍(因?yàn)樨i心臟中這些床的相對(duì)大小所致)，但病毒顆?？倲?shù)的增加更 傾向于被乾床的相對(duì)大小抵銷(xiāo)，因?yàn)長(zhǎng)AD床比RCA床約大2至3倍。
5天后，殺死動(dòng)物。用低聚甲醛灌注心臟，由RCA區(qū)域和LAD區(qū) 域得到透壁切片，將樣品與X-gal溶液(p-半乳糖苷酶的底物)保溫。 16小時(shí)之后包埋材料，切片，放在載玻片上，用伊紅進(jìn)行染色。
顯微分析揭示出LAD床比RCA床的基因轉(zhuǎn)移效力要高得多。尤其 是，在不用組胺處理的情況下，約30%心肌細(xì)胞在冠內(nèi)灌注之后表達(dá) lacZ。與之形成對(duì)照的是，LAD區(qū)域的幾乎所有的肌細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)基 因lacZ，這表明相對(duì)于對(duì)照區(qū)域而言，用血管活性劑處理過(guò)的區(qū)域中 基因轉(zhuǎn)移的效力增加了幾倍。實(shí)際上，如本文所述，血管活性劑的使 用導(dǎo)致基因幾乎完全傳遞至靶組織。
權(quán)利要求
1.體內(nèi)靶向基因表達(dá)的方法，所述方法包括通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)直接注射至供給組織或器官的動(dòng)脈以傳遞載體，其中載體含有編碼欲在該動(dòng)脈供給的血管床中表達(dá)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因，其中所述動(dòng)脈內(nèi)注射與用血管活性劑灌注動(dòng)脈同時(shí)進(jìn)行或在用血管活性劑灌注動(dòng)脈之后進(jìn)行。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中在注射所述栽體之前至少約2分鐘將 所述血管活性劑灌注至動(dòng)脈中。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑或血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述載體是病毒載體。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒載體是復(fù)制缺損的腺病毒載體。
7. 權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒載體是腺伴隨病毒載體。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)注射傳遞約107至1013個(gè)腺病毒載 體顆粒。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)注射傳遞約10n個(gè)腺病毒載體顆粒。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因與組成型啟動(dòng)子可操作相連。
11. 權(quán)利要求1的方法,其中所述轉(zhuǎn)基因與組織特異性啟動(dòng)子可操 作相連。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因與心室肌細(xì)胞特異性啟動(dòng) 子可搡作相連。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述心室肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子具有 心室肌球蛋白輕鏈-2的序列。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述心室肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子具有 肌務(wù)泉蛋白重鏈啟動(dòng)子的序列。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼血管生成蛋白或肽。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述血管生成蛋白或肽選自aFGF， bFGF， FGF-4， FGF-5和VEGF。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼血管生成蛋白或肽， 其中通過(guò)冠內(nèi)直接注射至一個(gè)或兩個(gè)冠狀動(dòng)脈將載體傳遞至患者的心 肌中，籍此促進(jìn)所述患者心肌中冠狀側(cè)血管的生成。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述血管生成蛋白或肽選自aFGF, bFGF， FGF-4， FGF-5和VEGF。
19. 權(quán)利要求17的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑或 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白。
20. 權(quán)利要求17的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑。
21. 權(quán)利要求17的方法，其中所述載體是病毒載體。
22. 權(quán)利要求17的方法，其中所述病毒載體是復(fù)制缺損的腺病毒 載體或腺伴隨病毒載體。
23. 權(quán)利要求17的方法，其中所述冠內(nèi)注射深入至左和右冠狀動(dòng) 脈腔內(nèi)至少約lcm。
24. 權(quán)利要求17的方法，其中除了冠狀動(dòng)脈外，所述冠內(nèi)注射還 深入至隱靜脈移植物或乳房?jī)?nèi)部動(dòng)脈移植物腔內(nèi)至少約lcm。
25. 權(quán)利要求17的方法，其中所述方法包括三次注射， 一次注射 至左前降冠狀動(dòng)脈(LAD), —次注射至左旋(LCx)冠狀動(dòng)脈， 一次注射 至右冠狀動(dòng)脈。
26. 權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼p-腎上腺素能信號(hào)傳 導(dǎo)蛋白，其中通過(guò)冠內(nèi)直接注射至一個(gè)或兩個(gè)冠狀動(dòng)脈將栽體傳遞至 患 者的心肌中。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述p-腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)蛋白選 自P-腎上腺素能受體(P-AR)， G-蛋白受體激酶抑制劑(GRK抑制劑)和 腺苷酸環(huán)化酶(AC)。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑或 VEGF。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑。
30. 權(quán)利要求26的方法，其中所述載體是病毒載體。
31. 權(quán)利要求26的方法，其中所述病毒載體是復(fù)制缺損的腺病毒 載體或腺伴隨病毒載體。
32. 權(quán)利要求26的方法，其中所述冠內(nèi)注射深入至左和右冠狀動(dòng) 脈腔內(nèi)至少約lcra。
33. 權(quán)利要求26的方法，其中除了冠狀動(dòng)脈外，所述冠內(nèi)注射還 深入至隱靜脈移植物或乳房?jī)?nèi)部動(dòng)脈移植物腔內(nèi)至少約1 cm。
34. 權(quán)利要求26的方法，其中所述方法包括三次注射， 一次注射 至左前降冠狀動(dòng)脈(LAD)， 一次注射至左旋(LCx)冠狀動(dòng)脈， 一次注射 至右冠狀動(dòng)脈。
35. 權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)直接進(jìn)入一個(gè)或兩個(gè)股動(dòng)脈的股 動(dòng)脈內(nèi)注射將載體導(dǎo)入外周血管系統(tǒng)。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述載體含有編碼血管生成蛋白或 肽的轉(zhuǎn)基因，并在外周血管系統(tǒng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，籍此促進(jìn)外周血管系統(tǒng) 位點(diǎn)的血管生成。
37. 權(quán)利要求35的方法，其中所述血管生成蛋白或肽選自aFGF， bFGF， FGF-4， FGF-5和VEGF。
38. 權(quán)利要求35的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑或 VEGF。
39. 權(quán)利要求35的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動(dòng)劑。
40. 權(quán)利要求35的方法，其中所述載體是病毒載體。
41. 權(quán)利要求35的方法，其中所述病毒載體是復(fù)制缺損的腺病毒載體。
42. 權(quán)利要求35的方法，其中所述病毒栽體是復(fù)制缺損的腺伴隨 病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸和血管活性劑相結(jié)合用于加強(qiáng)的基因投遞。通過(guò)將插入了轉(zhuǎn)基因的載體直接注射到為所靶向組織供血的動(dòng)脈內(nèi)，優(yōu)選結(jié)合應(yīng)用在傳遞載體之前或同時(shí)將血管活性劑灌注到該動(dòng)脈內(nèi)，可以對(duì)外周血管病、心臟病和其它狀況進(jìn)行有效的體內(nèi)基因治療。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101186928SQ20071018083
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期1999年2月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月11日
發(fā)明者H·K·哈蒙德 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)