專利名稱：包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素(follistain)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)生長和分化因子-8(GDF-8)的水平或活性的用途。更特別的，本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(不包括促濾泡素抑制素本身)在治療與GDF-8水平或活性的調(diào)節(jié)相關(guān)的病癥中的用途。本發(fā)明用于治療肌肉疾病和病癥，特別是隨肌肉組織的增加而治療有效的肌肉疾病和病癥。本發(fā)明也用于治療與新陳代謝、脂肪組織和骨退化相關(guān)的疾病和病癥。
背景技術(shù)：
生長和分化因子-8(GDF-8)，亦稱為肌肉生長抑制素(myostatin)，是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的生長因子的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的成員，所有的生長因子具有重要的生理學(xué)生長調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生的特性(Kingsley等人，(1994)Genes Dev.，8133-46；Hoodless等人(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.，228235-72)。GDF-8是骨骼肌質(zhì)量的負(fù)調(diào)節(jié)物，并且對鑒定調(diào)節(jié)其生物活性的因子相當(dāng)有興趣。例如GDF-8在發(fā)育和成體骨骼肌中高表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠中GDF-8的無效突變特征為骨骼肌的明顯肥大和增生(McPherron等人，(1997)Nature，38783-90)。類似的骨骼肌質(zhì)量增加在牛GDF-8的天然存在的突變中是明顯的(Ashmore等人(1974)Growth，38501-507；Swatland和Kieffer(1994)J.Anim.Sci.，38752-757；McPherron和Lee(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，9412457-12461；和Kambadur等人(1997)Genome Res.，7910-915)。最近的研究已經(jīng)顯示人類中與HIV感染有關(guān)的肌肉損耗伴隨GDF-8蛋白質(zhì)表達(dá)的增加(Gonzalez-Cadavid等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9514938-43)。此外，GDF-8可以調(diào)節(jié)肌肉特異性酶的產(chǎn)生(例如，肌酸激酶)以及調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖(WO 00/43781)。
許多人和動(dòng)物的病癥與肌肉組織的損失或功能性損傷相關(guān)。迄今為止，很少存在對這些病癥可靠或有效的治療。然而，與這些病癥有關(guān)的可怕癥狀可基本上在患有這些病癥的患者中通過使肌肉組織量增加的治療而減輕。雖然并不治愈該病癥，但這種治療可顯著改善這些患者的生活質(zhì)量并且可以改進(jìn)這些疾病的一些效果。因此，在本領(lǐng)域中有必要鑒定可在患這些病癥的患者中促進(jìn)肌肉組織整體增加的新療法。
除骨骼肌中GDF-8的生長調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生的特性外，GDF-8也可參與許多其他的生理學(xué)過程(例如，葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài))，以及例如在類型2糖尿病和例如肥胖的脂肪組織病癥發(fā)展過程中的異常狀況。例如，GDF-8調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞(Kim等人(2001)B.B.R.C.281902-906)。因此，GDF-8的調(diào)節(jié)也可用于治療這些疾病。
GDF-8蛋白質(zhì)是作為由氨基末端的前肽和羧基末端的成熟結(jié)構(gòu)域組成的前體蛋白質(zhì)而合成的(McPherron和Lee，(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，9412457-12461)。切割前，該前體GDF-8蛋白質(zhì)形成同型二聚體。隨后氨基末端的前肽從成熟的結(jié)構(gòu)域上切割下來。切割下來的前肽可保持與成熟的結(jié)構(gòu)域二聚體非共價(jià)結(jié)合，使其生物活性失活(Miyazono等人，(1988)J.Biol.Chem.，2636407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.，2637646-7654；和Brown等人(1990)Growth Factors，335-43)。相信2種GDF-8前肽與GDF-8成熟二聚體結(jié)合(Thies等人(2001)Growth Factors，18251-259)。由于這種失活的特性，前肽被稱為″潛在相關(guān)的肽″(LAP)，并且成熟結(jié)構(gòu)域和前肽的復(fù)合物通常稱為″小的潛在的復(fù)合物″(Gentry和Nash(1990)Biochemistry，296851-6857；Derynck等人(1995)Nature，316701-705；和Massague(1990)Ann.Rev.CellBiol.，12597-641)。已知其他蛋白質(zhì)是與GDF-8或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合，并抑制其生物活性。具有這種抑制作用蛋白質(zhì)包括促濾泡素抑制素(Gamer等人(1999)Dev.Biol.，208222-232)。相信當(dāng)前肽被除去時(shí)，GDF-8的成熟結(jié)構(gòu)域作為同型二聚體是有活的。
顯而易見，GDF-8參與許多決定性的生物進(jìn)程的調(diào)控。由于它在這些過程中的關(guān)鍵功能，GDF-8可能是用于治療介入所需的目標(biāo)。特別地，可使用抑制GDF-8活性的治療劑治療人或動(dòng)物的病癥，其中肌肉組織的增加是治療有效的。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的已知蛋白質(zhì)在許多生物進(jìn)程中，特別是在TGF-β超家族信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)過程例如細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。促濾泡素抑制素、與促濾泡素抑制素相關(guān)的基因(FLRG，F(xiàn)SRP)和與促濾泡素抑制素相關(guān)的蛋白質(zhì)(FRP)，通過經(jīng)TGF-β的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Bartholin等人(2001)Oncogene，205409-5419；Shibanuma等人(1993)Eur.J.Biochem.21713-19)或通過它們拮抗TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的能力(Phillips和de Kretser(1998)Front.Neuroendocrin.，19287-322；Tsuchida等人(2000)J.Biol.Chem.，27540788-40796；Patel等人(1996)Dev.Biol.，178327-342；Amthor等人(1996)Dev.Biol.，178343-362)而都與TGF-β信號傳導(dǎo)相聯(lián)系。括號中蛋白質(zhì)的名稱是備選名稱。
胰島素生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7，mac25)，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域，結(jié)合胰島素并隨后阻斷與胰島素受體的相互作用。此外，IGFBP7已經(jīng)顯示結(jié)合一種TGF-β家族成員的活化素(Kato(2000)Mol.Med.，6126-135)。
集聚蛋白和與集聚蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)包含9個(gè)以上的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域并且從神經(jīng)細(xì)胞分泌以促進(jìn)乙酰膽堿受體和參與形成突觸的其他分子的聚集。已經(jīng)表明促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域可能幫助生長因子定位于突觸(Patthy等人(1993)Trends Neurosci.，1676-81)。
骨粘連蛋白(SPARC，BM40)和hevin(SC1，mast9，QR1)是與細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)相互作用并且調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和粘附的緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)(Motamed(1999)Int.J.Biochem.Cell.Biol.，311363-1366；Girard和Springer(1996)J.Biol.Chem.，2714511-4517)。這些蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域。
其他的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)已經(jīng)被NCBI數(shù)據(jù)庫(國家生物技術(shù)信息中心，Bethesda，馬里蘭州，美國)描述或公開，然而它們的功能目前是未知的。這些蛋白質(zhì)包括U19878(G01639，與fomoregulin-1很相似)、T46914、人GASP1(與GDF-相關(guān)的血清蛋白1；在此所描述的；圖7)、人GASP2(WFIKKN；Trexler等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，983705-3709；圖9)，和testican(SPOCK)蛋白質(zhì)的蛋白多糖家族(Alliel等人(1993)Eur.J.Biochem.，214347-350)。也根據(jù)Celera數(shù)據(jù)庫確定了小鼠GASP1(圖6)和小鼠GASP2(圖8)的氨基酸和核苷酸序列(Rockville，MD)。如在此所描述的，克隆的小鼠GASP1的核苷酸序列除在不改變預(yù)測的氨基酸序列的搖擺密碼子中的一些堿基置換外，與預(yù)測的Celera序列匹配(參見

圖13)。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明涉及除促濾泡素抑制素外的蛋白質(zhì)，它包含獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，即存在至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域。促濾泡素抑制素本身不包括于本發(fā)明中。包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)特異性地與成熟的GDF-8蛋白質(zhì)或其片段反應(yīng)，無論該GDF-8蛋白質(zhì)是單體形式、二聚體的活性形式，或是GDF-8潛在復(fù)合物的復(fù)合形式。包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能結(jié)合成熟GDF-8蛋白質(zhì)上的表位，導(dǎo)致與GDF-8相關(guān)的一種或多種生物活性的減少，相對于不與相同蛋白質(zhì)結(jié)合的成熟GDF-8蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)GDF-8對細(xì)胞的作用的方法。這種方法包括施用有效量的包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括通過施用編碼包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的DNA分子，在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。
根據(jù)本發(fā)明，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以以治療有效劑量對患者給藥，以治療或預(yù)防其中肌肉組織的增加對治療有效的醫(yī)學(xué)狀況。實(shí)施方案包括與GDF-8的產(chǎn)生、新陳代謝或活性相關(guān)的疾病、病癥和細(xì)胞和組織創(chuàng)傷的治療。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以藥物制劑的形式制備。該藥物制劑可以包含幫助結(jié)合成熟GDF-8蛋白質(zhì)或其片段的其他成分，無論該GDF-8是單體形式、二聚體的活性形式或是GDF-8潛在復(fù)合物的復(fù)合形式。
此外，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可用作定量或定性檢測成熟GDF-8蛋白質(zhì)或其片段的診斷工具，無論其是單體形式、二聚體的活性形式，或是GDF-8潛在復(fù)合物的復(fù)合形式。例如，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可用于檢測細(xì)胞、體液、組織或生物體中GDF-8蛋白質(zhì)的存在、缺乏或數(shù)量。檢測的成熟GDF-8蛋白質(zhì)的存在或數(shù)量可能與在此所列出的一種或多種醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可在診斷試劑盒中提供以檢測成熟GDF-8蛋白質(zhì)或其片段，無論其是單體形式、二聚體的活性形式，或是GDF-8潛在復(fù)合物的復(fù)合形式，并且有助于使所得的結(jié)果與在此所描述的一種或多種醫(yī)學(xué)狀況相互關(guān)聯(lián)。這種試劑盒可能包括包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)，無論它是標(biāo)記的或未標(biāo)記的，并且包括至少一個(gè)結(jié)合該蛋白質(zhì)的試劑，例如標(biāo)記的抗體。該試劑盒可能同時(shí)包括適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)準(zhǔn)物和對照樣品，它們可用于比較實(shí)驗(yàn)檢測的結(jié)果。它可能還包括緩沖液或洗滌液以及使用該試劑盒的用法說明。結(jié)構(gòu)成分可被包括在內(nèi)以用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，例如棍、珠、紙、柱、小瓶或凝膠。
附圖簡述圖1顯示了從野生型的小鼠血清中抗體純化GDF-8復(fù)合物。銀染還原性凝膠顯示使用共價(jià)偶聯(lián)瓊脂糖珠的JA16單克隆抗體從野生型小鼠血清中純化的蛋白質(zhì)。平行進(jìn)行使用模擬偶聯(lián)珠的對照純化(0)。隨后使用緩沖液(模擬洗提)、競爭性肽和SDS樣品緩沖液的洗提顯示用來自JA16-結(jié)合珠的肽的特異洗提有2個(gè)可見的蛋白質(zhì)條帶(用箭頭指示)。
圖2顯示在來自正常小鼠血清的親和純化的樣品中鑒定成熟和未加工的GDF-8。圖2A顯示從親和純化的樣品中的可見的12 kDa條帶中鑒定出的GDF-8衍生肽(SEQ ID NO19)的代表性的MS/MS譜。N-末端碎片離子(b離子)和C-末端碎片離子(y離子)都是可見的。值得注意的是，最強(qiáng)的y碎片離子由脯氨酸殘基前的裂解作用引起，這是包含脯氨酸的肽的通常的特征。圖2B顯示用識別GDF-8成熟區(qū)域的多克隆抗體作為探針的western印跡，證實(shí)親和純化樣品中存在GDF-8。GDF-8的成熟和未加工的形式都是可見的。
圖3顯示GDF-8前肽和促濾泡素抑制素樣相關(guān)基因(FLRG)與從正常小鼠血清分離的循環(huán)的GDF-8的結(jié)合。顯示鑒定自36 kDa條帶中的GDF-8前肽(SEQ ID NO23)(圖3A)和FLRG(SEQ ID NO30)(圖3C)的衍生肽的代表性MS/MS譜。圖3B顯示用特異性地識別GDF-8前肽區(qū)域的多克隆抗體作為探針對親和純化的GDF-8復(fù)合物進(jìn)行的western印跡，證實(shí)GDF-8復(fù)合物中該蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定。剪切的前肽和未加工的GDF-8是可見的--在較長的曝光時(shí)間下，未加工的GDF-8也可在SDS洗提樣品中見到。圖3D顯示用FLRG的單克隆抗體作為探針對親和純化的GDF-8復(fù)合物進(jìn)行的western印跡。
圖4顯示鑒定的GDF-8前肽、FLRG和作為血清中的主要GDF-8結(jié)合蛋白的新蛋白質(zhì)的大規(guī)模GDF-8純化的完全分析的結(jié)果。將陰性對照和JA16免疫沉淀的肽洗提樣品的銀染凝膠切割成為13個(gè)部分。每個(gè)部分中的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化并且使用納流(nanoflow)-LC-MS/MS和數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行鑒定。JA16樣品的獨(dú)特蛋白質(zhì)只包括未加工的和成熟的GDF-8、GDF-8前肽、FLRG和新的多結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑(與GDF-相關(guān)的血清蛋白1，GASP1)。這些蛋白質(zhì)鑒定自凝膠的標(biāo)記區(qū)域。
圖5顯示新的多結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑，GASP1，它與血清中的GDF-8結(jié)合。圖5A(指定為SEQ ID NO31的肽)和5B(指定為SEQ ID NO33的肽)顯示鑒定自圖4銀染凝膠的條帶3的2個(gè)GASP1肽的代表性的MS/MS譜。
圖6A顯示預(yù)測的小鼠GASP1的核苷酸序列。圖6B顯示預(yù)測的小鼠GASP1的備選的核苷酸序列。圖6C顯示由圖6A和6B中顯示的核苷酸序列編碼的預(yù)測的氨基酸序列。由這2種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列是相同的，因?yàn)楹塑账岬牟町惗荚趽u擺密碼子的位置。促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域以粗體和加下劃線顯示。
圖7A顯示預(yù)測的人GASP1的核苷酸序列。圖7B顯示相應(yīng)的預(yù)測的氨基酸序列。促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域以粗體和加下劃線顯示。圖7C顯示使用備選的起始位點(diǎn)預(yù)測的人GASP1的核苷酸序列。圖7D顯示相應(yīng)的預(yù)測的氨基酸序列。促濾泡素抑制素的結(jié)構(gòu)域以粗體和加下劃線顯示。序列的結(jié)尾加注星號表示。
圖8A顯示預(yù)測的小鼠GASP2的核苷酸序列，同時(shí)圖8B顯示相應(yīng)預(yù)測的氨基酸序列。促濾泡素抑制素的結(jié)構(gòu)域以粗體和加下劃線顯示。
圖9A顯示預(yù)測的人GASP2的核苷酸序列，同時(shí)圖9B顯示相應(yīng)的預(yù)測的氨基酸序列。促濾泡素抑制素的結(jié)構(gòu)域以粗體和加下劃線顯示。
圖10顯示小鼠GASP1在許多成體組織中和發(fā)育期間的表達(dá)。該圖顯示小鼠GASP1的組織表達(dá)分布圖。GASP1的551bp片段擴(kuò)增自Clontech(Palo Alto，CA)標(biāo)準(zhǔn)化的第一鏈cDNA組。擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的一部分作為對照。已知G3PDH的表達(dá)在骨骼肌中很高而在睪丸中很低。模板除了G3PDH之外相對于，還相對于β-肌動(dòng)蛋白、磷脂酶A2和核糖體蛋白S29將cDNA組標(biāo)準(zhǔn)化。
圖11顯示分離自人血清的蛋白質(zhì)。來自JA16免疫沉淀或?qū)φ諛悠?0)的蛋白質(zhì)在模擬的PBS洗提、競爭性肽洗提或SDS洗提中洗提。凝膠指示區(qū)域的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化并且經(jīng)LS-MS/MS和數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行分析。存在于JA16樣品而不存在于對照樣品中的蛋白質(zhì)是成熟的GDF-8(條帶16)、GDF-8前肽和FLRG(條帶11)以及人GASP1(條帶4)。圖11B顯示用識別成熟GDF-8的抗體作為探針對相同JA16免疫沉淀進(jìn)行的western印跡。相應(yīng)于分離自人血清的成熟的和未加工的GDF-8的條帶是可見的。
圖12顯示來源于分離自條帶4，11和16(圖11)的GDF-8的肽和相關(guān)的蛋白質(zhì)的典型質(zhì)譜。顯示肽序列和N-末端(b離子)和C-末端(y離子)。鑒定的肽的一覽表在表1中提供。顯示的譜來自GASP1肽(SEQ ID NO44)(圖12A)、FLRG肽(SEQ ID NO41)(圖12B)、GDF-8前肽的肽(SEQ ID NO24)(圖12C)和成熟的GDF-8肽(SEQ ID NO13)(圖12D)。
圖13顯示克隆的小鼠GASP1的核苷酸(SEQ ID NO48)和氨基酸(SEQ ID NO49)序列。由質(zhì)譜法在JA16親和純化的樣品中鑒定的肽是加下劃線的。序列的結(jié)尾加注星號表示。
圖14A顯示GASP1的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。GASP1具有在氨基酸29后的信號序列/切割位點(diǎn)。此外，GASP1包含可能抑制金屬蛋白酶的2個(gè)Kunitz/BPTI絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域(包括Kazal絲氨酸蛋白酶抑制劑基序)和netrin結(jié)構(gòu)域。圖14B顯示從小鼠和人基因組序列預(yù)計(jì)的GASP1和GASP2的進(jìn)行系統(tǒng)樹。小鼠和人的GASP1是90％相同的。GASP1和GASP2是54％相同的。
圖15顯示重組生產(chǎn)的GASP1分別結(jié)合GDF-8和GDF-8前肽。(A)使用JA16從補(bǔ)充有重組純化的GDF-8和/或前肽的模擬的或GASP1-V5-His轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞條件培養(yǎng)基中免疫沉淀GDF-8。使用抗V5(上端組)、抗GDF-8(中間組)，或抗前肽的多克隆抗體的Western印跡檢測這些蛋白質(zhì)是否存在于免疫沉淀中。(B)重組生產(chǎn)的GASP1蛋白質(zhì)從補(bǔ)充有重組純化的GDF-8和/或前肽的模擬的或GASP1-V5-His條件培養(yǎng)基中經(jīng)抗V5標(biāo)記的抗體免疫沉淀。如(A)中所述通過western印跡分析免疫沉淀物。
圖16顯示GASP1抑制GDF-8和高度相關(guān)的BMP-11的生物活性，但不抑制活化素或TGF-β。將來自模擬(空心圓形)或GASP1-V5-His(實(shí)心正方形)轉(zhuǎn)染子的條件培養(yǎng)基的多種稀釋物與(A)10ng/ml GDF-8，(B)10ng/ml BMP-11，(C)10ng/ml活化素，或(D)0.5ng/ml TGF-β溫育。然后將這些樣品在A204(A-C)或RD(D)細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶報(bào)道分子活性分析以確定加入的生長因子的活性。熒光素酶活性以相對的熒光素酶單位顯示。由每一生長因子單獨(dú)產(chǎn)生的活性通過實(shí)心菱形和短虛線顯示。不加入任何生長因子，則分析中的背景活性很低，如不帶有符號的長虛線表示。
圖17顯示GASP1抑制GDF-8的效價(jià)。測試了純化的GASP1在RD細(xì)胞的(CAGA)12(SEQ ID NO53)熒光素酶報(bào)道分子分析中抑制20ng/ml肌肉生長抑制素的能力(實(shí)心正方形)。由GDF-8單獨(dú)產(chǎn)生的活性通過實(shí)心菱形和短虛線顯示。沒有加入生長因子時(shí)存在的活性以長虛線顯示。
定義術(shù)語″促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域″是指以富含半胱氨酸的重復(fù)單元為特征的氨基酸結(jié)構(gòu)域或編碼該氨基酸結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)構(gòu)域。促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域一般包括65-90個(gè)氨基酸的跨度并且包含10個(gè)保守的半胱氨酸殘基和與Kazal絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域相似的區(qū)域。一般，半胱氨酸殘基之間的環(huán)區(qū)域在促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域顯示出序列的可變性，但是一些保守仍是明顯的。第4和第5個(gè)半胱氨酸之間的環(huán)通常是小的，只包含1或2個(gè)氨基酸。第7和第8個(gè)半胱氨酸之間的環(huán)中的氨基酸一般是最高度保守的，包含(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)的共有序列，然后為(T，S)-Y基序。第9和第10個(gè)半胱氨酸之間的區(qū)域一般包括被另一個(gè)氨基酸分隔開的包含2個(gè)疏水殘基(具體地為V，I或L)的基序。
術(shù)語″包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)″是指包含至少一個(gè)，但可能超過一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該術(shù)語也指這種蛋白質(zhì)的任何變體(包括片段；具有置換、添加或缺失突變的蛋白質(zhì)；以及融合蛋白質(zhì))，這些變體保持與天然蛋白質(zhì)相關(guān)的已知生物活性，特別是與GDF-8結(jié)合活性相關(guān)的已知生物活性，包括已經(jīng)用保守的或非保守的氨基酸序列變化修飾的序列。這些蛋白質(zhì)可來源于天然或合成的任何來源。該蛋白質(zhì)可以來源于人或動(dòng)物來源，包括牛、雞、鼠、大鼠、豬、羊、火雞、狒狒和魚。促濾泡素抑制素本身不包括于本發(fā)明中。
術(shù)語″GDF-8″或″GDF-8蛋白質(zhì)″是指特異的生長和分化因子。該術(shù)語包括該蛋白質(zhì)的全長未加工的前體形式，以及由翻譯后切割產(chǎn)生的成熟的和前肽的形式。該術(shù)語也指保持與蛋白質(zhì)相關(guān)的已知生物活性的GDF-8的任何片段，包括已經(jīng)用保守的或非保守的氨基酸序列變化修飾的序列。這些GDF-8分子可來源于天然或合成的任何來源。該蛋白質(zhì)可能來源于人或動(dòng)物來源，包括牛、雞、鼠、大鼠、豬、羊、火雞、狒狒和魚。多種GDF-8分子已經(jīng)在McPherron等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci. USA，9412457-12461中有描述。
″成熟的GDF-8″是指從GDF-8前體蛋白質(zhì)的羧基末端結(jié)構(gòu)域切割下來的蛋白質(zhì)。成熟的GDF-8可作為單體、同型二聚體或GDF-8潛在的復(fù)合物存在。根據(jù)體內(nèi)或體外的狀況，成熟的GDF-8可在這些不同的任何或所有形式之間建立平衡。同型二聚體被認(rèn)為是有生物學(xué)活性的。在它的生物活性形式中，該成熟的GDF-8也被稱為″活化的GDF-8″。
″GDF-8前肽″是指從GDF-8前體蛋白質(zhì)的氨基末端結(jié)構(gòu)域切割下來的多肽。GDF-8前肽能夠結(jié)合成熟的GDF-8上的前肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
″GDF-8潛在的復(fù)合物″是指在成熟GDF-8的同型二聚體和GDF-8前肽之間形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。認(rèn)為2個(gè)GDF-8前肽結(jié)合2個(gè)分子的同型二聚體形式的成熟GDF-8以形成無活性的四聚合復(fù)合物。該潛在復(fù)合物可包括替代一個(gè)或多個(gè)GDF-8前肽的其它GDF抑制劑或除一個(gè)或多個(gè)GDF-8前肽之外還包括其他的GDF抑制劑。
短語″GDF-8活性″是指與活化的GDF-8蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種生理學(xué)上的生長調(diào)節(jié)或形態(tài)發(fā)生的活性。例如，活化的GDF-8是骨骼肌的負(fù)調(diào)節(jié)劑。活化的GDF-8還可以調(diào)節(jié)肌肉-特異性酶(例如，肌酸激酶)的生產(chǎn)，刺激成肌細(xì)胞的細(xì)胞增殖并且調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞。GDF-8也被認(rèn)為增加對胰島素的敏感性和在外周組織中，特別是在骨骼肌或脂肪細(xì)胞中對葡萄糖的攝取。因此，GDF-8生物活性包括但不限于，抑制肌肉形成、抑制肌細(xì)胞生長、抑制肌肉發(fā)育、減少肌肉質(zhì)量、調(diào)節(jié)肌肉特異性酶、抑制成肌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞、增加對胰島素的敏感性、調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、葡萄糖止血和調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)育和維持。
術(shù)語″分離的″或″純化的″是指基本上不含其自然環(huán)境的分子。例如，分離的蛋白是指來源于細(xì)胞或組織源而基本上不含源于該細(xì)胞或組織的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。短語″基本上不含細(xì)胞物質(zhì)″是指其中分離的蛋白至少為70％-80％(w/w)純、至少為80％-89％(w/w)純、至少為90-95％純，或至少為96％、97％、98％、99％或100％(w/w)純的制劑。
術(shù)語″LC-MS/MS″指液相層析與質(zhì)譜儀串聯(lián)安排以分離特定質(zhì)量/電荷比的分子離子、破碎該離子并且記錄該碎片離子的質(zhì)量/電荷比。當(dāng)分析肽樣品時(shí)，這種技術(shù)使得能夠通過液相層析上游分離復(fù)雜樣品，然后記錄碎片離子的質(zhì)量并且隨后確定肽的序列。
術(shù)語″MS/MS″指使用質(zhì)譜儀分離特定質(zhì)量/電荷比的分子離子、破碎該離子并且記錄所得到的碎片離子的質(zhì)量/電荷比的方法。該碎片離子提供有關(guān)肽序列的信息。
術(shù)語″治療″或″療法″指治療法和預(yù)防法或預(yù)防措施。需要治療者可能包括已經(jīng)患有特定的醫(yī)學(xué)病癥以及可能最終患上病癥的個(gè)體(即，需要預(yù)防措施的個(gè)體)。術(shù)語治療包括確定病癥的潛在原因的措施和減少醫(yī)學(xué)病癥的癥狀而不必影響其成因的措施。因此，改進(jìn)生活質(zhì)量和改善癥狀，正如抵消病因的措施被認(rèn)為是治療。
術(shù)語″醫(yī)學(xué)病癥″指肌肉、骨或葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的紊亂，并且包括與GDF-8和/或TGF-β超家族其他成員(例如，BMP-11)相關(guān)的病癥。這種病癥的實(shí)例包括但不限于，代謝疾病和紊亂，例如胰島素依賴性(1型)糖尿病、非胰島素依賴型(2型)糖尿病、高血糖、減損的葡萄糖耐量、新陳代謝綜合征(例如，綜合征X)，和由外傷(如燒傷或氮失衡)誘導(dǎo)的胰島素抗性，以及脂肪組織紊亂(例如，肥胖癥)；肌肉和神經(jīng)肌肉病癥，例如肌營養(yǎng)不良(包括但不限于，嚴(yán)重的或良性的X-連鎖的肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、面肩胛肱骨營養(yǎng)不良、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端肌營養(yǎng)不良、進(jìn)行性營養(yǎng)不良的眼肌麻痹、眼咽肌營養(yǎng)不良，杜興肌營養(yǎng)不良和Fakuyama型先天性肌營養(yǎng)不良)；肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)；肌內(nèi)萎縮；器官萎縮；脆性；腕管綜合征；充血梗阻性肺病；先天性肌病；先天性肌強(qiáng)直；家族性周期性麻痹；突發(fā)性肌紅蛋白尿；重癥肌無力；伊-朗綜合征；繼發(fā)性肌無力；去神經(jīng)支配萎縮；突發(fā)性肌肉萎縮；以及肌肉貧乏癥(Sarcopenia)、惡病質(zhì)和其他肌肉消耗綜合征。其他實(shí)例包括，特別是在老年人和/或絕經(jīng)后的婦女中的骨質(zhì)疏松癥；糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥；骨量減少；骨關(guān)節(jié)炎；與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的骨折；以及肌肉組織的外傷或慢性損傷。更進(jìn)一步的實(shí)例包括由慢性糖皮質(zhì)激素治療、早熟性生殖腺障礙、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、營養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食造成的低骨質(zhì)量。
術(shù)語″質(zhì)量增加″是指在用包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)治療后，相對于治療前存在的肌肉量，出現(xiàn)更多數(shù)量的肌肉。
術(shù)語″治療效益″指病癥癥狀的改善，病癥發(fā)展的減慢，或病癥發(fā)展的停止。治療效益通過比較病癥的各個(gè)方面而確定，例如在包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)的施用前后肌內(nèi)的數(shù)量。
術(shù)語″調(diào)節(jié)″指通過增加、減少或抑制蛋白質(zhì)的活性、性能或數(shù)量改變蛋白質(zhì)的特性。例如，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可通過抑制其活性而調(diào)節(jié)GDF-8。
術(shù)語″穩(wěn)定化修飾″是本領(lǐng)域已知的或在此提出的，能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)、增加蛋白質(zhì)的體外半衰期、增加蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期和/或減少蛋白質(zhì)的蛋白水解降解的任何修飾。這種穩(wěn)定化修飾包括但不限于，融合蛋白質(zhì)(包括，例如，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì))、糖基化位點(diǎn)的修飾(包括，例如，給包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)增加糖基化位點(diǎn))，以及碳水化合物部分的修飾(包括，例如，從包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)除去碳水化合物部分)。在包括融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化修飾的情況下(例如，第二蛋白質(zhì)與包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)融合)，該第二蛋白質(zhì)可被稱為″穩(wěn)定劑部分″或″穩(wěn)定劑蛋白質(zhì)″。例如，包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)人蛋白質(zhì)可以與IgG分子融合，其中IgG作為穩(wěn)定劑蛋白質(zhì)或穩(wěn)定劑部分起作用。如在此所使用的，除了指融合蛋白質(zhì)的第二蛋白質(zhì)外，″穩(wěn)定劑部分″也包括非蛋白質(zhì)類的修飾，例如碳水化合物部分或非蛋白質(zhì)類的聚合物。
術(shù)語″IgG分子的Fc區(qū)域″是指如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的同種型IgG免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域。IgG分子的Fc區(qū)域是負(fù)責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的IgG分子(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的部分。
″體外半衰期″指在活生物體外測量的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。測量體外半衰期的測定方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，SDS-PAGE、ELISA、基于細(xì)胞的分析、脈沖追蹤、western印跡、northern印跡等。這些和其他有用的測定是本領(lǐng)域公知的。
″體內(nèi)半衰期″是指生物體中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。體內(nèi)半衰期可通過許多本領(lǐng)域已知的方法測量，包括但不限于，體內(nèi)血清半衰期、循環(huán)半衰期和在此的實(shí)施例中所闡明的測定方法。
″體內(nèi)血清半衰期″指在生物體的血液中循環(huán)的蛋白質(zhì)的半衰期。本領(lǐng)域已知的方法可用于測量體內(nèi)血清半衰期。例如，可對動(dòng)物施用放射性的蛋白質(zhì)并且可隨時(shí)間監(jiān)測血清中標(biāo)記蛋白質(zhì)的數(shù)量。
為了幫助鑒定本說明書和附圖中所列出的序列，提供下列表格，列出SEQ ID NO、圖的位置和序列的說明。
發(fā)明詳述包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)本發(fā)明涉及除促濾泡素抑制素外的蛋白質(zhì)，它具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，即包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域。促濾泡素抑制素本身不包括于本發(fā)明中。相信包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)將結(jié)合和抑制GDF-8。具有至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于，與促濾泡素抑制素類相關(guān)的基因(FLRG)、FRP(flik，tsc36)、集聚素、骨粘連蛋白(SPARC，BM40)、hevin(SC1，mast9，QR1)、IGFBP7(mac25)和U19878。包括圖6和7中提供的核苷酸和氨基酸序列的GASP1，和包括圖8和9中提供的核苷酸和氨基酸序列的GASP2是包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的其他實(shí)例。
如上所述，促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域被定義為，其特征為富含半胱氨酸重復(fù)單元的氨基酸結(jié)構(gòu)域或編碼該氨基酸結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)構(gòu)域。促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域一般包括65-90個(gè)氨基酸的跨度并且包含10個(gè)保守的半胱氨酸殘基和與Kazal絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域相似的區(qū)域。一般，半胱氨酸殘基之間的環(huán)區(qū)域在促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域顯示出序列的變化性，但是一些保守仍是明顯的。第4和第5個(gè)半胱氨酸之間的環(huán)通常是小的，只包含1或2個(gè)氨基酸。第7和第8個(gè)半胱氨酸之間的環(huán)中的氨基酸一般是最高度保守的，包含(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)的共有序列，然后為(T，S)-Y基序。第9和第10個(gè)半胱氨酸之間的區(qū)域一般包括被另一個(gè)氨基酸分隔開的包含2個(gè)疏水殘基(特定地為V，I或L)的基序。
可結(jié)合GDF-8的包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，可使用多種方法分離。例如，可如本發(fā)明所舉例說明的利用GDF-8的親和純化。此外，可使用cDNA文庫的低嚴(yán)謹(jǐn)篩選，或使用利用靶向促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的探針的簡并PCR技術(shù)。當(dāng)可利用更多基因組數(shù)據(jù)時(shí)，使用大量的序列分布圖和分析程序進(jìn)行相似性搜索，例如MotifSearch(Genetics Computer Group，Madison，WI)、ProfileSearch(GCG)和BLAST(NCBI)可用于發(fā)現(xiàn)包含與已知的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域有顯著同源性的新蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到GDF-8或包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可包含其各自氨基酸序列的任何數(shù)量的保守變化而不改變它們的生物特性。這種保守的氨基酸改變是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性的，例如，其疏水性、親水性、電荷、大小等。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，考慮上述多種特征的代表性的保守置換是公知的并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。此外，可使用包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的功能性片段。預(yù)計(jì)這種片段可結(jié)合并抑制GDF-8。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合成熟的GDF-8或其片段，無論它是單體形式、活性的二聚體形式或GDF-8潛在復(fù)合物的復(fù)合形式，其親和力在0.001-100nM或0.01-10nM或0.1-1nM之間。
核苷酸和蛋白質(zhì)序列雖然不一定總是必需的，但如果需要，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以確定包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的新蛋白質(zhì)的氨基酸或核酸序列。例如，本發(fā)明提供如圖6-9所示的GASP1和GASP2的氨基酸和核苷酸序列。
本發(fā)明也包括該核酸和氨基酸序列的變體、同系物和片段。例如，該核酸或氨基酸序列可包括與天然蛋白質(zhì)的核酸或氨基酸序列至少70％-79％相同，或至少80％-89％相同，或至少90％-95％相同，或至少96％-100％相同的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到結(jié)合GDF-8的區(qū)域可以容許比不參與結(jié)合的蛋白質(zhì)的另外部分更少的序列變異。因此，該蛋白質(zhì)的這些非結(jié)合區(qū)域可包含不顯著改變該蛋白質(zhì)結(jié)合特性的實(shí)質(zhì)性變異。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認(rèn)識到可產(chǎn)生許多變化以特異性地增加該蛋白質(zhì)對于其目標(biāo)物的親和力。這種增加親和力的改變一般通過在結(jié)合區(qū)域改變蛋白質(zhì)并測試結(jié)合GDF-8的能力或該結(jié)合的強(qiáng)度而以經(jīng)驗(yàn)方式確定。所有這類變化，無論其在結(jié)合區(qū)域的內(nèi)部或外部都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
相對的序列相似性或同一性可使用序列分析軟件包(SequenceAnalysis Software PackageTM)(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，威斯康辛大學(xué)生物技術(shù)中心，Madison，WI)的″Best Fit″或″Gap″程序確定?！錑ap″運(yùn)用Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch，1970)的算法以發(fā)現(xiàn)最大化相配數(shù)目并最小化缺口數(shù)目的2個(gè)序列的序列對比?！錌estFit″進(jìn)行2個(gè)序列間相似性最好部分的最適序列對比。最適的序列對比是通過使用Smith和Waterman(Smith和Waterman，1981；Smith等人，1983)的局部同源性算法插入缺口以最大化相配數(shù)目而發(fā)現(xiàn)的。
如上所述的序列分析軟件包包含許多用于鑒定本發(fā)明所公開的核苷酸和氨基酸序列的同系物的其他有用的序列分析工具。例如，″BLAST″程序(Altschul等人，1990)在特定的數(shù)據(jù)庫(例如，NCBI維持的序列數(shù)據(jù)庫)中搜索與查詢序列(肽或核酸)相似的序列；″FastA″(Lipman和Pearson，1985；也參見Pearson和Lipman，1988；Pearson等人，1990)進(jìn)行Pearson和Lipman搜索，用于在查詢序列和一組相同類型(核酸或蛋白質(zhì))的序列之間搜索相似性；″TfastA″進(jìn)行Pearson和Lipman搜索，用于在蛋白質(zhì)查詢序列和任何核苷酸序列組(它在進(jìn)行比較前按總共6個(gè)閱讀框翻譯該核苷酸序列)之間搜索相似性；″FastX″進(jìn)行考慮到移碼的Pearson和Lipman搜索，用于在核苷酸查詢序列和一組蛋白質(zhì)序列之間搜索相似性?！錞fastX″進(jìn)行考慮到移碼的Pearson和Lipman搜索，用于在蛋白質(zhì)查詢序列和任何核苷酸序列組之間搜索相似性(它在進(jìn)行比較前翻譯該核酸序列的兩個(gè)鏈)。
修飾的蛋白質(zhì)本發(fā)明包括包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的片段。這種片段可能包括促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的全部或部分。片段可包括在促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域和N-末端之間和/或在促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域和C-末端之間全部、部分序列或不包括該序列。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可被其他氨基酸置換，而并不有害地影響該蛋白質(zhì)活性，例如包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的結(jié)合特性。因此發(fā)明者預(yù)期可在包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的氨基酸序列、或編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列中產(chǎn)生多種變化，而不明顯地?fù)p失它們的生物用途或活性。這種改變可包括缺失、插入、截短、置換、融合、基序序列的改組(shuffing)等。
在產(chǎn)生這種改變中，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物功能中的重要性一般在本領(lǐng)域中是可理解的(Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.，157105-132)。公認(rèn)氨基酸相對的親水特性對生成的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)，該二級結(jié)構(gòu)又轉(zhuǎn)過來限定該蛋白質(zhì)與其他分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。
每種氨基酸已經(jīng)根據(jù)其疏水性和電荷特性被指定了親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)；這些是異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在產(chǎn)生這種改變中，置換的氨基酸的親水指數(shù)可在±2內(nèi)、±1內(nèi)和±0.5內(nèi)。
本領(lǐng)域中也可理解類似氨基酸的置換可根據(jù)親水性有效產(chǎn)生。美國專利4,554,101說明蛋白質(zhì)最大的局部平均親水性取決于其鄰近氨基酸的親水性，與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。
如美國專利4,554,101中所詳述的，下列親水性的值已經(jīng)被指定給氨基酸殘基精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在產(chǎn)生這種改變中，置換的氨基酸的親水值可在±2內(nèi)、±1內(nèi)和±0.5內(nèi)。
修飾可能是保守的以使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或生物功能不受該變化的影響。這種保守的氨基酸修飾是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性的，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，考慮上述多種特征的代表性的保守置換是公知的并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的氨基酸序列可改變?yōu)榫哂腥魏螖?shù)目的保守變化，只要該蛋白質(zhì)對其靶抗原的結(jié)合不受有害影響。這種變化可導(dǎo)入包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合部分的內(nèi)部或外部。例如，可以對導(dǎo)入蛋白質(zhì)抗原結(jié)合部分內(nèi)部的變化進(jìn)行設(shè)計(jì)來增加蛋白質(zhì)對其目標(biāo)物的親合性。
穩(wěn)定化修飾穩(wěn)定化修飾能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)，增加蛋白質(zhì)體外和/或體內(nèi)的半衰期，增加蛋白質(zhì)循環(huán)的半衰期和/或減少蛋白質(zhì)的蛋白水解的降解作用。這種穩(wěn)定化修飾包括但不限于融合蛋白質(zhì)，糖基化位點(diǎn)的修飾和碳水化合物部分的修飾。穩(wěn)定劑蛋白質(zhì)可以是能增加修飾的GDF前肽的總穩(wěn)定性的任何蛋白質(zhì)。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所能認(rèn)識到的，這種融合蛋白質(zhì)可任選地在前肽部分和穩(wěn)定化部分之間包括接頭肽。本領(lǐng)域眾所周知，制備融合蛋白質(zhì)使得第二蛋白質(zhì)與第一蛋白質(zhì)在框內(nèi)融合，因此所得到的翻譯的蛋白質(zhì)包含第一和第二蛋白質(zhì)。例如，在本發(fā)明中，可制備融合蛋白質(zhì)以使得包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)(例如，穩(wěn)定劑蛋白質(zhì)部分)融合。制備這種融合蛋白質(zhì)以使得所得到的翻譯蛋白質(zhì)包含前肽部分和穩(wěn)定劑部分。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以是糖基化的或與清蛋白或是非蛋白質(zhì)類的聚合物相連的。例如，包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可與一種或多種非蛋白質(zhì)類的聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以在美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中闡明的方式相連。例如，將蛋白質(zhì)通過共價(jià)連接到聚合物上來進(jìn)行化學(xué)修飾以提高它們的循環(huán)半衰期。聚合物和使它們附著于肽的方法也在美國專利號4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546中顯示。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可被聚乙二醇化。聚乙二醇化是通過將聚乙二醇(PEG)附著于蛋白質(zhì)的方法以延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期。包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的聚乙二醇化可減少最適抑制GDF-8所需的蛋白質(zhì)給藥的劑量或頻率。該技術(shù)的評述在Bhadra等人(2002)Pharmazie，575-29和Harris等人(2001)Clin.Pharmacokinet.，40539-551中有提供。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可與IgG分子的Fc區(qū)域連接。包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可與IgG分子的Fc區(qū)域鄰接融合，或通過接頭肽附著于IgG分子的Fc區(qū)域。這種接頭肽的使用在蛋白質(zhì)生物化學(xué)領(lǐng)域中是公知的。該Fc區(qū)域可來源于例如IgG1或IgG4。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可被修飾為具有改變的糖基化模式(即，與原始的或天然的糖基化模式不同)。如在此所使用的，″改變的″指缺失一種或多種碳水化合物部分，和/或?qū)⒁环N或多種糖基化位點(diǎn)添加到原始蛋白質(zhì)中。
蛋白質(zhì)的糖基化一般是N-連接的或O-連接的。N-連接是指碳水化合物部分附著到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是碳水化合物部分酶促地附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中任何一個(gè)的存在產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種糖附著于羥基氨基酸，最通常為絲氨酸或蘇氨酸，不過也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
向包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)加入糖基化位點(diǎn)是通過改變氨基酸序列以使得其包含一種或多種上述的三肽序列(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))而方便地實(shí)現(xiàn)的。該變化也可通過向原始蛋白質(zhì)的序列加入或置換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))而產(chǎn)生。為了方便，蛋白質(zhì)氨基酸序列可通過在DNA水平上的變化而改變。
另一種在蛋白質(zhì)上增加碳水化合物部分的數(shù)量的方式是通過將糖苷化學(xué)偶聯(lián)或酶促偶聯(lián)于蛋白質(zhì)的氨基酸殘基。這些方法由于它們不需要在具有用于N-或O-連接糖基化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生GDF肽的抑制劑因而是有利的。根據(jù)所使用的偶聯(lián)方式，糖可附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)自由羧基，(c)例如半胱氨酸的自由巰基，(d)例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的自由羥基，(e)例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法在WO 87/05330和Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22259-306中有描述。
除去包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)上存在的任何碳水化合物部分可通過化學(xué)或酶促方式完成?；瘜W(xué)的去糖基化需要將蛋白質(zhì)暴露于三氟甲磺酸或等同的化合物。這種處理導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部的糖被切除，同時(shí)剩下完整的氨基酸序列。
化學(xué)的去糖基化由Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.，25952；和Edge等人(1981)Anal.Biochem.，118131描述。GDF肽的抑制劑上碳水化合物部分的酶促切割可通過利用如Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.，138350描述的多種內(nèi)切和外切糖苷酶獲得。
包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可與蛋白質(zhì)清蛋白或清蛋白的衍生物相連。將蛋白質(zhì)和多肽連接到清蛋白或清蛋白衍生物的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，美國專利號5,116,944。
藥物組合物本發(fā)明提供包含包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的組合物。這種組合物可適合于藥物用途和對患者給藥。該組合物一般包含包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的一種或多種蛋白質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑。如在此所使用的，短語¨藥物學(xué)上可接受的賦形劑¨包括與藥物給藥相適應(yīng)的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。用于藥物學(xué)上活性物質(zhì)的這種介質(zhì)和試劑的用途在本領(lǐng)域中是公知的。該組合物也可包含提供補(bǔ)充、附加或增加治療功能的其他活性化合物。該藥物組合物還可與給藥說明書一起被包括在容器、包裝或分液器中。
配制本發(fā)明的藥物組合物以與其預(yù)定的給藥途徑相適應(yīng)。完成給藥的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公知的。給藥可以是例如，靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的或皮下的給藥。
用于皮下應(yīng)用的溶液或懸液一般包括一種或多種下列成分無菌的稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖液，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)滲度的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。這種制劑可裝入安瓿瓶、一次性的注射器或由玻璃或塑料制成的多次劑量小瓶中。
適合注射的藥物組合物包括無菌的水溶液或分散液和用于臨時(shí)配制無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌的水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。在所有情況中，該組合物必須是無菌的并且應(yīng)該是達(dá)到能夠輕易注射程度的液體。它必須在制造和貯存的條件下是穩(wěn)定的，并且必須在抗微生物，例如抗細(xì)菌和真菌的污染作用下保存。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可通過利用例如卵磷脂的包被，在分散液的情況下通過保持所需顆粒的大小并且通過使用表面活性劑而保持。防止微生物的作用可通過多種抗細(xì)菌和抗真菌劑獲得，例如對羥基苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。多數(shù)情況下，可在該組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在該組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠而實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)用可保護(hù)該化合物不被機(jī)體快速消除的載體制備，這樣的載體例如為控釋制劑，包括植入物和微膠囊密封的遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯基酯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這種制劑的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。該物質(zhì)還可從Alza有限公司和Nova藥物公司從商業(yè)上獲得。包含包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體懸液也可以用作藥物學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的例如，如美國專利號4,522,811所描述的方法制備。
治療有用的試劑，例如生長因子(例如，BMPs、TGF-β、FGF、IGF)、細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素和CDFs)、抗生素，和對所治療的狀況有效的任何其他治療劑可任選地被包括在內(nèi)，或與包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)同時(shí)或相繼給藥。
特別有利的是以便于給藥和劑量一致性的劑量單位的形式配制組合物。如在此所使用的劑量單位形式是指對于治療的受試者適合作為單一劑量的物理上非連續(xù)的單位；每種單位包含經(jīng)計(jì)算的預(yù)先確定量的活性化合物以與所要求的藥物載體產(chǎn)生相應(yīng)的所需的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格直接取決于活性化合物的獨(dú)特特性和所獲得的特定治療效果，以及在化合物領(lǐng)域中這種活性化合物對于個(gè)體治療所固有的局限性并受其支配。
治療適應(yīng)癥包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對預(yù)防、診斷、或治療多種人或動(dòng)物的醫(yī)學(xué)病癥有用。因此，本發(fā)明提供用于通過對受試者施用足夠改善疾病癥狀的數(shù)量的，包括至少一個(gè)包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的組合物治療與肌細(xì)胞及組織相關(guān)的疾病以及病癥的方法。這類病癥包括肌營養(yǎng)不良，包括但不限于嚴(yán)重的或良性的X-連鎖的肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、面肩胛肱骨營養(yǎng)不良、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端肌營養(yǎng)不良、進(jìn)行性營養(yǎng)不良的眼肌麻痹、眼咽肌營養(yǎng)不良，杜興肌營養(yǎng)不良和Fakuyama型先天性肌營養(yǎng)不良)；肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)；肌內(nèi)萎縮；器官萎縮；脆性；腕管綜合征；充血梗阻性肺病；先天性肌病；先天性肌強(qiáng)直；家族性周期性麻痹；突發(fā)性肌紅蛋白尿；重癥肌無力；伊-朗綜合征；繼發(fā)性肌無力；去神經(jīng)支配萎縮；突發(fā)性肌肉萎縮；以及肌肉貧乏癥、惡病質(zhì)和其他肌肉消耗綜合征。
本發(fā)明還涉及肌肉組織的外傷性或慢性損傷。
除了提供用于肌肉疾病和病癥的治療外，本發(fā)明也提供用于預(yù)防或治療代謝疾病或由異常的葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生的病癥的方法。這種疾病或病癥包括代謝疾病和病癥(例如胰島素依賴性(1型)糖尿病、非胰島素依賴型(2型)糖尿病)、高血糖、減損的葡萄糖耐量、新陳代謝綜合征(例如，綜合征X)，和由外傷(如燒傷或氮失衡)誘導(dǎo)的胰島素抗性，脂肪組織紊亂(例如，肥胖癥)；或骨退化疾病(例如骨質(zhì)疏松癥，特別是老年人和/或絕經(jīng)后婦女中的骨質(zhì)疏松癥；糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥；骨量減少；骨關(guān)節(jié)炎；和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的骨折)。更進(jìn)一步的實(shí)例包括由于慢性糖皮質(zhì)激素治療、早發(fā)性生殖腺障礙、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、營養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食造成的低骨質(zhì)量。
正常的葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要胰腺的β-細(xì)胞應(yīng)答血液中葡萄糖水平的微小變化從而精細(xì)調(diào)節(jié)胰島素分泌的協(xié)調(diào)結(jié)合。胰島素的一個(gè)基本作用是刺激從血液中攝取葡萄糖到組織，特別是到肌肉和脂肪組織中。
因此，本發(fā)明提供通過對受試者施用足夠改善癥狀的數(shù)量的，包括至少一種包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的組合物來治療糖尿病和相關(guān)病癥，例如肥胖癥或高血糖的方法。2型或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)，特別地，其特征為三個(gè)(1)在外周組織，特別是骨骼肌和脂肪細(xì)胞中阻抗胰島素作用于葡萄糖攝取，(2)減弱胰島素抑制肝產(chǎn)生葡萄糖的作用，和(3)異常調(diào)節(jié)胰島素分泌(DeFronzo(1997)Diabetes Rev.5177-269)。因此，患有2型糖尿病的受試者可根據(jù)本發(fā)明通過施用包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)而治療，該蛋白質(zhì)增加對胰島素的靈敏度和細(xì)胞對葡萄糖的攝取。
類似地，以胰島素機(jī)能障礙(例如，阻抗、失活或缺乏)和/或轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的葡萄糖不足為特征的其他疾病和代謝病癥也可根據(jù)本發(fā)明通過施用包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)而治療，該蛋白質(zhì)增加對胰島素的靈敏度和細(xì)胞對葡萄糖的攝取。
使用蛋白質(zhì)治療的方法相對于不被相同蛋白質(zhì)結(jié)合的GDF-8蛋白質(zhì)，可使用包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)來抑制或減少與GDF-8蛋白質(zhì)(無論是單體形式、二聚體的活性形式，或GDF-8潛在復(fù)合物的復(fù)合形式)相關(guān)的一種或多種活性。在實(shí)施方案中，當(dāng)與包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，成熟的GDF-8蛋白質(zhì)相對于不與具有促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合的成熟GDF-8蛋白質(zhì)，其活性被抑制至少50％，或至少60，62，64，66，68，70，72，72，76，78，80，82，84，86，或88％，或至少90，91，92，93，或94％，或至少95％至100％。
包括包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的藥物制劑以治療的有效量給藥。如在此所使用的，″有效量″的蛋白質(zhì)是足夠減少GDF-8的活性以獲得所需的生物學(xué)結(jié)果的劑量。所需的生物學(xué)結(jié)果可以是任何的治療效益，包括增加肌肉質(zhì)量、增加肌力、改善代謝、減少肥胖或改善葡萄糖的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這種改善可通過多種方法測量，包括測量瘦體重和胖體重(例如雙X-射線掃描分析)、肌力、血清脂類、血清瘦素(1eptin)、血清葡萄糖、糖化的血紅蛋白、葡萄糖耐量和改善糖尿病的繼發(fā)性并發(fā)癥的方法。
一般，治療的有效量可隨受試者的年齡、狀況和性別以及受試者的醫(yī)學(xué)病癥的嚴(yán)重程度而變化。劑量可由醫(yī)生確定并根據(jù)需要調(diào)整以適合治療觀察的效果。施用包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)的適當(dāng)劑量可以是在5mg-100mg，15mg-85mg，30mg-70mg，或40mg-60mg的范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)可以一個(gè)劑量給藥，或以例如每日一次、每周一次以及每月一次的間隔給藥。劑量時(shí)間表可根據(jù)蛋白質(zhì)對GDF-8的親合力、蛋白質(zhì)的半衰期或患者病癥的嚴(yán)重度調(diào)整。一般，組合物以大丸劑的劑量給藥，以使包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在給藥后在最長的時(shí)間內(nèi)的循環(huán)水平最大化。持續(xù)的灌輸也可在大丸劑劑量后使用。
這種化合物的毒性和治療效果可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)制藥規(guī)程確定，例如，確定LD50(50％群體的致死劑量)和ED50(50％群體的治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是療效指數(shù)并且它可以表示為比率LD50/ED50?？墒褂蔑@示大的療效指數(shù)的包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
可使用通過對細(xì)胞培養(yǎng)物的分析和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)來評估用于人類的劑量范圍。這種化合物的劑量可在包括ED50而毒性較少或無毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可依賴于所使用的劑型和所使用的給藥途徑而在該范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明中使用的任何包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，治療有效劑量可從細(xì)胞培養(yǎng)分析開始估計(jì)。劑量可在動(dòng)物模型中制定以獲得如在細(xì)胞培養(yǎng)物中所確定的，包括IC50(即，達(dá)到癥狀的最大抑制的一半時(shí)測試蛋白質(zhì)的濃度)的循環(huán)血漿的濃度范圍。血漿中的水平可通過例如高效液相層析測量。任何特定劑量的效果可通過合適的生物測定監(jiān)測。合適的生物測定的實(shí)例包括GDF-8蛋白/受體結(jié)合分析、肌酸激酶分析、基于脂肪細(xì)胞中葡萄糖攝取的分析和免疫學(xué)分析。
DNA給藥的方法本發(fā)明也提供在體內(nèi)產(chǎn)生包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的基因治療。這種治療可通過將多核苷酸序列導(dǎo)入患有在此所列出的病癥的細(xì)胞或組織而取得其治療效果。
遞送包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可使用例如嵌合病毒的重組表達(dá)載體或膠態(tài)分散系統(tǒng)獲得?？墒褂媚繕?biāo)脂質(zhì)體進(jìn)行多核苷酸序列的治療性遞送?？捎糜诨蛑委煹亩喾N病毒載體包括腺病毒(adenovirus)、皰疹病毒(herpes virus)、牛痘(vaccinia)或例如反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)的RNA病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是鼠或鳥類反轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。其中可插入單個(gè)外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例包括，但不限于莫洛尼鼠類白血病毒(Moloney murine leukemiavirus)(MoMuLV)、Harvey鼠類肉瘤病毒(Harrey murine sarcoma virus)(HaMuSV)、鼠類乳癌病毒(murinemammary tumor virus)(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)(RSV)。許多附加的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可整合入多基因中。所有這些載體可傳遞或整合選擇標(biāo)記的基因以使得轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可被鑒定并產(chǎn)生。例如通過將令人感興趣的GDF前肽多核苷酸序列與另一個(gè)編碼特異的靶細(xì)胞上受體的配體的基因一起插入到病毒載體中，則該載體現(xiàn)在就是靶特異性的。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過附著例如糖、糖脂、或蛋白質(zhì)而產(chǎn)生靶特異性。靶向可通過使用抗體而實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到可將特異性的多核苷酸序列插入反轉(zhuǎn)錄病毒基因組或附著于病毒包膜以使得包含包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的多核苷酸的反轉(zhuǎn)錄病毒載體靶能夠特異地遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體靶向肌細(xì)胞或肌肉組織。
由于重組反轉(zhuǎn)錄病毒是有缺陷的，它們需要包含編碼所有在LTR中調(diào)節(jié)序列的調(diào)控下的反向病毒結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒的輔助細(xì)胞系。這些質(zhì)粒丟失了啟動(dòng)識別用于衣殼化作用的RNA轉(zhuǎn)錄物的包裝機(jī)制的核苷酸序列。缺失包裝信號的輔助細(xì)胞系包括但不限于，例如PSI.2、PA317和PA12。這些細(xì)胞系因?yàn)闆]有包裝基因組而產(chǎn)生空的病毒體。如果將反轉(zhuǎn)錄病毒載體引入這種其中包裝信號是完整的，但是結(jié)構(gòu)基因被其他令人感興趣的基因替代的細(xì)胞，該載體可被包裝并且產(chǎn)生載體病毒體。
備選地，其他組織培養(yǎng)細(xì)胞可通過常規(guī)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染用編碼反向病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol ar env的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染。隨后用包含令人感興趣的基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。所得到的細(xì)胞釋放反轉(zhuǎn)錄病毒載體到培養(yǎng)基中。
另一個(gè)包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的多核苷酸的定向遞送系統(tǒng)是膠態(tài)分散系統(tǒng)。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括高分子復(fù)合物、納膠囊、微球體、珠和基于脂類的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合的膠束和脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是體外和體內(nèi)作為有用的遞送載體的人工膜小泡?？蓪NA、DNA和完整的病毒體包封在水分散體的內(nèi)部并且以生物活性形式遞送到細(xì)胞(參見，例如，F(xiàn)raley等人(1981)TrendsBiochem.Sci.，677)。使用脂質(zhì)體載體的有效基因轉(zhuǎn)移的方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，Mannino等人(1988)Biotechniques，6682)。脂質(zhì)體的組合物通常是磷脂的組合，一般與類固醇，特別是膽固醇組合。也可使用其他磷脂或其他脂類。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)取決于pH、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽離子的存在。
在脂質(zhì)體生產(chǎn)中有用的脂類的實(shí)例包括磷脂?；衔?，例如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂類、腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂。示例性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體的定向也可基于例如，器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性并且是本領(lǐng)域已知的。
有多種方法可用于遞送表達(dá)包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的細(xì)胞至一個(gè)位點(diǎn)以用于調(diào)節(jié)GDF-8應(yīng)答。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)促濾泡素抑制素蛋白質(zhì)的細(xì)胞可通過直接的應(yīng)用例如，將這種細(xì)胞的樣品直接注射到組織損傷的位點(diǎn)而遞送。這些細(xì)胞可被純化。這種細(xì)胞可在部分阻礙其流動(dòng)性的介質(zhì)或基質(zhì)中遞送以使得其將細(xì)胞定位至創(chuàng)傷的位點(diǎn)。這種介質(zhì)或基質(zhì)可以是半固體的，例如糊劑或凝膠，包括膠狀的聚合物。備選地，該介質(zhì)或基質(zhì)可以是固體的形式，使得細(xì)胞能夠遷移入固體基質(zhì)，并且將它們保持在其中同時(shí)使得細(xì)胞能夠增殖的多孔質(zhì)固體。
檢測和分離GDF-8的方法可使用包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在體內(nèi)或體外檢測GDF-8的存在或水平。通過使這些蛋白質(zhì)的存在或水平與醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)聯(lián)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可診斷相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在此闡明了可通過包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)診斷的醫(yī)學(xué)狀況。
這種檢測方法是本領(lǐng)域公知的并且包括ELISA、放射免疫測定、免疫印跡、western印跡、免疫熒光、免疫沉淀和其他可比較的技術(shù)。包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步存在于結(jié)合了一種或多種檢測GDF-8的技術(shù)的診斷試劑盒中。這種試劑盒可包含其他成分、包裝、用法說明或幫助檢測蛋白質(zhì)和使用該試劑盒的其他物質(zhì)。
當(dāng)試圖將包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)用于診斷目的時(shí)，可按照需要，例如用配體基團(tuán)(例如生物素)或可檢測的標(biāo)記基團(tuán)(例如熒光基團(tuán)、放射性同位素或酶)修飾它們。如果需要，可使用常規(guī)技術(shù)標(biāo)記蛋白質(zhì)。合適的標(biāo)記包括熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性原子、電子密集試劑、酶和具有特異性結(jié)合伴侶的配體。酶一般通過它們的活性檢測。例如，辣根過氧化物酶一般通過其將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色色素的能力來檢測，可用分光光度計(jì)計(jì)量而檢測。其他合適的結(jié)合伴侶包括生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素、IgG和A蛋白，以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。其他的變換和可能性對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)被認(rèn)為是等同的。
包括至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)或其片段也可用于在純化過程中分離GDF-8。在一類方法中，蛋白質(zhì)可以例如通過摻入柱或樹脂而固定。使用該蛋白質(zhì)結(jié)合GDF-8，并隨后施用于導(dǎo)致該結(jié)合的GDF-8釋放的狀況?？墒褂眠@種方法商業(yè)性生產(chǎn)GDF-8。
下列實(shí)施例提供本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到可進(jìn)行許多修飾和變異而不改變本發(fā)明的精神或范圍。這種修飾和變異被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。可以理解，說明書和權(quán)利要求中所有經(jīng)術(shù)語大約修飾的數(shù)量，例如作為劑量中的微小變化，被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。
實(shí)施例實(shí)施例1JA16-結(jié)合珠的純化N-羥基琥珀酰亞胺基活化的珠(4％瓊脂糖珠，Sigma H-8635，St Louis MO)在MilliQ-H2O中洗滌，并且于4℃與抗GDF-8的JA16單克隆抗體(100mM的MOPS中3-4μg/μl，pH 7.5)以10mg JA16/ml的樹脂終濃度的比率溫育4小時(shí)。將珠用100mM pH 7.5的MOPS和磷酸緩沖鹽水(PBS)充分洗滌(Ausubel等人，(1999)Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley和Sons)并且于4℃儲(chǔ)存在PBS中直到使用。以相同的方式制備對照珠只是不含JA16抗體。
實(shí)施例2親和純化總共40μl包裝的與JA16-結(jié)合的珠或?qū)φ盏闹榕c15ml正常的Balb/C小鼠血清(Golden West Biologicals，Temecula CA)或30ml收集的正常人血清(ICN Biomedical，Aurora OH)于4℃溫育3小時(shí)。將珠在～10ml冷的1％Triton X-100/PBS中洗滌兩次，在～10ml冷的0.1％Triton X-100/PBS中洗滌兩次，以及在～1ml冷的PBS中洗滌兩次。將蛋白質(zhì)分3個(gè)后續(xù)步驟從珠中洗提出來。首先，珠受到‘模擬洗提’處理，其中將100μl PBS加入珠中并且在4℃溫育30分鐘。收集上清液并且與30μl 4×LDS樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad CA)相結(jié)合。第二，珠受到‘肽洗提’，將100μl PBS中的1μg/μl競爭肽(序列DFGLDSDEHSTESRSSRYPLTVDFEAFGWD-COOH(SEQ IDNO12)加入珠中并且再于4℃溫育30分鐘。如上所述收集上清液。第三，將珠用‘SDS洗提’技術(shù)處理，其中將30μl的4×LDS緩沖液(Invitrogen)和100μl的PBS加入珠中并在轉(zhuǎn)移上清液到新的試管前于80℃加熱10分鐘。
將每個(gè)洗提步驟中釋放的蛋白質(zhì)的銀染凝膠顯示在圖1中。圖1中顯示的銀染凝膠中大約為12和36kDa的2個(gè)蛋白質(zhì)條帶是從與JA16-結(jié)合的珠中特異性地洗提出來的，而不是從非結(jié)合的對照珠中洗提出來的。
實(shí)施例3質(zhì)譜法將樣品用NuPage 10×還原劑(Invitrogen)于80℃還原10分鐘并且用110μM的碘乙酰胺于22℃在黑暗中烷基化30分鐘。立即在10％的NuPage Bis-Tris凝膠上根據(jù)制造商的推薦(Invitrogen)將樣品于MES緩沖系統(tǒng)中電泳并且使用無戊二醛的系統(tǒng)銀染(Shevchenko等人，(1996)Anal.Chem.，68850-858)。切下條帶并且在Abimed DigestPro(Langenfeld，德國)或ProGest Investigator(Genomics Solutions，Ann Arbor MI)中用測序級改良的胰蛋白酶(Promega，Madison WI)消化。通過蒸發(fā)減小消化樣品的體積并且用1％的乙酸補(bǔ)充到～20μl的終體積。將樣品(5-10μl)加載到包裝在Picofrit針(New Objectives，Woburn MA)中的10cm×75μm內(nèi)徑的C18反相柱上。使用LCQ Deca或LCQ Deca XP(Finnigan，San Jose CA)質(zhì)譜儀收集MS/MS數(shù)據(jù)并且使用Sequest程序(Finnigan)對NCBI的非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。除非另有說明，在本文中列出的所有肽序列相應(yīng)于通過手工檢驗(yàn)被認(rèn)為是高質(zhì)量的MS/MS譜，并且在Sequest記分系統(tǒng)中產(chǎn)生Xcorr記分＞2.5。
實(shí)施例4Western印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45μm的硝化纖維素膜(Invitrogen)上并且用封閉緩沖液(Tris-緩沖鹽水(TBS10mM Tris-Cl，pH 7.5，150mMNaCl)中的5％脫脂奶粉)于4℃封閉過夜。然后在封閉緩沖液中用1∶1000稀釋的第一抗體在室溫下探測印跡1-3小時(shí)，用5×TBS洗滌，在封閉緩沖液中用辣根過氧化物酶結(jié)合的第二抗體在室溫下探測1-3小時(shí)，并且如上述洗滌。通過使用West Pico Substrate(Pierce)放射自顯影檢測信號。
實(shí)施例5GDF-8的分離使用上述實(shí)施例所描述方法的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致GDF-8的分離。因?yàn)檫€原形式的GDF-8是12kDa，我們推測圖1中顯示的銀染凝膠上的較低條帶的蛋白質(zhì)是成熟的GDF-8。為了證實(shí)該假設(shè)，我們切下該條帶，用胰蛋白酶消化，并且通過LC-MS/MS獲得所得到肽的MS/MS譜。對應(yīng)于6個(gè)胰蛋白酶肽的MS/MS譜證實(shí)成熟的GDF-8從凝膠的這個(gè)區(qū)域中分離，正如圖2A和表1所顯示的。
表1列出了在來源于小鼠和人血清的JA16免疫沉淀中發(fā)現(xiàn)的GDF-8(SEQ ID NO13-20)、GDF-8前肽(SEQ ID NO21-27)、FLRG(SEQ ID NO28-30)，和GASP1(SEQ ID NO31-35)的肽。在蛋白質(zhì)序列中恰好在每種肽前面的氨基酸顯示在括號中，并且列出了肽的電荷狀態(tài)(z)和Sequest程序的相關(guān)系數(shù)(Xcorr，置信度量度)。表中的序列表號碼只是指分離的肽和它們的序列。在括號中的所述的前面的氨基酸不包括在肽內(nèi)，只是提供參考。所有的譜都經(jīng)過手工檢驗(yàn)確認(rèn)。
有趣地是，western印跡也包含相當(dāng)于未加工的全長GDF-8(43kDa)的條帶，這意味著該分子的一些部分未受到蛋白水解加工而分泌到血清中(圖2B)。通過質(zhì)譜法證實(shí)了未加工的GDF-8的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，親和純化方法能有效地從正常小鼠血清中分離GDF-8。
盡管JA16抗體識別GDF-8和高度相關(guān)的蛋白質(zhì)BMP/GDF-11，但我們通過質(zhì)譜法注意到在我們的親和純化樣品中不存在BMP-11肽。
表1在JA16免疫沉淀中鑒定的肽
M*＝氧化的甲硫氨酸
實(shí)施例6與GDF-8結(jié)合的蛋白質(zhì)的分離一旦證實(shí)親和純化技術(shù)可從正常小鼠血清成功分離GDF-8，我們在自然條件下對結(jié)合GDF-8的蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。圖1中顯示的銀染凝膠上的36kDa條帶如上所述進(jìn)行分析。質(zhì)譜法鑒定在特異于JA16免疫純化樣品的凝膠的該區(qū)域中的2種蛋白質(zhì)。這些確定是GDF-8前肽和促濾泡素抑制素樣相關(guān)基因(FLRG)。從這些蛋白質(zhì)的每一個(gè)鑒定的肽顯示在表1中(SEQ ID NO13-27)。從GDF-8前肽中發(fā)現(xiàn)的6個(gè)獨(dú)特肽的高質(zhì)量的MS/MS譜、從FLRG中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)獨(dú)特的肽、代表性的肽顯示在圖3A和3C中。此外，這兩種蛋白質(zhì)的存在通過利用分別特異于GDF-8前肽和FLRG的多克隆抗體的western印跡得到證實(shí)(圖3B和3D)。因此，循環(huán)的GDF-8看來似乎在體內(nèi)結(jié)合GDF-8前肽和FLRG。
實(shí)施例7與GDF-8結(jié)合的新蛋白質(zhì)的分離為了表征體內(nèi)循環(huán)的GDF-8復(fù)合物的主要成分，從野生型小鼠血清中通過用與瓊脂糖結(jié)合的抗GDF-8單克隆抗體JA16親和純化分離天然的GDF-8及其締合蛋白質(zhì)。結(jié)合JA16的蛋白質(zhì)隨后受到單獨(dú)的PBS緩沖液(模擬洗提)、與GDF-8競爭結(jié)合JA16的肽以及SDS去污劑的洗提步驟。濃縮這些樣品，在一維的SDS-PAGE凝膠上電泳，并且通過銀染顯象(圖4)。JA16純化的樣品獨(dú)有的2個(gè)條帶是可見的--12kDa的條帶被鑒定為GDF-8，而36kDa的條帶包含GDF-8前肽和FLRG。
為了確定是否可以在體內(nèi)鑒定結(jié)合GDF-8的其他蛋白質(zhì)，我們將純化擴(kuò)大了大約5倍并且使用質(zhì)譜法搜索存在于JA16免疫復(fù)合物中，但不存在于陰性對照中的蛋白質(zhì)。為了達(dá)到這個(gè)目的，我們切下銀染凝膠上相應(yīng)于分子量為10-200kDa的區(qū)域成為13個(gè)凝膠切片，如圖4所示。這些切片的每一個(gè)都經(jīng)受凝膠中胰蛋白酶的消化并進(jìn)行LC-MS/MS。將所得的MS/MS譜與已知蛋白質(zhì)的非冗余NCBI數(shù)據(jù)庫比較，未顯示任何特異于JA16免疫沉淀的另外的蛋白質(zhì)，盡管以前所描述的蛋白質(zhì)(成熟的GDF-8、GDF-8前肽、未加工的GDF-8和FLRG)都在這些樣品中鑒定出來(圖4)。在JA16免疫復(fù)合物和陰性對照樣品中都出現(xiàn)的背景蛋白質(zhì)包括大量的血清蛋白，例如清蛋白、免疫球蛋白和補(bǔ)體蛋白質(zhì)。沒有證據(jù)顯示在JA16樣品中存在其他TGF-β超家族的成員，包括高度相關(guān)的蛋白質(zhì)BMP--11/GDF-11。因此，在這些實(shí)驗(yàn)中JA16抗體特異地純化GDF-8。
有趣地是，我們發(fā)現(xiàn)在我們的GDF-8免疫復(fù)合物中不存在促濾泡素抑制素，盡管JA16能夠在體外免疫沉淀GDF-8/促濾泡素抑制素復(fù)合物(數(shù)據(jù)未顯示)。已經(jīng)顯示促濾泡素抑制素通過拮抗GDF-8與ActRIIB受體的締合而抑制GDF-8活性(Lee和McPherron(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，989306-9311)。我們的結(jié)果表明促濾泡素抑制素在正常情況下的循環(huán)GDF-8復(fù)合物的活性調(diào)節(jié)中不發(fā)揮主要作用。
既然通過MS/MS方法鑒定蛋白質(zhì)依賴于所搜索的數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容量，我們進(jìn)一步通過將收集自13個(gè)樣品的MS/MS譜與來自Celera小鼠基因組序列的預(yù)測的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較來分析來自圖4的數(shù)據(jù)。這些分析鑒定特異于JA16-純化樣品的附加蛋白質(zhì)，并因此被稱為GDF-締合的血清蛋白1(GASP1)。由于這些蛋白質(zhì)的初始鑒定，這些序列已經(jīng)通過公共基因組測序工作以登錄號gi|20914039加到NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中。
根據(jù)高質(zhì)量MS/MS譜(表1(SEQ ID NO31-35)；圖5A和B)將相應(yīng)于GASP1序列的5個(gè)肽鑒定出來。在條帶3中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于GASP1肽的譜，其中包含70-80kDa的蛋白質(zhì)。然而，相應(yīng)于該蛋白質(zhì)的特異條帶是不可見的，大概由于在該區(qū)域有大量的背景免疫球蛋白和清蛋白(參見圖4)。高于2.3的Sequest Xcorr記分一般認(rèn)為對于2+離子是顯著的。偶然地，我們實(shí)驗(yàn)中鑒定的一個(gè)肽(序列＝ECETDQECETYEK(SEQ ID NO31))跨越了編碼該蛋白質(zhì)的2個(gè)外顯子之間的接合處，在這種情況下證實(shí)了Celera基因預(yù)測算法的準(zhǔn)確度。
在GASP1的實(shí)際克隆前對GASP1轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行預(yù)測(圖6)。預(yù)測GASP1是571個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)計(jì)的分子量為63kDa。它在其N-末端具有推定的信號序列/切割位點(diǎn)并且在氨基酸314和514處有2個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)。通過Pfam和BLAST(根據(jù)Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.，215403-410；Bateman等人(2002)Nucleic Acids Res.，30276-280)對GASP1蛋白質(zhì)序列的分析顯示，GASP1包含許多保守的結(jié)構(gòu)域，包括WAP結(jié)構(gòu)域、促濾泡素抑制素/Kazal結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、2個(gè)串聯(lián)的Kunitz結(jié)構(gòu)域和netrin結(jié)構(gòu)域(圖14A)。最初在乳清酸性蛋白中鑒定的WAP結(jié)構(gòu)域包含形成4個(gè)二硫鍵核心的8個(gè)半胱氨酸，并且經(jīng)常出現(xiàn)在具有抗蛋白酶活性的蛋白質(zhì)中(Hennighausen和Sippel(1982)NucleicAcids Res.，102677-2684；Seemuller等人(1986)FEBS Lett.，19943-48)。相信促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)GDF-8和GASP1之間的相互作用。促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的C-末端包含與Kazal絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的相似性。就GASP1來說，該區(qū)域是比在促濾泡素抑制素或FLRG中與Kazal結(jié)構(gòu)域更加緊密相關(guān)的，提示該區(qū)域可能具有附加的蛋白酶抑制劑的功能。最初在牛胰腺胰蛋白酶抑制劑中鑒定的Kunitz結(jié)構(gòu)域，也抑制絲氨酸蛋白酶，因此確定GASP1可能在這類蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。此外，netrin結(jié)構(gòu)域已涉及金屬蛋白酶的抑制(Banyai和Patthy，1999；Mott等人，2000)。因此，根據(jù)這些保守區(qū)域的存在，GASP1可能抑制蛋白酶的活性，或許調(diào)節(jié)GDF-8的加工或潛在的GDF-8復(fù)合物的活化。
針對小鼠Celera轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索顯示與GASP1具有＞50％同一性的蛋白質(zhì)，在此稱為GASP2。GASP2包含與GASP1相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，表明這些蛋白質(zhì)定義多價(jià)蛋白酶抑制劑的2個(gè)成員的家族(圖14B)。有趣地是，在我們的JA16純化樣品中只發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于GASP1而不是GASP2的肽。該結(jié)果表明GASP1和GASP2可能具有不同的生物學(xué)特異性。GASP1和GASP2在人類中都是保守的(與小鼠有＞90％的同一性)。人類GASP1的序列現(xiàn)在在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫的登錄號gi|18652308下是可得到的。雖然GDF-8在人類血清中的濃度與在小鼠血清中所發(fā)現(xiàn)的相比是相當(dāng)?shù)偷?Hill等人(2002)J.Biol.Chem.，27740735-40741)，但蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的靈敏度使得我們能夠鑒定相應(yīng)于來自人類血清JA16免疫沉淀的人GASP1的同系物的3種肽(表1)。在相應(yīng)的陰性對照中未發(fā)現(xiàn)這些肽。此外，在這些實(shí)驗(yàn)中也沒有存在人類GASP2的證明。因此，GASP1和GDF-8之間的相互作用在小鼠和人之間是保守的。
GDF-8幾乎專門在骨骼肌中產(chǎn)生。為了確定GASP1 mRNA的組織分布，從由多種小鼠組織和分階段的胚胎中產(chǎn)生的第一鏈cDNA擴(kuò)增GASP1的551bp片段(圖10)。從標(biāo)準(zhǔn)化的小鼠第一鏈cDNA組(Clontech，Palo Alto CA)利用Advantage cDNA PCR試劑盒(Clontech)根據(jù)制造商的推薦對小鼠GASP1片段擴(kuò)增(正向引物5′TTGGCCACTGCCACCACAATCTCAACCACTT 3′(SEQ IDNO46)；反向引物5′TCTCAGCATGGCCATGCCGCCGTCGA 3′(SEQ ID NO47))。GASP1看來得到了相當(dāng)廣泛地表達(dá)，在骨骼肌和心臟中得到了特別高的表達(dá)。也在腦、肺和睪丸中見到顯著的表達(dá)。相反，肝和腎相對低水平地表達(dá)GASP1 mRNA。在發(fā)育中，GASP1mRNA的水平保持相當(dāng)恒定，或許在小鼠胚胎發(fā)育的第7天和第11天之間有輕微的增加。
實(shí)施例8人類和小鼠血清中的GDF-8在人類血清中GDF-8的濃度比起在小鼠血清中發(fā)現(xiàn)的濃度是相當(dāng)?shù)偷?。既然GDF-8具有作為治療目標(biāo)的潛能，所以目標(biāo)是確定人類中循環(huán)的GDF-8復(fù)合物的組成。這種知識將決定小鼠模型的有效性和有可能鑒定備選的治療目標(biāo)。因此，基于JA16的GDF-8的親和純化利用人類血清重復(fù)進(jìn)行。由于與小鼠相比，人類血清中的GDF-8水平較低，沒有見到相應(yīng)于成熟GDF-8和GDF-8前肽/FLRG的條帶(圖11A)。然而，使用識別GDF-8成熟區(qū)域的多克隆抗體的western印跡顯示，在JA16-純化的樣品中存在成熟的和未加工的GDF-8(圖11B)。
我們利用質(zhì)譜法的高靈敏度鑒定與成熟的GDF8共同純化的蛋白質(zhì)。將相應(yīng)于從陰性對照和JA16結(jié)合珠的樣品洗提的肽的泳道切割成16個(gè)片段。這些凝膠切片受到凝膠中胰蛋白酶的消化，進(jìn)行納流LC-MS/MS以及如前所述用Sequest分析。
有趣地是，只在JA16樣品而非陰性對照中特異性地鑒定的唯一蛋白質(zhì)是成熟的GDF-8、GDF-前肽、人FLRG和人的GASP1同系物。從這些蛋白質(zhì)的每一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的肽列在表1中(SEQ ID NO36-45)并且其代表性的MS/MS譜顯示在圖12中。因此看來活體內(nèi)的GDF-8復(fù)合物在小鼠和人之間是保守的。
實(shí)施例9小鼠GASP1的克隆和表征在鑒定預(yù)測的GASP1序列后，目標(biāo)是確定小鼠GASP1的實(shí)際序列。根據(jù)Celera預(yù)測的序列，從小鼠心臟的QUICKCLONE cDNA(Clontech)通過使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene)PCR對GASP1編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增，其中使用下列引物(fp5′CACCATGTGTGCCCCAGGGTATCATCGGTTCTGG3，(SEQ IDNO50)；rp5′TTGCAAGCCCAGGAAGTCCTTGAGGAC3′(SEQID NO51))。該反應(yīng)的PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，走成由大約1700個(gè)堿基對組成的單個(gè)主要條帶。隨后根據(jù)制造商的推薦將擴(kuò)增的DNA克隆到pcDNA3.1D/V5-His-TOPO載體(Invitrogen)的TOPO位點(diǎn)使其包含框內(nèi)的C-末端V5-His標(biāo)記。在兩個(gè)鏈上都進(jìn)行全長的cDNA插入物的測序。小鼠GASP1克隆的核苷酸序列顯示在圖13中。該克隆除在搖擺密碼子的一些不改變預(yù)測的氨基酸序列上發(fā)生堿基置換外(即，288CG；294GA；615GA；738AG；768CT；1407AG；1419AG；以及1584CG，其中在標(biāo)明位置的第一個(gè)堿基是由Celera報(bào)道的，而第二個(gè)堿基是對克隆進(jìn)行測序獲得的；參見圖6A和B)，與預(yù)測的Celera序列相匹配。
為了確定GASP1蛋白質(zhì)的N-末端加工，我們用編碼小鼠GASP1的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞，該GASP1與C-末端V5-His(GASP1-VS-His)標(biāo)記一起克隆。48小時(shí)后收獲無血清的條件培養(yǎng)基并且通過使用抗V5多克隆抗體(Sigma)的western印跡分析進(jìn)行檢測。更具體地說，用GASP1-V5-His/pcDNA3.1D-V5-His-TOPO或空載體，利用FuGENE6試劑(Roche)在無血清的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞48小時(shí)后收集條件培養(yǎng)基。
看到在大約80kDa處電泳的單一條帶，證實(shí)GASP1被分泌到條件培養(yǎng)基中(數(shù)據(jù)未顯示)。讓大約10ml的該條件培養(yǎng)基通過His-親和柱并進(jìn)一步通過反相層析純化。這個(gè)純化方案在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上產(chǎn)生了預(yù)期大小的全長GASP1的條帶。該條帶的Edman測序確定N-末端序列為L-P-P-I-R-Y-S-H-A-G-I(SEQ ID NO52)。因此，GASP1的氨基酸1-29構(gòu)成了在加工和分泌期間被除去的信號序列。
實(shí)施例10重組生產(chǎn)的GASP1與GDF-8前肽和成熟的GDF-8的結(jié)合下一步，確定重組生產(chǎn)的GASP1具有與分離自小鼠血清的GASP1相同的結(jié)合GDF-8的模式。為了免疫沉淀重組的蛋白質(zhì)，將來自載體或GASP1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的400μl條件培養(yǎng)基與1.2μg重組純化的GDF-8和/或GDF-8前肽蛋白質(zhì)混合(Thies等人，2001)。將JA16(10μl包裝體積)或抗V5(30μl)結(jié)合的瓊脂糖珠與補(bǔ)充的條件培養(yǎng)基在4℃溫育2小時(shí)，并且在含1％Triton的冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌兩次，以及在PBS中洗滌兩次。將珠重懸在含DTT的50μl 1×LDS緩沖液中。如前所述進(jìn)行western印跡(Hill等人，2002)。
為了證實(shí)并進(jìn)一步表征GDF-8和GASP1之間的相互作用，我們將純化的重組GDF-8和純化的重組GDF-8前肽與來自用對照載體或GASP1-V5-His轉(zhuǎn)染的COS1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基溫育。隨后我們用JA16-結(jié)合的瓊脂糖珠免疫沉淀GDF-8并且利用western印跡尋找GASP1和GDF-8前肽的共純化物(圖15A)。GASP1(泳道3)和GDF-8前肽(泳道1)與GDF-8的共免疫沉淀，證明GDF-8可與這兩種蛋白質(zhì)相互作用。在JA16免疫沉淀中，當(dāng)缺少GDF-8時(shí)既未檢測到GASP1也未檢測到前肽(泳道4)，消除了這些實(shí)驗(yàn)中非特異結(jié)合的可能性。當(dāng)存在所有3種蛋白質(zhì)時(shí)，GASP1和GDF-8前肽都隨GDF-8被一起洗脫下來，提示有可能這些蛋白質(zhì)可以形成三元復(fù)合物(泳道5)。然而，這個(gè)實(shí)驗(yàn)沒有消除GASP1和前肽與分離的GDF-8分子上的相同表位結(jié)合的可能性。
為了進(jìn)一步證實(shí)GASP1和GDF-8之間的相互作用，我們通過從補(bǔ)充有GDF-8和/或GDF-8前肽的重組蛋白質(zhì)的條件培養(yǎng)基中洗脫GASP1而進(jìn)行反向免疫沉淀。為了達(dá)到這個(gè)目的，我們用與瓊脂糖綴合的靶向GASP1上C-末端V5-His標(biāo)記的V5表位的單克隆抗體。不出所料，GDF-8與GASP1共免疫沉淀(圖15B，泳道3和5)，進(jìn)一步證實(shí)在這些蛋白質(zhì)之間存在直接的相互作用。令人驚訝的是，即使在不存在GDF-8(泳道4)的情況下，GDF-8前肽也與GASP1共同純化，提示GDF-8前肽可直接與GASP1結(jié)合。因此，GASP1獨(dú)立地結(jié)合GDF-8和GDF-8前肽二者。這與FLRG-另一個(gè)專門結(jié)合成熟的GDF-8的促濾泡素抑制素-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)相反(Hill等人(2002)J.Biol.Chem.，27740735-40741)。與當(dāng)單獨(dú)加入前肽時(shí)相比，同時(shí)加入GDF-8和前肽一致顯示較少的前肽與GASP1結(jié)合。這個(gè)觀察提示GASP1也許不與GDF-8的小的潛在復(fù)合物結(jié)合。
實(shí)施例11GASP1-介導(dǎo)的對GDF-8和BMP-11活性的抑制，但不對活化素或TGF-β1的活性產(chǎn)生抑制將熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體，pGL3-(CAGA)12(SEQ ID NO53)(Dennler等人(1998)EMBO J.，173091-3100)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到A204或RD橫紋肌肉瘤細(xì)胞中。將來自載體或GASP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的稀釋物與10ng/ml GDF-8、10ng/ml BMP-11、10ng/ml rh活化素A(R&D Systems)或0.5ng/ml rh TGF-β1(R&D Systems)在37℃溫育30分鐘。熒光素酶活性根據(jù)Thies等人(2001)Growth Factors，18251-259和Zimmers等人(2002)Science，2961486-1488進(jìn)行測量。在這個(gè)分析中，A204細(xì)胞應(yīng)答GDF-8、BMP-11和活化素，但并不很好地應(yīng)答TGF-β1。RD細(xì)胞應(yīng)答GDF-8和TGF-β1。因此，我們使用A204細(xì)胞檢測GASP1抑制GDF-8、BMP-11和活化素的能力，并使用RD細(xì)胞監(jiān)測TGF-β和GDF-8的活性。GDF-8的結(jié)果在A204細(xì)胞中顯示，但與RD細(xì)胞中的相似。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別產(chǎn)生了測量經(jīng)這些生長因子的每一種誘導(dǎo)的熒光素酶活性的濃度依賴性標(biāo)準(zhǔn)曲線(數(shù)據(jù)未顯示)。所使用的生長因子的濃度落在該曲線的線性區(qū)域內(nèi)，使得濃度的微小變化導(dǎo)致熒光素酶活性的可測量變化。
2種促濾泡素抑制素-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，促濾泡素抑制素和FLRG在(CAGA)12(SEQ ID NO53)熒光素酶轉(zhuǎn)錄報(bào)道分析中抑制GDF-8活性，但也抑制相關(guān)蛋白質(zhì)活化素和BMP-11的生物活性。也在(CAGA)12(SEQ ID NO53)報(bào)道分析中測試了GASP1抑制GDF-8、BMP-11、活化素和TGF-β1活性的能力。
將來自用V5-His標(biāo)記的GASP1或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的多種稀釋物與純化的重組GDF-8(10ng/ml)、BMP-11(10ng/ml)、活化素(10ng/ml)或TGF-β1(0.5ng/ml)溫育，并且分析在表達(dá)(CAGA)12(SEQ ID NO53)報(bào)道構(gòu)建體的橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的生長因子活性。GASP1以濃度依賴的方式有效地抑制GDF-8的活性(圖16A)。正如所料，在這個(gè)分析中，GASP1同樣抑制BMP-11的活性(圖16B)，因?yàn)槌墒斓腉DF-8和BMP-11是高度保守的并且只相差11個(gè)氨基酸。令人驚訝的是，GASP1不抑制活化素或TGF-β1的活性(圖16C和D)，表明有極高水平的特異性，這是不能經(jīng)促濾泡素抑制素本身證明的。因此，GASP1在其對GDF-8和BMP-11的抑制中顯示特異性。
GASP1對GDF-8的親和性通過在報(bào)道基因分析中確定抑制GDF-8的IC50而被評估。如上所述，GASP1-V5-His蛋白質(zhì)是在鈷親和柱上的條件培養(yǎng)基純化并進(jìn)行洗提。進(jìn)一步通過在PBS中利用BioSepS3000柱(Phenomenex)大小排阻層析純化包含GASP1的級分。如圖17所示，GASP1以約3nM的IC50抑制GDF-8。
實(shí)施例12肌肉病癥的治療可根據(jù)表2給患有與GDF-8功能相關(guān)的疾病或病癥的患者施用GASP1。患者以一定時(shí)間或間隔攝取該組合物，例如每日一次，并且他們的疾病或病癥的癥狀得到改善。例如，與肌肉的病癥相關(guān)的癥狀得到改善，如通過測量肌肉質(zhì)量、肌肉活性和/或肌張力所示。由此可見，本發(fā)明的組合物可用于治療與GDF-8功能相關(guān)的疾病或病癥，例如肌肉病癥。
表2GASP1的給藥
本申請中自始至終引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請的全部內(nèi)容在此引入作為參考。給出上述的發(fā)明詳述只為了例證說明的目的。可對如上所述的實(shí)施方案進(jìn)行各種各樣的變化和修飾。因此應(yīng)該理解下列權(quán)利要求書，包括所有的等同物是用來限定本發(fā)明的范圍的。
序列表<110>HILL，JENNIFER J.
WOLFMAN，NEIL M.
<120>包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)<130>08702.0014-00<140>
<141>
<150>60/357,846<151>2002-02-21<150>60/434,645<151>2002-12-20<160>53<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1716<212>DNA<213>小鼠<400>1atgtgtgccc cagggtatca tcggttctgg tttcactggg ggctgctgtt gctgctgctc 60ctcgaggctc cccttcgagg cctagcactg ccacccatcc gatactccca tgcgggcatc 120tgccccaacg acatgaaccc caacctctgg gtggatgccc agagcacctg caagcgagag 180tgtgaaacag accaggaatg tgagacctat gagaaatgct gccccaatgt gtgtgggacc 240aagagctgtg tggcagcccg ctacatggat gtgaaaggga agaagggccc tgtgggcatg 300cccaaggagg ccacatgtga ccatttcatg tgcctgcagc agggctctga gtgtgacatc 360tgggacggcc agcccgtgtg taagtgcaaa gatcgctgtg agaaggagcc cagcttcacc 420tgtgcctctg atggccttac ctactacaac cgttgcttca tggacgccga agcctgctcc 480aagggcatca cactgtctgt ggtcacctgt cgttatcact tcacctggcc taacaccagc 540cctccaccgc ctgagaccac ggtgcatccc accaccgcct ctccggagac tctcgggctg 600gacatggcag ccccggccct gctcaaccac cctgtccatc agtcagtcac cgtgggtgag 660actgtgagtt tcctctgtga cgtggtaggc cggcctcggc cagagctcac ttgggagaaa 720cagctggagg accgagaaaa tgttgtcatg aggcccaacc acgtgcgcgg taatgtggtg 780gtcactaaca ttgcccagct ggtcatctac aacgtccagc cccaggatgc tggcatatac 840acctgtacag ctcgaaatgt cgctggtgtc ctgagggctg acttcccgtt gtcggtggtc 900aggggtggtc aggccagggc cacttcagag agcagtctca atggcacagc ttttccagca 960
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ctgggcaggg tctctgagct gaccgaggag caagactcgg gccgtgccct ggtgaccgtg 1440gatgaggtct taaaagatga gaagatgggc ctcaagtttc tgggccggga gcctctggaa 1500gtcaccctgc ttcatgtaga ctggacctgt ccttgcccca acgtgacagt gggtgagaca 1560ccactcatca tcatggggga ggtggacggc ggcatggcca tgctgagacc cgatagcttt 1620gtgggggcat cgagcacacg gcgggtcagg aagctccgtg aggtcatgta caagaaaacc 1680tgtgacgtcc tcaaggactt cctgggcttg caatga 1716<210>3<211>571<212>PRT<213>小鼠<400>3Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro20 25 30Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn35 40 45Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp50 55 60Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr65 70 75 80Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly85 90 95Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu100 105 110Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys115 120 125Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp130 135 140Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser145 150 155 160
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<221>經(jīng)過修飾的堿基<222>(732)<223>a，t，c or g
<400>4atgaatccca acctctgggt ggacgcacag agcacctgca ggcgggagtg tgagacggac 60caggagtgtg agatggacca ggtgagtggg atccagaagc cacagtgtga ggcagaccag 120gtgaatgggg tccagaagcc gcaatgtgag atggaccaga agtgggagtg tgaggttgac 180caggtgagtg gggtccagaa gccggtgtgt gaggcggacc aggtgagtgg ggtccagaag 240ccacagtgtg agatggacca ggtgagtggg atccagaagc tggagtgtga ggcggaccag 300aagtgggagt atgaggtgga ccaggtgagt ggggtccaga agccacagtg tgagatggac 360caggtgagtg ggatccagaa gctggagtgt gaggcggacc aggagtgtga gacctatgag 420aagtgctgcc ccaacgtatg tgggaccaag agctgcgtgg cggcccgcta catggacgtg 480aaagggaaga agggcccagt gggcatgccc aaggaggcca catgtgacca cttcatgtgt 540ctgcagcagg gctctgagtg tgacatctgg gatggccagc ccgtgtgtaa gtgcaaagac 600cgctgtgaga aggagcccag ctttacctgc gcctcggacg gcctcaccta ctataaccgc 660tgctacatgg atgccgaggc ctgctccaaa ggcatcacac tggccgttgt aacctgccgc 720tatcacttca cntggcccaa caccagcccc ccaccacctg agaccaccat gcaccccacc 780acagcctccc cagagacccc tgagctggac atggcggccc ctgcgctgct caacaaccct 840gtgcaccagt cggtcaccat gggtgagaca gtgagcttcc tctgtgatgt ggtgggccgg 900ccccggcctg agatcacctg ggagaagcag ttggaggatc gggagaatgt ggtcatgcgg 960cccaaccatg tgcgtggcaa cgtggtggtc accaacattg cccagctggt catctataac 1020gcccagctgc aggatgctgg gatctacacc tgcacggccc ggaacgtggc tggggtcctg 1080agggctgatt tcccgctgtc ggtggtcagg ggtcatcagg ctgcagccac ctcagagagc 1140agccccaatg gcacggcttt cccggcggcc gagtgcctga agcccccaga cagtgaggac 1200tgtggcgaag agcagacccg ctggcacttc gatgcccagg ccaacaactg cctgaccttc 1260accttcggcc actgccaccg taacctcaac cactttgaga cctatgaggc ctgcatgctg 1320gcctgcatga gcgggccgct ggccgcgtgc agcctgcccg ccctgcaggg gccctgcaaa 1380gcctacgcgc ctcgctgggc ttacaacagc cagacgggcc agtgccagtc ctttgtctat 1440ggtggctgcg agggcaatgg caacaacttt gagagccgtg aggcctgtga ggagtcgtgc 1500cccttcccca gggggaacca gcgctgtcgg gcctgcaagc ctcggcagaa gctcgttacc 1560agcttctgtc gcagcgactt tgtcatcctg ggccgagtct ctgagctgac cgaggagcct 1620gactcgggcc gcgccctggt gactgtggat gaggtcctaa aggatgagaa aatgggcctc 1680aagttcctgg gccaggagcc attggaggtc actctgcttc acgtggactg ggcatgcccc 1740tgccccaacg tgaccgtgag cgagatgccg ctcatcatca tgggggaggt ggacggcggc 1800atggccatgc tgcgccccga tagctttgtg ggcgcatcga gtgcccgccg ggtcaggaag 1860cttcgtgagg tcatgcacaa gaagacctgt gacgtcctca aggagtttct tggcttgcac 1920tga 1923<210>5<211>640<212>PRT<213>人<400>5Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg Glu
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tctgagtgtg acatctggga tggccagccc gtgtgtaagt gcaaagaccg ctgtgagaag 420gagcccagct ttacctgcgc ctcggacggc ctcacctact ataaccgctg ctacatggat 480gccgaggcct gctccaaagg catcacactg gccgttgtaa cctgccgcta tcacttcacc 540tggcccaaca ccagcccccc accacctgag accaccatgc accccaccac agcctcccca 600gagacccctg agctggacat ggcggcccct gcgctgctca acaaccctgt gcaccagtcg 660gtcaccatgg gtgagacagt gagtttcctc tgtgatgtgg tgggccggcc ccggcctgag 720atcacctggg agaagcagtt ggaggatcgg gagaatgtgg tcatgcggcc caaccatgtg 780cgtggcaacg tggtggtcac caacattgcc cagctggtca tctataacgc ccagctgcag 840gatgctggga tctacacctg cacggcccgg aacgtggctg gggtcctgag ggctgatttc 900ccgctgtcgg tggtcagggg tcatcaggct gcagccacct cagagagcag ccccaatggc 960acggctttcc cggcggccga gtgcctgaag cccccagaca gtgaggactg tggcgaagag 1020cagacccgct ggcacttcga tgcccaggcc aacaactgcc tgaccttcac cttcggccac 1080tgccaccgta acctcaacca ctttgagacc tatgaggcct gcatgctggc ctgcatgagc 1140gggccgctgg ccgcgtgcag cctgcccgcc ctgcaggggc cctgcaaagc ctacgcgcct 1200cgctgggctt acaacagcca gacgggccag tgccagtcct ttgtctatgg tggctgcgag 1260ggcaatggca acaactttga gagccgtgag gcctgtgagg agtcgtgccc cttccccagg 1320gggaaccagc gctgtcgggc ctgcaagcct cggcagaagc tcgttaccag cttctgtcgc 1380agcgactttg tcatcctggg ccgagtctct gagctgaccg aggagcctga ctcgggccgc 1440gccctggtga ctgtggatga ggtcctaaag gatgagaaaa tgggcctcaa gttcctgggc 1500caggagccat tggaggtcac tctgcttcac gtggactggg catgcccctg ccccaacgtg 1560accgtgagcg agatgccgct catcatcatg ggggaggtgg acggcggcat ggccatgctg 1620cgccccgata gctttgtggg cgcatcgagt gcccgccggg tcaggaagct tcgtgaggtc 1680atgcacaaga agacctgtga cgtcctcaag gagtttcttg gcttgcactg a 1731<210>7<211>576<212>PRT<213>人<400>7Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg Trp Glu Gln Val1 5 10 15Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Pro Pro Arg Ser20 25 30Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn35 40 45Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg50 55 60Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro
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Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly305 310 315 320Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp325 330 335Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn340 345 350Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe355 360 365Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala370 375 380Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro385 390 395 400Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr405 410 415Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys420 425 430Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys435 440 445Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val450 455 460Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg465 470 475 480Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu485 490 495Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp500 505 510Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile515 520 525Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser530 535 540
Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val545 550 555 560Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His565 570 575<210>8<211>1659<212>DNA<213>小鼠<400>8atgcctgccc cacagccatt cctgcctctg ctctttgtct tcgtgctcat ccatctgacc 60tcggagacca acctgctgcc agatcccgga agccatcctg gcatgtgccc caacgagctc 120agcccccacc tgtgggtcga cgcccagagc acctgtgagc gtgagtgtac cggggaccag 180gactgtgcgg catccgagaa gtgctgcacc aatgtgtgtg ggctgcagag ctgcgtggct 240gcccgctttc ccagtggtgg cccagctgta cctgagacag cagcctcctg tgaaggcttc 300caatgcccac aacagggttc tgactgtgac atctgggatg ggcagccagt ttgtcgctgc 360cgtgaccgct gtgaaaaaga acccagcttc acatgtgctt ctgatggcct tacctattac 420aaccgctgct acatggacgc agaagcctgc ctgcggggtc tccacctgca cgttgtaccc 480tgtaagcaca ttctcagttg gccgcccagc agcccgggac cacccgagac cactgctcgc 540ccaacccctg gggctgctcc catgccacct gccctgtaca acagcccctc accacaggca 600gtgcatgttg gggggacagc cagcctccac tgtgatgtta gtggccgtcc accacctgct 660gtgacctggg agaagcagag ccatcagcgg gagaacctga tcatgcgccc tgaccaaatg 720tatggcaacg tggttgtcac cagtatcgga cagctagtcc tctacaatgc tcagttggag 780gatgcgggcc tgtatacctg cactgcacga aacgctgccg gcctgctgcg ggccgacttt 840cccctttccg ttttacagcg ggcaactact caggacaggg acccaggtat cccagccttg 900gctgagtgcc aggccgacac acaagcctgt gttgggccac ctactcccca tcatgtcctt 960tggcgctttg acccacagag aggcagctgc atgacattcc cagccctcag atgtgatggg 1020gctgcccggg gctttgagac ctatgaggca tgccagcagg cctgtgttcg tggccccggg 1080gatgtctgtg cactgcctgc agttcagggg ccctgccagg gctgggagcc acgctgggcc 1140tacagcccac tgctacagca gtgccacccc tttgtataca gtggctgtga aggaaacagc 1200aataactttg agacccggga gagctgtgag gatgcttgcc ctgtaccacg cacaccaccc 1260tgtcgtgcct gccgcctcaa gagcaagctg gctctgagct tgtgccgcag tgactttgcc 1320atcgtgggga gactcacaga ggtcctggag gagcccgagg ctgcaggcgg catagctcgt 1380gtggccttgg atgatgtgct aaaggacgac aagatgggcc tcaagttctt gggcaccaaa 1440tacctggagg tgacattgag tggcatggac tgggcctgcc catgccccaa cgtgacagct 1500gtcgatgggc cactggtcat catgggtgag gttcgtgaag gtgtggctgt gttggacgcc 1560aacagctatg tccgtgctgc cagcgagaag cgagtcaaga agattgtgga actgctcgag 1620aagaaggctt gtgaactgct caaccgcttc caagactag1659
<210>9<211>552<212>PRT<213>小鼠<400>9Met Pro Ala Pro Gln Pro Phe Leu Pro Leu Leu Phe Val Phe Val Leu1 5 10 15Ile His Leu Thr Ser Glu Thr Asn Leu Leu Pro Asp Pro Gly Ser His20 25 30Pro Gly Met Cys Pro Asn Glu Leu Ser Pro His Leu Trp Val Asp Ala35 40 45Gln Ser Thr Cys Glu Arg Glu Cys Thr Gly Asp Gln Asp Cys Ala Ala50 55 60Ser Glu Lys Cys Cys Thr Asn Val Cys Gly Leu Gln Ser Cys Val Ala65 70 75 80Ala Arg Phe Pro Ser Gly Gly Pro Ala Val Pro Glu Thr Ala Ala Ser85 90 95Cys Glu Gly Phe Gln Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp100 105 110Asp Gly Gln Pro Val Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro115 120 125Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr130 135 140Met Asp Ala Glu Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Val Val Pro145 150 155 160Cys Lys His Ile Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu165 170 175Thr Thr Ala Arg Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Met Pro Pro Ala Leu180 185 190Tyr Asn Ser Pro Ser Pro Gln Ala Val His Val Gly Gly Thr Ala Ser195 200 205
Leu His Cys Asp Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu210 215 220Lys Gln Ser His Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met225 230 235 240Tyr Gly Asn Val Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn245 250 255Ala Gln Leu Glu Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala260 265 270Ala Gly Leu Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Leu Gln Arg Ala275 280 285Thr Thr Gln Asp Arg Asp Pro Gly Ile Pro Ala Leu Ala Glu Cys Gln290 295 300Ala Asp Thr Gln Ala Cys Val Gly Pro Pro Thr Pro His His Val Leu305 310 315 320Trp Arg Phe Asp Pro Gln Arg Gly Ser Cys Met Thr Phe Pro Ala Leu325 330 335Arg Cys Asp Gly Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln340 345 350Gln Ala Cys Val Arg Gly Pro Gly Asp Val Cys Ala Leu Pro Ala Val355 360 365Gln Gly Pro Cys Gln Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu370 375 380Leu Gln Gln Cys His Pro Phe Val Tyr Ser Gly Cys Glu Gly Asn Ser385 390 395 400Asn Asn Phe Glu Thr Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro405 410 415Arg Thr Pro Pro Cys Arg Ala Cys Arg Leu Lys Ser Lys Leu Ala Leu420 425 430Ser Leu Cys Arg Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val
435 440 445Leu Glu Glu Pro Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Asp450 455 460Asp Val Leu Lys Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys465 470 475 480Tyr Leu Glu Val Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro485 490 495Asn Val Thr Ala Val Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg500 505 510Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Ala Asn Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser515 520 525Glu Lys Arg Val Lys Lys Ile Val Glu Leu Leu Glu Lys Lys Ala Cys530 535 540Glu Leu Leu Asn Arg Phe Gln Asp545 550<210>10<211>1695<212>DNA<213>人<400>10atgcccgccc tacgtccact cctgccgctc ctgctcctcc tccggctgac ctcgggggct 60ggcttgctgc cagggctggg gagccacccg ggcgtgtgcc ccaaccagct cagccccaac 120ctgtgggtgg acgcccagag cacctgtgag cgcgagtgta gcagggacca ggactgtgcg 180gctgctgaga agtgctgcat caacgtgtgt ggactgcaca gctgcgtggc agcacgcttc 240cccggcagcc cagctgcgcc gacgacagcg gcctcctgcg agggctttgt gtgcccacag 300cagggctcgg actgcgacat ctgggacggg cagcccgtgt gccgctgccg cgaccgctgt 360gagaaggagc ccagcttcac ctgcgcctcg gacggcctca cctactacaa ccgctgctat 420atggacgccg aggcctgcct gcggggcctg cacctccaca tcgtgccctg caagcacgtg 480ctcagctggc cgcccagcag cccggggccg ccggagacca ctgcccgccc cacacctggg 540gccgcgcccg tgcctcctgc cctgtacagc agcccctccc cacaggcggt gcaggttggg 600ggtacggcca gcctccactg cgacgtcagc ggccgcccgc cgcctgctgt gacctgggag 660aagcagagtc accagcgaga gaacctgatc atgcgccctg atcagatgta tggcaacgtg 720gtggtcacca gcatcgggca gctggtgctc tacaacgcgc ggcccgaaga cgccggcctg 780tacacctgca ccgcgcgcaa cgctgctggg ctgctgcggg ctgacttccc actctctgtg 840
gtccagcgag agccggccag ggacgcagcc cccagcatcc cagccccggc cgagtgcctg 900ccggatgtgc aggcctgcac gggccccact tccccacacc ttgtcctctg gcactacgac 960ccgcagcggg gcggctgcat gaccttcccg gcccgtggct gtgatggggc ggcccgcggc 1020tttgagacct acgaggcatg ccagcaggcc tgtgcccgcg gccccggcga cgcctgcgtg 1080ctgcctgccg tgcagggccc ctgccggggc tgggagccgc gctgggccta cagcccgctg 1140ctgcagcagt gccatccctt cgtgtacggt ggctgcgagg gcaacggcaa caacttccac 1200agccgcgaga gctgcgagga tgcctgcccc gtgccgcgca caccgccctg ccgcgcctgc 1260cgcctccgga gcaagctggc gctgagcctg tgccgcagcg acttcgccat cgtggggcgg 1320ctcacggagg tgctggagga gcccgaggcc gccggcggca tcgcccgcgt ggcgctcgag 1380gacgtgctca aggatgacaa gatgggcctc aagttcttgg gcaccaagta cctggaggtg 1440acgctgagtg gcatggactg ggcctgcccc tgccccaaca tgacggcggg cgacgggccg 1500ctggtcatca tgggtgaggt gcgcgatggc gtggccgtgc tggacgccgg cagctacgtc 1560cgcgccgcca gcgagaagcg cgtcaagaag atcttggagc tgctggagaa gcaggcctgc 1620gagctgctca accgcttcca ggactagccc ccgcaggggc ctgcgccacc ccgtcctggt 1680gaataaacgc actcc 1695<210>11<211>548<212>PRT<213>人<400>11Met Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu1 5 10 15Thr Ser Gly Ala Gly Leu Leu Pro Gly Leu Gly Ser His Pro Gly Val20 25 30Cys Pro Asn Gln Leu Ser Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr35 40 45Cys Glu Arg Glu Cys Ser Arg Asp Gln Asp Cys Ala Ala Ala Glu Lys50 55 60Cys Cys Ile Asn Val Cys Gly Leu His Ser Cys Val Ala Ala Arg Phe65 70 75 80Pro Gly Ser Pro Ala Ala Pro Thr Thr Ala Ala Ser Cys Glu Gly Phe85 90 95Val Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro100 105 110
Va1 Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys115 120 125Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp Ala Glu130 135 140Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Ile Val Pro Cys Lys His Val145 150 155 160Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu Thr Thr Ala Arg165 170 175Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Ser Ser Pro180 185 190Ser Pro Gln Ala Val Gln Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu His Cys Asp195 200 205Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu Lys Gln Ser His210 215 220Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met Tyr Gly Asn Val225 230 235 240Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn Ala Arg Pro Glu245 250 255Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala Ala Gly Leu Leu260 265 270Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Gln Arg Glu Pro Ala Arg Asp275 280 285Ala Ala Pro Ser Ile Pro Ala Pro Ala Glu Cys Leu Pro Asp Val Gln290 295 300Ala Cys Thr Gly Pro Thr Ser Pro His Leu Val Leu Trp His Tyr Asp305 310 315 320Pro Gln Arg Gly Gly Cys Met Thr Phe Pro Ala Arg Gly Cys Asp Gly325 330 335Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln Gln Ala Cys Ala340 345 350
Arg Gly Pro Gly Asp Ala Cys Val Leu Pro Ala Val Gln Gly Pro Cys355 360 365Arg Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu Leu Gln Gln Cys370 375 380His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe His385 390 395 400Ser Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro Arg Thr Pro Pro405 410 415Cys Arg Ala Cys Arg Leu Arg Ser Lys Leu Ala Leu Ser Leu Cys Arg420 425 430Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val Leu Glu Glu Pro435 440 445Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Leu Lys450 455 460Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys Tyr Leu Glu Val465 470 475 480Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Met Thr Ala485 490 495Gly Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg Asp Gly Val Ala500 505 510Val Leu Asp Ala Gly Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser Glu Lys Arg Val515 520 525Lys Lys Ile Leu Glu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Cys Glu Leu Leu Asn530 535 540Arg Phe Gln Asp545<210>12<211>30<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述示例性的競爭肽<400>12Asp Phe Gly Leu Asp Ser Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Ser Ser1 5 10 15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp20 25 30<210>13<211>15<212>PRT<213>小鼠<400>13Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15<210>14<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>14Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10<210>15<211>14<212>PRT<213>小鼠<400>15Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg1 5 10
<210>16<211>15<212>PRT<213>小鼠<400>16Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15<210>17<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>17Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10<210>18<211>19<212>PRT<213>小鼠<400>18Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile1 5 10 15Ala Pro Lys<210>19<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>19Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10<210>20
<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>20Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys1 5 10<210>21<211>16<212>PRT<213>小鼠<400>21Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys1 5 10 15<210>22<211>28<212>PRT<213>小鼠<400>22Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro1 5 10 15Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys20 25<210>23<211>16<212>PRT<213>小鼠<400>23Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys1 5 10 15<210>24<211>10
<212>PRT<213>小鼠<400>24Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg1 5 10<210>25<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>25Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg1 5 10<210>26<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>26Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Lys1 5 10<210>27<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>27Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg1 5 10<210>28<211>18<212>PRT<213>小鼠<400>28
Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val1 5 10 15Cys Arg<210>29<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>29Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys1 5 10<210>30<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>30Ser Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg1 5<210>31<211>13<212>PRT<213>小鼠<400>31Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys1 5 10<210>32<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>32Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg
1 5<210>33<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>33Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg1 5 10<210>34<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>34Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg1 5<210>35<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>35Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg1 5 10<210>36<211>15<212>PRT<213>人<400>36Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15<210>37
<211>14<212>PRT<213>人<400>37Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg1 5 10<210>38<211>28<212>PRT<213>人<400>38Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro1 5 10 15Gly Glu Asp Gly Le uAsn Pro Phe Leu Glu Val Lys20 25<210>39<211>10<212>PRT<213>人<400>39Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg1 5 10<210>40<211>18<212>PRT<213>人<400>40Pro Gln Ser Cys Val Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val1 5 10 15Cys Arg
<210>41<211>13<212>PRT<213>人<400>41Cys Glu Cys Ala Pro Asp Cys Ser Gly Leu Pro Ala Arg1 5 10<210>42<211>12<212>PRT<213>人<400>42Leu Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人<400>43Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>人<400>44Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser Lys1 5 10<210>45<211>10<212>PRT
<213>人<400>45Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg1 5 10<210>46<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>46ttggccactg ccaccacaat ctcaaccact t 31<210>47<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>47tctcagcatg gccatgccgc cgtcga 26<210>48<211>1716<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(1713)<400>48atg tgt gcc cca ggg tat cat cgg ttc tgg ttt cac tgg ggg ctg ctg 48Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu1 5 10 15
ttg ctg ctg ctc ctc gag gct ccc ctt cga ggc cta gca ctg cca ccc96Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro20 25 30atc cga tac tcc cat gcg ggc atc tgc ccc aac gac atg aac ccc aac144Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn35 40 45ctc tgg gtg gat gcc cag agc acc tgc aag cga gag tgt gaa aca gac192Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp50 55 60cag gaa tgt gag acc tat gag aaa tgc tgc ccc aat gtg tgt ggg acc240Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr65 70 75 80aag agc tgt gtg gca gcc cgc tac atg gat gtg aaa ggg aag aag ggg288Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly85 90 95cct gta ggc atg ccc aag gag gec aca tgt gac cat ttc atg tgc ctg336Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu100 105 110cag cag ggc tct gag tgt gac atc tgg gac ggc cag ccc gtg tgt aag384Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys115 120 125tgc aaa gat cgc tgt gag aag gag ccc agc ttc acc tgt gcc tct gat432Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp130 135 140ggc ctt acc tac tac aac cgt tgc ttc atg gac gcc gaa gcc tgc tcc480Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser145 150 155 160aag ggc atc aca ctg tct gtg gtc acc tgt cgt tat cac ttc acc tgg528Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp165 170 175cct aac acc agc cct cca ccg cct gag acc acg gtg cat ccc acc acc576Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr180 185 190
gcc tct ccg gag act ctc ggg ctg gac atg gca gcc cca gcc ctg ctc624Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu195 200 205aac cac cct gtc cat cag tca gtc acc gtg ggt gag act gtg agt ttc672Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe210 215 220ctc tgt gac gtg gta ggc cgg cct cgg cca gag ctc act tgg gag aaa720Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys225 230 235 240cag ctg gag gac cga gag aat gtt gtc atg agg ecc aac cac gtg cgt768Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg245 250 255ggt aat gtg gtg gtc act aac att gcc cag ctg gtc atc tac aac gtc816Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val260 265 270cag ccc cag gat gct ggc ata tac acc tgt aca gct cga aat gtc gct864Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala275 280 285ggt gtc ctg agg gct gac ttc ccg ttg tcg gtg gtc agg ggt ggt cag912Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln290 295 300gcc agg gcc act tca gag agc agt ctc aat ggc aca gct ttt cca gca960Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala305 310 315 320aca gag tgc ctg aag ccc cca gac agt gag gac tgt gga gag gag cag1008Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln325 330 335aca cgc tgg cac ttc gac gcc cag gct aac aac tgc ctc act ttc acc1056Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr340 345 350ttt ggc cac tgc cac cac aat ctc aac cac ttt gag acc tac gag gcc1104Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala355 360 365
tgt atg ctg gct tgt atg agt ggg cca ttg gcc acc tgc agc ctg cct1152Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro370 375 380gcc ctg caa ggg cct tgc aaa gct tat gtc cca cgc tgg gcc tac aac1200Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn385 390 395 400agc cag aca ggc cta tgc cag tcc ttc gtc tat ggc ggc tgt gag ggc1248Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly405 410 415aac ggt aac aac ttt gaa agc cgt gag gct tgt gag gag tcg tgt ccc1296Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro420 425 430ttc ccg agg ggt aac cag cac tgc cgg gcc tgc aag ccc cgg caa aaa1344Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys435 440 445ctt gtt acc agc ttc tgt cgg agt gac ttt gtc atc ctg ggc agg gtc1392Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val450 455 460tct gag ctg acc gag gag caa gac tcg ggc cgt gcc ctg gtg acc gtg1440Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val465 470 475 480gat gag gtc tta aaa gat gag aag atg ggc ctc aag ttt ctg ggc cgg1488Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg485 490 495gag cct ctg gaa gtc acc ctg ctt cat gta gac tgg acc tgt cct tgc1536Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys500 505 510ccc aac gtg aca gtg ggt gag aca cca ctc atc atc atg ggg gag gtg1584Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val515 520 525gac ggc ggc atg gcc atg ctg aga ccc gat agc ttt gtg ggg gca tcg1632Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser530 535 540
agc aca cgg cgg gtc agg aag ctc cgt gag gtc atg tac aag aaa acc1680Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr545 550 555 560tgt gac gtc ctc aag gac ttc ctg ggc ttg caa tga1716Cys Asp Val Leu Lys Asp Phe Leu Gly Leu Gln565 570<210>49<211>571<212>PRT<213>小鼠<400>49Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro20 25 30Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn35 40 45Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp50 55 60Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr65 70 75 80Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly85 90 95Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu100 105 110Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys115 120 125Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp130 135 140Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser
145 150 155 160Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp165 170 175Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr180 185 190Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu195 200 205Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe210 215 220Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys225 230 235 240Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg245 250 255Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val260 265 270Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala275 280 285Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln290 295 300Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala305 310 315 320Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln325 330 335Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr340 345 350Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala355 360 365Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro370 375 380
Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn385 390 395 400Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly405 410 415Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro420 425 430Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys435 440 445Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val450 455 460Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val465 470 475 480Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg485 490 495Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys500 505 510Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val515 520 525Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser530 535 540Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr545 550 555 560Cys Asp Val Leu Lys Asp Phe Leu Gly Leu Gln565 570<210>50<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>50caccatgtgt gccccagggt atcatcggtt ctgg 34<210>51<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>51ttgcaagccc aggaagtcct tgaggac 27<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述示例性的N-末端肽序列<400>52Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile1 5 10<210>53<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>53cagacagaca gacagacaga cagacagaca gacagacaga cagacaga 48
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包括i)包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素，和ii)至少一種藥物學(xué)上可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)選自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘連蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定化修飾。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的修飾是與IgG分子的Fc區(qū)域融合。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中IgG分子是IgG1或IgG4，或其衍生物。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中IgG分子是IgG1或其衍生物。
7.權(quán)利要求4的組合物，其中IgG分子通過接頭肽與包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)融合。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的修飾包括改變的糖基化位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的修飾包括至少一個(gè)碳水化合物部分。
10.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的修飾包括清蛋白或清蛋白的衍生物。
11.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的修飾包括非蛋白質(zhì)類的聚合物。
12.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的修飾包括聚乙二醇化。
13.包括包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)的診斷試劑盒，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素并且至少一種另外的試劑盒成分選自i)至少一種結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑；ii)至少一種緩沖液和/或溶液；和iii)至少一種結(jié)構(gòu)性成分。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述的蛋白質(zhì)選自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘連蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
15.包括編碼包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的核酸的重組細(xì)胞，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素。
16.權(quán)利要求15的重組細(xì)胞，其中所述的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性修飾。
17.權(quán)利要求15或16的重組細(xì)胞，其中所述的蛋白質(zhì)選自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘連蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
18.調(diào)節(jié)GDF-8的方法，包括施用包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素，并且使該蛋白質(zhì)能夠與GDF-8相互作用。
19.治療患有醫(yī)學(xué)病癥的患者的方法，包括施用有效劑量的包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的至少一種蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素，并且使該蛋白質(zhì)能夠與GDF-8相互作用。
20.治療患有醫(yī)學(xué)病癥的患者的方法，包括施用編碼包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的核酸，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素，使該核酸能夠被翻譯成蛋白質(zhì)，并使翻譯的蛋白質(zhì)能夠與GDF-8相互作用。
21.表達(dá)核酸的方法，包括i)將編碼包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的核酸施用于細(xì)胞，其中該蛋白質(zhì)不是促濾泡素抑制素，ii)使該核酸能夠進(jìn)入細(xì)胞，以及iii)使細(xì)胞能夠表達(dá)該蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中所述的蛋白質(zhì)選自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘連蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
23.權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中所述的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定化修飾。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的修飾是與IgG分子的Fc區(qū)域融合。
25.權(quán)利要求24的方法，其中IgG分子是IgG1或IgG4或其衍生物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中IgG分子是IgG1或其衍生物。
27.權(quán)利要求24的方法，其中IgG分子通過接頭肽與包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)融合。
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述的修飾包含改變的糖基化位點(diǎn)。
29.權(quán)利要求23的方法，其中所述的修飾包含至少一個(gè)碳水化合物部分。
30.權(quán)利要求23的方法，其中所述的修飾包含清蛋白或清蛋白的衍生物。
31.權(quán)利要求23的方法，其中所述的修飾包含非蛋白質(zhì)類的聚合物。
32.權(quán)利要求23的方法，其中所述的修飾包含聚乙二醇化。
33.權(quán)利要求19的方法，其中所述的患者從肌肉組織質(zhì)量和數(shù)量的增加中獲得治療效果。
34.權(quán)利要求19的方法，其中所述的病癥是肌肉性病癥。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述的肌肉性病癥是肌營養(yǎng)不良。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述的肌肉萎縮選自嚴(yán)重的或良性的X-連鎖的肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、面肩胛肱骨營養(yǎng)不良、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端肌營養(yǎng)不良、進(jìn)行性營養(yǎng)不良的眼肌麻痹、眼咽肌營養(yǎng)不良，和Fakuyama型先天性肌營養(yǎng)不良。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述的病癥選自先天性肌病、先天性肌強(qiáng)直、家族性周期性麻痹、突發(fā)性肌紅蛋白尿、重癥肌無力、伊-朗綜合征、繼發(fā)性肌無力、去神經(jīng)支配萎縮、突發(fā)性肌肉萎縮、肌肉消耗綜合征、肌肉貧乏癥和惡病質(zhì)。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述的病癥是肌肉病癥，選自肌肉組織的外傷和肌肉組織的慢性損傷。
39.權(quán)利要求19的方法，其中所述的病癥是新陳代謝疾病或病癥。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述的病癥是2型糖尿病、非胰島素依賴型糖尿病、高血糖癥或肥胖癥。
41.權(quán)利要求19的方法，其中所述的病癥是脂肪組織病癥，例如肥胖癥。
42.權(quán)利要求19的方法，其中所述的病癥是骨退化疾病，例如骨質(zhì)疏松癥。
43.權(quán)利要求19的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是以一定的時(shí)間或每天、每周或每月的時(shí)間間隔給藥的。
44.權(quán)利要求19的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是以5mg-100mg的劑量給藥的。
45.權(quán)利要求19的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是以15mg-85mg的劑量給藥的。
46.權(quán)利要求19的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是以3mg-70mg的劑量給藥的。
47.權(quán)利要求19的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是以40mg-60mg的劑量給藥的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)生長和分化因子－8(GDF－8)的水平或活性的用途。更特別地，本發(fā)明涉及利用除了促濾泡素抑制素本身外的包含至少一個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，治療與GDF－8的水平或活性的調(diào)節(jié)相關(guān)的病癥。本發(fā)明可用于治療肌肉疾病和病癥，特別是隨肌肉組織的增加而治療有效的肌肉疾病和病癥。本發(fā)明也用于治療與新陳代謝、脂肪組織和骨退化相關(guān)的疾病和病癥。
文檔編號A61K38/16GK1993048SQ03808084
公開日2007年7月4日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月21日
發(fā)明者J·J·希爾, N·M·沃爾夫曼 申請人:惠氏公司